Summary
현재 학문 vivo에서 시각화 및 형광 현미경 검사 법에 따라 시간이 지나면 소재 관련 감염의 intravital 분석을 위한 zebrafish 태아 모델을 설명 합니다. 이 모델은 소재 관련 감염 vivo에서 공부에 대 한 마우스 모델 같은 포유류 동물 모델을 보완 하는 유망한 시스템.
Abstract
소재 관련 감염 (바이) 바이오/의료 장치 실패의 주요 원인입니다. 황색 포도상구균 바이에 주요 병원 중 하나입니다. 현재 실험 바이 포유류 동물 모델 같은 마우스 모델은 비용이 많이 드는 고 어렵고, 따라서 높은 처리량 분석에 적합 하지 않은. 따라서, 바이 vivo에서 조사에 대 한 보완 시스템으로 새로운 동물 모델 원하는 됩니다. 현재의에서 연구, vivo에서 시각화 및 형광 현미경 검사 법에 따라 생체의 세균성 감염의 intravital 분석을 위한 zebrafish 태아 모델을 개발 하는 목적으로 우리. 또한, 만들었다 대 식 세포 반응 연구 했다. 이 위해, 우리는 형광 단백질을 표현 S. 구 균 및 그들의 세포에서 형광 단백질을 표현 하는 유전자 변형 zebrafish 태아를 사용 하 고 근육에 혼자 또는 스피어 함께 박테리아를 주입 하는 절차를 개발 태아 조직 시간이 지남에 라이브 배아에서 세균 감염 진행을 모니터링 하려면 우리는 형광 박테리아의 미세한 득점의 간단 하지만 신뢰할 수 있는 방법을 고안. 미세한 점수에서 결과 20 이상 식민지 형성 단위 (CFU) 박테리아의 모든 배아 박테리아의 긍정적인 형광 신호를 굴복 했다. 감염에 생체의 잠재적인 효과 연구, 우리는 결정 S. 구 균 의 CFU 숫자와 10 μ m의 폴리스 티 렌 스피어 (PS10) 없이 배아 생체 재료 모델. 또한, 우리 시간이 지남에 PS10 없이 S. 구 균 감염의 형광 강도 계량 ObjectJ 프로젝트 파일 "제 브라-Immunotest" ImageJ에서 사용. 두 방법의 결과 보다는 소재에 존재 증가 감염 민감성을 나타내는 스피어 없이 배아에 스피어와 감염 된 태아 S. 구 균 수가 보였다. 따라서, 현재 연구 여기 개발 방법으로 바이 공부 zebrafish 태아 모델의 잠재력을 보여줍니다.
Introduction
다양 한 의료 기기 ("바이오" 라고도 함) 점점을 복원 하거나 인체 부품1현대 의학에서 사용 하 고 있습니다. 그러나, 생체 이식 감염, 불리는 소재 관련 감염 (바이), 임 플 란 트 수술에서의 주요 합병증에 환자를 걸리기. 포도 상 구 균 그리고 포도 상 구 균 epidermidis 두 개의 가장 널리 퍼진 세균 종 바이2,,34,,56에 대 한 책임입니다. 이식 생체 재료 형태 표면 세균의 biofilm 형성에 취약 합니다. 또한, 로컬 면역 반응은 일으키는 세균성 클리어런스의 감소 효과 이식된 생체 재료에 의해 미친 수 있습니다. 박테리아 감염의 초기 허가 강하게 존재는 삽입 된 살 균 용량 감소 또는 이식 소재7호 중구 침투에 의해 주로 수행 됩니다. 또한, 후에 호 중구의 초기 유입 나머지 박테리아 phagocytose 것 있지만 수 없습니다 효과적으로 조직에 침투 하는 세포 그들을 죽 일 침,의 결합 된 존재의 결과 이다 미친된 면역 신호 때문 소재 및 박테리아8. 따라서, 생체 재료의 존재는 박테리아9,10,11,12,13 , biofilm 형성에는 이식의 세포내 생존을 촉진할 수 있다 바이오4,14. 따라서, 바이 실패 이어질 수 있으며 추가 비용2,15증가 병 적 상태와 사망률과 장기 입원을 일으키는 이식된 생체 재료의 교체에 대 한 필요.
개발된2,,1617안티 바이 전략의 수가 증가 되. 이러한 전략 관련 동물 모델에서의 효능의 vivo에서 평가 필수적 이다. 그러나, 전통적인 실험적인 바이 동물 모델 (예:, 마우스 모델)은 일반적으로 비용이 많이 드는, 어렵고, 따라서 여러 전략18의 높은 처리량 테스트에 적합 하지 않은. 발광/형광 호스트 세포와 박테리아의 라벨에 따라 바이오 광 이미징 기술의 최근 발전 한 작은 동물에서 바이 진행 및 호스트 재료 호스트 병원 체 상호 작용의 지속적인 모니터링에 대 한 수 있습니다. 같은 쥐18,19,,2021. 그러나,이 기술은 상대적으로 복잡 하 고, 그것의 초기 단계에 아직도 이며 바이18의 정량 분석에 대 한 몇 가지 문제를 해결 해야 합니다. 예를 들어, 높은 도전 복용량은 세균성 식민지를 시각화 해야 합니다. 또한, 비 산 빛을 생물 발광/형광 신호 포유류 테스트 또한 있어야 동물의 조직에의 흡착 처리18,,1921. 따라서, 소설, 시간이 지남에 intravital 시각화 및 정량 분석에 허용 된 동물 모델에는 바이 vivo에서 공부에 대 한 귀중 한 보완 시스템입니다.
