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Bioengineering

Um modelo de embrião de Zebrafish para na visualização de Vivo e Intravital análise de biomateriais-associado Staphylococcus aureus infecção

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58523
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 2,3, 4, 1
1Department of Medical Microbiology, Amsterdam UMC, 2Technical Medical Center, Department of Biomaterials Science and Technology, University of Twente, 3Department of Biomedical Engineering, W.J. Kolff Institute, University Medical Center Groningen, University of Groningen, 4Institute of Biology, Leiden University

Summary

O presente estudo descreve um modelo de embrião de zebrafish para visualização in vivo e intravital análise de infecção biomaterial associada ao longo do tempo com base em microscopia de fluorescência. Este modelo é um sistema promissor complementando modelos animais mamíferos, tais como modelos de rato para o estudo in vivo de infecções associadas a biomaterial.

Abstract

Infecção associada biomaterial (BAI) é das principais causas do fracasso de biomateriais/dispositivos médicos. Staphylococcus aureus é um dos principais patógenos em BAI. Atual animal experimental de mamíferos BAI modelos tais como modelos de mouse são dispendiosos e demorados e, portanto, não é adequado para análise de alto rendimento. Assim, novos modelos animais como sistemas complementares para investigar BAI in vivo são desejados. No presente estudo, visamos desenvolver um modelo de embrião de zebrafish para visualização in vivo e intravital análise de infecção bacteriana na presença de biomateriais baseado em microscopia de fluorescência. Além disso, estudou-se a resposta de macrófagos provocado. Para este fim, usamos de expressar a proteína fluorescente S. aureus e embriões de zebrafish transgênicos expressando proteínas fluorescentes em seus macrófagos e desenvolveu um procedimento para injetar o músculo bactérias sozinhos ou em conjunto com microesferas tecido de embriões. Para monitorar a progressão da infecção bacteriana em embriões ao vivo ao longo do tempo, criámos um método simples mas confiável de marcar microscópica de bactérias fluorescentes. Os resultados de marcar microscópica mostraram que todos os embriões com mais de 20 unidades de formadoras de Colônia (UFC) de bactérias produziram um positivo sinal fluorescente de bactérias. Para estudar os efeitos potenciais de biomateriais na infecção, determinamos os números CFU de S. aureus com e sem 10 µm microesferas de poliestireno (PS10) como biomateriais modelo nos embriões. Além disso, usamos o arquivo de projeto ObjectJ "Zebrafish-Immunotest" operando em ImageJ para quantificar a intensidade de fluorescência da infecção por S. aureus com e sem PS10 ao longo do tempo. Os resultados de ambos os métodos mostraram números mais altos de S. aureus em embriões infectados com microesferas que em embriões sem microesferas, indicando uma susceptibilidade aumentada infecção na presença do biomaterial. Assim, o presente estudo mostra o potencial do modelo de embrião de peixe-zebra para estudar BAI com os métodos desenvolvidos aqui.

Introduction

Uma variedade de dispositivos médicos (referido como "biomateriais") são cada vez mais utilizados na medicina moderna para restaurar ou substituir as partes de corpo humano1. No entanto, a implantação de biomateriais predispõe um paciente à infecção, chamada uma infecção associada biomaterial (BAI), que é uma grande complicação dos implantes em cirurgia. Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis são duas espécies bacterianas mais prevalentes responsáveis por BAI2,3,4,5,6. Implantou a forma de biomateriais uma superfície suscetível à formação de biofilme bacteriano. Além disso, resposta imune local pode ser perturbada pelos biomateriais implantados, causando reduzida eficácia do apuramento bacteriana. A autorização inicial de infectar bactérias é realizada principalmente por infiltração de neutrófilos, fortemente reduzida capacidade bactericida na presença de um inserido ou implantado biomaterial7. Além disso, os macrófagos infiltrando o tecido após o fluxo inicial de neutrófilos será fagocitam as bactérias restantes, mas não pode efetivamente matá-los intracelular, devido a demente imunológico sinalizando que é uma consequência da presença combinada de o biomaterial e bactérias8. Assim, a presença de biomateriais pode facilitar a sobrevivência intracelular de bactérias9,10,11,12,13 e biofilme formação sobre o implantado biomateriais4,14. Consequentemente, BAI pode levar ao fracasso e a necessidade de substituição de biomateriais implantados, causando aumento de morbilidade e mortalidade e hospitalização prolongada com custos adicionais2,15.

Um número crescente de estratégias anti-BAI está sendo desenvolvidos2,16,17. Avaliação in vivo da eficácia destas estratégias em modelos animais relevantes é essencial. No entanto, a tradicional BAI animais modelos experimentais (por exemplo, modelos de rato, ) são geralmente caro, demorado e, portanto, não é adequado para testar a alta taxa de transferência de múltiplas estratégias18. O desenvolvimento recente de técnicas bio-óptico de imagem baseado em bioluminescentes/fluorescente rotular de bactérias e células hospedeiras pode permitir o monitoramento contínuo das interações hospedeiro-patógeno/hospedeiro-material e progressão de BAI em único pequenos animais como ratos18,19,20,21. No entanto, esta técnica é relativamente complexa e ainda em sua infância, e várias questões devem ser resolvidas para análise quantitativa de BAI18. Por exemplo, uma dose de alto desafio é necessário para visualizar a colonização bacteriana. Além disso, a luz espalhamento e adsorção de bioluminescência/fluorescência sinais em tecidos de mamíferos teste os animais também devem ser abordadas de19,18,21. Portanto, novo, cost-effective modelos animais, permitindo a visualização intravital e análise quantitativa ao longo do tempo são valiosos sistemas complementares para o estudo in vivo do BAI.

