Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Samtidige studie av rekrutteringen av Monocyte subpopulasjoner Under flyt In Vitro

Published: November 26, 2018 doi: 10.3791/58509
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 3
1Hematology service, Centre Médical Universitaire (CMU), Medical faculty, University of Geneva, 2Department of Pathology and Immunology, Centre Médical Universitaire (CMU), Medical faculty, University of Geneva, 3Department of Cell Physiology and Metabolism, Centre Médical Universitaire (CMU), Medical faculty, University of Geneva

Summary

Her presenterer vi en integrert protokoll som måler monocytt subpopulasjon smugling under flyt i vitro ved bruk av bestemte overflate markører og AC confocal fluorescens mikroskopi. Denne protokollen kan brukes å utforske sekvensiell rekruttering trinn også om profil andre leukocytter subtyper med andre spesifikke overflate markører.

Abstract

Rekruttering av monocytter fra blodet til målrettet perifere vev er avgjørende for inflammatorisk prosessen under tissue skade, tumor utvikling og autoimmune sykdommer. Dette er tilrettelagt gjennom en fange fra fri flyt på luminal overflaten av aktivert endotelceller, etterfulgt av folkevandring vedheft og transendothelial (transmigration) i det underliggende berørte vev. Men er mekanismer som støtter fortrinnsrett og kontekst-avhengige rekruttering av monocyte subpopulasjoner fortsatt ikke fullt ut forstått. Derfor har vi utviklet en metode der rekruttering av ulike monocytt subpopulasjoner samtidig visualisert og målt under flyt. Denne metoden, basert på tidsinnstilt AC confocal bildebehandling, gjør entydig skillet mellom tilhenger og transmigrated monocytter. Her beskriver vi hvordan denne metoden kan brukes samtidig studere rekruttering kaskade av pro-angiogenic og ikke-angiogenic monocytter i vitro. Denne metoden kan videre utvides for å studere de ulike trinnene i rekrutteringen av opptil tre monocytt populasjoner.

Introduction

Monocytter utgjør en phagocytic komponent i medfødt immunitet som er nødvendig for å bekjempe patogener, rydde opp skadet vev og angiogenese i Patofysiologien ved mange sykdommer, inkludert kreft1,2,3 . Monocytter er Ben margtransplantasjon-avledet celler består av heterogene subpopulasjoner som sirkulerer i blodet, men kan bli rekruttert til området av betennelse i perifere vev gjennom bestemte molekylære mekanismer. Rekruttering kaskader av monocytter, som leukocytter, impliserer fremgangsmåten inkludert fange, rullende, krypende, arrestasjon, transendothelial overføring (transmigration) og overføring gjennom fartøyet veggen (kjelleren membran og veggmaleri celler)4. Disse trinnene omfatter hovedsakelig betennelse-indusert molekyler på endothelial luminal overflaten som selectins, glykoprotein ligander, chemokines, junctional og intercellulær adhesjon molekyler og deres reseptorer på leukocytter som selectin ligander og integrins. Menneskehandel veier gjennom enten endothelial celle veikryss (paracellular) eller via endothelial celle kroppen (transcellular) kan brukes av leukocytter for å krysse endothelial barriere5. Mens monocytter historisk dokumentert for å transmigrate gjennom transcellular ruten, er potensielle forskjeller i deres vandrende veien foreslått som monocytter er ikke lenger ansett som en homogen celle befolkningen. Nå blir det klart at monocytt mangfold kan defineres av hver av sine fellestrekk og ulikheter, med hensyn til deres karakteristiske bloduttredelse kaskader3,6. Derfor for å entydig forskjellsbehandle monocytt subpopulasjoner, er det avgjørende å visualisere og fenotypen virkemåten til hver av disse forskjellige subpopulasjoner under rekruttering behandle.

Monocytter fra menneske, gris, rotte og mus var inndelt i fenotypiske subpopulasjoner med visse tilskrives funksjoner og spesifikk vandrende atferd7,8,9. For eksempel i mennesker, kan monocytter deles inn i tre undergrupper basert på deres overflate gjengivelsen av CD14, en coreceptor for bakteriell lipopolysakkarid, og CD16, Fc-gamma reseptoren III. Menneskelige monocytt subpopulasjoner inkluderer klassisk CD14+CD16-, middels CD14+CD16+ og ikke-klassiske CD14dimCD16+ celler6,9. Den klassiske CD14+CD16- monocytter ble vist å være hovedsakelig inflammatorisk mens utvalget av CD16+ monocytter fant kollektivt for å presentere TIE2 uttrykk og proangiogenic funksjonen10. Konsekvent endothelial celle stimulering med inflammatoriske cytokiner som menneskelige tumor nekrose faktor (TNF) α eller interleukin (IL-1) beta (konvensjonelle betennelse) er tilstrekkelig til å utløse komplett rekruttering av klassisk CD14+CD16 - reaksjoner. Men samtidig handlinger av vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) A og TNFα (angiogenic faktorer-drevet betennelse) er påkrevd å provosere transmigration av CD16+ proangiogenic pool av monocytter3. Historisk, tradisjonell Transwell systemet under statisk forhold, parallelle plate flow chamber og μ-slide flyt kamrene har blitt brukt kvantitativt analysere rekruttering av en leukocytter befolkningen på en gang i vitro11 ,12,13. Mens disse protokollene har validert, betraktes en mer robust metode som tillater samtidig analyse av flere monocytt subpopulasjoner mer innsiktsfulle. Slike metoder må konto for flere interaksjoner og ulike frekvenser av hver respektive befolkningen og også gi en mekanistisk forståelse av likheter og særegenheter for rekruttering kaskader som definerer hver monocytt delsett.

Her presenterer vi en metode basert på time-lapse avbilding av monocyte rekruttering under flyt som lar den vandrende kaskader av ulike monocytt subpopulasjoner studier samtidig ved hjelp av AC confocal mikroskopi. Denne metoden integrerer visse kritiske funksjoner som etterligner endothelial celle betennelse, samt hemodynamics i sirkulerende monocytter i post kapillært venules, viktigste plasseringen av leukocytter rekruttering i vivo. Den foreslåtte metoden bruker menneskelige umbilical blodåre endotelceller (HUVEC), som er generert gjennom en veletablert protokoll isolasjon fra menneskelige kontrollkabler. Denne kliniske ressursen har fordelen av å lett tilgjengelig som et biologisk biprodukt, samtidig gir en rimelig avkastning av endotelceller som kan isoleres fra navle venen. Vi brukte også fluorescerende fargestoffer og immunofluorescence for å skille mellom forskjellige cellulære komponenter og AC confocal mikroskopi utvetydig definere monocytt posisjonering (luminal vs. abluminal) over tid. Protokollen presenteres her er utviklet til samtidig måle transmigration nivåer av monocyte subpopulasjoner. Videre bør det bemerkes at denne metodikken kan utvides for å studere andre leukocytter subpopulasjoner og rekrutteringsprosesser ved bruk av forskjellige biomarkers og merking.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Menneskelige materialer ble brukt med samtykke av frivillige donorer og i samsvar med den sveitsiske komiteer på klinisk forskning.

