Summary
Transcranial प्रत्यक्ष वर्तमान उत्तेजना (tDCS) एक चिकित्सीय तकनीक मनोरोग रोगों के इलाज के लिए प्रस्तावित है । एक पशु मॉडल विशिष्ट जैविक tDCS द्वारा पैदा परिवर्तन को समझने के लिए आवश्यक है । इस प्रोटोकॉल का वर्णन करता है एक tDCS माउस मॉडल है कि एक लंबे प्रत्यारोपित इलेक्ट्रोड का उपयोग करता है ।
Abstract
Transcranial प्रत्यक्ष वर्तमान उत्तेजना (tDCS) एक गैर इनवेसिव neuromodulation कई neuropsychiatric रोगों के लिए एक वैकल्पिक या पूरक उपचार के रूप में प्रस्तावित तकनीक है । tDCS के जैविक प्रभाव पूरी तरह से समझ में नहीं आ रहे हैं, जो भाग में है मानव मस्तिष्क ऊतक प्राप्त करने में कठिनाई की वजह से समझाया । इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक tDCS माउस मॉडल है कि एक लंबी प्रत्यारोपित इलेक्ट्रोड का उपयोग करता है tDCS के लंबे समय से स्थाई जैविक प्रभाव के अध्ययन की अनुमति । इस प्रायोगिक मॉडल में, tDCS cortical जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन और इसके चिकित्सीय उपयोग के लिए तर्क की समझ के लिए एक प्रमुख योगदान प्रदान करता है ।
Introduction
Transcranial प्रत्यक्ष वर्तमान उत्तेजना (tDCS) एक गैर इनवेसिव, कम लागत, चिकित्सकीय तकनीक है, जो कम तीव्रता निरंतर धाराओं1के उपयोग के माध्यम से ंयूरॉन मॉडुलन पर केंद्रित है । tDCS के लिए वर्तमान में दो स्थापक (anodal और cathodal) हैं. जबकि anodal उत्तेजना एक मौजूदा बिजली के क्षेत्र को भी कार्रवाई की क्षमता को ट्रिगर कमजोर डालती है, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी अध्ययन से पता चला है कि इस विधि synaptic प्लास्टिक2में परिवर्तन का उत्पादन । उदाहरण के लिए, सबूत से पता चलता है कि tDCS प्रेरित लंबी अवधि के potentiation (LTP) प्रभाव जैसे उत्तेजक postsynaptic की वृद्धि की चोटी आयाम के रूप में3,4 और cortical उत्तेजित की मॉडुलन5।
इसके विपरीत, cathodal उत्तेजना बाधा लाती है, झिल्ली hyperpolarization6में जिसके परिणामस्वरूप । इस तंत्र के लिए एक परिकल्पना शारीरिक निष्कर्षों पर आधारित है जहां tDCS ंयूरॉन शरीर3में कार्रवाई संभावित आवृत्ति और अवधि का नियमन करने के लिए वर्णित है । यह ध्रुवीकरण दहलीज बदलाव और सुविधा या न्यूरॉन फायरिंग7में बाधा हो सकती है, हालांकि विशेष रूप से, इस प्रभाव सीधे कार्रवाई की क्षमता पैदा नहीं करता है. इन विषम प्रभाव पहले प्रदर्शन किया गया है । उदाहरण के लिए, anodal और cathodal उत्तेजना8खरगोश में electromyography गतिविधि के माध्यम से पंजीकृत वातानुकूलित प्रतिक्रियाओं में प्रभाव का विरोध का उत्पादन किया । हालांकि, अध्ययनों से यह भी पता चला है कि लंबे समय तक anodal उत्तेजना सत्र उत्तेजित करने में कमी हो सकती है, जबकि cathodal धाराओं बढ़ रही है उत्तेजित करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, आत्म-विषम प्रभाव3पेश ।
दोनों anodal और cathodal उत्तेजनाओं कुल इलेक्ट्रोड जोड़े का उपयोग करें । उदाहरण के लिए, anodal उत्तेजना में, "सक्रिय" या "anode" इलेक्ट्रोड मस्तिष्क क्षेत्र पर रखा गया है, जबकि "संदर्भ" या "कैथोड" इलेक्ट्रोड जबकि एक क्षेत्र पर स्थित है, जहां वर्तमान के प्रभाव को तुच्छ9माना जाता है । cathodal उत्तेजना में, इलेक्ट्रोड विन्यास औंधा है. प्रभावी tDCS के लिए उत्तेजना तीव्रता वर्तमान तीव्रता और इलेक्ट्रोड आयाम है, जो अलग से बिजली के क्षेत्र को प्रभावित10पर निर्भर करता है । सबसे अधिक प्रकाशित अध्ययनों में, औसत वर्तमान तीव्रता ०.१० से २.० ma और ०.१ ma के लिए ०.८ ma के लिए मानव और चूहों के लिए, क्रमशः6,11के बीच है । ३५ सेमी2 के इलेक्ट्रोड आकार आम तौर पर मनुष्यों में प्रयोग किया जाता है, वहाँ कुतर के लिए इलेक्ट्रोड आयामों के बारे में कोई उचित समझ है और एक अधिक गहन जांच6की जरूरत है.