Zebrafish (embriões) têm sido usados como uma ferramenta versátil em vivo para dissecar as interações patógeno-hospedeiro e patogênese da infecção de diversas espécies bacterianas como micobactérias22, Pseudomonas aeruginosa23, Escherichia coli24, estafilococose Enterococcus faecalis2526,27. Zebrafish embriões têm muitas vantagens tais como a transparência óptica, um relativamente baixo custo de manutenção e a posse de um sistema imune altamente similar em mamíferos28,29. Isto torna o zebrafish embriões um organismo modelo altamente econômico, vivendo para visualização intravital e análise da progressão da infecção e hospedeiro associados respostas28,29. Para permitir a visualização do comportamento de célula zebrafish transgênicos, vivo em linhas com diferentes tipos de células do sistema imunológico (por exemplo,, de macrófagos e neutrófilos) e até mesmo com estruturas subcelulares fluorescente etiquetadas foram desenvolvidos28 ,29. Além disso, a taxa de reprodução alta de zebrafish fornece a possibilidade de desenvolver sistemas de teste de alto rendimento com injeção robótica automatizada, quantificação de fluorescência automatizada e de análise de sequência de RNA27, 30.

No presente estudo, objetivou-se desenvolver um modelo de embrião de zebrafish para infecção associada biomaterial, usando técnicas da imagem latente de fluorescência. Para este fim, nós desenvolvemos um procedimento para injetar bactérias (S. aureus) na presença de microesferas de biomaterial no tecido muscular de embriões de peixe-zebra. Usamos o S. aureus RN4220 expressando mCherry proteína fluorescente (s. aureus- mCherry), que foi construída conforme descrito em outro lugar para S. aureus outra estirpe de10,31. A linha de zebrafish transgênicos (mpeg1: UAS/Kaede) expressando Kaede proteína verde fluorescente nos macrófagos32 e azul fluorescente poliestireno microesferas foram usados. Em um estudo anterior, mostramos que a injeção intramuscular de microesferas em embriões de peixe-zebra para imitar o implante do biomaterial é viável33. Para analisar quantitativamente a progressão de BAI e infiltração de célula associada em embriões única ao longo do tempo, usamos o arquivo de projeto "Zebrafish-Immunotest", que é operado dentro de "ObjectJ" (um plug-in para ImageJ) para quantificar a intensidade da fluorescência de as bactérias que residem e macrófagos, infiltrando-se nas proximidades do local da injeção de microesferas33. Além disso, nós determinamos os números de formadoras de Colônia (UFC) de unidades de bactérias na presença e na ausência de microesferas nos embriões para estudar os efeitos potenciais de biomateriais na infecção. Nosso presente estudo demonstra que, com os métodos desenvolvidos aqui, o embrião de zebrafish é promissor, a novo vertebrado modelo animal para o estudo in vivo de infecções associadas a biomaterial.

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Protocol

Neste protocolo, manutenção de zebrafish adulto é em conformidade com os regulamentos locais de bem-estar animal como aprovado pelo Comitê de bem-estar animal local. Foram realizados experimentos com embriões de acordo com a Directiva 2010/63/UE.

1. preparação de "bactérias" e somente as suspensões de bactérias-microesferas

Nota: A tensão de RN4220 de S. aureus expressando a proteína fluorescente mCherry (S. aureus- mCherry) é usada. A tensão de RN4220 de S. aureus é de mutação do gene regulador de virulência agrA (regulador de acessório gene A)34e portanto pode ter virulência relativamente baixa no modelo de embrião de peixe-zebra. Outras cepas de aureus S. ou outras espécies bacterianas para BAI podem ser usados.

