Summary
تصف هذه الدراسة نموذجا جنين الزرد المجراة في التصور والتحليل إينترافيتال للعدوى المرتبطة بمادة بيولوجية على مر الزمن استناداً إلى الفحص المجهري الأسفار. هذا النموذج نظام واعدة لاستكمال نماذج الحيوانات الثديية مثل الماوس نماذج لدراسة الأمراض المرتبطة بمادة بيولوجية المجراة.
Abstract
العدوى المرتبطة بمادة بيولوجية (بأي) أحد أسباب رئيسية لفشل الأجهزة الطبية الحيوية. المكوّرات العنقودية الذهبية إحدى المسببات الرئيسية في بأي. النماذج الحالية تجريبية بأي الحيوانات الثديية مثل نماذج الماوس مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً، وذلك غير مناسبة لتحليل الإنتاجية العالية. وهكذا، الرواية نماذج حيوانية كنظم متكاملة للتحقيق بأي المجراة في المرغوب فيها. في هذه الدراسة، نحن تهدف إلى تطوير نموذج جنين الزرد المجراة في التصور والتحليل إينترافيتال للعدوى البكتيرية حضور الحيوية استناداً إلى الفحص المجهري الأسفار. وبالإضافة إلى ذلك، تدرس استجابة بلعم استفزاز. وتحقيقا لهذه الغاية، استخدمنا الفلورسنت معربا عن البروتين المذهبة س. والأجنة المعدلة وراثيا الزرد معربا عن البروتينات الفلورية في الضامة بهم ووضع إجراء لحقن البكتيريا وحدها أو بالاشتراك مع الجزئي المجالات الخرز الصغير في العضلات أنسجة الأجنة. لرصد تطور العدوى البكتيرية في الأجنة الحية على مر الزمن، ونحن استنباط طريقة بسيطة ولكنها موثوقة التهديف مجهرية للبكتيريا الفلورسنت. وأظهرت النتائج من التهديف مجهرية أن جميع الأجنة مع الوحدات المكونة للمستعمرة أكثر من 20 (زيمبابوي) من البكتيريا أسفرت عن إشارة إيجابية فلورسنت من البكتيريا. لدراسة الآثار المحتملة للمواد الحيوية على العدوى، حددنا الأرقام زيمبابوي في المذهبة س. مع أو بدون 10 ميكرون البوليستيرين الجزئي المجالات الخرز الصغير (PS10) كنموذج الحيوية في الأجنة. وعلاوة على ذلك، قمنا باستخدام ملف المشروع أوبجيكتج "الزرد-إيمونوتيست" العاملة في إيماجيج لقياس كثافة الأسفار من عدوى المكوّرات س. مع أو بدون ملاحظة:10 مع مرور الوقت. وأظهرت النتائج من كلا الأسلوبين أعلى الأرقام في المذهبة س. في الأجنة المصابة مع الجزئي المجالات الخرز الصغير مما في الأجنة دون الجزئي المجالات الخرز الصغير، مما يدل قابلية إصابة بزيادة حضور مادة بيولوجية. وهكذا، يظهر هذه الدراسة إمكانيات النموذجي الجنين الزرد للدراسة بأي مع الأساليب المتقدمة هنا.
Introduction
يتزايد استخدام مجموعة متنوعة من الأجهزة الطبية (يشار إليها على أنها "الحيوية") في الطب الحديث لاستعادة أو استبدال أجزاء جسم الإنسان1. ومع ذلك، عند غرس الحيوية مريض للعدوى، دعا عدوى المرتبطة بمادة بيولوجية (بأي)، ومضاعفات رئيسية ليزرع في الجراحة. المكوّرات العنقودية الذهبية و المكوّرات العنقودية ابيديرميديس هي الأنواع البكتيرية الأكثر انتشارا هما مسؤولة بأي2،،من34،،من56. مزروع النموذج الحيوية على سطح عرضه لتشكيل بيوفيلم الجرثومي. وعلاوة على ذلك، قد تكون مختل الاستجابة المناعية المحلية بالحيوية مزروع، مما تسبب في انخفاض فعالية إزالة البكتيريا. الموافقة الأولية على إصابة البكتيريا يقوم أساسا بتسلل العَدلات، التي بشدة انخفاض قدرة جراثيم حضور المدرج أو مزروع مادة بيولوجية7. وعلاوة على ذلك، الضامة التسلل إلى الأنسجة بعد تدفق العَدلات الأولى سوف phagocytose البكتيريا المتبقية ولكن لا يمكن فعلياً قتلهم إينتراسيلولارلي، بسبب المناعة مختل مما يشير إلى أنه نتيجة لوجود مجتمعة مادة بيولوجية والبكتيريا8. وهكذا، يمكن تيسير وجود الحيوية البقاء داخل الخلايا للبكتيريا9،10،11،،من1213 وبيوفيلم تشكيل على مزروع الحيوية4،14. ونتيجة لذلك، قد تؤدي إلى الفشل بأي والحاجة إلى استبدال مزروع الحيوية، مما تسبب في زيادة معدلات الاعتلال والوفيات والاستشفاء المطول مع التكاليف الإضافية2،15.
ويجري عدد متزايد من استراتيجيات مكافحة--بأي المتقدمة2،،من1617. المجراة في تقييم فعالية هذه الاستراتيجيات في نماذج حيوانية ذات الصلة أمر ضروري. ومع ذلك، التقليدية التجريبية بأي نماذج حيوانية (مثل، الماوس نماذج) عادة ما تكون مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً لذلك غير مناسب لاختبار الإنتاجية العالية من استراتيجيات متعددة18. التطورات الأخيرة في تقنيات التصوير الضوئية الحيوية استناداً إلى طرحه/فلوري تسمية الخلايا المضيفة والبكتيريا قد يسمح للرصد المستمر للتفاعلات بأي تطور والمضيف الممرض/المضيف-المواد في الحيوانات الصغيرة واحدة مثل الفئران18،19،،من2021. ومع ذلك، هذا الأسلوب معقد نسبيا ولا تزال في مهدها، ويجب معالجة عدة قضايا للتحليل الكمي بأي18. على سبيل المثال، مطلوب بجرعة عالية من تحدي لتصور الاستعمار الجرثومي. وبالإضافة إلى ذلك، على ضوء التشتت والامتزاز إشارات الإضاءة الحيوية/الأسفار في أنسجة الثدييات اختبار الحيوانات كما يجب تناول18،،من1921. ولذلك، هي نماذج حيوانية مبتكرة، وفعالة من حيث التكلفة مما يسمح للتصور إينترافيتال والتحليل الكمي على مر الزمن قيمة النظم التكميلية للدراسة المجراة في بأي.
وقد استخدمت الزرد (الأجنة) كأداة في الحية تنوعاً لتشريح التفاعلات المضيف-مسببات المرض والإصابة المرضية للعديد من الأنواع البكتيرية مثل المتفطرة22،23من الزائفة الزّنجاريّة، الإشريكيّة القولونية26،24و العنقوديات البرازية faecalis2527. وقد أجنة الزرد العديد من المزايا مثل الشفافية الضوئية، وتكلفة الصيانة منخفضة نسبيا، وحيازة نظام المناعة عالية مماثلة لتلك في الثدييات28،29. وهذا يجعل الأجنة الزرد كائن نموذج الغاية الاقتصادية والمعيشية للتصور إينترافيتال وتحليل تطور العدوى والمضيف المقترنة الردود28،29. للسماح لتصور سلوك الخلية خطوط الزرد في الحية، ومحوره وراثيا مع أنواع مختلفة من الخلايا المناعية (مثل الضامة، والعدلات) وحتى مع المعلمة فلوريسسينتلي الهياكل سوبسيلولار وقد وضعت28 ،29. وبالإضافة إلى ذلك، يوفر معدل الإنجاب عالية الزرد إمكانية تطوير نظم اختبار إنتاجية عالية يتميز الحقن الآلية المؤتمتة والأسفار الآلي الكمي و تحليل الحمض النووي الريبي تسلسل27، 30.