tDCS ऐसे मिर्गी12के रूप में कई स्नायविक और neuropsychiatric विकारों11 के लिए एक वैकल्पिक या पूरक उपचार की पेशकश की कोशिश के साथ नैदानिक अध्ययन में प्रस्तावित किया गया है, द्विध्रुवी विकार13,5 स्ट्रोक , मेजर डिप्रेशन14, अल्जाइमर रोग15, मल्टीपल स्केलेरोसिस16 और पार्किंसंस रोग17. नैदानिक परीक्षणों में tDCS और इसके उपयोग में बढ़ती रुचि के बावजूद, मस्तिष्क के ऊतकों, लघु और लंबे समय तक चलने वाले प्रभाव, साथ ही व्यवहार परिणामों में विस्तृत सेलुलर और आणविक उदाहरणात्मक परिवर्तन, अभी तक और अधिक गहराई से18खोजी जा रहे हैं, 19. के बाद से एक प्रत्यक्ष मानव अच्छी तरह से अध्ययन tDCS के दृष्टिकोण व्यवहार्य नहीं है, एक tDCS पशु मॉडल का उपयोग सेलुलर और आणविक tDCS के लिए पहुंच के कारण के चिकित्सीय तंत्र अंतर्निहित घटनाओं में बहुमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते है पशु मस्तिष्क ऊतक ।
उपलब्ध साक्ष्य चूहों में tDCS मॉडल के संबंध में सीमित है । रिपोर्ट मॉडल के अधिकांश विभिंन आरोपण लेआउट, इलेक्ट्रोड आयाम, और सामग्री का इस्तेमाल किया । उदाहरण के लिए, विंकलर एट अल. (२०१७) प्रत्यारोपित सिर इलेक्ट्रोड (एजी/AgCl, व्यास में 4 मिमी) खारा से भरा है और यह एक्रिलिक सीमेंट और20शिकंजा के साथ cranium के लिए तय की । हमारे दृष्टिकोण से अलग है, उनके सीने इलेक्ट्रोड (प्लैटिनम, 20 x १.५ mm) प्रत्यारोपित किया गया । Nasehi एट अल. (२०१७) एक बहुत हमारे लिए बहुत समान प्रक्रिया का इस्तेमाल किया, हालांकि वक्ष इलेक्ट्रोड एक खारा से लथपथ स्पंज (कार्बन भरा, ९.५ सेमी2)21से बनाया गया था । एक अंय अध्ययन के पशुओं के सिर में दोनों इलेक्ट्रोड प्रत्यारोपित, जो तय प्लेटों का उपयोग करके प्राप्त किया गया था और एक hydrogel कंडक्टर22के साथ पशुओं के सिर को कवर । यहाँ, हम सरल शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं और tDCS सेटअप (चित्रा 1) के माध्यम से एक लंबे प्रत्यारोपित इलेक्ट्रोड का उपयोग करता है कि एक tDCS माउस मॉडल का वर्णन.
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Protocol
व्यक्तिगत रूप से स्थित पुरुष वयस्क (8-12 सप्ताह) C57BL/इस प्रयोग में 6 चूहों का प्रयोग किया गया । पशुओं के दौरान और भोजन और पानी के साथ प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के बाद पहले उचित देखभाल प्राप्त विज्ञापन libitum । सभी प्रक्रियाओं को फेडरल यूनिवर्सिटी ऑफ मीनस गेरैस (प्रोटोकॉल नंबर 59/2014) से एनिमल एथिक्स कमेटी ने मंजूरी दी थी ।
1. इलेक्ट्रोड प्लेसमेंट
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बेहोश और stereotaxic उपकरण पर पशु निर्धारण
- सभी आवश्यक शल्य चिकित्सा उपकरणों निष्फल ।
नोट. ४४० डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए शल्य चिकित्सा उपकरणों का बंध्याकरण किया गया । कपास झाड़ू 20 साई पर autoclaved थे (प्रति वर्ग इंच पाउंड) १२१ ° c पर 20 मिनट के लिए । - ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए थर्मल मंच नियंत्रक समायोजित करें ।
- पशु वजन और संज्ञाहरण प्रेरण के लिए उचित खुराक की गणना । intraperitoneally (सुई आकार, 31 ग्राम) दिया १०० मिलीग्राम/किलो ketamine और 8 मिलीग्राम/किलो xylazine की एक खुराक पर ketamine और xylazine के मिश्रण का उपयोग करें । पशु 2 से 3 मिनट के भीतर सो जाना चाहिए ।
- एक इलेक्ट्रिक शेविंग या उस्तरा का उपयोग करने के लिए नीचे शल्य साइट दाढ़ी ।
- पूर्व गर्म हीटिंग प्लेट पर stereotaxic उपकरण पर पशु प्लेस ।
- पशु के सिर पकड़ो और stereotaxic मंच के लिए इसे ठीक करने के लिए जानवरों के कानों में से प्रत्येक में टिप कान सलाखों डालें ।
- सत्यापित करें कि कोई पार्श्व सिर स्थानांतरण और थोड़ा ऊर्ध्वाधर आंदोलन के बाद धीरे से है पशु सिर पोजीशनिंग स्थानांतरण द्वारा ।
- धीरे माउस की नाक पर संज्ञाहरण मुखौटा स्लाइड और पेंच कस द्वारा जगह में इसे ठीक ।
- isoflurane सेट 1% के साथ १.० एल ओ2के/
- शल्य चिकित्सा के दौरान corneal सुखाने को रोकने के लिए जानवरों की आंखों के लिए आंख मरहम लागू करें ।
- सभी आवश्यक शल्य चिकित्सा उपकरणों निष्फल ।