  1. Tomar 4 a 5 colônias de bactérias de RN4220 de S. aureus de placas de cultura de ágar tryptic soja suplementadas com 10 cloranfenicol µ g/mL e a cultura de bactérias para a fase de crescimento meados-logarítmica em 10 mL de caldo tryptic soja suplementado com 10 µ g/mL cloranfenicol em 37 ° C, sob agitação.
    1. Durante a cultura, diluir 100 µ l da suspensão bacteriana em 900 µ l de solução salina estéril tampão de fosfato (PBS) em uma cubeta (largura de 1 cm), para uma medição de densidade óptica (OD) a 620 nm (OD620). Cultura de bactérias até o OD620 atinge 0,4 – 0,8.
      Nota: Uma OD620 de 0.1 geralmente corresponde a 3,0 x 107 UFC/mL de S. aureus. O OD620 de um inóculo de bactérias em fase de crescimento logarítmico meados é entre 0.4-0.8. Períodos de tempo diferentes para cultivo podem ser necessários para outras espécies e cepas de bactérias.
  2. Centrifugar as bactérias em 3.500 x g durante 10 minutos e ressuspender as bactérias peletizadas em 1 mL de PBS estéril. Posteriormente, lavar as bactérias com estéril PBS 2 vezes e finalmente Ressuspender as bactérias em 1,1 mL de solução a 4% (p/v) polivinilpirrolidona40 (PVP40) em PBS.
  3. Vórtice esta suspensão bacteriana e diluir 100 µ l de suspensão em 900 µ l de PBS estéril em uma cubeta para a medição de620 OD. Ajuste a concentração da suspensão bacteriana com solução PVP40 . Esta é a suspensão de ""bactérias-somente.
  4. Biomateriais podem ser escolhidos livremente para misturar com a suspensão bacteriana. No presente estudo, microesferas comercial poliestireno (PS) (azul fluorescente, 10 µm) são utilizadas. Para gerar uma suspensão de bactérias-microesferas, as microesferas por 1 min em 1.000 x g, temperatura de centrifugação, descartar o sobrenadante e ressuspender as microesferas na suspensão de ""bactérias-somente (em solução de40 PVP).
  5. Para injetar doses aproximadamente iguais de bactérias na presença e na ausência de microesferas, a concentração de bactérias-microesferas suspensão precisa ser dois terços da concentração da suspensão de ""bactérias-somente (sem microesferas). Isto é conseguido por diluir a suspensão de bactérias-microesferas com 0,5 volume da solução de40 PVP. Misture as suspensões por num Vortex. Digno de nota, esta proporção (dois terços) foi avaliada por S. aureus. É também apropriado para S. epidermidis, mas é aconselhável verificar se esta relação também se aplica às outras espécies bacterianas e outros tamanhos (de 10 µm) ou formas de biomateriais (que microesferas) deve ser injetado.
  6. Verificar a concentração da suspensão "bactérias" e somente bactérias-microesferas pela cultura quantitativa de 10 vezes diluições em série como abaixo: transferência 100 µ l das suspensões de um 96-placa e serialmente diluída pela transferência de 10 alíquotas µ l do suspensão em 90 µ l de PBS estéril. Placa duplicados 10 alíquotas de µ l das suspensões não diluídas e diluídas em placas de agarose, incubar as placas a 37 ° C durante a noite, contar as colônias e calcular o número de bactérias (unidades formadoras de colônia. CFU).

2. reprodução, colheita e manutenção de embriões de peixe-zebra

  1. Siga os procedimentos gerais descritos anterior35,36 para reprodução, colheita e manutenção de embriões de peixe-zebra, com modificações descritas abaixo. Atravessar uma família de tipo selvagem Tupfel barbatana longa (TL) zebrafish ou zebrafish da linha selecionada transgénico (aqui, Mpeg1: Kaede) em um tanque com uma rede adicionado para induzir as fêmeas adultas para produzir ovos, depois que a luz acende, então separar adultos dos ovos produzidos.
  2. Recolher os embriões no dia seguinte e descartar os transparentes que não são viáveis. Manter aproximadamente 60 embriões por placa de Petri (100 mm de diâmetro) na E3 médio37 e incubar a 28 ° C. Remover embriões mortos e anormais e atualizar o E3 meio diariamente.

3. preparação de agulhas de injeção

  1. Prepare as agulhas de conta de vidro para injeção usando um instrumento de extrator de micropipeta. Use as seguintes configurações: calor: 772, puxar: 100, vel: 200, altura: 40, gás: 75.
  2. Quebre a ponta da agulha com a pinça na posição onde a agulha tem um diâmetro exterior de cerca de 20 µm (para 10 µm microesferas), usando um microscópio de luz com uma barra de escala na ocular. Evite agulhas com um tamanho de abertura muito grande, pois eles irão comprometer a sobrevivência dos embriões.
    Nota: A abertura pode ser escolhida para ser menor ou maior, dependendo do tamanho e forma dos biomateriais para ser injetado. Na literatura, injeções com agulhas com uma abertura de aproximadamente 50 µm foram relatadas para causar uma diminuição significativa na sobrevivência de embriões38.

4. injeção de ""bactérias-somente ou suspensão de bactérias-microesferas em embriões de peixe-zebra

  1. Aquecer a solução de agarose (1-1,5% (wt) no demi-água) usando um forno de microondas e despeje em um prato de Petri-100mm. Um modelo de molde de plástico em cima a solução de agarose na prato de Petri de lugar para criar recuos no agarose para a colocação de embriões em posições adequadas, facilitando as injeções. Incubar a temperatura ambiente e retire o molde quando a solução de agarose solidificou.
  2. Na pós-fertilização 3 d, coloque os embriões em um prato de Petri de 100mm contendo 0,02% (p/v) de ácido 3-aminobenzoico (tricaina) para anestesiar os. Depois de 5 min, transferir os embriões para a placa de agarose sobreposta com meio de E3 contendo 0,02% (p/v) tricaina e alinhá-los em uma orientação para a injeção. Para o Mpeg1: Kaede transgénica linha primeiro anestesiar embriões em E3 metanosulfonato de 0,02% (p/v) contendo médio. Em seguida, selecione embriões expressando proteínas fluorescentes verdes usando um microscópio de fluorescência estéreo.
  3. Carrega a agulha com aproximadamente 10 µ l da suspensão de ""bactérias-somente ou bactérias-microesferas usando uma ponta de pipeta microloader. Monte a agulha de um micromanipulador conectado para o micro-injector. Para o injetor usado aqui (ver tabela de materiais), utilizar as seguintes configurações para injeções de 2 – 3 nL: pressão: 300-350, pressão de retorno: 0, tempo: 2 ms.
    Nota: As configurações para o micro-injector dependem o injetor usado. Configurações de injector podem precisar de ser ajustados para injeções de bactérias misturadas com biomateriais com outras formas ou tamanhos.
    1. Use agulhas com a mesma abertura para a injeção da suspensão "Somente bactérias" e a suspensão de bactérias-microesferas. Se a agulha está quebrada ou entupida, sempre mude para uma nova agulha para mais injeções.
  4. Insira a agulha no tecido do músculo de embriões sob um microscópio óptico (Figura 1), em um ângulo de 45-60 ° entre a agulha e o corpo de embriões. Ajuste a posição da agulha no tecido, suavemente, movendo-o para a frente e para trás. Injete os embriões usando um pedal conectado ao micro-injector.
  5. Após a injeção de bactérias fluorescentes, marca os embriões para infecção bem sucedida sob um microscópio de fluorescência estéreo. Descarte o embriões marcados negativo (sem bactérias fluorescentes visíveis ou não visíveis microesferas fluorescentes). Manter os embriões individualmente em meio de E3 em placas boas 48. Meio de atualizar diariamente.