في هذه الدراسة، ونحن تهدف إلى وضع نموذج الزرد جنين للعدوى المرتبطة بمادة بيولوجية باستخدام تقنيات التصوير الأسفار. وتحقيقا لهذه الغاية، قمنا بتطوير إجراء لحقن البكتيريا (S. aureus) حضور مادة بيولوجية الجزئي المجالات الخرز الصغير الأنسجة العضلية الزرد الأجنة. كنا المذهبة س. RN4220 وإذ تعرب عن مشري الفلورسنت البروتين (S. aureus-مشري)، الذي شيد كما هو موضح في مكان آخر لآخر10،سلالة المذهبة س. 31. السطر الزرد المحورة وراثيا (mpeg1: UAS/كايد) معربا عن كايد واستخدمت بروتين فلوري أخضر في الضامة32 والأزرق الفلورسنت البوليستيرين الجزئي المجالات الخرز الصغير. في دراسة سابقة، وقد أظهرنا أن ضخ العضلي الجزئي المجالات الخرز الصغير في الأجنة الزرد لتقليد غرس مادة بيولوجية هي عمليا33. لتحليل كمي التقدم بأي وتسلل خلية مرتبطة في الأجنة واحد مع مرور الوقت، كنا ملف المشروع "الزرد-إيمونوتيست" الذي يجري تشغيله في "أوبجيكتج" (المكونات في إيماجيج) لقياس كثافة الأسفار البكتيريا المقيمين والضامة التسلل إلى محيط موقع الحقن الجزئي المجالات الخرز الصغير33. وباﻹضافة إلى ذلك، عقدنا العزم الأرقام لتشكيل مستعمرة وحدات (زيمبابوي) من البكتيريا في الوجود والغياب الجزئي المجالات الخرز الصغير في الأجنة لدراسة الآثار المحتملة للمواد الحيوية على العدوى. لدينا هذه الدراسة يتبين أن الجنين الزرد مع الأساليب المتقدمة هنا، نموذج حيوانات الفقارية واعدة، ورواية لدراسة الإصابات المرتبطة بمادة بيولوجية المجراة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
في هذا البروتوكول، وصيانة الزرد الكبار امتثالا للوائح المحلية الرفق بالحيوان كما أقرته اللجنة المحلية الرفق بالحيوان. وأجريت تجارب على الأجنة وفقا لتوجيهات 2010/63/الاتحاد الأوروبي.
1-إعداد "البكتيريا فقط" وتعليق البكتيريا-الجزئي المجالات الخرز الصغير
ملاحظة: يتم استخدام سلالة RN4220 S. aureus معربا عن البروتين الفلورسنت مشري (S. aureus-مشري). سلالة RN4220 في المذهبة س. هو تحور في أغرا (منظم الجينات الملحق A) منظم الجينات الفوعة34، وذلك قد فوعة منخفضة نسبيا في الطراز الجنين الزرد. ويمكن استخدام سلالات المكوّرات س. الأخرى أو غيرها من الأنواع البكتيرية لأي.
-
يأخذ 4 إلى 5 مستعمرات من البكتيريا المكوّرات س. RN4220 من فول الصويا تريبتيك أجار الثقافة لوحات تستكمل مع 10 ميكروغرام/مل الكلورامفينيكول والثقافة البكتيريا إلى مرحلة النمو منتصف لوغاريتمي في 10 مل مرق الصويا تريبتيك تكملة مع 10 ميكروغرام/مل الكلورامفينيكول في 37 درجة مئوية تحت تهتز.
- خلال الثقافة، وتمييع 100 ميليلتر من تعليق البكتيرية في 900 ميليلتر من الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS) في ومبومو (عرض 1 سم) لقياس كثافة بصرية (OD) في 620 نانومتر (OD620). الثقافة البكتيريا حتى OD620 يصل إلى 0.4 – 0.8.
ملاحظة: عموما يناظر التطوير التنظيمي620 من 0.1 3.0 x 107 زيمبابوي/مل س المذهبة. OD620 من العدوى البكتيريا في منتصف مرحلة النمو لوغاريتمي ما بين 0.4 0.8. قد يلزم فترات زمنية مختلفة لاستزراع أنواع وسلالات من البكتيريا الأخرى.
- خلال الثقافة، وتمييع 100 ميليلتر من تعليق البكتيرية في 900 ميليلتر من الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS) في ومبومو (عرض 1 سم) لقياس كثافة بصرية (OD) في 620 نانومتر (OD620). الثقافة البكتيريا حتى OD620 يصل إلى 0.4 – 0.8.
- إعادة وقف البكتيريا الأعلاف في 1 مل PBS العقيمة والطرد المركزي البكتيريا في س 3,500 ز لمدة 10 دقائق. بعد ذلك يغسل البكتيريا مع أوقات PBS 2 العقيمة، وأخيراً إعادة تعليق البكتيريا في 1.1 مل محلول40 (40من حماية الأصناف النباتية) بوفيدون 4% (w/v) في برنامج تلفزيوني.
- دوامة هذا التعليق البكتيرية وتمييع ميليلتر 100 تعليق في 900 ميليلتر من PBS العقيمة في ومبومو لقياس620 OD. ضبط تركيز تعليق البكتيرية مع الحل40 حماية الأصناف النباتية. وهذا تعليق "للبكتيريا فقط".
- ويمكن اختيار الحيوية بحرية لخلط مع تعليق البكتيرية. وتستخدم في هذه الدراسة، الجزئي المجالات التجارية البوليستيرين (PS) الخرز الصغير (الفلورية الزرقاء، 10 ميكرومتر). لإنشاء تعليق بكتيريا-الجزئي المجالات الخرز الصغير، الطرد المركزي الجزئي المجالات الخرز الصغير لمدة 1 دقيقة في 1,000 ز x، درجة حرارة الغرفة، وتجاهل المادة طافية وإعادة تعليق الجزئي في المجالات الخرز الصغير في تعليق "للبكتيريا فقط" (في حماية الأصناف النباتية40 الحل).
- من أجل حقن جرعات متساوية تقريبا من البكتيريا في الوجود وفي غياب الجزئي المجالات الخرز الصغير، تركيز التعليق الجزئي المجالات الخرز الصغير-البكتيريا يجب أن يكون ثلثا تركيز تعليق "للبكتيريا فقط" (بدون الجزئي المجالات الخرز الصغير). ويتحقق ذلك بتمييع تعليق البكتيريا-الجزئي المجالات الخرز الصغير بحجم 0.5 من حل40 حماية الأصناف النباتية. مزيج أن الإيقاف قبل فورتيكسينج. من المذكرة، هذه النسبة (ثلثي) قد جرى تقييم المذهبة س. كما أنها مناسبة ابيديرميديس س.، ولكن ينصح بالتحقق من ما إذا كانت هذه النسبة ينطبق أيضا على غيرها من الأنواع البكتيرية والأحجام (من 10 ميكرون) أو الأشكال الحيوية (من الجزئي المجالات الخرز الصغير) بالحقن.