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पशु के सिर को प्रत्यारोपण संलग्न
- povidone-आयोडीन (या 2% chlorhexidine) और ७०% इथेनॉल के तीन बारी सफ़ाई के साथ शल्य साइट तैयार करने के लिए कपास झाड़ू का प्रयोग करें ।
- हल्के से जानवर के पंजे निचोड़ और जानवर के पेडल वापसी (पैर की अंगुली चुटकी) पलटा के नुकसान की पुष्टि करके संज्ञाहरण गहराई को सत्यापित करने के लिए चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग करें ।
- जानवर के कान लाइन के लिए 3 मिमी पीछे के बारे में एक चीरा बनाओ और आंख लाइन पर रोक । चीरा साइट लगभग 1 सेमी लंबाई में होना चाहिए काफी बड़े प्रत्यारोपण प्राप्त करने के लिए ।
- धीरे गोंद और सीमेंट पालन में सुधार करने के लिए एक हड्डी खुरचनी के साथ cranium परिमार्जन । माइक्रो स्क्रैच बनाने के इरादे से इस लाइट को हाथ से करें ।
- ध्यान से स्थिति सर्जिकल हुक ढीला त्वचा के लिए एक खुला शल्य क्षेत्र और त्वचा और फर जैसे अवरोधों से मुक्त बनाए रखने के लिए ।
- एक बाँझ कपास झाड़ू का उपयोग करने के लिए पशु की खोपड़ी सूखी ।
- पशु के cranium के ऊपर की कल्पना करने के लिए एक विदारक माइक्रोस्कोप का प्रयोग करें ।
- stereotaxic धारक को एक सुई लगायेंगे और bregma का पता लगाएँ । सीधे जानवर के सिर के ऊपर सुई की स्थिति थोड़ा bregma छू ।
- बाहर शूंय सभी डिजिटल अनुरेखक पर निर्देशांक और फिर सुई बढ़ा.
- stereotaxic धारक पर tDCS प्रत्यारोपण ठीक । पशु के सिर पर प्रत्यारोपण स्थिति और यह कम धीरे से ब्याज के क्षेत्र पर उचित stereotaxic निर्देशांक का उपयोग कर ।
- एक सुई का प्रयोग करें प्रत्यारोपण के आधार पर सुपर गोंद के 1 ड्रॉप (लगभग ३५ μL) फैल गया ।
- धीरे धारक चाल नीचे की ओर जब तक यह खोपड़ी को छूता है । सुनिश्चित करें कि प्रत्यारोपण आधार पूरी तरह से सतह के साथ संपर्क में है ।
- निर्माता के निर्देश अनुसार सर्जिकल सीमेंट तैयार करें ।
- सटीक स्थिति के बाद, cranium भर में और प्रत्यारोपण के निचले हिस्से पर 3 पतली, यहां तक कि सीमेंट की परत लागू होते हैं । एक अनुप्रयोग ब्रश का उपयोग करके ड्रॉप प्रति ड्रॉप लागू करें । परतों के प्रत्यारोपण के आगे संरचनात्मक समर्थन के लिए एक पहाड़ी के आकार का संरचना फार्म चाहिए ।
- एक चिकनी, अबाधित कनेक्शन की अनुमति देने के लिए सीमेंट के प्रत्यारोपण के पेंच धागा साफ छोड़ दें ।
- प्रत्येक परत लगभग 4 मिनट के लिए शुष्क करने की अनुमति दें ।
- जब सूखी, ध्यान से धारक को दूर जब तक यह पूरी तरह से प्रत्यारोपण से अलग है । हमेशा अत्यधिक सावधानी जब प्रत्यारोपण हैंडलिंग का उपयोग करें, क्योंकि यह गलती से जानवर की खोपड़ी से निकाला जा सकता है ।
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परिष्करण सर्जरी और बाद सर्जिकल देखभाल
- एक खारा-भीगे सूती झाड़ू के साथ चीरा साइट में पशु की त्वचा हाइड्रेट ।
- कोट tDCS प्रत्यारोपण के आधार पर त्वचा ।
- ऊतक एक साथ लाने और ऊतक के ०.२ सेमी प्रति सर्जिकल ऊतक गोंद की एक बूंद के साथ चीरा बंद करने के लिए चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग करें ।
- घुसपैठ 1-2% lidocaine चीरा साइट और अंतर्निहित ऊतकों में ।
- के साथ ५०० µ l हाइड्रेट के स्तनपान के लिए है रिंगर समाधान चमड़े के नीचे ।
- एक पूर्व गर्म (३७ ° c) स्वच्छ, एकल घर पिंजरे में माउस प्लेस ।
- निंनलिखित घंटे में भोजन के लिए आसान पहुंच के लिए पिंजरे में गीले भोजन छर्रों के साथ एक छोटी सी डिश रखो ।
- पशु शल्य चिकित्सा के बाद वजन रजिस्टर ।
- पशु ketoprofen (5 मिलीग्राम/सर्जरी के बाद और अगले 2 दिनों पर चमड़े के नीचे) दे ।
- बारीकी से पशु की वसूली पर नजर रखने के लिए एक सप्ताह के अंत । piloerection, सौंदर्य की कमी, कम गतिवान, घाव खरोंच और शल्य साइट की सूजन के रूप में संकट के किसी भी संकेत का आकलन करें ।
2. tDCS सेटअप और उत्तेजना
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tDCS सेटअप ( चित्र 2देखें)
नोट. सुनिश्चित करें कि tDCS उत्तेजित करने के लिए पूरी तरह से चार्ज किया जाता है ।- tDCS उत्तेजितकर्ता को anode और कैथोड केबल देते हैं और उन्हें उत्तेजना स्थल के पास उपलब्ध कराते हैं. stereotaxic धारक के लिए पिन प्रकार इलेक्ट्रोड संलग्न.