5. esmagamento de embriões, marcando microscópico e cultura quantitativa de bactérias

  1. Marca todos os embriões microscopicamente para a presença de bactérias fluorescentes, utilizando um microscópio de fluorescência estéreo, começando imediatamente após as injeções e todos os dias subsequentes até que os embriões são selecionados aleatoriamente para cultura quantitativa.
  2. Aleatoriamente, selecione alguns embriões de infectados ao vivo (5 a 6 no presente estudo) logo após a injeção e transferi-los individualmente para microtubos de 2ml separadas usando dicas estéril. Remover o meio, lave os embriões suavemente com PBS estéril uma vez e adicione 100 µ l de PBS estéril.
  3. Adicionar contas de zircônia estéril de 2 – 3 (2 mm de diâmetro) para cada frasco e esmagar os embriões usando o homogeneizador (ver Tabela de materiais) a 3.500 rpm por 30 s. cultura o homogenate quantitativamente, conforme descrito na etapa 1.3.
    Nota: Outros Homogeneizadores podem exigir configurações diferentes.
  4. Selecione aleatoriamente vários embriões nos dias subsequentes após a injeção para a cultura quantitativa, conforme item 5.3.

6. fluorescência microscopia de progressão da infecção e infiltração celular provocado em embriões de peixe-zebra

  1. Anestesiar os embriões conforme descrito na etapa 4.2. Pipete 500 µ l de solução PBS - 2% (wt) metil celulose para uma placa de Petri contendo meio de E3 com 0,02% (p/v) tricaina. Coloque os embriões na solução metil celulose e mantê-los em linha reta e horizontal.
    Nota: Solução de metil celulose é usada como uma "cola", que, devido a sua viscosidade, imobilizar temporariamente embriões na melhor orientação para a imagem latente.
  2. Uso de um microscópio de fluorescência estéreo equipado com campo claro, mCherry, proteína verde fluorescente (GFP) e UV filtros para embriões individual de imagem sob configurações otimizadas idênticas (por exemplo,, exposição, intensidade e ganho de tempo) na ampliação de 160 x . Defina o plano focal, tal que o dano tecidual causado pela injeção está em foco, usando o filtro de campo brilhante. Defina a profundidade Z-pilha 10 tamanho µm e passo a 5 µm, que permite a gravação de 3 imagens consecutivas.
  3. Embriões de imagem individuais uma vez por dia de pós-injeção de 5h até pós-injeção de 2 dias. Exclua embriões mortos (sem batimento cardíaco ou embrião parcialmente degradado) por mais de imagem e análise. Manter os embriões individualmente em meio de E3 em placas boas 48. Meio de atualizar diariamente.

7. análise quantitativa da intensidade de fluorescência da progressão da infecção e infiltração celular provocado usando o arquivo de projeto do objeto J "Zebrafish-Immunotest"

  1. Download "Zebrafish-Immunotest" e o manual detalhado da ligação: < https://sils.fnwi.uva.nl/bcb/objectj/examples/zebrafish/MD/zebrafish-immunotest.htmL>, conforme descrito em um anterior estudo33. Em breve, abrir imagens para análise com "Zebrafish-Immunotest", operando sob o programa freeware imagem J. Em cada imagem carregada, marca manualmente o local de injeção baseado o dano no tecido observado de embriões.
    Nota: o local marcado é usado pelo "Zebrafish-Immunotest" como o ponto central para detectar o pico de fluorescência, a uma distância de 50 µm. O pico de fluorescência detectada é usado como o centro de uma área padronizada (diâmetro de 100 µm) para medição de fluorescência.
  2. Clique em "cálculo" no menu objeto J para executar a medição fluorescente para múltiplos canais, se for o caso, automaticamente para todas as imagens. Exportar os dados e analisar por métodos de ensaio de estatística adequada.

