Her presenterer vi en integrert protokoll som måler monocytt subpopulasjon smugling under flyt i vitro ved bruk av bestemte overflate markører og AC confocal fluorescens mikroskopi. Denne protokollen kan brukes å utforske sekvensiell rekruttering trinn også om profil andre leukocytter subtyper med andre spesifikke overflate markører.
Rekruttering av monocytter fra blodet til målrettet perifere vev er avgjørende for inflammatorisk prosessen under tissue skade, tumor utvikling og autoimmune sykdommer. Dette er tilrettelagt gjennom en fange fra fri flyt på luminal overflaten av aktivert endotelceller, etterfulgt av folkevandring vedheft og transendothelial (transmigration) i det underliggende berørte vev. Men er mekanismer som støtter fortrinnsrett og kontekst-avhengige rekruttering av monocyte subpopulasjoner fortsatt ikke fullt ut forstått. Derfor har vi utviklet en metode der rekruttering av ulike monocytt subpopulasjoner samtidig visualisert og målt under flyt. Denne metoden, basert på tidsinnstilt AC confocal bildebehandling, gjør entydig skillet mellom tilhenger og transmigrated monocytter. Her beskriver vi hvordan denne metoden kan brukes samtidig studere rekruttering kaskade av pro-angiogenic og ikke-angiogenic monocytter i vitro. Denne metoden kan videre utvides for å studere de ulike trinnene i rekrutteringen av opptil tre monocytt populasjoner.
Monocytter utgjør en phagocytic komponent i medfødt immunitet som er nødvendig for å bekjempe patogener, rydde opp skadet vev og angiogenese i Patofysiologien ved mange sykdommer, inkludert kreft1,2,3 . Monocytter er Ben margtransplantasjon-avledet celler består av heterogene subpopulasjoner som sirkulerer i blodet, men kan bli rekruttert til området av betennelse i perifere vev gjennom bestemte molekylære mekanismer. Rekruttering kaskader av monocytter, som leukocytter, impliserer fremgangsmåten inkludert fange, rullende, krypende, arrestasjon, transendothelial overføring (transmigration) og overføring gjennom fartøyet veggen (kjelleren membran og veggmaleri celler)4. Disse trinnene omfatter hovedsakelig betennelse-indusert molekyler på endothelial luminal overflaten som selectins, glykoprotein ligander, chemokines, junctional og intercellulær adhesjon molekyler og deres reseptorer på leukocytter som selectin ligander og integrins. Menneskehandel veier gjennom enten endothelial celle veikryss (paracellular) eller via endothelial celle kroppen (transcellular) kan brukes av leukocytter for å krysse endothelial barriere5. Mens monocytter historisk dokumentert for å transmigrate gjennom transcellular ruten, er potensielle forskjeller i deres vandrende veien foreslått som monocytter er ikke lenger ansett som en homogen celle befolkningen. Nå blir det klart at monocytt mangfold kan defineres av hver av sine fellestrekk og ulikheter, med hensyn til deres karakteristiske bloduttredelse kaskader3,6. Derfor for å entydig forskjellsbehandle monocytt subpopulasjoner, er det avgjørende å visualisere og fenotypen virkemåten til hver av disse forskjellige subpopulasjoner under rekruttering behandle.
Monocytter fra menneske, gris, rotte og mus var inndelt i fenotypiske subpopulasjoner med visse tilskrives funksjoner og spesifikk vandrende atferd7,8,9. For eksempel i mennesker, kan monocytter deles inn i tre undergrupper basert på deres overflate gjengivelsen av CD14, en coreceptor for bakteriell lipopolysakkarid, og CD16, Fc-gamma reseptoren III. Menneskelige monocytt subpopulasjoner inkluderer klassisk CD14+CD16–, middels CD14+CD16+ og ikke-klassiske CD14dimCD16+ celler6,9. Den klassiske CD14+CD16– monocytter ble vist å være hovedsakelig inflammatorisk mens utvalget av CD16+ monocytter fant kollektivt for å presentere TIE2 uttrykk og proangiogenic funksjonen10. Konsekvent endothelial celle stimulering med inflammatoriske cytokiner som menneskelige tumor nekrose faktor (TNF) α eller interleukin (IL-1) beta (konvensjonelle betennelse) er tilstrekkelig til å utløse komplett rekruttering av klassisk CD14+CD16 – reaksjoner. Men samtidig handlinger av vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) A og TNFα (angiogenic faktorer-drevet betennelse) er påkrevd å provosere transmigration av CD16+ proangiogenic pool av monocytter3. Historisk, tradisjonell Transwell systemet under statisk forhold, parallelle plate flow chamber og μ-slide flyt kamrene har blitt brukt kvantitativt analysere rekruttering av en leukocytter befolkningen på en gang i vitro11 ,12,13. Mens disse protokollene har validert, betraktes en mer robust metode som tillater samtidig analyse av flere monocytt subpopulasjoner mer innsiktsfulle. Slike metoder må konto for flere interaksjoner og ulike frekvenser av hver respektive befolkningen og også gi en mekanistisk forståelse av likheter og særegenheter for rekruttering kaskader som definerer hver monocytt delsett.