- ३७ ° c के लिए थर्मल मंच सेट करें ।
- 1 L/मिनट के लिए साँस लेना संज्ञाहरण प्रणाली पर ऑक्सीजन flowmeter पर बारी ।
- संज्ञाहरण प्रेरण चैंबर में माउस प्लेस ।
- isoflurane vaporizer को 3% पर चालू करें । पशु 4 मिनट के लिए isoflurane प्रभाव से गुजरना करने की अनुमति दें ।
- जबकि पशु प्रेरण कक्ष में है, एक बाँझ सिरिंज का उपयोग ०.९% खारा समाधान के साथ शरीर इलेक्ट्रोड को भरने के लिए.
- प्रेरण कक्ष से पशु निकालें और शरीर इलेक्ट्रोड पर अपनी छाती की स्थिति.
- धीरे माउस की नाक पर संज्ञाहरण मुखौटा स्लाइड और जगह में इसे ठीक । १.५% के लिए isoflurane उत्पादन कम ।
- प्रत्यारोपण और खारा के साथ पिन प्रकार इलेक्ट्रोड भरें और ध्यान से उन्हें देते हैं ।
- उत्तेजना समय और वर्तमान तीव्रता समायोजित करें ।
- tDCS उत्तेजित करने पर संपर्क गुणवत्ता की जांच करें । इष्टतम संपर्क एक 1 से 10 पैमाने पर 7 से 10 के लिए चला जाता है ।
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उत्तेजना
- उत्तेजना शुरू करो ।
- चयनित मूल्य के लिए 30 एस के लिए वर्तमान रैंप पर निरीक्षण और स्थापित करने के समय के लिए खुद को स्थिर बनाए रखने, तो, नीचे फिर से रैंप सत्र के अंत में ।
- नियंत्रण चूहों के लिए अन्तर्वासना बटन को सक्रिय करें ।
- वर्तमान में चयनित मूल्य के लिए 30 एस के लिए रैंप पर निरीक्षण और फिर 1 से नीचे एक लगातार रैंप के साथ अंत में चयनित मूल्य के लिए एक अंतिम रैंप के साथ उत्तेजना अवधि के आराम के लिए नीचे ।
- एक बार उत्तेजना सत्र पूरा हो गया है, ध्यान से 10 मिनट के लिए एक पूर्व गर्म (३७ ° c) पिंजरे में पशु हस्तांतरण ।
नोट. पशु 3 मिनट के बाद जगाने के लिए शुरू करते हैं । - सांस लेना संज्ञाहरण प्रणाली बंद करो ।
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Representative Results
सर्जिकल प्रोटोकॉल के लिए लंबे समय तक प्रत्यारोपण स्थिरता प्रस्तुत कम एक महीने के लिए, उत्तेजित साइट पर कोई भड़काऊ संकेतों और न ही किसी भी अंय अवांछित प्रभाव के साथ । सभी जानवरों शल्य प्रक्रिया और tDCS सत्र (n = 8) बच गया । इस प्रयोग में, tDCS प्रत्यारोपण एम 1 और M2 cortices (+ १.० mm पूर्वकाल-पीछे और ०.० mm bregma को पार्श्व) पर तैनात थे । एक सप्ताह बाद, tDCS (n = 3-4) और शम (n = 3) चूहों के दौरान लगातार पांच दिनों के लिए प्रेरित किया गया 10 मिनट में ०.३५ मा. संपर्क गुणवत्ता (सीक्यू) मूल्यों के प्रत्यारोपण व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए पंजीकृत थे और कोई महत्वपूर्ण मतभेद एक 5 दिन उत्तेजना प्रक्रिया (3 ए आंकड़ा) के दौरान समूहों के बीच पाया गया । इस पशु मॉडल का उपयोग करके, उत्तेजना सफलता मस्तिष्क व्युत्पंन neurotrophic फैक्टर (बीडीएनएफ) और glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) के लिए जीन अभिव्यक्ति के स्तर के मूल्यांकन के माध्यम से निर्धारित किया जा सकता है । दोनों बीडीएनएफ और GFAP के प्रत्यारोपण के नीचे प्रांतस्था क्षेत्र में काफी अधिक mRNA स्तर प्रस्तुत किया जब अन्तर्वासना समूह की तुलना में. जीन अभिव्यक्ति पर tDCS के प्रभाव के लिए गतिविधि की अभिव्यक्ति के स्तर के बाद से विशिष्ट जीन को प्रतिबंधित कर रहे है-विनियमित cytoskeleton-जुड़े प्रोटीन (चाप), और synapsin 1 (SYN1) जीन नहीं बदल रहे थे (चित्र 3 बी) ।