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Representative Results

O presente estudo avaliou a aplicabilidade do zebrafish embriões de novela modelo animal vertebrado para investigar infecção associada biomaterial. Técnica de microinjeção tem sido comumente usada para injetar diferentes espécies bacterianas em embriões de peixe-zebra para causar infecção22,26,,27,30,36. Usando o procedimento descrito na Figura 1, S. aureus sozinho ou em conjunto com microesferas de PS 10 µm (PS10) foram injetadas no tecido muscular do zebrafish embriões no presente estudo. Injeção intramuscular de S. aureus causado infecção dose-dependente em embriões (Figura 2). As doses injetadas aproximaram-se as doses de desafio apontado (dia 0 na Figura 2). Observaram-se apenas a pequenas variações dentro de grupos. Embriões injetados com doses de alto desafio mostrou progressão variável infecção no dia 1 e 2 dias pós-injeção (Figura 2, UFC 6000 e 2000). O injetado bactérias S. aureus também foram erradicados ou havia proliferado e posteriormente estabeleceu altos níveis de infecção dentro os embriões. Isso é semelhante à relatada progressão da infecção por S. aureus após injeção intravenosa no zebrafish embriões26. Os embriões injetados com doses baixas de desafio de S. aureus desmarcada as bactérias (Figura 2, 600 e 200 CFU). Estes resultados indicaram que a dose de desafio de S. aureus influencia fortemente sua progressão da infecção em embriões de peixe-zebra.

Co injeção de bactérias e microesferas resultou em números mais altos de bactérias injetados do que a injeção de bactérias apenas (dados não mostrados). Ao preparar o inóculo bacteriano para as injeções de ""bactérias-somente em uma concentração mais elevada (aproximadamente 1,5 vezes maior) do que na suspensão de bactérias-microesferas, fomos capazes de superar a diferença nos números de UFC injetado. Desta forma, é possível injetar números semelhantes de bactérias em embriões na presença e na ausência de PS10 (dia 0, Figura 3). Os números de microesferas por injecção variaram. Por exemplo, em um de nossos experimentos, metade das microesferas de 1 a 2 embriões recebidos por injecção (12 de 25 embriões no grupo de10 PS + S. aureus ), alguns recebeu 3 a 4 (8 de 25 embriões) e alguns recebidas microesferas de 5 a 7 (em 5 de 25 bryos). No entanto, essas variações não influenciou os níveis das respostas celulares provocadas, como relatado em um anterior estudo33.

Em seguida, investigamos se a presença de microesferas tem um impacto sobre a progressão da infecção em embriões de zebrafish desafiado com baixas doses de S. aureus. Para este fim, nós injetamos aproximadamente 600 CFU de S. aureus- mCherry com ou sem PS10. Usamos dois métodos para estudar a progressão da infecção: (i) convencional cultura quantitativa dos embriões infectados após o esmagamento e (ii) marcando de deteção microscópica ("marcando microscópicos") de bactérias fluorescentes (S. aureus- mCherry). Comparamos os resultados a partir desses dois métodos. O placar foi definido como "Sim" ou "não" visibilidade de bactérias fluorescentes nos embriões, independentemente da intensidade de fluorescência. Nossos resultados mostraram que todos os embriões com mais de 20 CFU de S. aureus- mCherry foram positivos em microscópicas de Pontuação (pontos vermelhos na Figura 3). Para 600 CFU de S. aureus por embrião, a presença de PS10 parecia não influenciar significativamente a progressão da infecção. No momento todos os pontos, dois a frequência de infectados embriões (indicados no topo da Figura 3, dose baixa de desafio) e os números do UFC após o esmagamento não eram diferentes de embriões com ou sem PS10 (Figura 3, dose baixa de desafio). Isto sugere que doses maiores de desafio de S. aureus são necessários para estudar os efeitos potenciais de biomateriais na progressão da infecção em embriões de peixe-zebra. Daí, nós injetamos aproximadamente 1.000 CFU de S. aureus na presença e na ausência de PS10 em embriões. O marcador microscópico não mostrou diferenças na frequência dos embriões infectados com e sem PS10 em qualquer ponto do tempo (Figura 3, dose desafio elevado). A cultura quantitativa, no entanto, mostrou o maior número de UFC obtido embriões no S. aureus + PS10 grupo obtido o S. aureus -único grupo no pós-injeção de 2 dias (Figura 3, alta dose de desafio).

Para quantificar a extensão da infecção na presença e na ausência de biomateriais em embriões de peixe-zebra por análise de imagem, nós gravamos uma série de imagens que mostram a progressão da infecção de S. aureus- mCherry (1.000 CFU por embrião) na presença e ausência de PS10 em embriões ao vivo ao longo do tempo (Figura 4A). Também gravamos a provocado infiltração de macrófagos de expressar a proteína fluorescentes verde Kaede em embriões a quantificar a resposta imune celular (Figura 4B). Kaede proteína fluorescente pode ser sujeitas a conversão de cor de verde para vermelho sob exposição à luz UV, dependendo do tempo de exposição e intensidade da luz,39. No entanto, tal conversão de cor não foi observada sob a condição experimental utilizada no presente estudo. A intensidade de fluorescência da bactéria infectante também segundo os macrófagos infiltrante dentro de uma área padronizada em torno do local da injeção foi medida por nosso arquivo de projeto ObjectJ "Zebrafish-Immunotest", operando dentro imagem J." Zebrafish-Immunotest"define uma área padronizada com um diâmetro de 100 µm (círculos amarelos na Figura 4) em torno de um ponto indicado da injeção. Nos embriões, esta área incluía a maioria das bactérias fluorescentes que residem nas proximidades das microesferas injetadas, bem como os macrófagos infiltrante. A presença de um biomaterial foi mostrada para influenciar tanto inicial susceptibilidade à infecção e imune respostas de célula. No pós-injeção de 5h, infiltração de macrófagos em resposta a S. aureus só foi significativamente maior do que em resposta ao S. aureus + PS10 (Figura 5, infiltração de macrófagos, hpi 5). Em 1 dia pós-injeção embriões com PS10 mostraram níveis significativamente mais elevados de S. aureus infecção do que embriões sem PS10 (Figura 5, progressão da infecção, 1 dpi). Assim, estes resultados quantitativos demonstraram que a combinação de gravação de imagem de fluorescência e o arquivo de projeto ObjectJ "Zebrafish-Immunotest" pode ser usada para quantificar a progressão da infecção e provocou a resposta imune celular na presença de um biomaterial no modelo de embrião de peixe-zebra. O modelo permite avaliar pequenas diferenças nas respostas imunes celular e níveis de infecção bacteriana em vivo, e ele só precisa de um microscópio de fluorescência estéreo (com gravação de imagem) e o acesso aberto "Zebrafish-Immunotest" para avaliação.