- فحص تركيز تعليق "للبكتيريا فقط" والبكتيريا-الجزئي المجالات الخرز الصغير بثقافة الكمية لتخفيف المسلسل إذ وصفها أدناه: نقل 100 ميليلتر من المعلقات إلى 96 لوحة جيدا وتمييع متسلسل بنقل 10 ميليلتر مختبرين تعليق إلى 90 ميليلتر من PBS العقيمة. لوحة مختبرين ميليلتر 10 مكرر من المعلقات غير مخفف والمخفف على ألواح [اغروس]، واحتضان لوحات عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها، عد المستعمرات وحساب أرقام البكتيريا (الوحدات المكونة للمستعمرة. زيمبابوي).
2-تربية، الحصاد، والحفاظ على الأجنة الزرد
- اتبع الإجراءات العامة وصف سابق35،36 لتربية والحصاد، والحفاظ على الأجنة الزرد، مع إدخال التعديلات المبينة أدناه. عبر أسرة من نوع البرية توفيل زعنفة طويلة (TL) الزرد أو الزرد للسطر المحدد وراثيا (هنا، Mpeg1: كايد) في دبابة مع صافي إضافة إلى حمل الإناث البالغات لإنتاج البيض بعد يضيء الضوء، ثم فصل البالغين من البيض المنتجة.
- جمع الأجنة في اليوم التالي، وتجاهل تلك غير الشفافة التي لا تكون قابلة للتطبيق. تبقى حوالي 60 أجنة كل طبق بتري (100 ملم في القطر) في E3 المتوسطة37 واحتضان عند 28 درجة مئوية. إزالة أجنة ميتة وغير طبيعي، وتحديث المتوسطة E3 يوميا.
3-التحضير للحقن بالإبر
- تعد الإبر ميكروكابيلاري الزجاج للحقن باستخدام أداة ساحبة ميكروبيبيتي. استخدم الإعدادات التالية: الحرارة: 772، سحب: حطي 100،: 200، الوقت: الغاز 40،: 75.
- كسر طرف إبرة مع الملقط في موضع الإبرة فيها قطر خارجي لما يقرب من 20 ميكرومتر (عن 10 ميكرون الجزئي المجالات الخرز الصغير)، استخدام مجهر خفيفة مع شريط مقياس في العين. تجنب الإبر مع حجم فتحه كبيرة جداً، كما أنها سوف تهدد بقاء الأجنة.
ملاحظة: ويمكن اختيار فتح يكون أصغر أو أكبر، تبعاً لحجم وشكل الحيوية بالحقن. في الأدب، أبلغ الحقن باستخدام الإبر مع فتح من حوالي 50 ميكرومتر يسبب انخفاضا كبيرا في بقاء الجنين38.
4-حقن "البكتيريا فقط" أو التعليق الجزئي المجالات الخرز الصغير-البكتيريا في الأجنة الزرد
- حرارة [اغروس] حل (1 – 1.5% (wt) في المياه ديمي) باستخدام فرن ميكروويف وتصب في طبق بتري 100 ملم. ضع قالب بلاستيكية العفن على رأس الحل [اغروس] في طبق بتري لإنشاء المسافات البادئة في [اغروس] لوضع الأجنة في المواقف المناسبة، تسهيل الحقن. احتضان في درجة حرارة الغرفة وإزالة العفن عندما قد وطدت الحل [اغروس].
- في 3 د بعد الإخصاب، وضع الأجنة في طبق بتري 100 ملم تحتوي على 0.02% (w/v) حمض 3-امينوبنزويك (تريكيني) تخدير لهم. بعد 5 دقائق، نقل الأجنة إلى اللوحة [اغروس] مضافين مع E3 المتوسطة التي تحتوي على 0.02% (w/v) تريكيني ومواءمتها في اتجاه واحد للحقن. Mpeg1: خط المعدلة وراثيا كايد أولاً تخدير الأجنة في E3 المتوسطة تحتوي على 0.02% (w/v) تريكيني. ثم حدد الأجنة معربا عن البروتينات الفلورية الخضراء باستخدام مجهر الأسفار ستيريو.
-
تحميل الإبرة مع حوالي 10 ميليلتر من تعليق "للبكتيريا فقط" أو البكتيريا-الجزئي المجالات الخرز الصغير باستخدام تلميح ماصة ميكرولوادير. جبل الإبرة على ميكرومانيبولاتور متصلاً مايكرو-الحاقن. لتستخدم محقن هنا (انظر الجدول للمواد)، استخدام الإعدادات التالية لحقن nL 2 – 3: الضغط: الضغط الخلفي 300 – 350،: 0, الوقت: 2 مللي ثانية.
ملاحظة: تعتمد إعدادات مايكرو-الحاقن على محقن المستخدمة. إعدادات حاقن قد تحتاج إلى تعديل لحقن البكتيريا مختلطة مع الحيوية مع أحجام أو أشكال أخرى.- استخدام الإبر مع فتح نفسه لحقن تعليق "للبكتيريا فقط" ووقف البكتيريا-الجزئي المجالات الخرز الصغير. إذا كان الإبرة مكسورة أو انسداد، دائماً تغيير إبرة جديدة لمزيد من الحقن.
- إدراج الإبرة في النسيج العضلي للأجنة تحت مجهر خفيفة (الشكل 1)، بزاوية من 45-60 درجة مئوية بين الإبرة والجسم للأجنة. ضبط موضع الإبرة في الأنسجة بلطف أنها تتحرك جيئة وذهابا. حقن الأجنة باستخدام دواسة قدم متصلاً مايكرو-الحاقن.
- بعد حقن البكتيريا الفلورسنت، نقاط الأجنة لعدوى ناجحة تحت مجهر fluorescence ستيريو. تجاهل السلبية الأجنة وسجل (لا البكتيريا الفلورسنت مرئية أو لا تظهر الجزئي الفلورسنت المجالات الخرز الصغير). الحفاظ على الأجنة على حدة في E3 المتوسطة في لوحات 48-جيدا. قم بتحديث في المتوسط يوميا.
5. سحق الأجنة والتهديف المجهرية، والثقافة كمية من البكتيريا
- نقاط جميع أجنة مجهريا لوجود البكتيريا الفلورية استخدام مجهر الأسفار ستيريو، البدء فورا بعد الحقن، وفي كل يوم بعد ذلك حتى الأجنة يتم اختيارها عشوائياً للثقافة الكمية.
- عشوائياً تحديد الأجنة المصابة حية قليلة (5 إلى 6 في هذه الدراسة) بعد الحقن بوقت قصير ونقلها على حدة إلى microtubes مل 2 منفصلة باستخدام النصائح العقيمة. إزالة المتوسطة وتغسل الأجنة بلطف مع PBS العقيمة مرة واحدة وإضافة 100 ميليلتر من PBS العقيمة.
- إضافة الخرز الزركونيا العقيمة 2 – 3 (قطرها 2 ملم) لكل قنينة وسحق الأجنة في الخالطون باستخدام (انظر الجدول للمواد) 3,500 لفة في الدقيقة لمدة 30 س. الثقافة هوموجيناتي كيفا وكما هو موضح في الخطوة 1، 3.
ملاحظة: الخالطون أخرى قد تتطلب إعدادات مختلفة. - عشوائياً اختيار أجنة متعددة في الأيام اللاحقة بعد الحقن لثقافة الكمية وفقا للخطوة 5.3.