चित्रा 1 . प्रत्यारोपण सर्जरी और उत्तेजना के लिए इस्तेमाल प्रयोगात्मक कदम । tDCS प्रत्यारोपण प्लेसमेंट, tDCS सेटअप, और उत्तेजना प्रक्रिया के माध्यम से कदम का एक योजनाबद्ध फ़्लोचार्ट । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2 . tDCS Setup. सही बेहतर छवि tDCS वर्तमान उत्तेजितकर्ता (ए), जो वर्तमान तीव्रता और उत्तेजना अवधि (ख), एक सीक्यू प्रदर्शन (ग) 1 से स्केलिंग 10 और एक सच वर्तमान प्रदर्शन (डी) के लिए एक प्रदर्शन शामिल है के aschematic से मेल खाती है । tDCS उत्तेजित करनेवाला भी है बटन को सक्रिय करने के लिए अन्तर्वासना उत्तेजना (ई), उत्तेजना (F) शुरू करने के लिए, और प्रोटोकॉल (G) को निरस्त करने के लिए. दो knobs के वर्तमान तीव्रता (एच) और उत्तेजना अवधि (मैं) को समायोजित करने के लिए उपयोग किया जाता है । पर/बंद स्विच रियर साइड (J) में स्थित है । दो महिला सम्मिलित प्रवेश द्वार इलेक्ट्रोड केबल (कश्मीर, नकारात्मक ध्रुव) (एल, सकारात्मक ध्रुव) के लिए उपयोग किया जाता है. सही अवर छवि सिर इलेक्ट्रोड के साथ showsthe पशु सेटअप एजी के बने/AgCl (O) और शरीर निकल मढ़वाया पीतल (एम) सेट और उनके संबंधित आयामों से बना इलेक्ट्रोड । एक ऑटो समायोजित थर्मल प्लेटफार्म (एन) पशुओं के तापमान का कहना है, और १००% ऑक्सीजन (पी) के साथ मिश्रित isoflurane stereotaxic गैस मास्क (क्यू) के माध्यम से आपूर्ति की है । इनसेट (आर) cortical मोटर क्षेत्र M1 और M2 (एस) के सापेक्ष anode की स्थिति को दर्शाता है । tDCS headstage एक प्रत्यारोपित धारक (टी) खारा (०.९% NaCl) (यू) से भरा है जो एक प्लास्टिक की टोपी (डब्ल्यू) से जुड़ी एक पिन प्रकार इलेक्ट्रोड (V) के साथ बंद है से बना है । संबंधित आयामों मिलीमीटर में चित्रित कर रहे हैं (डी = व्यास, एच = ऊंचाई, आईडी = आंतरिक व्यास). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3 . संपर्क गुणवत्ता और जीन अभिव्यक्ति tDCS द्वारा पैदा परिवर्तन । (A) समूहों के बीच संपर्क गुणवत्ता (सीक्यू) के लिए कोई सांख्यिकीय अंतर नहीं देखा गया । दो तरह दोहराया उपाय ANOVA, उपचार बनाम दिन बातचीत (एफ४.३० = ०.५५२, पी = ०.६९८), उपचार के कारक (एफ४.३० = ०.३४९, पी = ०.८१०), दिन कारक (एफ१.३० = ०.१५७, पी = ०.६९४) । (ख) मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला अभिक्रिया बीडीएनएफ के लिए जीन अभिव्यक्ति डेटा (मस्तिष्क-व्युत्पन्न neurotrophic कारक), GFAP (glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन), चाप (गतिविधि-विनियमित cytoskeleton-सम्बद्ध प्रोटीन) और SYN1 (synapsin 1). mRNA का स्तर दोनों बीडीएनएफ (p = ०.००८१) और GFAP (p = ०.०१०८) के लिए कोई परिवर्तन नहीं पाया गया, जबकि ARC (p = ०.०७६०) और SYN1 (p = ०.५०८), के लिए D'Agostino-पियरसन सामान्यता परीक्षण के अनुसार के बाद में वृद्धि की गई पैरामीट्रिक विद्यार्थी का टी-टेस्ट । गुना परिवर्तन RPL13A जीन के सापेक्ष 2-ΔΔCQ विधि का उपयोग कर की गणना की गई । सभी रेखांकन में, tDCS समूह रानी है और शम समूह हरा है; n = 3-4/समूह । डेटा अर्थ और ± S.E.M. त्रुटि सलाखों के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । एन एस = महत्वहीन, पृ ≤ ०.०५ *, पृ ≤ ०.०१ * * । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
हाल के वर्षों में, neurostimulation तकनीक neuropsychiatric विकारों23के इलाज के लिए एक होनहार प्रक्रिया के रूप में नैदानिक अभ्यास में प्रवेश किया गया है । neurostimulation के तंत्र के ज्ञान की कमी के द्वारा लगाया बाधा को कम करने के लिए, हम यहां एक tDCS माउस एक इलेक्ट्रोड है कि मस्तिष्क क्षेत्रों को लक्षित कर सकते है ले मॉडल प्रस्तुत किया । इलेक्ट्रोड लंबे समय से प्रत्यारोपित है के बाद से, इस पशु मॉडल जटिल उत्तेजना पैटर्न में tDCS द्वारा पैदा की लंबी चलने वाले जैविक प्रभाव की जांच में सक्षम बनाता है (कम से कम 1 महीने के लिए). वर्णित tDCS पशु मॉडल उच्च प्रत्यारोपण सहिष्णुता और संक्रमण की संभावना कम अगर सही ढंग से मार प्रस्तुत करता है । कुल मिलाकर, शल्य चिकित्सा कदम प्रत्यारोपण जगह के लिए त्वरित और सरल निष्पादन (30 मिनट/ इस tDCS मॉडल का एक अतिरिक्त लाभ यह है कि यह इलेक्ट्रोड संपर्क गुणवत्ता और वास्तविक वर्तमान उत्तेजना मूल्यों को ट्रैक करने के लिए संभव है.