Figure 1
Figura 1: esquemático procedimento de co injeção da suspensão de bactérias-microesferas no músculo cauda de embriões de zebrafish. Esta figura foi modificada de Zhang et al.33 com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: números de UFC de S. aureus obtido zebrafish embriões injetados com inóculos, variando de 6.000 a 200 CFU por embrião e avaliados no pós-injeção de 0 a 2 dias. As linhas vermelhas representam os números medianos de UFC. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Número de UFC e marcando microscópicas de proteína-expressando o S. aureus (S. aureus- mCherry) em embriões de peixe-zebra, avaliados em pontos diferentes do tempo de mCherry. Dose baixa de desafio: 600 CFU por embrião; Dose de alto desafio: 1.000 CFU por embrião; PS10: 10 µm PS microesferas; "+", embriões injetados com S. aureus- mCherry juntamente com PS10; "-", embriões injetaram com S. aureus- mCherry só, assim, sem PS10. Os embriões foram microscopicamente marcou para bactérias fluorescentes e selecionados aleatoriamente para cultura quantitativa de bactérias após o esmagamento de embriões no dia da injeção (dia 0) e no dia 1 e dia 2 pós-injeção. Os embriões microscopicamente marcados positivo e negativo para bactérias fluorescentes são mostrados em vermelhos e pretos pontos, respectivamente. Os números de positivo-marcando microscopicamente embriões divididos pelo número total de embriões marcados (frequência de embriões infectados) em cada ponto de tempo são indicados no topo do gráfico. As diferenças nas frequências de embriões infectados e em número de UFC entre o S. aureus + PS10 e S. aureus únicos grupos em cada ponto de tempo foram analisadas pelo pescador ' exata test e teste de Mann-Whitney, respectivamente. p ≤ 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Imagens representativas gravando a progressão da infecção de mCherry-expressando S. aureus (um, vermelho) em presença e ausência de 10 µm PS microesferas (PS10, azul) e a infiltração provocada de Kaede expressar a proteína macrófagos (B, verde) em embriões, de pós-injeção 5h (hpi) para injeção de pós de 2 dias (dpi). Embriões não-tratados (NT) foram usados como controles. Círculos amarelos (100 µm de diâmetro) indicam a área padronizada no local da injeção para quantificação de fluorescência usando o arquivo de projeto ObjectJ "Zebrafish-Immunotest'. A fluorescência quantificada de bactérias e de macrófagos é retratada na Figura 5. Barras de escala = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Quantificação de fluorescência de progressão de infecção de S. aureus e a infiltração de macrófagos provocado na presença e na ausência de microesferas de 10 µm PS (PS10) em embriões de peixe-zebra de pós-injeção de 5 horas (hpi) para 2 dias pós-injeção (dpi), usando o projeto de ObjectJ do arquivo "Zebrafish-Immunotest". Uma área padronizada no local da injeção foi usada para quantificação de fluorescência (com um diâmetro de 100 µm, indicado como círculos amarelos na Figura 4). Embriões não-tratados (NT) foram usados como controles. Diferenças entre cada dois grupos em cada ponto foram analisados pelo Mann-Whitney test, *p ≤ 0.05, * *p < 0,01, * * *p < 0,001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Infecção associada biomaterial (BAI) é uma complicação clínica grave. Uma melhor compreensão da patogênese de BAI em vivo proporcionaria novas ideias para melhorar a prevenção e tratamento do BAI. No entanto, atual BAI animais modelos experimentais tais como modelos de murino são caro, trabalhoso e exigem pessoal especializado treinado em técnicas cirúrgicas complexas. Portanto, estes modelos não são adequados para análise de alto rendimento. Desde que os requisitos para os modelos de embrião de zebrafish são menos complexos e custos em geral são inferiores para modelos murino, o presente estudo avaliou se zebrafish embriões podem ser usados como um novo modelo de animais vertebrado para investigar BAI em vivo, complementar à os modelos dos mamíferos.

Para configurar o modelo BAI embrião zebrafish, desenvolvemos um protocolo de co injeção de bactérias e microesferas com base em um método para injeção intramuscular de microesferas em embriões descrito antes33. Desta forma, a maioria das bactérias está presente nas proximidades as microesferas em embriões, imitando a interação bactéria-biomaterial que ocorre durante ou logo após o implante de biomateriais em seres humanos/mamíferos.