Zebrafish (배아) 호스트 병원 체 상호 작용 및 mycobacteria22, 녹 농 균23, 등 여러 가지 세균의 감염 병 인을 해 부에 대 한 다양 한 생체 조건 도구로 사용 되었습니다. 대장균24, Enterococcus faecalis25, 그리고 포도 상 구 균,2627. Zebrafish 태아 광학 투명도, 상대적으로 낮은 유지 보수 비용, 및 포유류28,29에 매우 비슷한 면역 시스템의 같은 많은 이점이 있다. 이로써 zebrafish 태아 intravital 시각화 및 감염 진행과 관련 된 호스트 응답28,29의 분석에 매우 경제, 생활 모형 유기 체. 셀 동작의 시각화 vivo에서, 유전자 변형 zebrafish 라인 (예:, 대 식 세포와 호 중구) 면역 세포의 종류와 고도 붙일 태그가 subcellular 구조 되었습니다28 개발 29. 또한, zebrafish의 높은 복제 율 높은 처리량 테스트 시스템 자동화 로봇 주입, 자동된 형광 정량화, 그리고 RNA 순서 분석27, 을 개발의 가능성을 제공 30.
현재 연구에 우리 형광 이미징 기술을 사용 하 여 소재 관련 감염을 위한 zebrafish 태아 모델 개발을 목적으로. 이 위해, 우리 zebrafish 태아의 근육 조직으로 소재 스피어의 박테리아 (S. 구 균)을 주입 하는 절차를 개발. S. 구 균 RN4220 표현 mCherry 형광 단백질 (균 S.-mCherry), 다른 미 균 스트레인10,31에 대 한 설명 되어 있는 대로 만들어진 사용 했습니다. 유전자 변형 zebrafish 라인 (mpeg1: UAS/단풍나무) 표현 하는 데 녹색 형광 단백질은 세포32 와 파란색 형광 폴리스 티 렌 스피어에 사용 되었다. 이전 연구에서 우리가 모방 소재 이식 zebrafish 태아에 스피어의 근육 주사 가능33는 것으로 나타났습니다. 바이의 진행과 시간이 지남에 단일 배아에 관련 된 세포 침투 양적 분석을 사용 하는 척도의 형광 강도를 "ObjectJ" (플러그인 ImageJ) 내에서 운영 되는 "제 브라-Immunotest" 프로젝트 파일 있는 박테리아 그리고 세포 침투 하는 스피어33의 사출 사이트 주변. 또한, 우리는 식민지 형성의 숫자를 결정 단위의 (CFU) 존재와 배아에 스피어의 부재에 박테리아 감염에 생체의 잠재적인 효과 공부 하. 우리의 현재 연구는 여기 개발 방법, zebrafish 태아는 소재 관련 감염 vivo에서 공부에 대 한 약속, 소설 척추 동물 모델을 보여 줍니다.
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Protocol
이 프로토콜에서 로컬 동물 복지 위원회에 의해 승인 된 성인 zebrafish의 유지 보수 로컬 동물 복지 규정입니다. 배아 실험 2010/63/EU 지침에 따라 수행 했다.
1. "박테리아 전용" 및 박테리아 스피어 정지의 준비
참고: MCherry 형광 성 단백질 (S. 구 균-mCherry)를 표현 하는 S. 구 균 RN4220 스트레인 사용 됩니다. S. 구 균 RN4220 긴장 독성 레 귤 레이 터 유전자 아그라 (액세서리 유전자 A 레 귤 레이 터)34에 돌연변이 그리고 그러므로 zebrafish 태아 모델에 상대적으로 낮은 독성을 할 수 있습니다. 다른 미 균 긴장 또는 다른 세균 종 바이 대 한 사용할 수 있습니다.
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10 µ g/mL 페니 보충 tryptic 콩 한 천 배양 배지에서 미 균 RN4220 박테리아의 4 ~ 5 식민지 고 중반 대 수 성장 단계 tryptic 간장 국물 10 µ g/mL와 보충의 10 mL에 박테리아 문화 떨고에서 37 ° C에서 페니입니다.
- 문화, 동안 100 µ L 900 µ L의 멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 620에서 광학 밀도 (OD) 측정 베트 (1 cm의 폭)에 있는 세균 현 탁 액의 희석 nm (OD620). 문화는 박테리아 OD620 0.4-0.8에 도달할 때까지.
참고: 0.1의 OD620 일반적으로 3.0 x 10에 해당7 CFU/mL S. 구 균. 중앙 대 수 성장 단계에 있는 박테리아의 inoculum의 OD620 0.4-0.8 사이입니다. 경작에 대 한 다른 기간 다른 종과 박테리아의 변종에 대 한 필요할 수 있습니다.
- 문화, 동안 100 µ L 900 µ L의 멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 620에서 광학 밀도 (OD) 측정 베트 (1 cm의 폭)에 있는 세균 현 탁 액의 희석 nm (OD620). 문화는 박테리아 OD620 0.4-0.8에 도달할 때까지.
- 3500 x g 10 분 동안에 박테리아를 원심 하 고 다시 살 균 PBS의 1 mL에 수송과 박테리아를 일시 중단. 이후 PBS 2 번 살 균과 박테리아를 세척 하 고 마지막으로 다시 PBS에 4% (w/v) polyvinylpyrrolidone40 (PVP40) 솔루션의 1.1 mL에 박테리아를 중단.
- 소용돌이이 세균성 펜션과 멧 세620 측정에 대 한 살 균 PBS의 900 µ L에서 현 탁 액의 희석 100 µ L. PVP40 솔루션 세균 현 탁 액의 농도 조정 합니다. 이것은 "박테리아 전용" 서 스 펜 션입니다.