इस पशु मॉडल के मुख्य दोष माउस के cranium पर उचित प्रत्यारोपण निर्धारण है । सर्जरी के दौरान, यह एक तरह से जिसमें कोई पार्श्व सिर स्थानांतरण संभव है में है पशु सिर को प्रतिबंधित करने के लिए आवश्यक है (सिर केवल खड़ी कदम होगा) । यह है कि जानवर की खोपड़ी पूरी तरह से प्रत्यारोपण के आधार के साथ गठबंधन है, दंत सीमेंट के साथ उचित निर्धारण की अनुमति है, और इच्छित लक्ष्य क्षेत्र संग्राहक में उच्च परिशुद्धता आश्वासन देगा । यह प्रत्यारोपण प्राप्त करने के लिए काफी बड़ा चीरा बनाने के लिए महत्वपूर्ण है । एक बड़ी कटौती कुछ tDCS प्रत्यारोपण के लिए आवश्यक हो सकता है । hypodermic सुइयों से बने दो से चार सर्जिकल हुक का प्रयोग करने से सीमेंटेड क्षेत्र में वृद्धि होगी । हालांकि, घावों की किसी भी संभावना को दूर करने के लिए जानवरों की आंखों के पास भी हुक रखने से बचें । जबकि धीरे खोपड़ी scratching सुपर गोंद और cranium पर सीमेंट के आसंजन में सुधार होगा, किसी भी अवशिष्ट मलबे अच्छा प्रत्यारोपण पालन को रोका जा सकता है । इसके अलावा, जब दंत सीमेंट लगाने, एक उच्च चिपचिपापन है, जो नीचे पशुओं की खोपड़ी चलाने के सीमेंट से बचा जाता है के साथ पहली परत तैयार करते हैं । प्रत्येक सीमेंट परत के लिए शुष्क करने के लिए अनुमति दी जानी चाहिए कम 4 मिनट क्योंकि गीला परतों पर सीमेंट लगाने के नीचे परतों के सख्त देरी होगी और प्रत्यारोपण के लिए shift या भी गिर कारण हो सकता है । अनुभव से, पेंच धागे की रुकावट से बचने के लिए प्रत्यारोपण के आसपास कोई सीमेंट की 3 परतों से अधिक होना चाहिए । गोंद और सीमेंट दोनों के लिए, प्रत्यारोपण के आधार के लिए प्रतिबंधित अपने आवेदन को बनाए रखने के लिए सुनिश्चित करें । अवशेषों प्रत्यारोपण के भीतर फैल करने के लिए अनुमति से बचें, जो सतह चालकता में कमी और tDCS प्रभाव कम हो जाएगा ।
इस प्रक्रिया में इस्तेमाल किया प्रत्यारोपित इलेक्ट्रोड घर में निर्मित नहीं था, लेकिन neuromodulation उपकरणों के उत्पादन में विशेषज्ञता एक चिकित्सा अनुसंधान कंपनी से अधिग्रहीत. प्रत्यारोपण के बाहर की ऊंचाई के 9 मिमी और ५.७ मिमी और ३.५ मिमी, क्रमशः के एक बाहरी और भीतरी व्यास के साथ बना रहे हैं । यह ८० µ एल की कुल खारा मात्रा पकड़ कर सकते हैं । प्रत्यारोपण के बेहतर भाग एक पेंच धागे के साथ एक पिन प्रकार इलेक्ट्रोड धारक प्राप्त करने के लिए तैयार है. पिन प्रकार इलेक्ट्रोड धारक के बाहरी शरीर भी एक ५.३ मिमी बाहरी व्यास और एक ३.७५ मिमी भीतरी व्यास के साथ 4 मिमी उच्च मापने के हैं. इलेक्ट्रोड पिन एजी/AgCl, एक निष्क्रिय अपने गैर भंग गुण (चित्रा 2) के कारण इस्तेमाल सामग्री से किया जाता है । चूंकि प्रत्यारोपण स्थान प्रभावी tDCS के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है, यह ब्याज के क्षेत्र के अनुसार एक उचित इलेक्ट्रोड आकार का चयन करने के लिए आवश्यक है. इस पशु मॉडल में इस्तेमाल प्रत्यारोपण ९.६१ cm2की सतह क्षेत्र में रह रहे हैं, इरादा मस्तिष्क से एक १.७५ मिमी त्रिज्या से अधिक बिजली के क्षेत्र में फैल एक 36, 3967 μA में जिसके परिणामस्वरूप समंवय/ संभवतः, tDCS उत्तेजना इस प्रोटोकॉल में निष्पादित ज्यादातर एम 1 और M2 cortices के लिए निर्देशित किया गया था ।