6-الأسفار مجهرية من تطور الإصابة وتسلل خلية استفزاز في الأجنة الزرد
- تخدير الأجنة كما هو موضح في الخطوة 4، 2. "الماصة؛" 500 ميليلتر حل السليلوز الميثيل PBS-2% (wt) في طبق بتري يحتوي على المتوسطة E3 مع 0.02% (w/v) تريكيني. وضع الأجنة في الحل الميثيل السليلوز وإبقائها مستقيمة وأفقية.
ملاحظة: يستخدم الميثيل السليلوز الحل "غراء"، الذي سبب لها اللزوجة، يمكن مؤقتاً تجميد الأجنة في اتجاه أفضل للتصوير. - استخدام مجهر الأسفار ستيريو مزودة بمرشحات للأجنة الصورة الفردية ضمن إعدادات الأمثل مماثلة (مثل، كثافة والكسب، والتعرض الوقت) في التكبير 160 x ميدان مشرق، مشري، والبروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل)، والأشعة فوق البنفسجية . قم بتعيين المستوى البؤري مثل الأنسجة الأضرار الناجمة عن الحقن في التركيز، باستخدام عامل التصفية حقل مشرق. تعيين عمق المكدس Z بحجم 10 ميكرون، وخطوة في 5 ميكرومتر، الذي يسمح بتسجيل الصور على التوالي 3.
- صورة فردية الأجنة مرة واحدة يوميا من الحقن بعد ح 5 حتى 3 أيام بعد الحقن. استبعاد أجنة ميتة (لا ضربات القلب أو الجنين جزئيا المتدهورة) لمواصلة التصوير والتحليل. الحفاظ على الأجنة على حدة في E3 المتوسطة في لوحات 48-جيدا. قم بتحديث في المتوسط يوميا.
7-التحليل الكمي لكثافة Fluorescence تطور العدوى وتسلل خلية تسبب استخدام كائن ي ملف المشروع "الزرد-إيمونوتيست"
- تحميل "الزرد-إيمونوتيست"، ودليل تفصيلي من الارتباط: < https://sils.fnwi.uva.nl/bcb/objectj/examples/zebrafish/MD/zebrafish-immunotest.htmL>، كما هو موضح في دراسة سابقة33. باختصار، فتح الصور للتحليل مع "الزرد-إيمونوتيست"، يعمل بموجب برنامج مجاني "صورة ج." في كل صورة تم تحميلها، يدوياً علامة الحقن استناداً إلى تلف الأنسجة الملحوظ للأجنة.
ملاحظة: يستخدم الموقع ملحوظة "الزرد-إيمونوتيست" كنقطة المركز للكشف عن ذروة الأسفار على مسافة 50 ميكرومتر. ثم يتم استخدام ذروة fluorescence تم الكشف عنها كمركز لمنطقة موحدة (قطرها 100 ميكرومتر) لقياس الأسفار. - انقر فوق "حساب" في القائمة "كائن ي" لتشغيل قياس الفلورسنت لقنوات متعددة، إذا كان ذلك ممكناً، لكل الصور تلقائياً. تصدير البيانات وتحليلها بطرق الاختبار الإحصائية المناسبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هذه الدراسة تقييم مدى انطباق الزرد الأجنة كنموذج حيوانات الفقارية رواية للتحقيق في الإصابة المرتبطة بمادة بيولوجية. قد استخدمت تقنية microinjection عادة لمختلف أنواع الجراثيم بحقن الأجنة الزرد تسبب الإصابة22،،من2627،،من3036. استخدام الإجراء هو مبين في الشكل 1، س المذهبة وحدها أو بالاشتراك مع 10 ميكرون PS الجزئي المجالات الخرز الصغير (ملاحظة:10) كانت حقن أنسجة العضلات الزرد الأجنة في هذه الدراسة. الحقن العضلي في المذهبة س. تسبب الإصابة تعتمد على الجرعة في الأجنة (الشكل 2). جرعات حقن كانت قريبة من جرعات التحدي هدف (يوم 0 في الشكل 2). ولوحظت اختلافات طفيفة فقط داخل المجموعات. حقن بجرعات عالية التحدي أظهر تطور العدوى متغير في يوم 1 و 2 يوما بعد حقن الأجنة (الشكل 2، زيمبابوي 6000 و 2000). حقن البكتيريا المكوّرات س. أما تم استئصالها أو قد تكاثرت وبعد ذلك أنشأت مستويات عالية من العدوى داخل الأجنة. هذا مماثل للتقدم المبلغ عنها من عدوى المكوّرات س. بعد الحقن الوريدي في الزرد الأجنة26. مسح الأجنة حقن بجرعات منخفضة من التحدي في المذهبة س. البكتيريا (الشكل 2، زيمبابوي 600 و 200). وأشارت هذه النتائج إلى أن جرعة التحدي في المذهبة س يؤثر بشدة تقدمهم العدوى في الأجنة الزرد.
حقن المشارك من البكتيريا والجزئي المجالات الخرز الصغير أسفرت عن أكبر عدد من البكتيريا حقنه من حقن بكتيريا فقط (البيانات لا تظهر). قبل إعداد العدوى البكتيرية لحقن "البكتيريا فقط" بتركيز أعلى (حوالي 1.5 مرات أعلى) من تعليق البكتيريا-الجزئي المجالات الخرز الصغير، كنا قادرين على التغلب على الاختلاف في الأرقام من زيمبابوي حقن. وبهذه الطريقة، فمن الممكن إعداد مماثلة من البكتيريا بحقن الأجنة في الوجود وفي غياب PS10 (اليوم 0، الشكل 3). تتباين أرقام الجزئي المجالات الخرز الصغير للحقنة. على سبيل مثال، في واحدة من تجاربنا، نصف الأجنة تلقي 1 إلى 2 الجزئي المجالات الخرز الصغير للحقنة (12 من أصل 25 الأجنة في المذهبة س + المجموعة10 PS)، تلقي بعض 3 إلى 4 (8 من أصل 25 الأجنة)، وعدد قليل تلقي 5 إلى 7 الجزئي المجالات الخرز الصغير (م 5 من أصل 25 بريس). ومع ذلك، لا تؤثر هذه الاختلافات مستويات الاستجابات الخلوية استفزاز، كما ورد في دراسة سابقة33.
المقبل، ونحن التحقيق في ما إذا كان وجود الجزئي المجالات الخرز الصغير له تأثير على تطور الإصابة في الزرد الأجنة طعنت بجرعات منخفضة في المذهبة س.. وتحقيقا لهذه الغاية، نحن حقن حوالي 600 زيمبابوي في المذهبة س-مشري مع أو بدون ملاحظة:10. استخدمنا طريقتين لدراسة تطور الإصابة: الثقافة الكمية (ط) التقليدية من الأجنة المصابة بعد سحق، و (ثانيا) سجل للكشف المجهري ("التهديف مجهرية") من البكتيريا الفلورسنت (S. aureus-مشري). أننا بالمقارنة مع النتائج من هذه الأساليب اثنين. النقاط عرفت أنها رؤية البكتيريا الفلورسنت في الأجنة، بغض النظر عن شدة الأسفار "نعم أو لا". النتائج التي توصلنا إليها أظهرت أن جميع الأجنة مع أكثر من 20 من زيمبابوي في المذهبة س-مشري الإيجابية في التهديف مجهرية (نقاط حمراء في الشكل 3). لزيمبابوى 600 س المذهبة للجنين، يبدو وجود PS10 أن لا تؤثر تأثيراً كبيرا على تطور الإصابة. في كل وقت النقاط، كل تكرار إصابة الأجنة (المشار إليها بأعلى الشكل 3، جرعة التحدي منخفضة) ولم تكن أرقام زيمبابوي بعد سحق مختلفة للأجنة مع أو بدون PS10 (الشكل 3، التحدي منخفضة الجرعة). هذا يشير إلى أن أعلى جرعة التحدي في المذهبة س. مطلوبة من أجل دراسة الآثار المحتملة للمواد الحيوية في تطور العدوى في الأجنة الزرد. ومن ثم فإننا حقن حوالي 1,000 زيمبابوي في المذهبة س. في حضور وغياب PS10 في الأجنة. التهديف المجهري لم تظهر فروق في تواتر الأجنة المصابة مع أو بدون ملاحظة:10 في أي وقت نقطة (الشكل 3، جرعة عالية من التحدي). ثقافة الكمية، ومع ذلك، أظهرت أرقام زيمبابوي أعلى استردادها من الأجنة في المذهبة س + PS10 مجموعة من تلك التي تم استردادها من المجموعة S. aureus-فقط في يومين بعد الحقن (الشكل 3، عالية جرعة التحدي).