- 바이오는 세균 현 탁 액과 섞어 자유롭게 선택할 수 있습니다. 현재 연구에서 상용 폴리스 티 렌 (PS) 스피어 (파란색 형광, 10 µ m) 사용 됩니다. 박테리아-스피어 정지를 생성 하려면 1000 x g, 실 온에서 1 분 동안 스피어 원심 하 고 삭제는 상쾌한 다시 (PVP40 솔루션)에 "박테리아 전용" 서 스 펜 션에는 스피어를 중단.
- 스피어의 부재와 존재에 박테리아의 약 복용량을 주사 하기 위하여 박테리아 스피어 현 탁 액의 농도 필요 (없이 "박테리아 전용" 현 탁 액의 농도의 2/3 스피어)입니다. 이 PVP40 솔루션의 0.5 볼륨 박테리아 스피어 정지를 diluting 하 여 이루어집니다. Vortexing에 의해 정지를 믹스. 메모의이 비율 (2/3)는 되었습니다 부과 S. 구 균에 대 한 있습니다. 그것은 또한 S. epidermidis, 적합 하지만 여부이 비율에도 적용 됩니다 다른 세균성 종 및 다른 (10 µ m) 보다 크기 또는 모양 (스피어) 보다 생체 재료의 주입을 확인 하는 것이 좋습니다.
- 아래와 같이 10 직렬 희석의 양적 문화 "박테리아 전용" 및 박테리아 스피어 현 탁 액의 농도 확인: 96 잘 접시와 10 µ L aliquots의 전송 하 여 순차적으로 희석 정지의 전송 100 µ L를 살 균 PBS의 90 µ L에 현 탁 액입니다. Agarose 접시에 undiluted 및 희석 정지의 중복 10 µ L aliquots 접시, 37 ° C에서 접시를 밤새 품 어, 식민지를 계산 및 박테리아 (콜로 니 형성 단위 숫자를 계산. CFU)입니다.
2. 번 식, 수확, 그리고 Zebrafish 태아의 유지 보수
- 수정 아래에 설명 된 일반적인 절차 설명된 이전35,36 번 식, 수확, 그리고 zebrafish 태아의 유지 보수에 대 한 따릅니다. 교차 하는 야생 타입 Tupfel 긴 탄 미 익 (TL) zebrafish 또는 선택 된 유전자 변형 선의 zebrafish의 가족 (여기, Mpeg1: 단풍나무) 유도 빛 켜 후 계란을 생산 하는 성인 여성에 추가 그물과 탱크, 다음 별도 성인 생산된 계란에서.
- 다음 날 배아를 수집 하 고 가능한 되지 않은 투명 하지 않은 것 들을 삭제. E3 매체37 페 트리 접시 (직경에서 100 m m) 당 약 60 배아를 유지 하 고 28 ° c.에 품 어 죽은 고 비정상적인 배아를 제거 하 고 E3 매체를 매일 새로 고침.
3입니다. 주사 바늘의 준비
- 유리 microcapillary 바늘 주입 micropipette 끌어당기는 악기를 사용 하 여에 대 한 준비. 다음 설정을 사용 합니다: 열: 772, 풀: 100, 벨: 200, 시간: 40, 가스: 75.
- 바늘은 안구에서 눈금 막대와 가벼운 현미경을 사용 하 여 (10 µ m 스피어), 대 한 약 20 µ m의 외부 직경을가지고 위치에 집게와 바늘 팁을 휴식. 그들은 배아의 생존은 타협을 매우 큰 오프닝 크기 바늘을 하지 마십시오.
참고: 오프닝은 작은 또는 큰 주입을 생체 재료의 형태와 크기에 따라 선택할 수 있습니다. 문학에서 주사 바늘을 사용 하 여 약 50 µ m의 개통을 가진 배아 생존38에 상당한 감소를 일으키는 원인이 되기 위하여 보고 되었다.
4. "박테리아 전용" 또는 박테리아 스피어 정지에 주입 Zebrafish 태아
- Agarose 솔루션 (1-1.5% (wt) 데 미 물에)가 열 전자 레인지를 사용 하 여 및 100 mm 페 트리 접시에 부 어. Agarose 솔루션 위에 플라스틱 금형 서식 파일을 적절 한 위치에 배아를 배치 하 여 촉진 주사 agarose에 들여쓰기를 만들 페 트리 접시에 놓습니다. 실 온에서 incubate 고 agarose 솔루션은 고형화 하는 때 금형을 제거 합니다.
- 3 일 후 수정에서 배아 0.02% (w/v) 3 aminobenzoic 산 (Tricaine) 그들을 anaesthetize에 포함 된 100 mm 페 트리 접시에 놓습니다. 5 분 후 0.02% (w/v) Tricaine 포함 하는 E3 매체와 겹쳐 agarose 접시에 배아를 전송 하 고 주입에 대 한 한 방향으로 그들을 정렬 합니다. Mpeg1에 대 한:가 유전자 변형 라인 먼저 배아 E3 매체 포함 0.02% (w/v) tricaine에 anaesthetize. 스테레오 형광 현미경을 사용 하 여 녹색 형광 단백질을 표현 하는 배아를 선택 합니다.
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Microloader 피 펫 팁을 사용 하 여 "박테리아 전용" 또는 박테리아 스피어 현 탁 액의 약 10 µ L로 바늘을 로드 합니다. 마이크로-인젝터에 연결 micromanipulator에 바늘을 탑재 합니다. 인젝터 여기 (재료의 표 참조)를 사용 하 여 다음 설정을 사용 2-3 nL의 주사에 대 한 대 한: 압력: 300-350, 다시 압력: 0 시간: 2ms.
참고: 마이크로-인젝터에 대 한 설정을 사용 하는 인젝터에 따라 달라 집니다. 인젝터 설정을 다른 모양 또는 크기와 생체 재료와 혼합 하는 박테리아의 주사에 대 한 조정 될 필요가 있습니다.- "박테리아 전용" 펜션과 박테리아 스피어 현 탁 액의 주입을 위해 같은 열기와 함께 바늘을 사용 합니다. 바늘 깨진 막힌 경우 항상 추가 주사에 대 한 새로운 바늘에 대 한 변경.