1. isolering og frysing av menneskelig Umbilical vene endotelceller (HUVEC)

  1. Legge til 5 mL belegg løsning en MT75 kolbe (0,1 mg/mL kollagen G og 0,2% gelatin i fosfat bufret saltvann PBS ved pH 7.4) i 30 min på 37 ° C før du starter HUVEC isolasjon.
  2. Rengjør ledningen med PBS, tørk av den med sterilt komprimerer og plassere den i et sterilt 20 cm Petriskål. Skjær endene av ledningen med sterilt saks.
  3. Identifiser enkelt store venen og to små arteriene. Forsiktig inn en kanyle med en tre-veis stopcock knyttet til den i blodåre ekstremitetene på endene på tråden.
  4. Stram ledningen og kanyle tilkoblingen fast med en lengde på ledningen.
  5. Perfuse ledningen to ganger med 20 mL av RPMI medium som inneholder 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin og 250 ng/mL amfotericin B å vaske den ledningen årer. Denne prosessen gjør utseendet av nettledningen hvitere og klarere. Tømme venen før collagenase tillegg ved å samle RPMI med en sprøyte i den ene enden.
  6. Perfuse åre med 12 mL 1 mg/mL collagenase type jeg (0.22 µm-filtrert).
  7. Lukk stopcock på ledningen ender og ruge ledningen på 37 ° C i 12 minutter.
  8. Forsiktig massasje ledningen for å løsne endotelceller fra blodåre lumen.
  9. Ta 30 mL av RPMI som inneholder 10% fosterets kalv serum med en 50 mL sprøyte og koble den ene enden av navlestrengen.
  10. Koble en tom 50 mL sprøyte til den andre enden av navlestrengen
  11. Åpne stopcock og perfuse i venen fra den ene enden mens gjensidige samle fra den andre enden.
    Merk: Samlet suspensjon inneholder endotelceller.
  12. Sentrifuge denne cellen suspensjon på 200 x g i 5 min.
  13. Forkaste nedbryting og resuspend celle pellets med 10 mL av komplett M199 medium (M199 inneholder 20% FCS, 15 µg/mL endothelial cellevekst kosttilskudd 100 µg/mL heparin natrium 0,5 µM hydrocortisone, 10 µg/mL L-askorbinsyre, 100 U/mL penicillin, 100 U/mL Streptomycin og 250 ng/mL amfotericin B).
  14. Fjerne belegg løsningen fra MT75 kolbe og skyll når med PBS.
  15. Frø cellene samles fra trinn 1.13 i MT75 flasken og plassere den i kuvøse på 37 ° C med 5% CO2.
  16. Den neste dagen, skyll kolbe 3 ganger med komplett M199 mediet fjerne gjenværende røde blod celler og deretter endre mediet hver 2 dager før samløpet.
  17. På 80-90% samløpet, skyll HUVEC monolayer en gang med 5 mL PBS og koble cellene med 5 mL av 0,05% trypsin i 1 mM EDTA ved 37 ° C i 5 min. legge 4 mL av M199 og 1 mL av FCS stoppe handlingen trypsin. Tømme flasken for å koble alle HUVEC.
  18. Samle en aliquot av 50 µL brukes til farging av VE-cadherin, PECAM-1 og gp38, og analysere av flowcytometri å sjekke HUVEC renhet.
  19. Samle resten av HUVEC fra trinn 1,18 15 mL tube og sentrifuger 200 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
  20. Forkaste nedbryting fra trinn 1,19 resuspend celle pellet i iskaldt løsning (FCS som inneholder 10% DMSO) på en tetthet på 5 x 105 celler/mL i cryotubes og fryse-80 ° C eller i flytende nitrogen til bruk.
  21. Sjekke HUVEC renhet:
    1. Legge til 1 µL anti-VE-cadherin-FITC antistoff, 1 µL anti-PECAM1-PE antistoff og 1 µL anti-Podoplanin-APC antistoff aliquot av 50 µL av HUVEC samlet på trinn 1,18.
    2. Inkuber ved romtemperatur for 10 min.
    3. Legge til 100 µL PBS og sentrifuger 400 x g for 30 s.
    4. Forkast nedbryting og resuspend i 100 µL av PBS. Data kan nå være kjøpt av flyt cytometri teknikker.
      Merk: HUVEC er positivt for VE-cadherin og PECAM-1, og negative for Podoplanin.

2. HUVEC avriming

Merk: Bruk HUVEC på lav passage for eksperimenter (maksimum 5 passasjer).

  1. Lag en MT75 kolbe med 1 mL av belegg løsning på 37 ° C i 30 min.
  2. Raskt defreeze HUVEC på 37 ° C i 2 minutter og resuspend cellene i 10 mL av fullstendig M199.
  3. Sentrifuge cellene på 200 x g ved romtemperatur for 5 min og kast nedbryting.
  4. Resuspend celle pellet i 10 mL av fullstendig M199.
  5. Overføre celle suspensjon i pre belagt kolbe. Plass kolbe i kuvøse på 37 ° C med 5% CO2. Endre cellen kultur medium hver 2 dager.

3. HUVEC kultur i 0,4 μ-Slide kammer

  1. Fem dager før du starter eksperimentet flyt coat pre kamrene en 0,4 μ-lysbilde med 30 µL av PBS med 0,1 mg/mL kollagen G, 0,2% gelatin på 37 ° C i 30 min.
  2. Vask kamrene med 100 µL av PBS.
  3. Koble cellene fra en 80-90% confluent HUVEC av en MT75 kolbe.
  4. Skyll HUVEC med 5 mL PBS og ta dem med 5 mL 0,05% trypsin ved 37 ° C i 5 minutter.
  5. Flush og samle celle suspensjon i komplett M199 og telle celler ved den mest praktiske metoden. Sentrifuge 200 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
  6. Resuspend celle pellet på 106 celler/mL og distribuere 30 µL (30.000 celler) per kammer.
  7. Inkuber cellene i en inkubator på 37 ° C med 5% CO2 1t.
  8. Legge til 150 µL av komplett M199 hvert kammer og kultur cellene i 5 dager i kuvøse på 37 ° C og 5% CO2. Endre mediet hver 2 dager.