لتقدير مدى الإصابة في الوجود وفي غياب الحيوية في الأجنة الزرد بتحليل الصور، سجلنا مجموعة من الصور التي تبين تطور الإصابة في المذهبة س-مشري (زيمبابوي 1,000 للجنين) في الوجود و غياب PS10 في الأجنة الحية على مر الزمن (الشكل 4 أ). كما سجلنا تسلل كايد أخضر نيون معربا عن البروتين الضامة استفزاز في الأجنة لقياس الاستجابة المناعية الخلية (الشكل 4 باء). وقد تخضع بروتين فلوري كايد تحويل اللون من الأخضر إلى اللون الأحمر تحت التعرض للأشعة فوق البنفسجية الخفيفة، اعتماداً على وقت التعرض وشدة الضوء39. ومع ذلك، لم يلاحظ مثل تحويل اللون بشرط التجريبية المستخدمة في هذه الدراسة. كثافة fluorescence البكتيريا إصابة كذلك اعتبارا من الضامة المتسللة داخل منطقة موحدة حول موقع الحقن تم قياسه بواسطة ملف المشروع أوبجيكتج لدينا "الزرد-إيمونوتيست"، تعمل داخل صورة ج. " يعرف الزرد-إيمونوتيست "منطقة موحدة يبلغ قطرها 100 ميكرومتر (الدوائر الصفراء في الشكل 4) حول نقطة الحقن المشار إليه. في الأجنة، يشمل هذا المجال معظم البكتيريا الفلورسنت المقيمين بالقرب من حقن الجزئي المجالات الخرز الصغير، فضلا عن الضامة المتسللة. تبين وجود مادة بيولوجية التأثير على كلا قابلية الأولية للعدوى والمناعة من استجابات الخلية. في حقن بعد ح 5، تسلل بلعم ردا في المذهبة س. فقط أعلى بكثير من استجابة في المذهبة س + PS10 (الشكل 5، تسلل بلعم، 5 hpi). وفي يوم 1 أظهرت الأجنة بعد الحقن مع PS10 مستويات أعلى بكثير من عدوى المكوّرات س. من الأجنة دون ملاحظة:10 (الشكل 5، تطور الإصابة، 1 نقطة في البوصة). وهكذا، أثبتت هذه النتائج الكمية أن الجمع بين الأسفار صورة التسجيل وملف المشروع أوبجيكتج "الزرد-إيمونوتيست" يمكن استخدامها لقياس تطور العدوى وأثارت استجابة الخلايا المناعية في حضور كل من مادة بيولوجية في الطراز الجنين الزرد. يسمح النموذج لتقييم الفروق الصغيرة في استجابات الخلايا المناعية، ومستويات العدوى البكتيرية الحية في، وأنه يتطلب إلا مجهر الأسفار ستيريو (مع تسجيل الصورة) والوصول المفتوح "الزرد-إيمونوتيست" للتقييم.
رقم 1: الإجراء التخطيطي لحقن المشارك التعليق الجزئي المجالات الخرز الصغير-البكتيريا في العضلات الذيل الأجنة الزرد. وقد تم تعديل هذا الرقم من تشانغ et al.33 مع الإذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: أرقام زيمبابوي في المذهبة س. تم استردادها من الأجنة الزرد حقن لقاح، تتراوح من 6000 إلى زيمبابوي 200 كل الأجنة وتقييمه على حقن بعد أيام 0 إلى 2- وتمثل الخطوط الحمراء عدد متوسط من زيمبابوي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: أرقام من زيمبابوي وسجل مجهرية من مشري البروتين-الإعراب عن المكوّرات س. (S. aureus-مشري) في الأجنة الزرد، المقررة في نقاط زمنية مختلفة- جرعة منخفضة من التحدي: 600 زيمبابوي في الجنين؛ جرعة عالية من التحدي: زيمبابوي 1,000 للجنين؛ ملاحظة:10: 10 ميكرون PS الجزئي المجالات الخرز الصغير؛ "+"، الأجنة حقن المكوّرات س-مشري جنبا إلى جنب مع ملاحظة:10؛ "-"، حقن الأجنة المذهبة س-مشري فقط، ذلك دون ملاحظة:10. وحقق مجهريا للبكتيريا الفلورسنت الأجنة تم اختيارها عشوائياً للثقافة كمية من البكتيريا بعد سحق الأجنة في يوم الحقن (يوم 0) وفي حقن بعد انتهاء يوم 1 و 2 يوم. الأجنة مجهريا وسجل إيجابي وسلبي للبكتيريا الفلورسنت ترد في النقاط الحمراء والسوداء، على التوالي. أرقام تسجيل النقاط الإيجابية مجهريا الأجنة مقسوماً على إجمالي عدد الأجنة سجل (تردد الأجنة المصابة) عند كل نقطة الوقت مبينة في الجزء العلوي من الرسم البياني. وجرى تحليل الاختلافات في ترددات أجنة المصابة وفي إعداد من زيمبابوي بين المذهبة س. + PS10 ومجموعات المذهبة س. فقط عند كل نقطة في الوقت فيشر ' الضبط واختبار مان-ويتني، على التوالي. p ≤ 0.05. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: صور الممثل تسجيل تطور الإصابة معربا عن مشري المذهبة س. (أحمر) في الوجود وغياب 10 ميكرون PS الجزئي المجالات الخرز الصغير (PS10، الأزرق) وتسلل استفزاز كايد البروتين-الإعراب عن الضامة (ب، الأخضر) في الأجنة، من حقن بعد (hpi) ح 5 إلى 3 أيام بعد الحقن (dpi)- واستخدمت كعناصر تحكم عدم تعامل الأجنة (NT). وتشير الدوائر الصفراء (100 ميكرومتر في القطر) إلى منطقة موحدة في موقع الحقن للأسفار القياس الكمي باستخدام ملف المشروع أوبجيكتج "الزرد-إيمونوتيست'. الأسفار كمياً للبكتيريا والضامة هو مبين في الشكل 5. تغيير حجم أشرطة = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5: Fluorescence الكمي لتسلل بلعم تسبب في وجود وغياب 10 ميكرون PS الجزئي المجالات الخرز الصغير (ملاحظة:10) في الأجنة الزرد من 5 ساعات بعد الحقن (hpi) ليومين وتطور الإصابة المذهبة س. بعد الحقن (نقطة في البوصة)، المشروع أوبجيكتج باستخدام ملف "الزرد-إيمونوتيست"- استخدمت منطقة موحدة في موقع الحقن للقياس الكمي الفلورية (التي يبلغ قطرها 100 ميكرومتر، كما أن الدوائر الصفراء في الشكل 4). واستخدمت كعناصر تحكم عدم تعامل الأجنة (NT). اختبار الفروق بين كل فريقين في كل مرة تم تحليل نقطة قبل مان-ويتني، *p ≤ 0.05، * *ف < 0.01، * * *ف < 0.001. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
العدوى المرتبطة بمادة بيولوجية (بأي) مضاعفات سريرية خطيرة. فهم أفضل للآلية المرضية بأي المجراة في أن يوفر رؤى جديدة لتحسين الوقاية والعلاج بأي. بيد أن الحالية تجريبية بأي نماذج حيوانية مثل نماذج مورين هي مكلفة وتتطلب عمالة مكثفة، وتتطلب تدريب العاملين المتخصصين في التقنيات الجراحية المعقدة. ولذلك، أن هذه النماذج ليست مناسبة لتحليل الإنتاجية العالية. نظراً لمتطلبات لالزرد الجنين النماذج أقل تعقيداً والتكاليف بشكل عام أقل من نماذج موريني، هذه الدراسة تقييم ما إذا كان يمكن استخدام الأجنة الزرد كنموذج حيوانات الفقارية رواية للتحقيق بأي في الحية، ومكملة نماذج الثدييات.