- 태아의 몸과 바늘 사이 45-60 °의 각도에서 가벼운 현미경 (그림 1), 태아의 근육 조직에 바늘을 삽입 합니다. 부드럽게 앞뒤로 이동 하 여 조직에서 바늘의 위치를 조정 합니다. 마이크로-인젝터에 연결 하는 발 페달을 사용 하 여 배아를 주사.
- 형광 박테리아의 주입, 후 성공적인 감염 스테레오 형광 현미경에 대 한 배아를 점수. 배아 득점 네거티브 (보이는 형광 박테리아 없음 또는 없음 보이는 형광 스피어)을 삭제 합니다. 48-잘 접시에 E3 매체에 개별적으로 배아를 유지 합니다. 매일 매체를 새로 고칩니다.
5. 배아, 미세한 점수, 및 박테리아의 양적 문화의 분쇄
- 스테레오 형광 현미경, 주사, 직후와 배아 양적 문화에 대 한 무작위로 선택 됩니다 때까지 각 후속 하루에 시작을 사용 하 여 형광 박테리아의 존재에 대 한 모든 배아를 현미경으로 점수.
- 임의로 주입 직후 몇 라이브 감염 된 배아 (5 ~ 6 현재 연구에)을 선택 하 고 개별적으로 별도 2 mL microtubes 멸 균 팁을 사용 하 여 그들을 전송. 매체를 제거 하 고 부드럽게 살 균 PBS 가진 배아를 한 번 씻어 균 PBS의 100 µ L를 추가 합니다.
- 각 유리병에 2-3 살 균 지 르 코니 아 구슬 (직경에서 2mm)을 추가 하 고 분쇄는 균질 화기를 사용 하 여 배아 ( 재료의 표참조) 30 3500 rpm에서 1.3 단계에서 설명한 대로 양적 s. 문화는 homogenate.
참고: 다른 균질 다른 설정이 필요할 수 있습니다. - 단계 5.3에 따라 양적 문화에 대 한 주입 후에 후속 일에 여러 개의 배아를 임의로 선택 합니다.
6. 감염 진행 및 Zebrafish 태아에 있는 자극된 세포 침투의 형광 현미경 검사 법
- Anaesthetize 배아 단계 4.2에서에서 설명한 대로. 0.02% (w/v) Tricaine E3 매체를 포함 하는 배양 접시에 PBS-2% (wt) 메 틸 셀 룰 로스 솔루션의 500 µ L 플라스틱. 메 틸 셀 룰 로스 솔루션에 배아를 놓고 직선과 수평 그들을 유지 합니다.
참고: 메 틸 셀 룰 로스 솔루션은 "접착제", 그것의 점성으로 인해 일시적으로 영상에 대 한 최고의 방향에 배아를 무력화 할 수 있는 데 사용 됩니다. - 스테레오 형광 현미경을 사용 하 여 밝은 분야, mCherry, 녹색 형광 단백질 (GFP)와 UV 필터 동일한 최적화 된 설정 (예:, , 이득, 강도와 노출 시간) 160 x 배율에서 이미지 개별 배아를 장착 . 주입으로 인 한 조직 손상 밝은 분야 필터를 사용 하 여 초점에 초점 평면을 설정 합니다. 3 연속 이미지의 녹음 수 있는 5 µ m에서 10 µ m 및 단계 크기에서 Z-스택 깊이 설정 합니다.
- 이미지 개별 배아 일단 5 h까지 2 일 후 주입 후 주입에서 매일. 추가 영상 및 분석에 대 한 죽은 태아 (하트 비트 또는 배아 분할 저하)을 제외 합니다. 48-잘 접시에 E3 매체에 개별적으로 배아를 유지 합니다. 매일 매체를 새로 고칩니다.
7. 감염 진행 및 개체 J 프로젝트 파일 "제 브라-Immunotest"를 사용 하 여 자극된 세포 침투의 형광 강도의 정량 분석
- 링크에서 다운로드 "제 브라-Immunotest"와 상세한 설명서: < https://sils.fnwi.uva.nl/bcb/objectj/examples/zebrafish/MD/zebrafish-immunotest.htmL>, 이전 연구33에 설명 된 대로. 간단 하 게, "제 브라-Immunotest", 프리웨어 프로그램 이미지 제이 운영 분석에 대 한 이미지를 엽니다 각 로드 된 이미지에 수동으로 배아의 관찰된 조직 손상에 따라 사출 사이트를 표시 합니다.
참고: 표시 된 사이트 50 µ m의 거리 내에서 형광 피크 검출을 중심점으로 "제 브라-Immunotest"에 의해 사용 됩니다. 검색 된 형광 피크는 형광 측정을 위한 표준화 된 지역 (100 µ m의 직경)의 중심으로 사용 됩니다. - 여러 채널에 대 한 형광 측정을 실행 하는 경우, 자동으로 모든 이미지에 대 한 개체 J 메뉴에서 "계산"을 클릭 합니다. 데이터를 내보내고 적절 한 통계 테스트 방법으로 분석.