4. HUVEC flekker for Monocyte rekruttering analysen Under flyt

  1. Forberede merking mediet laget av M199 og 1 µM av CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) og varme den ved 37 ° C i 5 minutter før cellen merking.
  2. Vask HUVEC to ganger med M199 medium varme på 37 ° C.
  3. Erstatt medium med 30 µL av varmet merking medium som inneholder 1 µM av CMFDA og plasser i inkubator på 37 ° C og 5% CO2 i 10 min.
  4. Vask en gang med komplett M199 og ruge cellene med fullstendig M199 i kuvøse på 37 ° C og 5% CO2 i 30 min.
    Merk: Det er viktig å fjerne alle spor av serum før addisjon av merking løsningen, ellers kan det endre HUVEC flekker.
  5. Erstatt medium med komplett M199 som inneholder enten menneskelig TNFα (500 U/mL) eller en blanding av menneskelige TNFα (500 U/mL) med menneskelig VEGFA (1 µg/mL) for 6 h i en inkubator på 37 ° C og 5% CO2.

5. isolering av menneskelig Pan monocytter og flekker av subpopulasjoner

  1. Bruke en buffy strøk av konsentrert menneskelig blod, eller 20 mL fersk isolert menneskelig blod, samlet ved eksperimentet i EDTA vacutainer rør.
  2. Fortynne blodet i PBS-1 mM EDTA (1:1) og Pipetter forsiktig 20 mL utvannet blod på den 20 mL tetthet gradert media. Sentrifuge 400 x g i 30 min ved romtemperatur med langsom akselerasjon og uten brems.
  3. Samle perifert blod mononukleære cellen (PBMC)-Platederivert lag (mellom tetthet gradert medier og plasma lag) i en ny 50 mL tube som inneholder 40 mL PBS - 1 mm EDTA. Topp opptil 50 mL med PBS - 1 mM EDTA.
  4. Sentrifuge 200 x g ved romtemperatur for 5 min. forkaste nedbryting.
  5. Resuspend celle pellets med 10 mL flekker buffer (PBS - 1 mM EDTA inneholder 0,5% bovin serum albumin BSA).
  6. Sentrifuge 200 x g ved romtemperatur for 5 min. forkaste nedbryting.
  7. Gjenta 5.5 og 5.6.
  8. Resuspend celle pellets med 10 mL flekker buffer. Ta en aliquot av 10 µL for en celletall.
  9. Sjekk PBMC bestander og telle celler raskt med en flyt cytometer.
    Merk: De karakteristiske lymfocytt og monocytt bestander kan observeres (figur 1A). Fra 50 mL av fersk menneskeblod forventer om 50-100 x 106 PBMC.
  10. For rekruttering av CD14 + versus CD14-PBMC under flyt:
    1. Vask pellet tre ganger med flyt buffer (M199 med 0,5% BSA) og resuspend de mononukleære cellene i flyt buffer på 6 x 106 celler per mL.
    2. Må dele 200 µL for hver analysen. Ruge på 37 ° C til 20 min før analysen.
    3. Legge til 5 µL av anti-CD14-PE og Hoechst 33342 i en endelig konsentrasjon av 2 µM i hver aliquot. Bland og ruge ved 37 ° C i 10 min.
    4. Sentrifuge aliquot på 400 x g for 30 s.
    5. Forkast nedbryting og resuspend pellets med 200 µL flyt bufferen.
  11. For rekruttering av monocyte subpopulasjoner under flyt:
    1. Isolere monocytter med en pan monocytt isolasjon utstyr i henhold til instruksjonene fra produsenten.
      Merk: Følgende isolasjon protokollen er 50 x 106 celler. Den kan skaleres opp eller ned så lenge det er innenfor produsentens anbefalinger.
    2. Sentrifuge PBMC suspensjon på 200 x g ved romtemperatur for 5 min.
    3. Forkast nedbryting og resuspend pellets med 400 µL av flekker buffer.
    4. Legge til 50 µL av Fc-reseptor blokkere reagensen og 50 µL Pan Monocyte antistoff cocktail.
    5. Inkuber ved romtemperatur for 10 min.
    6. Legge til 400 µL av flekker buffer og 100 µL magnetiske perler konjugert anti-biotin antistoff. Inkuber ved romtemperatur i 15 min.
    7. Legg 2 mL flekker bufferen og bruke en Mac LS kombinert med en magnet.
    8. Plasser kolonnen LS på magneten og legge 1 mL av flekker buffer. Kast gjennomflytsenhet.
    9. Pass PBMC suspensjon i kolonnen og samle klare strømmen om inneholder pan monocytter i en ny 15 mL tube.
    10. Legge til farging bufferen til opp til 5 mL.
    11. Ta en aliquot og sjekke kvaliteten på monocytt isolasjon med en flyt cytometer.
    12. Bestemme pan monocytt greven.
      Merk: Bare monocytt befolkningen kan observeres (figur 1B).
    13. Sentrifuge resten av monocytter fra trinn 5.11.11 200 x g i 5 min.
    14. Kast nedbryting.
    15. Resuspend celle pellet i 5 mL av flyt buffer (M199 med 0,5% BSA).
    16. Gjenta 5.11.13 å 5.11.14 to ganger for å fjerne alle spor av EDTA.
  12. Gjøre monocytt suspensjon i flyt buffer (M199 med 0,5% BSA) på 6 x 106 celler/mL.
  13. Må dele 200 µL av monocytter for hver rekruttering analysen.
  14. Hold aliquot på 37 ° C i inkubator til 20 min før injeksjon.
  15. Legge 5 µL av anti-CD16-PE antistoff og Hoechst 33342 (2 µM endelige) til hver aliquot.
  16. Bland og ruge ved 37 ° C i 10 min.
  17. Sentrifuge aliquot på 400 x g for 30 s.
  18. Forkast nedbryting og resuspend pellets med 250 µL flyt bufferen.
  19. Legge til 30 µL av monocyte suspensjon i et kammer til lysbildet å tjene til å angi parameterne oppkjøp på AC confocal mikroskopet.
  20. Holde dele monocytt suspensjon fra trinn 5.18 på 37 ° C.
    Merk: Denne suspensjon er klar til injiseres i flyt systemet.