आमतौर पर, इलेक्ट्रोड विंयास के अनुसार बदलता है इरादा उत्तेजक या निरोधात्मक उत्तेजना प्रभाव (anodal बनाम cathodal) । हालांकि धाराओं हमेशा कैथोड की दिशा में anode से बाहर प्रवाह होगा, उल्टे टर्मिनल की स्थिति में इलेक्ट्रोड रखकर विभिन्न इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रभाव सक्षम बनाता है. उदाहरण के लिए, जब आयनों anode की दिशा में कैथोड से प्रवाह, प्रक्रिया आमतौर पर एक cathodal उत्तेजना24के रूप में परिभाषित किया गया है । इस प्रयोग में, हमने anodal उत्तेजना का प्रदर्शन किया जिसमें anode को M1/M2 cortices पर रखा गया था और कैथोड को पशु के छाती पर रखा गया था । इस प्रकार, हमारे tDCS सेटअप में, यह आशा है कि उत्तेजना उत्तेजक क्षमता का उत्पादन25। tDCS प्रभाव भी वर्तमान तीव्रता और अवधि में परिवर्तन के माध्यम से विनियमित किया जा सकता है । कुतर में अधिकांश अध्ययनों ने ०.२ से १.० mA से बदलती हुई धाराओं का उपयोग किया है । tDCS धाराओं इलेक्ट्रोड के माध्यम से यात्रा केंद्रित गर्मी उत्पन्न करने की उम्मीद कर रहे हैं. पशु के सिर को tDCS इलेक्ट्रोड के सीधे संपर्क से बचना होगा । माध्यमों के संचालन का उपयोग इलेक्ट्रोड और cranium के बीच की दूरी को फैलाता है और जैविक ऊतकों पर स्थानीय रासायनिक प्रतिक्रियाओं के हानिकारक प्रभावों को रोकता है । यह संभव है कि तरल आचरण मीडिया में एक उच्च ईओण एकाग्रता के कारण गैस के गठन और बुलबुले इलेक्ट्रोलिसिस23,24से परिणाम हो सकता है । हालांकि, इस isotonic खारा समाधान और कम मौजूदा प्रसव के बाद से हमारे tDCS मॉडल में हुआ है की संभावना नहीं है इस तरह की जटिलताओं की संभावना24कम हो सकती है । फिर भी, अन्य मीडिया का संचालन ऐसे चिपचिपा और क्रीम जैसे24कंडक्टर के रूप में समान क्षमता, के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है ।
जब tDCS उत्तेजितकर्ता का चयन, यह लचीला विंयास क्षमताओं पर विचार महत्वपूर्ण है । इस प्रोटोकॉल के लिए, हम एक उत्तेजक दो 9 वी alkaline बैटरी, जो ०.३५ mA में उत्तेजना के 1 ज की उंमीद की अवधि प्रदान द्वारा संचालित किया करते थे । इस उत्तेजितकर्ता के पास एक ०.०२ के लिए 1 mA वर्तमान सीमा के साथ एक 10 µA संकल्प, कुतर उत्तेजना के लिए आदर्श । यह महत्वपूर्ण है कि tDCS उत्तेजितकर्ता एक वास्तविक वर्तमान संकेतक और संपर्क गुणवत्ता (सीक्यू) प्रतिक्रिया प्रणाली के साथ सुसज्जित है इष्टतम उत्तेजना की स्थिति को सत्यापित करने के लिए । वर्तमान संकेतक जब क्रमादेशित उत्तेजना तीव्रता से मुलाकात की जा रही है भरोसा दिलाते हैं । इस tDCS मॉडल में, दोषपूर्ण वर्तमान के लिए सबसे आम कारक खारा समाधान में बुलबुले की उपस्थिति है । यह समस्या सीक्यू प्रतिक्रिया प्रणाली है, जो संचालन मध्यम और पशु के शरीर के माध्यम से दोनों इलेक्ट्रोड के संपर्क के उपाय द्वारा संकेत किया जा सकता है । इस प्रयोग के दौरान इस्तेमाल किया tDCS उत्तेजित करता है सीक्यू (SMARTscan) मूल्यों को एक एलईडी पैमाने पर 1 से 10 से बदलती दिखाता है । इस पैमाने पर वोल्टेज मूल्यों के अनुसार प्रतिरोध अनुमान कर सकते हैं पर आधारित है ओम कानून. एलईडी 1 थोड़ा या असामान्य कम प्रतिरोध इंगित करता है, 2 एलईडी खुले सर्किट इंगित करता है और 3 के माध्यम से 10 एलईडी गरीब इष्टतम गुणवत्ता के लिए इंगित करता है (चित्रा 2-आइटम सी). सीक्यू इलेक्ट्रोड व्यवहार्यता सत्यापित करने के लिए tDCS और अन्तर्वासना दोनों समूहों के लिए दैनिक पंजीकृत किया गया था । यह उल्लेखनीय है कि उत्तेजना सत्र के दौरान औसत सीक्यू मूल्य 7 से अधिक था, जिसका अर्थ है कि वांछित धाराओं दिया जा रहा है । कुल मिलाकर, कोई सांख्यिकीय मतभेद समूहों या उत्तेजना के दिन (आंकड़ा 3ए) के बीच सीक्यू के लिए मनाया गया । आगे हमारे tDCS मॉडल को मांय करने के लिए, हम मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रियाओं (qPCR) की जांच करने के लिए कि क्या पांच tDCS सत्र (10 मिनट, ३५० μA) cortical जीन अभिव्यक्ति बदल प्रदर्शन किया । हमने पाया है कि बीडीएनएफ और GFAP के mRNA स्तरों में वृद्धि हुई थी M1/tDCS समूहों के M2 प्रांतस्था, के सापेक्ष अन्तर्वासना चूहों (चित्र बी1). ये परिणाम अन्य अध्ययन19,25के साथ संगत कर रहे हैं.