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Representative Results
현재 연구 소재 관련 감염 조사에 대 한 새로운 척추 동물 모델 zebrafish 태아의 적용 평가. Microinjection 기술은 zebrafish 태아 감염22,,2627,30,36원인 세균성 종 주입 하 일반적으로 사용 되었습니다. 그림 1에 표시 된 절차를 사용 하 여, S. 구 균 단독으로 또는 10 µ m PS 스피어 (PS10) 함께 했다 주입 현재 연구에서 zebrafish 태아의 근육 조직으로. S. 구 균 의 근육 주사는 배아 (그림 2)에서 복용량 의존 감염을 발생합니다. 복용량 주입 겨냥된 도전 복용량 (하루 0 그림2에서) 가까이 했다. 그룹 내에서 사소한 변화만 관찰 되었다. 배아 높은 도전 복용량을 주사 1 일 및 2 일 후 사출 (그림 2, 6000 2000 CFU)에서 변수 감염 진행을 보여주었다. 주입 S. 구 균 박테리아도 박멸 했다 또는 확산 졌고 이후 배아 내 감염의 상부를 설립. Zebrafish 태아26에 정 맥 주사 후 S. 구 균 감염의 보고 진행와 비슷합니다. 배아 미 균 의 낮은 도전 복용량을 주사 (그림 2, 600과 200 CFU) 박테리아 지워집니다. 이 결과 미 균 의 도전 복용량 강하게 그들의 감염 진행 zebrafish 태아에 영향을 나타냅니다.
박테리아와 스피어의 공동 주입 주입 박테리아만 (데이터 표시 되지 않음)의 주입 보다는 박테리아의 높은 숫자에 결과. 더 높은 농도 (약 1.5 배 이상)에서 "박테리아 전용" 주사에 대 한 세균 inoculum을 준비 하 여 보다 박테리아 스피어 정지에서 CFU 주입의 숫자에 차이 극복할 수 있었습니다. 이 이렇게, 배아 존재와 PS10 (하루 0, 그림 3)의 부재로 박테리아의 유사한 숫자를 주사 가능 하다. 주입 당 스피어의 숫자는 다양합니다. 예를 들어, 우리의 실험 중 하나에서 사출 ( S. 구 균 + PS10 그룹에서 12 중 25 배아), 당 배아 받은 1 ~ 2 스피어의 절반 일부 받은 3 ~ 4 (8 중에 25 배아), 그리고 몇 가지 받은 5 ~ 7 스피어 (5 개 중에 25 em bryos)입니다. 그러나, 이러한 유사 이전 연구33에서 보고 자극된 세포 응답의 수준 영향 하지 않았다.
다음으로, 우리는 스피어의 존재는 미 균의 낮은 복용량으로 도전 zebrafish 태아에 감염 진행에 영향 여부 조사. 이 위해, 우리 미 균mCherry의 약 600 CFU 또는 PS10없이 주입. 우리는 감염 진행을 공부 두 가지 방법을 사용: 분쇄, 그리고 (ii) 현미경 탐지의 득점 후 감염 된 태아의 (i) 기존의 양적 문화 ("미세한 점수")의 형광 박테리아 (S. 구 균-mCherry). 우리는 이러한 두 가지 방법에서 결과 비교. 점수는 형광 강도에 배아에서 형광 박테리아의 "예 또는 아니오" 표시로 정의 했다. 우리의 결과 미 균mCherry의 20 이상 CFU로 모든 배아 미세한 점수 ( 그림 3에 빨간 점)에 긍정적인으로 나타났다. 태아 당 S. 구 균 의 600 CFU에 대 한 PS10 의 존재 하지 감염 진행에 크게 영향을 미칠 것 같았다. 모든 시간에 포인트, 두 주파수의 배아 ( 그림 3, 낮은 도전 복용량 위에 표시)에 감염 및 분쇄 후 CFU의 숫자 또는 PS10 (그림 3, 낮은 도전 복용량) 없이 배아에 대 한 다른 되지 않았습니다. 이 미 균 의 높은 도전 복용량은 zebrafish 태아에 감염 진행에 생체의 잠재적인 효과 공부 하는 데 필요한 제안 했다. 따라서, 우리가 배아에 존재와 PS10 의 부재에 S. 구 균 의 약 1000 CFU 주입. 미세한 점수 (그림 3, 높은 도전 복용량) 언제 든 지 시간 차이 PS10 없이 감염 된 태아의 주파수에 표시 하지 않았습니다. 그러나 배아 미 균 + PS10 그룹 보다 2 일 후 주사 (그림 3, 높은 미 균-유일한 그룹에서 검색에서 양적 문화,, 보여주었다 더 높은 CFU 숫자 검색 도전 복용량)입니다.
이미지 분석에 의해 zebrafish 태아 생체 재료의 부재와 존재에 감염의 정도 계량 하 우리 존재에서 S. 구 균-mCherry (태아 당 1000 CFU)의 감염 진행을 보여주는 이미지의 일련을 기록 하 고 PS10 시간 (그림 4A)에 라이브 배아의 부재. 우리 또한 면역 세포 응답 (그림 4B) 척도를 배아가 녹색 형광 단백질을 표현 세포의 자극된 침투를 기록 했다. 가 형광 단백질 UV 노출 시간 및39빛의 강도 따라 빛에 노출 아래 빨간색 녹색에서 색상 변환을 받을 수 있습니다. 그러나, 이러한 색상 변환 하지 현재 연구에 사용 된 실험 조건 하에서 관찰 되었다. 사출 사이트 표준화 영역 내에서 침투 대 식 세포로 서 뿐만 아니라 감염 박테리아의 형광 강도 우리의 ObjectJ 프로젝트 파일 "제 브라-Immunotest", 이미지 제이에 의해 측정 되었다 " 제 브라-Immunotest "주입의 표시 점을 100 µ m (노란색 동그라미 그림4에서)의 직경을 가진 표준화 영역을 정의합니다. 배아,이 지역 침투 대 식 세포로 서 주입 된 스피어의 근접에 있는 형광 박테리아의 대부분 포함. 소재의 존재는 모두 초기 민감성 감염 및 면역 세포 응답에 영향을 표시 했다. 5 h 후 주사, S. 구 균 에 대 한 응답에 있는 대 식 세포 침투만 S. 구 균 + PS10 (그림 5, 대 식 세포 침투, 5 hpi)에 보다 훨씬 더 높은 했다. 1 일 PS10 포스트 주입 태아 PS10 (그림 5, 감염 진행 1 dpi) 없이 배아 보다 S. 구 균 감염의 상당히 높은 수준을 보였다. 따라서, 이러한 양적 결과 시연 형광 이미지 기록 및 ObjectJ 프로젝트 파일 "제 브라-Immunotest"의 조합을 감염 진행 척도를 사용할 수 있으며 면역 세포 응답의 존재를 자극 한 zebrafish 태아 모델에 소재입니다. 모델 면역 세포 응답의 작은 차이 vivo에서, 세균성 감염의 수준 평가 평가 대 한 (이미지 기록)와 스테레오 형광 현미경 및 오픈 액세스 "제 브라-Immunotest"만 필요 합니다.