6. forberedelse av Fluidic

  1. Sikre at cellen inkubator for avbilding satt på 37 ° C.
    Merk: Et diagram av flyt er vist i figur 2.
  2. Montere rør del I: sett Luer kontakt menn til den ene enden av en silikon rør (8 cm lang og 3 mm tykk) og koble den andre enden til en innebygd Luer injeksjon sett. Koble den sistnevnte Luer-kontakten til et stykke silikon rør (40 cm og 3 mm tykk) i den ene enden.
    Merk: En 3-veis kran koblet til en 5 mL sprøyte kan eventuelt settes mellom innebygd Luer injeksjon settet og silikon rør for eventuell luft boble fjerning.
  3. Montere rør del II: koble en 20 mL sprøyte til en ende av en lengde på silikon rør (1 meter lang og 3 mm tykk). Sett inn Luer kontakten han til den andre enden av slangen.
  4. Koble del I og del II slangen ved å sette inn Luer kontakt hannene å en kvinne Luer lås coupler (figur 2A).
  5. Sette gratis slutten av silikon slangen i reservoaret inneholder flyt bufferen (M199 + 0,5% BSA) varmet på 37 ° C.
  6. Trekk på stempelet til 20 mL sprøyte fylle slangen med flyt buffer.
  7. Legg sprøyten på pumpen og sikre den.
  8. Sette pumpen i trekke modus (i motsetning til) og angi flyt.
  9. Kontroller infusjonshastigheten ifølge IBIDI lysbildet brukt ved hjelp av følgende formel:
    Equation
    Merk: Det lysbildet er avhengig av IBIDI lysbildet brukes for eksperimentet. For μ-lysbildet jeg0,4 Luer-lock brukes i dette lysbildet faktoren er 131.6. Hvis lysbildet faktorer, kan du se de selskap nettsted14. Flyt buffer viskositet er 0.0072 dyn.s/cm2. Skjæring stress på de etter kapillært venules handler om 0,5 dyn/cm2.
  10. Koble lysbildet (figur 2B):
    1. Klemme silikon slangen rundt den kvinnelige Luer-Lock Coupler og koble to Luer kontakt menn fra kabelendene.
    2. Koble dem til reservoarene lysbildet som inneholder stimulert HUVEC og fyll med medium. Unngå luftbobler under dette trinnet.
    3. Ta av klemmer og sikre at tilkoblingen ikke lekker.
  11. Plasser lysbildet under mikroskop for tidsinnstilt bildebehandling og starte pumpen.

7. tidsinnstilt bildebehandling av Monocyte rekruttering Under flyt av AC Confocal mikroskopi

  1. Bruker en 40 x mål (se Tabell for materiale) for bildebehandling.
  2. Aktivere 405 nm (blå monocytt kjerner), 488 nm (grønn endotelceller) og 561 nm (røde CD16 + delsett) lasere.
  3. Bruk kammeret som inneholder monocytter for å angi parametere for oppkjøpet.
    Merk: For å oppdage både ikke-transmigrated og transmigrated monocytter, satt pinhole og intensiteten av laser 405 nm høyt. Dermed er ikke-transmigrated monocytter lett synlige i basale planen. Men bare transmigrated monocytter presenterer en unstained kvinne området rundt kjernen tilsvarer den nye plassen okkupert under endotelceller.
  4. Sted kammeret ervervet under mikroskopet.
  5. Velg 3 innen utsikt innen 1 cm radius for multi-posisjon AC confocal bildebehandling.
  6. Definere de basale og apikale sidene av endotelceller
  7. Angi en z-stabel 10-12 µm området (0,5 µm trinn). Kjøre en time-lapse oppkjøpet hver 1 min.
  8. Etter 3 min av imaging, injisere 200 µL av monocyte suspensjon (6 x 106 celler/mL) gjennom innebygd Luer injeksjon port.
    Merk: Raskt monocytter vises i apikale fokalplanet, følge og starte transmigration (transitt fra apikale på basale planen).
  9. Bilde i minst 30 min. Når ferdig, stoppe bildebehandling og stoppe flyten. Klemme slangen for å koble dem fra lysbildet.
  10. Fastsette lysbildet med 4% paraformaldehyde på 4 ° C i 10 min.
  11. Vask lysbildet med PBS og lagre lysbildet på 4 ° C for videre analyse hvis nødvendig.

8. analysere Data med ImageJ

  1. Telle antall totale tilhenger monocytter i hvert felt. Bestemme celletall per mm2.
  2. Telle transmigrated monocytter som er tilstede i den basale planen under endotelceller og identifisert ved tilstedeværelse av et svart hull (i den grønne kanalen) rundt kjernen.
  3. Del antall transmigrated leukocytter av antall tilhenger leukocytter. Transmigration frekvensen vises som en prosentandel av tilhenger monocytter.
  4. For illustrasjon, kan apikale og basale sider vises samtidig å illustrere hendelser som forekommer i hver av disse endothelial avdelinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bestemme tilstanden i HUVEC aktivering av TNFα

Bio-aktiviteten av inflammatoriske cytokin TNFα kan variere avhengig av batchen og repletion av frysing-tining syklus. Det er viktig å sjekk aktivisering rang av HUVEC med TNFα behandling. Dette kan utføres av flekker parallelt noen prøver av confluent HUVEC for inflammatorisk induksjon av selectins, ICAM-1 og VCAM-115,16,17. En enklere og enklere måte å sjekk aktivisering rang av HUVEC etter TNFα behandling morfologiske endringen vises av endotelceller under inflammatorisk stress. Som vist i Figur 3, forlenge HUVEC etter 6-h i nærvær av TNFα i forhold til unstimulated celler. Lignende forlengelse er observert når HUVECs blir stimulert av en blanding av TNFα og VEGFA. Innspillingen aktiviseringen rang av HUVEC er viktig som de endelige resultatene av transmigration av monocytter vil avhenge av kvaliteten på endothelial celle aktivering.

Monocytt transmigration gjør en karakteristisk opphør endotelceller

For å studere monocytt transmigration under flyt, brukte vi AC confocal mikroskopi med endotelceller farget i grønt med CMFDA og kjerner i isolerte monocytter farget i blått med celle-permeable Hoechst 33342 fargestoff (Figur 4). Time-lapse AC confocal avbilding tillatt visualisering av monocytter på apikale flyet, hvor deres fenotypen kan være vurdert (figur 4A-C, ekstra film 1). Migrere cellene gjennomgår transmigration flyttet til intercellulære plass tilsvarende celle-celle veikryss før de forsvant fra apikale flyet og dukket opp i basale flyet. Transmigrated cellene presentert et sort hull rundt kjernen tilsvarer monocytt figurene. Denne figuren stadig endres under monocytt overføring under endotelceller (figur 4A-C, supplerende filmer 2-3). Denne dynamiske svart hull gjort av monocyte kroppen under endotelceller og monocytt plasseringen, tillatt for entydig identifikasjon av transmigrated celler. Kvantifisering av monocyte rekruttering over tid viste monocytt vedheft etterfulgt av transmigration (Figur 4 d-E). Selv om leukocytter kan extravasate gjennom både transcellular og paracellular ruter, kan vi bare observere paracellular transmigration under flyt med denne metoden. Dette er i tråd med våre tidligere observasjoner3,11,18,19.