Para ser capaz de comparar a progressão da infecção na presença e na ausência de microesferas em embriões de peixe-zebra, embriões devem ser desafiados com semelhante número inicial de bactérias com e sem microesferas. No entanto, de acordo com nossa experiência, co injeção da suspensão de bactérias-microesferas resulta em mais bactérias sendo injetadas do que a injeção da suspensão de ""bactérias-somente. Para resolver esse problema, a relação entre a concentração de bactérias em suspensões de ""bactérias-somente (sem microesferas) e em suspensões de bactérias-microesferas deve ser adaptada. No presente estudo, a concentração de S. aureus na suspensão de ""bactérias-somente precisava ser aproximadamente 1,5 vezes maior do que a concentração na suspensão de bactérias-microesferas. Se esta relação também se aplica a outras espécies bacterianas e outros biomateriais continua a ser testado. Digno de nota, para injetar um número semelhante de bactérias com e sem microesferas, a abertura da agulha usada para injeções de qualquer suspensão deve ser tão perto de idêntico quanto possível.

Várias propriedades de um biomaterial como forma e tamanho de desempenham um papel importante na determinação do seu Injectabilidade e co injeção com bactérias. No presente estudo, nós usamos 10 µm microesferas de poliestireno (PS10) como biomateriais de modelo. De acordo com nossa experiência, microesferas de tamanho de até 15 µm são injetáveis por 3 dias velhos embriões seguindo o protocolo desenvolvidos no presente estudo33. Para microesferas de tamanho relativamente grande (por exemplo,, ≥ 10 µm), nós desencorajamos o uso de não-monodispersas ou microesferas/micropartículas de forma irregular, que tendem a causar entupimento da agulha. Se biomateriais em outras formas do que ronda e em tamanhos diferentes são escolhidos para ser usado, sua Injectabilidade precisa ser testado. Para (co-) injeção de microesferas e bactérias, foi utilizado uma solução de polivinilpirrolidona (PVP) de 4% para facilitar a dispersão. Isto pode ser útil para a injeção de biomateriais com e sem bactérias em embriões em geral.

Como foi o caso de injeções de microesferas apenas33,40, os números de microesferas injetados juntamente com bactérias embriões variaram por injeção, geralmente variando de 1 a 4 microesferas por embrião. No entanto, uma vez que essas variações não resultou em diferenças nos níveis de resposta celular imune provocada em embriões33, eles também não eram esperados para influenciar os efeitos potenciais das microesferas na progressão da infecção. No entanto, novas abordagens, permitindo que as injeções de um único micro (isoladamente ou em conjunto com as bactérias) que desejar.

Avaliamos se marcando microscópica da presença de bactérias fluorescentes pode ser usado como um "Sim ou não" sistema de Pontuação para analisar a progressão da infecção em embriões ao vivo. O critério de uma partitura microscópico positivo foi definido como a presença de bactérias fluorescentes visíveis, independentemente da intensidade de fluorescência. Comparado a cultura quantitativa de bactérias, nossos resultados representativos sugeriram que marcando microscópicas pode distinguir embriões com 20 ou mais UFC de bactérias S. aureus de embriões com números mais baixos de UFC ou não infecção. Assim, desde que apenas baixos números de bactérias são necessários para um resultado positivo, esse método é quase tão sensível como cultura quantitativa. Desde que os embriões não precisa ser sacrificado e não microscópios high-end ou sistemas de classificação para fluorescência são necessários para executar análises usando esse método, consideramos microscópicas marcando um método simples mas confiável para monitorar a progressão da infecção de bactérias em embriões ao vivo. Para análise quantitativa do nível de infecção (melhor que o "Sim" ou "não" sistema de Pontuação como descrito acima) e resposta imune celular em embriões ao vivo único, nós aplicamos o arquivo de projeto ObjectJ "Zebrafish-Immunotest" para quantificar a intensidade da fluorescência de as bactérias fluorescentes e fluorescentes macrófagos gravaram ao longo do tempo. Usamos uma área padronizada (com um diâmetro de 100 m) em torno do local da injeção para medir a fluorescência, uma vez que esta área foi mostrada para incluir a maioria das bactérias e os macrófagos infiltrante. Um manual detalhado de "Zebrafish-Immunotest" foi publicado anteriormente33,40. Digno de nota, "Zebrafish-Immunotest" é um plug-in de acesso aberto para ImageJ, que pode ser adaptada pelo usuário. Por exemplo, o diâmetro da área de análise e outros parâmetros de "Zebrafish-Immunotest" pode ser livremente alterado de acordo com o estudo de configuração (veja exemplos no link fornecido na etapa 7 do protocolo).