그림 1: zebrafish 태아의 꼬리 근육으로 박테리아 스피어 서 스 펜 션의 공동 주입의 도식 절차. 이 그림에서 장 수정 된 허가 외.33 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 6000에서 태아 당 200 CFU까지 및 0 ~ 2 일 후 주사 평가 미 균 의 CFU의 수 inocula, 주사 zebrafish 태아에서 검색. 빨간색 선은 CFU의 메디아 숫자를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 수의 CFU 및 mCherry 단백질- S. 구 균 (S. 구 균-mCherry)에 표현의 zebrafish 태아, 다른 시간 지점에서 평가의 미세한 점수. 낮은 도전 복용량: 배아; 당 600 CFU 높은 도전 복용량: 배아; 당 1000 CFU 추 신:10: 10 µ m PS 스피어; "+", 배아 미 균-mCherry PS10; 함께 주사 "-", 배아 주사 S. 구 균mCherry만, PS10없이 그렇게. 배아는 현미경으로 형광 박테리아에 대 한 득점 하 고 주입 (0 일)의 하루와 1 일 및 2 일 후 주입 배아의 분쇄 후 박테리아의 양적 문화에 대 한 무작위로 선택 했다. 현미경으로 득점 하는 배아 포지티브 / 네거티브 형광 박테리아에 대 한 빨간색과 검은색 점 들에 각각 표시 됩니다. 현미경으로 긍정적인 득점의 숫자 배아 배아 (감염 된 태아의 주파수) 각 시간 지점에서 득점의 총 수로 나눈 그래프의 상단에 표시 됩니다. S. 구 균 + PS10 및 S. 구 균 각 시간 지점에서 유일한 그룹 간의 차이 CFU의 수에 감염 된 태아의 주파수에는 피셔에 의해 분석 되었다 ' 정확한 테스트와 맨-휘트니 테스트, 각각. p ≤ 0.05 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 대표 이미지 존재와 10 µ m PS 스피어 (PS10, 파란색)의 부재에가 단백질 표현 자극된 침투 mCherry 표현 S. 구 균 (A, 레드)의 감염 진행을 기록 2 일 후 주입 (dpi)에 5 h 후 분사 (hpi)에서 배아에서 세포 (B, 녹색). 비 치료 배아 (NT) 컨트롤으로 사용 되었다. 노란색 원형 (직경에 있는 100 µ m) ObjectJ 프로젝트 파일을 사용 하 여 형광 정량화에 대 한 사출 사이트에 표준화 영역 표시 "제 브라-Immunotest'. 대 식 세포와 박테리아의 정량된 형광은 그림 5에 그려져 있습니다. 바 규모 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: S. 구 균 감염 진행 및 존재 및 10 µ m PS 스피어 (PS10) 2 일 5 시간 후 분사 (hpi)에서 zebrafish 태아에서의 부재에 만들었다 대 식 세포 침투의 형광 정량화 포스트 주입 (dpi), ObjectJ 프로젝트를 사용 하 여 파일 "제 브라-Immunotest". 사출 사이트에 표준화 된 영역 ( 그림 4에서 노란색 원으로 표시 된 100 µ m의 직경이) 형광 정량화 사용 되었다. 비 치료 배아 (NT) 컨트롤으로 사용 되었다. 포인트 맨-휘트니에 의해 분석 된 각 시간에 각 2 개 그룹 간의 차이 테스트 *p ≤ 0.05, * *p < 0.01, * * *p < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
소재 관련 감염 (바이) 심각한 임상 합병증 이다. Vivo에서 바이의 pathogenesis의 이해 바이의 치료와 예방을 개선 하기 위해 새로운 통찰력을 제공할 것 이다. 그러나, murine 모델 현재 바이 동물 모델 실험 비용, 노동 집약적인, 그리고 복잡 한 수술 기술 전문된 인력 훈련 필요. 따라서, 이러한 모델 높은 처리량 분석에 적합 하지 않습니다. 현재 연구 평가 여부 zebrafish 태아 바이 vivo에서, 보완 조사 소설 척추 동물 모델로 사용할 수 있습니다 이후 zebrafish 태아 모델에 대 한 요구는 덜 복잡 한 비용 일반적 murine 모델에 대 한 보다 낮은, 포유류 모델입니다.
Zebrafish 태아 바이 모델을 설정 하려면 우리는 박테리아와33전에 설명 배아로 스피어의 근육 주사 하는 방법에 따라 스피어의 공동 주입 프로토콜을 개발 했다. 이 방법에서는, 대부분의 박테리아는 스피어 주변에 있습니다 배아, 인간/동물에서 생체 주입 후 곧 일어난 박테리아 소재 상호 작용을 흉내 낸.