Her presenterer vi en metode basert på time-lapse avbilding av monocyte rekruttering under flyt som lar den vandrende kaskader av ulike monocytt subpopulasjoner studier samtidig ved hjelp av AC confocal mikroskopi. Denne metoden integrerer visse kritiske funksjoner som etterligner endothelial celle betennelse, samt hemodynamics i sirkulerende monocytter i post kapillært venules, viktigste plasseringen av leukocytter rekruttering i vivo. Den foreslåtte metoden bruker menneskelige umbilical blodåre endotelceller (HUVEC), som er generert gjennom en veletablert protokoll isolasjon fra menneskelige kontrollkabler. Denne kliniske ressursen har fordelen av å lett tilgjengelig som et biologisk biprodukt, samtidig gir en rimelig avkastning av endotelceller som kan isoleres fra navle venen. Vi brukte også fluorescerende fargestoffer og immunofluorescence for å skille mellom forskjellige cellulære komponenter og AC confocal mikroskopi utvetydig definere monocytt posisjonering (luminal vs. abluminal) over tid. Protokollen presenteres her er utviklet til samtidig måle transmigration nivåer av monocyte subpopulasjoner. Videre bør det bemerkes at denne metodikken kan utvides for å studere andre leukocytter subpopulasjoner og rekrutteringsprosesser ved bruk av forskjellige biomarkers og merking.
Her rapporterer vi en metode detaljering en studie av hvordan monocytt subpopulasjoner transmigrate gjennom den betente endotelial monolayer. Metoden diskutert brukt AC confocal mikroskopi i stedet for fase kontrast mikroskopi, som også brukes til å studere monocytt rekruttering under flyt3,11,19. En stor fordel ved å bruke AC confocal mikroskopi tidsinnstilt bildebehandling er muligheten til å entydig forskjellsbehandle tra…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Paul Bradfield for manuskript leser og tilbakemeldinger. A. S. mottatt økonomisk støtte fra det Sir Jules Thorn veldedige oversjøiske stoler Reg.,
Tissue Culture Flasks 75 cm2 | TPP | 90076 | Routine culture of isolated HUVEC |
µ-Slide VI 0.4 | IBIDI | 80606 | |
Centrifuge Tubes 15 mL | TPP | 191015 | |
Centrifuge Tubes 50 mL | TPP | 191050 | |
Collagen G | Biochrom | L 7213 | For coating of cell culture flasks |
Gelatin | Sigma-Aldrich | 1393 | For coating of cell culture flasks |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (without MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (with MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
3-Way Stopcocks | BIO-RAD | 7328103 | |
penicillin 10000 u/ml streptomycine 10000 ug/ml fungizone 25 ug/ml | AMIMED | 4-02F00-H | |
Collagenase type 1 | Worthington | LS004216 | |
Medium 199 1X avec Earle's salts, L-Glutamine, 25 mM Hepes | GIBCO | 22340020 | |
Bovine Albumin Fraction V | ThermoFisher | 15260037 | |
Endothelial Cell Growth Supplement, 150mg | Millipore | 02-102 | |
Heparin Sodium | Sigma-Aldrich | H3149RT | |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H6909 | |
L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A 4544 | |
EDTA disodium salt dihydrate C10H14N2Na2O8 · 2H2O | APPLICHEM | A2937.0500 | |
CD144 (VE-Cadherin), human recombinant clone: REA199, FITC | Miltenyi Biotech | 130-100-713 | AB_2655150 |
CD31-PE antibody, human recombinant clone: REA730, PE | Miltenyi Biotech | 130-110-807 | AB_2657280 |
Anti-Podoplanin-APC, human recombinantclone: REA446, APC | Miltenyi Biotech | 130-107-016 | AB_2653263 |
BD Accuri C6 Plus | BD Bioscience | ||
µ-Slide I Luer | IBIDI | 80176 | |
CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) | ThermoFisher | C2925 | |
Recombinant human TNFα | Peprotech | 300-01A | |
Recombinant human VEGFA | Peprotech | 100-20 | |
NE-1000 Programmable Syringe Pump | KF Technology | NE-1000 | |
Ficoll Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
Anti-human CD14-PE, human recombinant clone: REA599, PE | Miltenyi Biotech | 130-110-519 | AB_2655051 |
Pan Monocyte Isolation Kit, human | Miltenyi Biotech | 130-096-537 | |
Anti-human CD16-PE, human recombinant clone: REA423, PE | Miltenyi Biotech | 130-106-762 | AB_2655403 |
LS columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotech | 130-090-976 | |
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | ThermoFisher | H1399 | |
Silicone tubing | IBIDI | 10841 | |
Elbow Luer Connector | IBIDI | 10802 | |
Female Luer Lock Coupler | IBIDI | 10823 | |
Luer Lock Connector Female | IBIDI | 10825 | |
In-line Luer Injection Port | IBIDI | 10820 | |
Ar1 confocal microscope | Nikon | ||
40X objective | Nikon | 40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correction 0-2mm | |
ImageJ Software | NIH |