Angiogenic faktoren drevet betennelse fremmer transmigration av CD16 + monocytter

På denne måten, analyserte vi transmigration av menneskelig proangiogenic versus ikke-angiogenic monocytter gjennom en endotelial monolayer stimulert av inflammatoriske cytokin TNFα alene eller i kombinasjon med angiogenic faktor VEGFA. Menneskelige proangiogenic monocytter kan identifiseres ved uttrykk for CD16 eller TIE2 på overflaten deres. Her, ble anti-CD16-PE antistoff brukt til å skille mellom pro - og ikke-angiogenic monocytter. Som vist i figur 5A-B (supplerende filmer 4-5), transmigration frekvensen av CD16+ monocytter var lav da endotelceller ble stimulert med TNFα bare. Men dette økt når endotelceller ble stimulert samtidig med TNFα og VEGFA (figur 5C-E, supplerende filmer 6-7). Transmigration rate av ikke-angiogenic monocytter var tilsvarende høyt under begge inflammatoriske tilstander. For begge celle subpopulasjoner oppstod transmigration eksklusivt gjennom paracellular ruten. Denne metoden kan derfor transmigration aptitudes for ulike monocytic befolkningsgrupper undersøkes samtidig.

Renheten av monocytter påvirker transmigration effektiviteten

Perifert blod mononukleære celler består av T-celler, B celler, NK celler og monocytter. Metoden for monocytt-isolasjon brukes her krever uttømming av andre leukocytter befolkningen fra PBMC. For å forstå hvordan mangel på monocytt renhet påvirker resultatene, vi brukte PBMCs og farget for pan-monocytter med et anti-CD14-PE antistoff før du utfører rekruttering analysen under flyt. Som vist i figur 6, indusert HUVEC stimulering med TNFα eller TNFα + VEGFA transmigration av bare monocytt befolkningen. De andre leukocytter består av T-celler, B celler og celler NK transmigrate ikke TNFα eller TNFα + VEGFA. Faktisk er det dokumentert at disse leukocytter trenger andre signaler for transmigration. Dermed vil en ineffektiv isolering av monocytter føre til en undervurdering av monocyte transmigration, som de andre leukocytter ville bli regnet som monocytter. Dette vil føre til et feilaktig resultat på monocytt transmigration, på grunn av forurensning av monocyte befolkningen med andre leukocytter.

Figure 1
Figur 1: profilering av isolerte monocytter av flowcytometri. (A) analyse av morfologi av PBMC før lymfocytt uttømming. Størrelsen (fremover scatter: FSC) og tetthet (siden scatter: SSC) av perifert blod mononukleære celler ble fastsatt av flowcytometri. (B) størrelse og detaljene for isolert monocytter ble fastsatt av flowcytometri etter lymfocytt uttømming. En effektiv isolasjon av monocytter viser en komplett uttømming av lymfocytt befolkningen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Diagram av fluidic systemet. (A) skjematisk oversikt over perfusjon systemet før og etter tilkobling av lysbildet og montering på sprøytepumpen. (B) Diagram av prosessen med å koble lysbildet med slangen ved hjelp av klemmer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: sjekke effektiv aktivering av endotelceller. Aktivering av HUVEC av inflammatoriske stimuli ble sjekket ved å analysere celle figuren ved hjelp fase kontrast mikroskopi. Etter 6 timer av behandlingen, HUVEC presenterer en langstrakt morfologi ved stimulering med TNFα (500 U/mL) eller en blanding av TNFα (500 U/mL) + VEGFA (1 µg/mL) sammenlignet med unstimulated celler. Denne morfologiske HUVEC etter inflammatorisk stimulering er lett å oppdage indikator for celle aktivering, som bør sikres for flyt analysen. Skala bar = 120 µm Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Identifikasjon av transmigrated monocytter av AC confocal mikroskopi. (A) Diagram av monocyte transmigration med forventet visninger på apikale og basal fly. Kjerner av monocytter med Hoechst 33342 vises i blått, og teoretisk figurene av monocytter vises med stiplede linjer rundt kjerner. I visningen basale vises de transmigrated flat monocytter opptar en plass under endothelial celle. Dette området vises som et sort hull rundt monocytt kjernen på AC confocal bilder. (B) lokalisering av en monocytt før og etter transmigration. Visningene ortogonale vises, og utseendet til et svart hull (avgrenset med hvite stiplede linjen) kan observeres etter monocytt overføring endotelial abluminal rommet. En rød pilspiss angir plasseringen av en monocytt før transmigration og hvit pilspissen angir samme celle etter transmigration. Visningene ortogonale viser at den transmigrated monocytt under på endothelial celle. Skala bar = 40 µm. (C) Time-lapse bildesekvenser (fra 0 til 20 min) monocytt rekruttering overtid. Visningene apikale og basale vises. Full sekvenser kan sees i flere filmer 1, 2 og 3. Røde firkanter markere en transmigrated monocytt med en blå kjerne. Det svarte hullet tilsvarer flat kroppen av monocyte under endothelial celle er preget av en gul prikkelinje. Skala bar = 40 µm. (D) kvantifisering av monocyte vedheft til TNFα-stimulert versus unstimulated HUVEC over tid. (E) kvantifisering av monocyte transmigration over tid. N = 3 biologiske gjentak. Dataene presenteres som gjennomsnittlig ± SD Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: samtidige undersøkelse av transmigration av monocyte subpopulasjoner under flyt. (A) Time-lapse bildesekvenser (fra 0 til 20 min) av rekrutteringen av proangiogenic monocytter (CD16+) og ikke-angiogenic monocytter over tid gjennom TNFα-aktivert HUVEC. Skala bar = 40 µm; visningene apikale og basale vises. Full sekvenser kan sees i ekstra film 4 for apikale og supplerende film 5 for basale visninger. (B) kvantifisering av transmigration av menneskelig proangiogenic monocytter (HPMo: CD16 +) og menneskelige ikke-angiogenic monocytter (HNMo) gjennom en TNFα-aktivert HUVEC monolayer. N = 4 biologiske gjentak, data presenteres som gjennomsnittlig ± SD * p < 0,05; Mann-Whitney test. (C) Time-lapse bilde sekvenser (fra 0 til 20 min) av rekrutteringen av proangiogenic og ikke-angiogenic monocytter overtid gjennom TNFα + VEGFA-aktivert HUVEC. Skala bar = 40 µm; visningene apikale og basale vises. Full sekvenser kan sees i ekstra film 6 for apikale og supplerende film 7 for basale visninger. (D) kvantifisering av transmigration av menneskelig proangiogenic monocytter (HPMo: CD16 +) og menneskelige ikke-angiogenic monocytter (HNMo: CD16-) gjennom TNFα + VEGFA-aktivert HUVEC monolayer. N = 4 biologiske gjentak, data presenteres som gjennomsnittlig ± SD * p < 0,05; Mann-Whitney test. (E) lokalisering av CD16+ monocytter før (10 min) og etter (15 min) transmigration gjennom TNFα + VEGFA-stimulert HUVEC. Visningene ortogonale vises. Skala bar = 40 µm Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Samtidige gransking av transmigration av CD14 + versus CD14 - PBMC under flyt. (A) vedheft av CD14+versus CD14- PBMC til TNFα-aktivert HUVEC under flyt. (B) vedheft av CD14+versus CD14- PBMC til TNFα + VEGFA-aktivert HUVEC under flyt. (C) Transmigration rate (%) av CD14+versus CD14- PBMC gjennom TNFα-aktivert HUVEC under flyt. (D) Transmigration rate (%) av CD14+versus CD14- PBMC gjennom TNFα + VEGFA-aktivert HUVEC under flyt. Data er gjennomsnittlig ± SD N = 4 biologiske gjentak. * p < 0,05; Mann-Whitney test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Ekstra film 1: visning på apikale flyet av pan-monocytt rekruttering under flyt. Utvidet visning av rekruttering av pan monocytt under flyt på apikale flyet. HUVEC var farget med CMFDA og kjerner av monocytter var live-farget med Hoechst 33342. Skala bar = 50 µm Klikk her for å laste ned denne filen.