بغية إعداد نموذج بأي الجنين الزرد، قمنا بتطوير بروتوكول لحقن المشارك من البكتيريا والجزئي المجالات الخرز الصغير استناداً إلى أسلوب للحقن العضلي الجزئي المجالات الخرز الصغير في الأجنة ووصف قبل33. وبهذه الطريقة، معظم البكتيريا موجودة محيط الجزئي المجالات الخرز الصغير في الأجنة، محاكاة التفاعل مادة بيولوجية البكتيريا التي تحدث أثناء أو بعد وقت قصير من زرع الحيوية في البشر/الثدييات.
لتتمكن من مقارنة تطور الإصابة في الوجود وفي غياب الجزئي المجالات الخرز الصغير في الأجنة الزرد، ينبغي تحدي الأجنة مع الأرقام الأولية مماثلة للبكتيريا مع أو بدون الجزئي المجالات الخرز الصغير. ومع ذلك، ينتج الحقن المشارك بالتعليق الجزئي المجالات الخرز الصغير-البكتيريا وفقا لتجربتنا، أكثر البكتيريا حقنها من الحقن بتعليق "للبكتيريا فقط". لمعالجة هذه المسألة، ينبغي أن يكون متلائما مع النسبة بين تركيز البكتيريا في تعليق "للبكتيريا فقط" (دون الجزئي المجالات الخرز الصغير) وفي الوقف الجزئي المجالات الخرز الصغير-البكتيريا. في هذه الدراسة، تركيز المذهبة س. في تعليق "للبكتيريا فقط" يلزم حوالي 1.5 مرات أعلى من التركيز في التعليق الجزئي المجالات الخرز الصغير-البكتيريا. ما إذا كانت هذه النسبة ينطبق أيضا على سائر الأنواع البكتيرية والمواد الحيوية الأخرى ما زال لفحصها. الملاحظة، لإدخال أرقام مماثلة للبكتيريا مع أو بدون الجزئي المجالات الخرز الصغير، ينبغي فتح الإبر المستخدمة للحقن أما تعليق قريبة متطابقة قدر الإمكان.
عدة خصائص لمادة بيولوجية مثل الشكل والحجم دوراً هاما في تحديد إينجيكتابيليتي وحقن المشارك مع البكتيريا. في هذه الدراسة، واستخدمنا 10 ميكرون البوليستيرين الجزئي المجالات الخرز الصغير (PS10) كنموذج الحيوية. ووفقا لخبرتنا، الجزئي المجالات الخرز الصغير بحجم يصل إلى 15 ميكرون القابلة للحقن لمدة 3 أيام القديمة الأجنة بعد البروتوكول المتقدمة في الدراسة الحالية33. للجزئي المجالات الخرز الصغير بحجم كبير نسبيا (مثل، ≥ 10 ميكرون)، ونحن لا نشجع استعمال غير مونوديسبيرسيد أو على شكل غير منتظم الجزئي المجالات الخرز الصغير/المجهرية الدقيقة التي تميل إلى أن تسبب انسداد الإبرة. إذا كان يتم اختياره الحيوية في الأشكال الأخرى من الجولة وفي أحجام مختلفة لاستخدامها، يحتاج إينجيكتابيليتي بهم لفحصها. استخدمنا ل (co) حقن الجزئي المجالات الخرز الصغير والبكتيريا، حل بوفيدون (حماية الأصناف النباتية) 4% لتسهيل انتشارها. قد يكون هذا مفيداً لضخ الحيوية مع أو بدون البكتيريا في الأجنة بشكل عام.
كما كان الحال بالنسبة للحقن الجزئي المجالات الخرز الصغير سوى33،40، تفاوتت أرقام الجزئي المجالات الخرز الصغير حقن الأجنة جنبا إلى جنب مع البكتيريا الواحدة وحقن، معظمهم تتراوح من 1 إلى 4 الجزئي المجالات الخرز الصغير للجنين. ومع ذلك، نظراً لهذه الاختلافات لم تسفر عن الاختلافات في مستويات استجابة الخلايا المناعية استفزاز في الأجنة33، أنهم أيضا لا يتوقع للتأثير على الآثار المحتملة للجزئي المجالات الخرز الصغير في تطور العدوى. ومع ذلك، المطلوبة رواية النهج السماح حقن ميكروسفيري واحد (وحدة أو بالاشتراك مع البكتيريا).
قمنا بتقييم ما إذا كان التسجيل مجهرية من وجود البكتيريا الفلورسنت يمكن استخدامها "نعم أو لا" سجل النظام لتحليل تطور الإصابة في الأجنة الحية. وعرف معيار درجة مجهرية إيجابية كوجود البكتيريا الفلورسنت مرئية، بغض النظر عن شدة الأسفار. بالمقارنة مع الثقافة كمية من البكتيريا، رأي نتائجنا الممثل أن التهديف مجهرية يمكن أن تميز الأجنة مع زيمبابوي 20 أو أكثر من البكتيريا المكوّرات س. من الأجنة مع عدد أقل من زيمبابوي أو أي عدوى. وهكذا، نظراً لانخفاض أرقام فقط من البكتيريا اللازمة لنقاط إيجابية، هذا الأسلوب تقريبا حساسة كثقافة الكمية. إذ لا تحتاج إلى التضحية بالأجنة ولا مجاهر الراقية أو أنظمة الفرز للأسفار مطلوبة لإجراء تحليلات باستخدام هذا الأسلوب، ونحن نعتبر مجهرية التهديف أسلوب بسيط ولكن موثوق بها لمراقبة تطور الإصابة البكتيريا في الأجنة الحية. التحليل الكمي لمستوى الإصابة (بدلاً من "نعم أو لا" نظام التسجيل كما هو موضح أعلاه) واستجابة الخلايا المناعية في أجنة حية واحدة، قمنا بتطبيق ملف المشروع أوبجيكتج "الزرد-إيمونوتيست" لقياس كثافة الأسفار وسجلت البكتيريا الفلورسنت والضامة الفلورسنت على مر الزمن. قمنا باستخدام منطقة موحدة (التي يبلغ قطرها 100 متر) المحيطة بموقع الحقن لقياس الأسفار، حيث أبدى هذا المجال تشمل أغلبية من البكتيريا والضامة المتسللة. تم نشر دليل مفصل من "الزرد-إيمونوتيست" سابقا33،40. من المذكرة، هو "الزرد-إيمونوتيست" المكون إضافي لوصول مفتوحة إيماجيج، التي يمكن أن تكون مصممة من قبل المستخدم. على سبيل المثال، يمكن تغيير القطر في مجال تحليل ومعلمات أخرى من "الزرد-إيمونوتيست" بحرية وفقا لإعداد الدراسة (انظر تقديم أمثلة في الارتباط في الخطوة 7 في البروتوكول).