감염 진행 zebrafish 태아에 스피어의 부재와 존재에 비교할 수 있게 되려면, 배아 비슷한 초기 수가 박테리아와 스피어 없이 도전 한다. 그러나, 우리의 경험에의 하면 박테리아 스피어 서 스 펜 션의 공동 주입 "박테리아 전용" 현 탁 액의 주입 보다 주입 되 고 더 많은 박테리아에 결과. 이 문제를 해결 하려면 박테리아와 박테리아 스피어 정지 (스피어) 없이 "박테리아 전용" 정지에서의 농도 사이의 비율을 맞게 한다. 에 현재 연구는 박테리아-스피어에에서 농도 보다 약 1.5 배 높은 필요 "박테리아 전용" 정지에서 S. 구 균 의 농도. 여부이 비율에도 적용 됩니다 다른 세균성 종 및 다른 생체 테스트할 수 있다. 메모와 스피어, 없이 박테리아의 비슷한 번호를 삽입의 어느 서 스 펜 션의 주사에 사용 하는 바늘의 개통 가능한 동일로 가까이 있어야 한다.
소재 모양 및 크기 등의 여러 가지 속성의 injectability 및 박테리아와 공동 주입 결정에 중요 한 역할. 현재의에서 연구, 우리 모델 바이오로 10 µ m 폴리스 티 렌 (PS10) 스피어를 사용. 우리의 경험에의 하면 최대 15 µ m의 크기의 스피어는 현재 연구33에서 개발 된 오래 된 배아는 프로토콜에 따라 3 일 동안 주사. 비교적 큰 크기의 스피어에 대 한 (예:, ≥ 10 µ m), 우리 비 monodispersed의 사용을 억제 또는 불규칙 모양의 스피어/미 경향이 있는 바늘의 막힘. 바이오 소재 라운드 보다 다른 모양 및 다양 한 크기 사용을 선택 하는 경우 그들의 injectability는 테스트 해야 합니다. (Co-) 스피어와 박테리아의 주입, 4 %polyvinylpyrrolidone (PVP) 솔루션 분산 촉진을 사용 했습니다. 일반적으로 태아 생체 재료와 박테리아 없이 주입에 대 한 유용할 수 있습니다이.
스피어만33,40의 주사 마찬가지로, 배아에 박테리아와 함께 주입 하는 스피어의 주입, 주로 1에서 태아 당 4 스피어에 이르기까지 당 다양 합니다. 그러나, 이후 이러한 유사 배아33자극된 면역 세포 응답의 수준에 차이가 발생 하지 않았다, 그들은 또한 하지으로 예상 했다 감염 진행에 스피어의 잠재적인 효과 영향을. 그럼에도 불구 하 고, 새로운 접근 (혼자 또는 함께 박테리아) 단일 스피어의 주입을 허용을 원하는 것 이다.
우리는 형광 박테리아의 존재의 미세한 점수로 사용할 수는 "예 또는 아니오" 득점 시스템 라이브 태아에 감염 진행 분석 하 여부 평가. 긍정적인 미세한 점수 기준 형광 강도에 보이는 형광 박테리아의 존재로 정의 했다. 박테리아의 양적 문화에 비해, 우리의 대표적인 결과 CFU 또는 아무 감염의 낮은 수를 가진 배아에서 S. 구 균 박테리아의 20 이상의 CFU와 배아를 구분할 수 있습니다 미세한 점수 제안 했다. 따라서, 박테리아의 낮은 숫자만 긍정적인 점수에 대 한 필요 때문에,이 방법은 거의 같은 중요 한 양적 문화 같이 이다. 배아는 희생 하지 않아도 고급 현미경 또는 형광에 대 한 정렬 시스템은이 메서드를 사용 하 여 분석을 수행 하는 데 필요한 때문에, 우리는 미세한 점수의 감염 진행을 모니터링 하는 간단 하지만 신뢰할 수 있는 방법을 고려합니다 라이브 배아에 박테리아입니다. 감염 (보다는 오히려 "예 또는 아니오" 득점 시스템 설명으로 위의)의 레벨의 정량 분석, 단일 라이브 태아에서 면역 세포 응답에 대 한 적용 하는 ObjectJ 프로젝트 파일 "제 브라-Immunotest"의 형광 강도 측정 하 형광 박테리아와 형광 세포 시간이 지남에 기록. (100 미터 직경)와 표준화 된 영역을 사용 하는 우리 때문에이 지역 박테리아 및 침투 대 식 세포의 대부분을 포함 하도록 표시 했다 형광, 측정을 주사 사이트를 둘러싼. "제 브라-Immunotest"의 상세한 설명서 출판 이전33,40. 참고, "제 브라-Immunotest"는 오픈 액세스는 사용자에 의해 지 어질 수 있다 ImageJ 플러그인입니다. 예를 들어, 분석의 지역 및 "제 브라-Immunotest"의 다른 매개 변수의 직경 연구 설정 (프로토콜에 7 단계에 제공 된 링크에서 예제 참조)에 따라 자유롭게 변경할 수 있습니다.