Ekstra Movie 2: visning på basale flyet av pan-monocytt rekruttering under flyt. Utvidet visning av rekruttering av pan monocytt under flyt på basale flyet. HUVEC var farget med CMFDA og kjerner av monocytter var live-farget med Hoechst 33342. Skala bar = 50 µm Klikk her for å laste ned denne filen.

Ekstra Movie 3: maksimal projeksjon av z-stabler av pan-monocytt rekruttering under flyt. Utvidet visning av rekruttering av pan monocytt under flyt som vist i supplerende filmer 1 og 2. HUVEC var farget med CMFDA og kjerner av monocytter var live-farget med Hoechst 33342. Skala bar = 50 µm Klikk her for å laste ned denne filen.

Ekstra film 4: visning på apikale flyet av rekrutteringen av monocyte subpopulasjoner til TNFα-aktivert HUVEC. Utvidet visning på apikale flyet av samtidige rekrutteringen av monocyte subpopulasjoner under flyt til TNFα-aktivert HUVEC under flyt. HUVEC var farget med CMFDA og kjerner av monocytter var live-farget med Hoechst 33342. Menneskelige proangiogenic monocytt subpopulasjoner ble identifisert av overflaten uttrykk for CD16. Skala bar = 30 µm. Klikk her for å laste ned denne filen.

Ekstra film 5: visning på basale flyet av rekrutteringen av monocyte subpopulasjoner til TNFα-aktivert HUVEC. Utvidet Vis på basale flyet, samtidig rekruttering av monocyte subpopulasjoner under strømme til TNFα-aktivert HUVEC under flyt. HUVEC var farget med CMFDA og kjerner av monocytter var live-farget med Hoechst 33342. Den menneskelige proangiogenic monocytt (HPMo) subpopulasjon ble identifisert av overflaten uttrykk for CD16. Skala bar = 30 µm. Klikk her for å laste ned denne filen.

Ekstra film 6: visning på apikale flyet av rekrutteringen av monocyte subpopulasjoner til TNFα+ VEGFA-aktivert HUVEC. Utvidet visning, på apikale flyet, samtidig rekruttering av monocyte subpopulasjoner under strømme til TNFα + VEGFA-aktivert HUVEC under flyt. HUVEC var farget med CMFDA og kjerner av monocytter var live-farget med Hoechst 33342. Den menneskelige proangiogenic monocytt subpopulasjon ble identifisert av overflaten uttrykk for CD16. Skala bar = 30 µm Klikk her for å laste ned denne filen.

Ekstra film 7: visning på basale flyet av rekrutteringen av monocyte subpopulasjoner til TNFα+ VEGFA-aktivert HUVEC. Utvidet Vis på basale flyet, samtidig rekruttering av monocyte subpopulasjoner under strømme til TNFα + VEGFA-aktivert HUVEC under flyt. HUVEC var farget med CMFDA og kjerner av monocytter var live-farget med Hoechst 33342. Den menneskelige proangiogenic monocytt (HPMo) subpopulasjon ble identifisert av overflaten uttrykk for CD16. Skala bar = 30 µm Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her rapporterer vi en metode detaljering en studie av hvordan monocytt subpopulasjoner transmigrate gjennom den betente endotelial monolayer. Metoden diskutert brukt AC confocal mikroskopi i stedet for fase kontrast mikroskopi, som også brukes til å studere monocytt rekruttering under flyt3,11,19. En stor fordel ved å bruke AC confocal mikroskopi tidsinnstilt bildebehandling er muligheten til å entydig forskjellsbehandle transmigration og sterk vedheft av monocytter. Om kontrast mikroskopi-basert metode er også robust, krever det kompetanse for å unngå å blande opp transmigrated cellene og sterkt tilhenger. I dette tilfellet må etablere strenge kriterier for analyse for å gjøre en klar forskjell mellom disse to statene monocytt rekruttering cascade. I tillegg er det også viktig å utføre en endepunktet analyse av AC confocal mikroskopi for å bekrefte de globale trendene observert av kontrast mikroskopi. Dermed gir direkte bruk av AC confocal mikroskopi undersøke monocytt rekruttering under flyt klare resultater på faktiske transmigration status fanget monocytter.