من أجل إظهار الآثار المعززة للعدوى المحتملة للحيوية في الأجنة الزرد، جرعة التحدي البكتيريا يحتاج إلى تقييم. في هذه الدراسة، وجدنا أن هناك حاجة إلى جرعة تحدي من زيمبابوي 1,000 س المذهبة للجنين أو أعلى. تم العثور على مستويات أعلى من عدوى المكوّرات س. في الأجنة مع PS10 من تلك دون PS10 في أول يومين بعد الحقن، مما يشير إلى أن وجود المواد الحيوية ويسهل عابر ثمرة المذهبة س. في الأجنة. سواء العدوى تظل المستويات العالية في وجود الحيوية في نقاط زمنية لاحقة ينبغي أن تدرس استخدام الأجنة الأكبر سنا تحت الموافقة الأخلاقية وفقا للأنظمة المعمول بها. نظراً لتطهير S. aureus في الأجنة الزرد تعتمد أساسا على البلعمه والقتل على أيدي الضامة والعدلات،من2324، يمكن تفسير ثمرة البكتيريا انخفاض الفعالية البالعات لقتل البكتيريا بسبب وجود المواد الحيوية. هذا هو تمشيا مع تعزيز خطر العدوى المعروفة بالحيوية في المرضى2،،من415, أيضا عادة لاحظت في نماذج حيوانية أكثر تعقيداً مثل الماوس وغيرها نماذج حيوانية10 11، ،،من1213. بالإضافة إلى عدوى المكوّرات س. ، يمكن أن يحقق في تطور العدوى S. epidermidis أو مسببات الأمراض الأخرى حضور الحيوية بعد البروتوكول، المذكورة في هذه الدراسة. من هذه النقطة الحيوية، العديد من الخصائص المادية (مثل التركيب الكيميائي، ، هيدروفوبيسيتي وخشونة والتهم السطحية) قد تؤثر على الاستجابات الخلوية و/أو تفاعل البكتيريا-المواد41، 42-أظهرت الدراسة السابقة أن الحقن مادة بيولوجية (حضور حماية الأصناف النباتية) حرضت تسلل بلعم أقوى مقارنة بالحقن فقط حماية الأصناف النباتية في الأجنة الزرد. وعلاوة على ذلك، ردت الزرد الأجنة بشكل مختلف على الجزئي المجالات الخرز الصغير مصنوعة من بولي (-كابرولاكتوني) و البوليستيرين33. ولذلك، قد حقن الجزئي المجالات الخرز الصغير طبيعة مختلفة أيضا الآثار المتفاوتة على النهوض بالعدوى، التي يمكن تقييمها بسهولة نسبيا بالطريقة الموضحة هنا.
لمزيد من التطوير، يجوز تعديل هذا النموذج بأي الجنين الزرد ليضم النظام إنتاجية عالية الآلي حقن الروبوتية27،43وتحليل بارامتريه كائن معقد وفرز النظم (COPAS)، وإنتاجية عالية الجيش الملكي النيبالي تسلسل تحليل27،44. يجوز استخدام هذه النماذج بأي الإنتاجية العالية المستندة إلى الجنين الزرد كالنظم الحيوانية كله في فيفو فحص واختبار مدى الحيوية (رواية)، فضلا عن اختبار مدى فعالية العلاجات المضادات الحيوية أو غيرها من استراتيجيات مكافحة--بأي. وعلاوة على ذلك، هو البقاء داخل الخلايا إحدى الاستراتيجيات الرئيسية للبكتيريا البقاء على قيد الحياة حضور الحيوية9،،من1011،،من1213. لقد ثبت فائدة الزرد الأجنة لدراسة الإصابة داخل الخلايا في عدة دراسات36،46. وهكذا، يمكن استخدام نموذجنا الجنين لدراسة بقاء داخل الخلايا العنقوديات أو سائر العوامل الممرضة داخل الخلايا حضور الحيوية، واستراتيجيات لعلاج هذه العدوى داخل الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام تقنيات التهجين في الموقع45 في النموذج لدراسة تأثير البكتيريا أو الحيوية أو الجمع بينهما في التعبير عن الجينات خاصة في موقع الحقن، التي قد تكون مفيدة لاكتشاف الجينات علامة بأي.
وباختصار، يظهر هذه الدراسة إمكانيات الأجنة الزرد مع الأساليب المتقدمة هنا لدراسة الإصابة المرتبطة بمادة بيولوجية في الوقت الحقيقي المجراة. ولذلك قد استخدام هذا النموذج الجنين الزرد للتحقيق في رواية الحيوية مقاومة للعدوى ومنع واعدة واستراتيجيات العلاج بأي، وسد الفجوة بين الدراسات في المختبر ونماذج حيوانية أكبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذه الدراسة ماليا يدعمها المشروع إيبيزا البرنامج المواد الطبية الحيوية (بم) ويشترك في تمويله وزارة الشؤون الاقتصادية في هولندا. الكتاب يود أن يشكر الأستاذ الدكتور غراهام ليشكي من جامعة موناش، أستراليا لتوفير خط الزرد المحورة وراثيا (mpeg1:Gal4/UAS:Kaede).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptic soya agar | BD Difco | 236950 | Media preparation unit at AMC |
| Tryptic soya broth | BD Difco | 211825 | |
| Polyvinylpyrrolidone40 | Applichem | A2259.0250 | |
| 10 µm diameter polystyrene microspheres (blue fluorescent) | Life technology/ThemoFisher | F8829 | |
| Glass microcapilary (1 mm O.D. x 0.78 mm I.D.) | Harvard Apparatus | 30-0038 | |
| Micropipette puller instrument | Sutter Instrument Inc | Flaming p-97 | |
| Light microscope LM 20 | Leica | MDG33 10450123 | |
| 3-aminobenzoic acid (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Agarose MP | Roche | 11388991001 | |
| Stereo fluorescent microscope LM80 | Leica | MDG3610450126 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956.003 | |
| Micromanipulator M3301 with M10 stand | World Precision Instruments | 00-42-101-0000 | |
| FemtoJet express micro-injector | Eppendorf | 5248ZO100329 | |
| Microtrube 2 mL pp | Sarstedt | 72.693.005 | |
| Zirconia beads | Bio-connect | 11079124ZX | |
| MagNA lyser | Roche | 41416401 | |
| MSA-2 plates (Mannitol Salt Agar-2) | Biomerieux | 43671 | Chapmon 2 medium |
| Methyl cellulose 4000cp | Sigma-Aldrich | MO512-250G | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Gyrotory shaker (for bacterial growth) | New Brunswick Scientific | G10 | |
| Zebrafish incubator | VWR | Incu-line | |
| Cuvettes | BRAND | 759015 | |
| Centrifuge | Hettich-Zentrifugen | ROTANTA 460R | |
| Spectrometer | Pharmacia biotech | Ultrospec®2000 | |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F6521-1EA | |
| 48 well-plates | Greiner bio-one | 677180 | |
| 96 well-plates | Greiner bio-one | 655161 | |
| Petri dish | Falcon | 353003 | |
| Petri dish | Biomerieux | NL-132 | |
| ImageJ | Not applicable | Not applicable | link: https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| GraphPad 7.0 | Prism | Not applicable |
References
- Williams, D. F. On the nature of biomaterials. Biomaterials. 30, 5897-5909 (2009).