Zebrafish 태아에 생체의 가능한 감염 강화 효과 보여, 박테리아의 도전 복용량 평가 해야 합니다. 현재 연구에서 우리는 배아 또는 높은 미 균 의 1000 CFU의 도전 복용량은 필요 발견. PS10 없이 그 보다 PS10 배아에 S. 구 균 감염의 상부에 주입, 생체의 존재 정도 S. 구 균 의 발전이 용이 나타내는 후 처음 2 일 발견 했다 태아. 든 감염 남아 나중 시간 포인트에서 생체의 존재에 높은 수준에서 연구 되어야 해당 규정에 따라 윤리적인 승인 아래 이전 배아를 사용 하 여. Zebrafish 태아에서 미 균 의 클리어런스 먹어서과 대 식 세포와 호 중구23,24에 의해 살인에 주로 의존 때문에, 박테리아의 파생물의 감소 효과 의해 설명 될 수는 식 세포 생체의 존재로 인해 박테리아를 죽 일. 이 환자2,,415, 생체에 의해 잘 알려진 감염 위험 향상 라인 또한 일반적으로 관찰 마우스와 같은 더 복잡 한 동물 모델 및 다른 동물 모델10 ,11,,1213. S. 구 균 감염, 이외에 S. epidermidis 또는 생체의 다른 병원 체의 감염 진행 현재 연구에서 설명 하는 프로토콜에 따라 조사 수 있습니다. 생체 재료의 시점에서 몇 가지 소재 속성 (예:, 화학 성분, hydrophobicity, 거칠기, 그리고 표면 요금) 영향을 미칠 수 세포 응답 및 박테리아 물질 상호 작용41, 42. 우리의 이전 연구 소재 (PVP) 존재의 주입 zebrafish 태아에만 PVP의 주입에 비해 강한 대 식 세포 침투 도발을 보이고 있다. 또한, zebrafish 태아 폴 리의 스피어에 다르게 반응 (-caprolactone)와 폴리스 티 렌33. 따라서, 다른 자연의 스피어의 주입은 비교적 쉽게 여기에 설명 된 방법으로 평가 될 수 있다 감염의 향상에 차동 효과 있을 수 있습니다.
추가 개발을 위한 zebrafish 태아 바이 모델이 수정 될 수 있습니다 높은 처리량 시스템 갖춘 자동 로봇 사출27,43, 복잡 한 객체 파라미터 분석 및 정렬 (COPAS) 시스템, 및 높은 처리량에 대 한 RNA 순서 분석27,44. 이러한 zebrafish 태아 기반 높은 처리량 바이 모델에서 vivo에서 상영 하 고 (소설) 조직과 생체의 테스트 뿐만 아니라 항생제 치료 또는 다른 안티-바이 전략의 효능의 테스트에 대 한 전체 동물 시스템으로 사용할 수 있습니다. 또한, 세포내 생존 박테리아 생체9,10,11,,1213의 생존에 한 주요 전략 이다. Zebrafish 태아 세포내 감염 연구의 유용성은 여러 연구36,46에 표시 되었습니다. 따라서, 우리의 태아 모델 포도 상 구 균 또는 생체와 같은 세포내 감염을 치료 하는 전략의 존재 다른 세포내 병원 체의 세포내 생존 연구에 사용할 수 있습니다. 또한, 제자리 교 잡 기술을45 사용할 수 있습니다 모델에 박테리아 또는 생체 또는 그들의 조합에 대 한 표식 유전자를 도움이 될 수 있습니다 사출 사이트에서 특정 유전자의 표현에의 영향을 공부 하 바이입니다.
요약 하자면, 현재 연구는 여기 vivo에서 실시간으로에서 소재 관련 감염을 연구 개발 하는 방법으로 zebrafish 태아의 잠재력을 보여줍니다. Zebrafish 태아 모델이 소설 감염 방지 바이오 및 유망 예방 바이의 치료 전략을 조사 하 고 생체 외에서 연구 및 큰 동물 모델 사이의 격차를 닫습니다에 따라서 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구 재정적으로 생물 소재 (BMM) 프로그램의이 비자 프로젝트에 의해 지원 되었고 네덜란드 경제부의 공동 자금. 저자 교수 박사 그레이엄 Lieschke 모나 쉬 대학, 호주에서 zebrafish 유전자 변형 라인을 제공 하는 것을 감사 하 고 싶습니다 (mpeg1:Gal4 / UAS:Kaede).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptic soya agar | BD Difco | 236950 | Media preparation unit at AMC |
| Tryptic soya broth | BD Difco | 211825 | |
| Polyvinylpyrrolidone40 | Applichem | A2259.0250 | |
| 10 µm diameter polystyrene microspheres (blue fluorescent) | Life technology/ThemoFisher | F8829 | |
| Glass microcapilary (1 mm O.D. x 0.78 mm I.D.) | Harvard Apparatus | 30-0038 | |
| Micropipette puller instrument | Sutter Instrument Inc | Flaming p-97 | |
| Light microscope LM 20 | Leica | MDG33 10450123 | |
| 3-aminobenzoic acid (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Agarose MP | Roche | 11388991001 | |
| Stereo fluorescent microscope LM80 | Leica | MDG3610450126 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956.003 | |
| Micromanipulator M3301 with M10 stand | World Precision Instruments | 00-42-101-0000 | |
| FemtoJet express micro-injector | Eppendorf | 5248ZO100329 | |
| Microtrube 2 mL pp | Sarstedt | 72.693.005 | |
| Zirconia beads | Bio-connect | 11079124ZX | |
| MagNA lyser | Roche | 41416401 | |
| MSA-2 plates (Mannitol Salt Agar-2) | Biomerieux | 43671 | Chapmon 2 medium |
| Methyl cellulose 4000cp | Sigma-Aldrich | MO512-250G | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Gyrotory shaker (for bacterial growth) | New Brunswick Scientific | G10 | |
| Zebrafish incubator | VWR | Incu-line | |
| Cuvettes | BRAND | 759015 | |
| Centrifuge | Hettich-Zentrifugen | ROTANTA 460R | |
| Spectrometer | Pharmacia biotech | Ultrospec®2000 | |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F6521-1EA | |
| 48 well-plates | Greiner bio-one | 677180 | |
| 96 well-plates | Greiner bio-one | 655161 | |
| Petri dish | Falcon | 353003 | |
| Petri dish | Biomerieux | NL-132 | |
| ImageJ | Not applicable | Not applicable | link: https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| GraphPad 7.0 | Prism | Not applicable |
References
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