प्रयोगात्मक पशुओं में Neurostimulation अध्ययन neuropsychiatric विकारों के लिए प्रासंगिकता के साथ मस्तिष्क तंत्र के बारे में नए अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं । प्रयोगात्मक विन्यास पर निर्भर करता है, इस पशु मॉडल में tDCS विधानसभा भी एक साथ रिकॉर्डिंग और उत्तेजना के लिए एक सेटअप का उत्पादन करने के लिए एक मौजूदा optogenetic या इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी headstage के साथ जोड़ा जा सकता है, मस्तिष्क की एक भीड़ के साथ नमुना प्रयोग. इन दृष्टिकोणों को मनुष्यों में बाहर ले जाना चुनौतीपूर्ण होगा । इसलिए, वर्तमान में सूचना दी पशु tDCS के लिए लचीला जोड़ डालने का अवसर tDCS के तंत्रिका उपइलाकों की समझ और इसके चिकित्सीय उपयोग के लिए तर्क के लिए एक प्रमुख योगदान प्रदान करता है ।
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Disclosures
कोई
Acknowledgments
हम माउस कालोनियों को बनाए रखने में सहायता के लिए श्री Rodrigo de Souza धंयवाद । एल. ए. व्ही. एम एक CAPES postdoctoral येता. इस काम को ग्रांट PRONEX (FAPEMIG: APQ-00476-14) ने सपोर्ट किया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Ultra-Fine 50U Syringe | BD | 10033430026 | For intraperitonially injection. |
| Shaver (Philips Multigroom) | Philips (Brazil) | QG3340/16 | For surgical site trimming. |
| Surgical Equipment | |||
| Model 940 Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console | KOPF | 940 | For animal surgical restriction and positioning. |
| Model 922 Non-Rupture 60 Degree Tip Ear Bars | KOPF | 922 | For animal surgical restriction and positioning. |
| Cannula Holder | KOPF | 1766-AP | For implant positioning. |
| Precision Stereo Zoom Binocular Microscope (III) on Boom Stand | WPI | PZMIII-BS | For bregma localization and implant positioning. |
| Temperature Control System Model | KOPF | TCAT-2LV | For animal thermal control. |
| Cold Light Source | WPI | WA-12633 | For focal brightness |
| Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System with Scavenging | VetEquip | 901820 | For isoflurane delivery and safety. |
| VaporGuard Activated Charcoal Adsorption Filter | VetEquip | 931401 | Delivery system safety measures. |
| Model 923-B Mouse Gas Anesthesia Head Holder | KOPF | 923-B | For animal restriction and O2 and isoflurane delivery. |
| Oxygen regulator, E-cylinder | VetEquip | 901305 | For O2 regulation and delivery. |
| Oxygen hose – green | VetEquip | 931503 | For O2 and isoflurane delivery. |
| Infrared Sterilizer 800 ºC | Marconi | MA1201 | For instrument sterilization. |
| Surgical Instruments | |||
| Fine Scissors - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-11 | For incision. |
| Surgical Hooks | INJEX | 1636 | In House Fabricated - Used to clear the surgical site from skin and fur. |
| Standard Tweezers or Forceps | - | - | For skin grasping. |
| Surgical Consumables | |||
| Vetbond | 3M | SC-361931 | For incision closing. |
| Cement and Catalyzer KIT (Duralay) | Reliance | 2OZ | For implant fixation. |
| Sterile Cotton Swabs (Autoclaved) | JnJ | 75U | For surgical site antisepsis. |
| 24 Well Plate (Tissue Culture Plate) | SARSTEDT | 831,836 | For cement preparation. |
| Application Brush | parkell | S286 | For cement mixing and application. |
| Pharmaceutics | |||
| Xylazin (ANASEDAN 2%) | Ceva Pharmaceutical (Brazil) | P10160 | For anesthesia induction. |
| Ketamine (DOPALEN 10%) | Ceva Pharmaceutical (Brazil) | P30101 | For anesthesia induction. |
| Isoflurane (100%) | Cristália (Brazil) | 100ML | For anesthesia maintenance. |
| Lidocaine (XYLESTESIN 5%) | Cristal Pharma | - | For post-surgical care. |
| Ketoprofen (PROFENID 100 mg) | Sanofi Aventis | 20ML | For post-surgical care. |
| Ringer's Lactate Solution | SANOBIOL LAB | 7898153652145 | For post-surgical care. |
| TobraDex (Dexamethasone 1 mg/g) | Alcon | 631 | For eye lubrification and protection. |
| Stimulation | |||
| Animal Transcranial Stimulator | Soterix Medical | 2100 | For current generation. |
| Pin-type electrode Holder (Cylindrical Holder Base) | Soterix Medical | 2100 | Electrode support (Implant). |
| Pin-type electrode (Ag/AgCl) | Soterix Medical | 2100 | For current delivery (electrode). |
| Pin-type electrode cap | Soterix Medical | 2100 | For implant protection. |
| Body Electrode (Ag/AgCl Coated) | Soterix Medical | 2100 | For current delivery (electrode). |
| Saline Solution (0.9%) | FarmaX | 7896902206441 | Conducting medium for current delivery. |
| Standard Tweezers or Forceps | - | - | For tDCS setup. |
| Real Time Polymerase Chain Reaction | |||
| BioRad CFX96 Real Time System | BioRad | C1000 | For qPCR |
| SsoAdvancedTM Universal SYBR Green Supermix (5 X 1mL) | BioRad | 1725271 | For qPCR |
| Hard Shell PCR Plates PCT COM 50 p/ CFX96 | BioRad | HSP9601 | For qPCR |
| Microseal "B" seal pct c/ 100 | BioRad | MSB1001 | For qPCR |
References
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