- Busscher, H. J., et al. Biomaterial-Associated Infection: Locating the Finish Line in the Race for the Surface. Science Translational Medicine. 4, 153rv10 (2012).
- Otto, M. Staphylococcus epidermidis - the 'accidental' pathogen. Nature Reviews Microbiology. 7, 555-567 (2009).
- Moriarty, T. F., et al. Orthopaedic device-related infection: current and future interventions for improved prevention and treatment. EFORT Open Reviews. 1, 89-99 (2016).
- Campoccia, D., Montanaro, L., Arciola, C. R. The significance of infection related to orthopedic devices and issues of antibiotic resistance. Biomaterials. 27, 2331-2339 (2006).
- Schierholz, J. M., Beuth, J. Implant infections: a haven for opportunistic bacteria. Journal of Hospital Infection. 49, 87-93 (2001).
- Zimmerli, W., Lew, P. D., Waldvogel, F. A. Pathogenesis of foreign body infection. Evidence for a local granulocyte defect. Journal of Clinical Investigation. 73 (4), 1191-1200 (1984).
- Boelens, J. J., et al. Biomaterial-associated persistence of Streptococcus epidermidis in pericatheter macrophages. Journal of Infectious Diseases. 181 (4), 1337-1349 (2000).
- Broekhuizen, C. A. N., et al. Tissue around catheters is a niche for bacteria associated with medical device infection. Critical Care Medicine. 36, 2395-2402 (2008).
- Riool, M., et al. Staphylococcus epidermidis originating from titanium implants infects surrounding tissue and immune cells. Acta Biomaterial. 10, 5202-5212 (2014).
- Zaat, S. A. J., Broekhuizen, C. A. N., Riool, M. Host tissue as a niche for biomaterial-associated infection. Future Microbiology. 5, 1149-1151 (2010).
- Broekhuizen, C. A. N., et al. Staphylococcus epidermidis is cleared from biomaterial implants but persists in peri-implant tissue in mice despite rifampicin/vancomycin treatment. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 85, 498-505 (2008).
- Broekhuizen, C. A. N., et al. Peri-implant tissue is an important niche for Staphylococcus epidermidis in experimental biomaterial-associated infection in mice. Infection and Immunity. 75, 1129-1136 (2007).
- Zimmerli, W., Sendi, P. Pathogenesis of implant-associated infection: the role of the host. Seminars in Immunopathology. 33, 295-306 (2011).
- Darouiche, R. O. Current concepts - Treatment of infections associated with surgical implants. New England Journal of Medicine. 350, 1422-1429 (2004).
- Riool, M., de Breij, A., Drijfhout, J. W., Nibbering, P. H., Zaat, S. A. J. Antimicrobial peptides in biomedical device manufacturing. Frontiers in Chemistry. 5, 63 (2017).
- Brooks, B. D., Brooks, A. E., Grainger, D. W. Antimicrobial medical devices in preclinical development and clinical use. Biomaterials Associated Infection. Moriaty, F. T., Zaat, S. A., Busscher, H. J. , Springer. New York, NY, USA. 307-354 (2013).
- Sjollema, J., et al. The potential for bio-optical imaging of biomaterial-associated infection in vivo. Biomaterials. 31, 1984-1995 (2010).
- Suri, S., et al. In vivo fluorescence imaging of biomaterial-associated inflammation and infection in a minimally invasive manner. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103, 76-83 (2015).
- Zhou, J., Hu, W. J., Tang, L. P. Non-invasive characterization of immune responses to biomedical implants. Annals of Biomedical Engineering. 44, 693-704 (2016).
- van Oosten, M., et al. Real-time in vivo imaging of invasive- and biomaterial-associated bacterial infections using fluorescently labelled vancomycin. Nature Communications. 4, 2584 (2013).
- Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current Opinion in Microbiology. 11, 277-283 (2008).
- Brannon, M. K., et al. Pseudomonas aeruginosa Type III secretion system interacts with phagocytes to modulate systemic infection of zebrafish embryos. Cellular Microbiology. 11, 755-768 (2009).
- Wiles, T. J., Bower, J. M., Redd, M. J., Mulvey, M. A. Use of zebrafish to probe the divergent virulence potentials and toxin requirements of extraintestinal pathogenic Escherichia coli. PLoS Pathogens. 5, e1000697 (2009).
- Prajsnar, T. K., et al. Zebrafish as a novel vertebrate model to dissect enterococcal pathogenesis. Infection and Immunity. 81, 4271-4279 (2013).
- Prajsnar, T. K., Cunliffe, V. T., Foster, S. J., Renshaw, S. A. A novel vertebrate model of Staphylococcus aureus infection reveals phagocyte-dependent resistance of zebrafish to non-host specialized pathogens. Cellular Microbiology. 10, 2312-2325 (2008).
- Veneman, W. J., et al. A zebrafish high throughput screening system used for Staphylococcus epidermidis infection marker discovery. BMC Genomics. 14, 255 (2013).
- Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity. Disease Model and Mechanism. 5, 38-47 (2012).
- Meijer, A. H., van der Vaart, M., Spaink, H. P. Real-time imaging and genetic dissection of host-microbe interactions in zebrafish. Cellular Microbiology. 16, 39-49 (2014).
- Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).
- Riool, M., et al. A chlorhexidine-releasing epoxy-based coating on titanium implants prevents Staphylococcus aureus experimental biomaterial-associated infection. European Cells and Materials. 33, 143-157 (2017).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. Mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, E49-E56 (2011).
- Zhang, X., et al. The zebrafish embryo as a model to quantify early inflammatory cell responses to biomaterials. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105, 2522-2532 (2017).
- Traber, K., Novick, R. A slipped-mispairing mutation in AgrA of laboratory strains and clinical isolates results in delayed activation of agr and failure to translate delta- and alpha-haemolysins. Molecular Microbiology. 59, 1519-1530 (2006).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. 61, 3781 (2012).
- Brand, M., Granato, M., Christiane, N. -V. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish, A Practical Approach. Dahm, R., Nüsslein-Volhard, C. , Oxford University press. Oxford, UK. 7-37 (2002).
- Chaplin, W. T. P. Development of a microinjection platform for the examination of host-biomaterial interactions in zebrafish embryos. , Queen's University. Master thesis (2017).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 99, 12651-12656 (2002).
- Witherel, C. E., Gurevich, D., Collin, J. D., Martin, P., Spiller, K. L. Host-biomaterial interactions in zebrafish. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4, 1233-1240 (2018).
- Anderson, J. M. Biological responses to materials. Annual Review of Materials Research. 31, 81-110 (2001).
- Onuki, Y., Bhardwaj, U., Papadimitrakopoulos, F., Burgess, D. J. A review of the biocompatibility of implantable devices: current challenges to overcome foreign body response. Journal of Diabetes Science and Technology. 2, 1003-1015 (2008).
- Carvalho, R., et al. A High-Throughput Screen for Tuberculosis Progression. PLoS One. 6, e16779 (2011).
- Stockhammer, O. W., et al. Transcriptome analysis of Traf6 function in the innate immune response of zebrafish embryos. Molecular Immunology. 48, 179-190 (2010).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3, 59 (2007).
- Prajsnar, T. K., et al. A privileged intraphagocyte niche is responsible for disseminated infection of Staphylococcus aureus in a zebrafish model. Cellular Microbiology. 14, 1600-1619 (2012).