En av de store flaskehalsene utføre leukocytter rekruttering Søk under flyt og bruke en kontrast mikroskopet er tid brukt å utføre analyse og spore individuelle celler fra fangst til transmigration gjennom celle-celle krysset. Automatisering av slike analyser er mulig men vanskelig å utføre på grunn av kontrast likheter mellom gjennomgang og transmigrated monocytter. Her viser vi ved hjelp av AC confocal mikroskopi at monocytt transmigration ble ledsaget av en seponering av endothelial celle farging i basale flyet tilsvarer figuren av de transmigrated monocytter under HUVEC. Denne plasseringen ble bekreftet av orthogonal projeksjon. Overgangen av monocyte lokalisering oppstod utelukkende mellom celle-celle veikryss antyder en paracellular transmigration. Dette er i tråd med våre tidligere data, som viste at under flyt i vitro, monocytter transmigrate eksklusivt gjennom paracellular rute med HUVEC3,18. For å utfylle metoden foreslått her, er det mulig å bruke ikke-blokkerende antistoffer mot junctional proteiner som VE-cadherin, syltetøy eller PECAM1 for å bilde av potensielle områder av monocyte transmigration (paracellular vs. transcellular). Vi har bekreftet at svart figurene rundt monocytt kjerner er en robust karakteristikk av transmigrated celler og en enkelt hendelse som kan oppdages av programvare. Selv om en manuell celle teller systemet er vist her, er svart figur dannelsen rundt leukocytter kjernen et vilkår som kan brukes til å definere leukocytter transmigration i automatisk analyse, sparer mye tid. Vi arbeider for tiden på å utvikle et automatisert program for Slike analyser.

Fluorescens og AC confocal mikroskopi ble tidligere brukt i studiet av leukocytter rekruttering. Men ble de ikke brukt å undersøke rekruttering av ulike subpopulasjoner samtidig. Her foreslår vi en modalitet bruk av AC confocal mikroskopi rekruttering av leukocytter subtyper samtidig i den samme microenvironment. Vi viser at AC confocal mikroskopi kan brukes til å undersøke samtidig vandrende oppførsel av ulike monocytt subpopulasjoner. Som et eksempel, har vi brukt CD16 uttrykket for å skille mellom proangiogenic og ikke-angiogenic monocytter for å studere transmigration kapasitet av to subpopulasjoner i ulike inflammatoriske sammenhenger. Samsvar med våre siste publikasjon, ved hjelp av AC confocal mikroskopi modalitet, vi har vist at transmigration frekvensen av CD16+ monocytter var lavere når endothelial celle monolayer ble stimulert bare ved TNFα3. Kombinasjonen av TNFα og VEGFA førte til en økning i transmigration av proangiogenic monocytter. Den transmigration var tilsvarende høy for ikke-angiogenic CD16- monocytter under begge inflammatoriske tilstander. Vi har tidligere vist at monocytt farging med anti-CD16 antistoffer ikke presentere noen betydelig effekt på transmigration, bekrefter dette ved analyse av umerkede monocytter etter transmigration analysen, med AC confocal mikroskopi3. Imidlertid nye leukocytter subtyper eller antistoffer brukes til å merke dem, må merking effekten vurderes. Bruker denne metoden, kan opp til tre forskjellige populasjoner av leukocytter samtidig studeres. Dette kan være subpopulasjoner som er funksjonelt forskjellige eller lignende immun celletyper. Selv om Hovedvekten er på monocytt transmigration, kan også andre trinn av rekruttering analyseres på denne måten, inkludert celle atferd før transmigration, for eksempel fangst og migrational retningen. Etter transmigration hendelser som abluminal oppbevaring og omvendt transmigration kan også undersøkes for ulike leukocytter populasjoner, som en forlengelse av denne metoden. En begrensning er dårlig påvisning av den flekker i langt rødt kanalen i tidsinnstilt bildebehandling, samt noen overspill fluorescens signaler som reduserer z stabel oppløsningen. Dette skyldtes hovedsakelig på apparatet brukes for AC confocal bildebehandling. Bruk av bildet deconvolution kunne til slutt hjelpe å forbedre bildekvaliteten og tillate videre analyse av de ulike trinnene av leukocytter rekruttering.

For å studere leukocytter rekruttering under optimale forhold, er det viktig å sjekke aktiviseringen rang av endothelial celle monolayer. Faktisk fører en mangelfull aktivering av endotelceller til en global reduksjon i monocytt vedheft og transmigration. Endothelial celle aktivering kan kontrolleres ved å analysere hvilket uttrykk for vedheft molekyler på endothelial celleoverflaten som ICAM1 og VCAM1. Nivået på disse vedheft molekyler må økes sammenlignet unstimulated endotelceller. Hvis ingen endring er i disse endothelial vedheft molekyler, kultivert HUVEC kan betraktes som ikke aktivert. Vurdere hvilket uttrykk for vedheft molekyler kan utgjøre en god kvantitative kontroll mellom forskjellige eksperimenter ved hjelp av den samme gruppen av HUVEC. Men kan hvilket uttrykk disse vedheft molekyler også variere mellom forskjellige primære kultur av endotelceller begrense hensynet til en global grense for ICAM1 eller VCAM1. Endringen i form av macrovascular endotelceller som HUVEC er også en god indikator for aktivisering. Denne siste endringen i fenotypen tillater en rask og kvalitativ vurdering av HUVEC aktivisering. Men kan analyse av vedheft molekyler være et bedre valg for mikrovaskulær celler som ikke viser stor form-endring ved aktivering med inflammatoriske cytokiner.

For mekanistisk studier, kan relevante negative kontroller av monocyte transmigration utføres ved hjelp av antistoffer mot endothelial vedheft molekyler som ICAM1, VCAM1 eller på leukocytter overflaten som leukocytter funksjon-assosiert Antigen (LFA) -1. Bruk av en relevant negativ kontroll er viktig for slike mekanistisk studier i monocytter som de uttrykker Fc-reseptorer på deres cellen overflater. Renheten av monocytter etter isolasjon er også viktig, for å unngå forurensning av andre leukocytter befolkninger og en undervurdering av frekvensen av monocyte transmigration. En annen viktig parameter er temperaturen, som må angis på 37 ° C for alle analyser for å sikre at alle eksperimentelle observasjoner er relevante og oversette tilsvarende til menneskelig i vivo celle menneskehandel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Paul Bradfield for manuskript leser og tilbakemeldinger. A. S. mottatt økonomisk støtte fra det Sir Jules Thorn veldedige oversjøiske stoler Reg.,