A fim de mostrar os possíveis efeitos de aumento da infecção de biomateriais em embriões de peixe-zebra, a dose de desafio de bactérias deve ser avaliada. No presente estudo, nós encontramos que uma dose de desafio de 1.000 CFU de S. aureus por embrião ou superior é necessária. Níveis mais altos de infecção de S. aureus em embriões com PS10 do que naqueles sem PS10 foram encontrados sobre os 2 primeiros dias após a injeção, indicando que a presença de biomateriais transitoriamente facilita a consequência natural de S. aureus nos embriões. Se a infecção permanece em níveis elevados na presença de biomateriais em pontos de tempo posteriores deve ser estudada usando embriões mais velhos sob aprovação ética de acordo com as regulamentações aplicáveis. Desde que o afastamento de S. aureus em embriões de peixe-zebra é principalmente dependente de fagocitose e morte por macrófagos e neutrófilos23,24, a consequência natural de bactérias pode ser explicado por uma reduzida eficácia do fagócitos para matar as bactérias devido a presença de biomateriais. Isto está em consonância com o reforço de risco de infecção conhecida por biomateriais em pacientes2,4,15, também comumente observado em modelos animais mais complexos, tais como o rato e outros modelos animais10 ,11,12,13. Além de S. aureus , infecção, a progressão da infecção de S. epidermidis ou outros agentes patogénicos na presença de biomateriais pode ser investigado seguindo o protocolo descrito no presente estudo. Do ponto de biomateriais, várias propriedades do material (por exemplo, a composição química, , hidrofobicidade, rugosidade e cargas de superfície) podem influenciar a resposta celular e/ou interação bactéria-material41, 42. nosso estudo anterior mostrou que a injeção de um biomaterial (na presença de PVP) provocou uma infiltração de macrófagos mais forte em comparação com injeção de PVP apenas em embriões de peixe-zebra. Além disso, os embriões zebrafish reagiram de forma diferente para microesferas feitas de poli (-Caprolactona) e poliestireno33. Portanto, a injeção de microesferas de diferente natureza também pode ter efeitos diferenciais na valorização da infecção, que pode ser facilmente avaliada segundo o método descrito aqui.

Para o desenvolvimento, este modelo BAI zebrafish embrião pode ser alterado para apresentando um sistema de alta taxa de transferência automatizada injeção robótico27,43, análise paramétrica de objeto complexo e classificação de sistemas (COPAS) e alta taxa de transferência Sequência do RNA análise27,44. Tais modelos BAI zebrafish baseada em embrião alto throughput podem ser usados como todo animais sistemas na vivo de triagem e testes de biomateriais anti-infecciosos (romance), bem como testes da eficácia dos tratamentos com antibióticos ou outras estratégias anti-BAI. Além disso, a sobrevivência intracelular é uma importante estratégia de bactérias para sobreviver na presença de biomateriais9,10,11,12,13. A utilidade de embriões de peixe-zebra para estudar infecção intracelular tem sido demonstrada em vários estudos36,46. Assim, nosso modelo de embrião pode ser usado para estudar a sobrevivência intracelular de estafilococos ou outros patógenos intracelulares na presença de biomateriais e estratégias para tratar tais infecções intracelulares. Além disso, técnicas de hibridização in situ45 pode ser usado no modelo para estudar a influência de bactérias ou biomateriais ou sua combinação na expressão de genes específicos no local da injeção, que pode ser útil para descobrir genes marcadores para BAI.

Em resumo, o presente estudo mostra o potencial de zebrafish embriões com os métodos desenvolvidos aqui para estudar a infecção associada biomaterial em tempo real em que vivo. Este modelo de embrião de zebrafish, portanto, pode ser utilizado para investigar novos biomateriais infecção resistente e promissor prevenção e estratégias de tratamento do BAI e a lacuna entre estudos in vitro e em modelos animais maiores.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este estudo foi financeiramente apoiado pelo projecto IBIZA do programa materiais biomédicos (BMM) e co-financiado pelo Ministério dos assuntos económicos. Os autores gostaria de agradecer a Prof. Dr. Graham Lieschke da Universidade de Monash, Austrália para fornecer a linha de zebrafish transgênicos (mpeg1:Gal4 / UAS:Kaede).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptic soya agar BD Difco 236950 Media preparation unit at AMC
Tryptic soya broth BD Difco 211825
Polyvinylpyrrolidone40 Applichem A2259.0250
10 µm diameter polystyrene microspheres (blue fluorescent) Life technology/ThemoFisher F8829
Glass microcapilary (1 mm O.D. x 0.78 mm I.D.) Harvard Apparatus 30-0038
Micropipette puller instrument Sutter Instrument Inc Flaming p-97
Light microscope LM 20 Leica MDG33 10450123
3-aminobenzoic acid (Tricaine) Sigma-Aldrich E10521-50G
Agarose MP Roche 11388991001
Stereo fluorescent microscope LM80 Leica MDG3610450126
Microloader pipette tips Eppendorf 5242956.003
Micromanipulator M3301 with M10 stand World Precision Instruments 00-42-101-0000
FemtoJet express micro-injector Eppendorf 5248ZO100329
Microtrube 2 mL pp Sarstedt 72.693.005
Zirconia beads Bio-connect 11079124ZX
MagNA lyser Roche 41416401
MSA-2 plates (Mannitol Salt Agar-2) Biomerieux 43671 Chapmon 2 medium
Methyl cellulose 4000cp Sigma-Aldrich MO512-250G
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
Gyrotory shaker (for bacterial growth) New Brunswick Scientific G10
Zebrafish incubator VWR Incu-line
Cuvettes BRAND 759015
Centrifuge Hettich-Zentrifugen ROTANTA 460R
Spectrometer Pharmacia biotech Ultrospec®2000
Forceps Sigma-Aldrich F6521-1EA
48 well-plates Greiner bio-one 677180
96 well-plates Greiner bio-one 655161
Petri dish Falcon 353003
Petri dish Biomerieux NL-132
ImageJ Not applicable Not applicable link: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
GraphPad 7.0 Prism Not applicable

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