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tissue Culture Flasks 75 cm2 TPP 90076 Routine culture of isolated HUVEC
µ-Slide VI 0.4 IBIDI 80606
Centrifuge Tubes 15 mL TPP 191015
Centrifuge Tubes 50 mL TPP 191050
Collagen G Biochrom L 7213 For coating of cell culture flasks
Gelatin Sigma-Aldrich 1393 For coating of cell culture flasks
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (without MgCl2 and CaCl2) Sigma-Aldrich D8537
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (with MgCl2 and CaCl2) Sigma-Aldrich D8662
RPMI-1640 Medium Sigma-Aldrich R8758
3-Way Stopcocks BIO-RAD 7328103
penicillin 10,000 μ/mL streptomycine 10,000 μg/mL fungizone 25 μ/mL AMIMED 4-02F00-H
Collagenase type 1 Worthington LS004216
Medium 199 1x avec Earle's salts, L-Glutamine, 25 mM Hepes GIBCO 22340020
Bovine Albumin Fraction V ThermoFisher 15260037
Endothelial Cell Growth Supplement, 150 mg Millipore 02-102
Heparin Sodium Sigma-Aldrich H3149RT
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H6909
L-Ascorbic acid Sigma-Aldrich A 4544
EDTA disodium salt dihydrate C10H14N2Na2O8 · 2H2O APPLICHEM A2937.0500
CD144 (VE-Cadherin), human recombinant clone: REA199, FITC Miltenyi Biotech 130-100-713 AB_2655150
CD31-PE antibody, human recombinant clone: REA730, PE Miltenyi Biotech 130-110-807 AB_2657280
Anti-Podoplanin-APC, human recombinantclone: REA446, APC Miltenyi Biotech 130-107-016 AB_2653263
BD Accuri C6 Plus BD Bioscience
µ-Slide I Luer IBIDI 80176
CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) ThermoFisher C2925
Recombinant human TNFα Peprotech 300-01A
Recombinant human VEGFA Peprotech 100-20
NE-1000 Programmable Syringe Pump KF Technology NE-1000
Ficoll Paque Plus GE Healthcare 17-1440-02
Anti-human CD14-PE, human recombinant clone: REA599, PE Miltenyi Biotech 130-110-519 AB_2655051
Pan Monocyte Isolation Kit, human Miltenyi Biotech 130-096-537
Anti-human CD16-PE, human recombinant clone: REA423, PE Miltenyi Biotech 130-106-762 AB_2655403
LS columns Miltenyi Biotech 130-042-401
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotech 130-090-976
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate ThermoFisher H1399
Silicone tubing IBIDI 10841
Elbow Luer Connector IBIDI 10802
Female Luer Lock Coupler IBIDI 10823
Luer Lock Connector Female IBIDI 10825
In-line Luer Injection Port IBIDI 10820
Ar1 confocal microscope Nikon
40x objective Nikon 40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correction 0-2mm
ImageJ Software NIH

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Auffray, C., Sieweke, M. H., Geissmann, F. Blood Monocytes: Development, Heterogeneity, and Relationship with Dendritic Cells. Annual Review of Immunology. 27 (1), 669-692 (2009).
  2. De Palma, M., Venneri, M. A., Roca, C., Naldini, L. Targeting exogenous genes to tumor angiogenesis by transplantation of genetically modified hematopoietic stem cells. Nature Medicine. 9 (6), 789-795 (2003).
  3. Sidibe, A., et al. Angiogenic factor-driven inflammation promotes extravasation of human proangiogenic monocytes to tumours. Nature Communications. 9 (1), 355 (2018).
  4. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Review Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
  5. Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte Migration into Inflamed Tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
  6. Cros, J., et al. Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors. Immunity. 33 (3), 375-386 (2010).
  7. Geissmann, F., Jung, S., Littman, D. R. Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties. Immunity. 19 (1), 71-82 (2003).
  8. Chamorro, S., et al. In vitro differentiation of porcine blood CD163− and CD163+ monocytes into functional dendritic cells. Immunobiology. 209 (1-2), 57-65 (2004).
  9. Passlick, B., Flieger, D., Ziegler-Heitbrock, H. Identification and characterization of a novel monocyte subpopulation in human peripheral blood. Blood. 74 (7), (1989).
  10. Venneri, M. A., et al. Identification of proangiogenic TIE2-expressing monocytes (TEMs) in human peripheral blood and cancer. Blood. 109 (12), 5276-5285 (2007).
  11. Bradfield, P. F., et al. JAM-C regulates unidirectional monocyte transendothelial migration in inflammation. Blood. 110 (7), 2545-2555 (2007).
  12. Schenkel, A. R., Mamdouh, Z., Muller, W. A. Locomotion of monocytes on endothelium is a critical step during extravasation. Nature Immunology. 5 (4), 393-400 (2004).
  13. Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. Kinetics of the different steps during neutrophil migration through cultured endothelial monolayers treated with tumour necrosis factor-alpha. Journal Vascular Research. 36 (6), 477-485 (1999).
  14. ibidi GmbH. Shear Stress and Shear Rates for ibidi µ-Slides - Based on Numerical Calculations. , (2014).
  15. Yang, L., Froio, R. M., Sciuto, T. E., Dvorak, A. M., Alon, R., Luscinskas, F. W. ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow. Blood. 106 (2), 584-592 (2005).
  16. Yang, C. -R., Hsieh, S. -L., Ho, F. -M., Lin, W. -W. Decoy receptor 3 increases monocyte adhesion to endothelial cells via NF-kappa B-dependent up-regulation of intercellular adhesion molecule-1, VCAM-1, and IL-8 expression. Journal of Immunology. 174 (3), Baltimore, Md. 1647-1656 (2005).
  17. Wong, D., Dorovini-Zis, K. Expression of vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) by human brain microvessel endothelial cells in primary culture. Microvascular Research. 49 (3), 325-339 (1995).
  18. Bradfield, P. F., Nourshargh, S., Aurrand-Lions, M., Imhof, B. A. JAM family and related proteins in leukocyte migration (Vestweber series). Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 27 (10), 2104-2112 (2007).
  19. Bradfield, P. F., et al. Divergent JAM-C Expression Accelerates Monocyte-Derived Cell Exit from Atherosclerotic Plaques. PLoS One. 11 (7), e0159679 (2016).

Tags

Immunologi og infeksjon problemet 141 leukocytter menneskehandel monocyte rekruttering betennelse timelapse tenkelig AC confocal mikroskopi vedheft transmigration monocyte subpopulasjoner chemokines integrins vedheft molekyler
Samtidige studie av rekrutteringen av Monocyte subpopulasjoner Under flyt In Vitro
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ropraz, P., Imhof, B. A., Matthes,… More

Ropraz, P., Imhof, B. A., Matthes, T., Wehrle-Haller, B., Sidibé, A. Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro. J. Vis. Exp. (141), e58509, doi:10.3791/58509 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter