Summary
نقدم منهجية لتقدير محتوى النشا في بريمورديا المبيض في الكرز الحلو (خوخ بالمتفطره L.) خلال فصل الشتاء السكون باستخدام نظام تحليل صورة جنبا إلى جنب مع تقنيات histochemical.
Abstract
التغييرات في النشا في الهياكل الصغيرة المرتبطة بالأحداث الرئيسية خلال عدة عمليات إنمائية النباتية، بما في ذلك المرحلة الإنجابية من التلقيح للاخصاب وبداية الاثمار. بيد الاختلافات في النشا خلال التمايز زهرة ليست تماما معروفة، أساسا بسبب صعوبة تقدير محتوى النشا في هياكل primordia زهرة صغيرة خاصة. هنا، يمكننا وصف طريقة للتحديد الكمي للنشا في primordia المبيض من الكرز الحلو (خوخ بالمتفطره L.) باستخدام نظام تحليل صورة المرفقة بالمجهر، مما يسمح المتعلقة بالتغييرات في محتوى النشا مع المراحل المختلفة من السكون من الخريف إلى الربيع. لهذا الغرض، تتحدد حالة السكون من براعم الزهور بتقييم نمو برعم البراعم نقلت إلى ظروف خاضعة للرقابة في أوقات مختلفة في وقت الشتاء. للتحديد الكمي للنشا في primordia المبيض، براعم الزهور تسلسلياً جمعت وثابتة، وجزءاً لا يتجزأ من شمع البارافين، مقطوع وملطخة بانا2-كوالا لمبور (يوديد البوتاسيوم-اليود). لاحظ تحت المجهر الأعمال التحضيرية وتحليلها بواسطة محلل صورة وضوح يميز النشا من الخلفية. يتم الحصول على قيم محتوى النشا بقياس الكثافة الضوئية للصورة التي تناظر النشا الملون، النظر في مجموع الكثافة البصرية لكل بكسل كتقدير محتوى النشا إطار درس.
Introduction
المعتدلة والجنيبات تتكيف مع المواسم بتحوير على النمو والتنمية. في حين أن تتطور خلال فصلي الربيع والصيف، أنها تتوقف عن النمو خلال فصل الخريف للانتقال الخاملة في فصل الشتاء1. تقشعر لها اﻷبدان على الرغم من السكون يسمح لهم بالبقاء على قيد الحياة في درجات الحرارة في فصل الشتاء منخفضة، شرط أساسي للبراعم سليم في الربيع2. آثار هامة من السكون في إنتاج فاكهة المناطق المعتدلة والغابات أدت إلى جهود متنوعة لتحديد وتوقع فترة السكون3. في أنواع أشجار الفاكهة، هي تجارب التجريبية تحويل البراعم إلى فرض شروط والتنبؤات الإحصائية استناداً إلى بيانات المزهرة النهج الحالية لتحديد التاريخ لكسر السكون، مما يسمح للباحثين لتقدير تقشعر لها اﻷبدان الاحتياجات لكل الأصناف المستنبطة. ومع ذلك، تظل كيفية تحديد حالة السكون استناداً إلى العمليات البيولوجية غير واضحة3.
الأزهار في أشجار فاكهة المناطق المعتدلة، مثل الكرز الحلو (خوخ بالمتفطره L.)، تحدث مرة واحدة في سنة، ويستمر عن أسبوعين. ومع ذلك، بدء الزهور التفريق ووضع حوالي 10 أشهر، وخلال الصيف الماضي4. زهرة primordia تتوقف عن النمو خلال فصل الخريف تظل نائمة داخل البراعم خلال فصل الشتاء. وفي هذه الفترة، يحتاج كل الأصناف المستنبطة تتراكم شرطا تقشعر لها اﻷبدان خاصة المزهرة السليم4. وعلى الرغم من عدم وجود تغييرات phenological في براعم خلال فصل الشتاء، زهرة primordia فسيولوجيا نشطة أثناء السكون وتراكم تقشعر لها اﻷبدان درجات الحرارة ارتبط مؤخرا مع دينامية تراكم النشا أو إنقاصها داخل خلايا primordium المبيض، تقدم نهجاً جديداً للسكون تصميم5. غير أن صغر حجم وموقع بريمورديوم المبيض يتطلب منهجية خاصة.
النشا من الكربوهيدرات مخزن كبير في أنواع النباتات الخشبية6. وهكذا، تم المتصلة بالتغيرات في النشا بالنشاط الفسيولوجية لانسجة الزهرة، التي تحتاج إلى الكربوهيدرات لدعم هذه التنمية7،8. أحداث رئيسية مختلفة أثناء عملية الإنجاب تتصل أيضا بالتغيرات في محتوى النشا في هياكل الأزهار مختلفة، مثل العضو الذكرى الانقسام الاختزالي9، نمو أنابيب اللقاح عن طريق التسميد نمط أو أوفولي10. تسمح التقنيات histochemical الكشف عن النشا في كل الأنسجة خاصة من بريمورديا زهرة أثناء السكون. ومع ذلك، يظل الصعوبة في التحديد الكمي لأن النشا للسماح في أعقاب النمط لتقليل تراكم على مر الزمن أو مقارنة النشا المحتوى بين الأنسجة، والأصناف، أو سنوات. وهذا نظراً لكمية ضئيلة من أنسجة للتقنيات التحليلية11. وكبديل لذلك، يسمح تحليل الصور المرتبطة بالفحص المجهري12 التحديد الكمي للنشا في عينات صغيرة جداً من الأنسجة النباتية13.
وقد استخدمت نهج الجمع بين التحليل المجهري والصورة التحديد الكمي لمحتوى مكونات مختلفة في الأنسجة النباتية، مثل كلوس14،15من microtubes، أو النشا16، بقياس حجم منطقة مصبوغ بخاصة البقع. للنشويات، فإنه يمكن بسهولة الكشف عن استخدام اليود في يوديد البوتاسيوم (أنا2كي) رد فعل17. هذا الأسلوب محددة للغاية؛ أنا2كي إينتيركالاتيس داخل بنية طبقية من الحبوب النشا وأشكال داكنة لون الأزرق أو البنى المحمر، اعتماداً على محتوى اميلوز النشاء18. أقسام ملطخة بانا2كي وصمة عار إظهار التباين كافية بين النشا والأنسجة الخلفية، مما يسمح الكشف عن نشأ لا لبس فيه والتقدير الكمي لاحقاً ب نظام تحليل الصورة19. على الرغم من أن هذه الصبغة غير المقايسة، تراكم اليود يتناسب مع طول جزيء النشا، التي يمكن أن تختلف الغاية17. وهكذا، حجم المنطقة الملون معبراً عنها بعدد البكسل قد لا تعكس بدقة محتوى النشا، حيث يمكن إيجاد فروق عالية في محتوى النشا بين الحقول باستخدام المناطق الملون من حجم مماثل. وكبديل لذلك، يمكن تقييم محتوى النشا بقياس الكثافة البصرية من الحبيبات الملون على الصور بالأبيض والأسود التي تم الحصول عليها من المجهر، كما أفيد في أنسجة مختلفة في المشمش8،13 , 19،20من اﻷفوكادو10،، و الزيتون21.
هنا، يمكننا وصف منهجية تجمع بين تصميم تجريبي من حالة السكون بالتحديد الكمي لمحتوى النشا في أنسجة المبيض بريمورديوم من الخريف إلى الربيع في الكرز الحلو، يوفر أداة جديدة للفهم والتنبؤ من السكون استناداً إلى دراسة الآليات البيولوجية المرتبطة بالسكون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. جمع مواد التصميم السكون والنبات
- عينة براعم الزهور في الميدان. دراسات السكون تجارب طويلة الأجل وتتطلب أشجار كبيرة بما يكفي لجمع براعم الكبار ويطلق النار طوال فصل الشتاء دون المساس بالتنمية الأشجار خلال فصل الربيع المقبل. إدارة بستان الخاصة يمكن أن تكون مطلوبة بالاعتماد على نظام التدريب؛ وهكذا، قد يكون التقليم أقل حدة من لأغراض إنتاج الفاكهة.
- جمع كل أسبوع، من بداية الخريف حتى بداية كسر برعم، وتزن 10 براعم الزهور.
- إصلاح براعم الزهور بوضعها في أنبوب زجاج 10 مل مع قبعة ونقع العينات في محلول مثبت من حمض الخليك/الإيثانول (3:1) لمالا يقل عن 24 ساعة عند 4 درجة مئوية. ثم تجاهل مثبت وإضافة الإيثانول 75%، سخاء ضمان أن يغطي العينات. يمكن حفظ العينات في هذا الحل في 4 درجات مئوية حتى استخدام.
ملاحظة: يمكن استخدام تسلل الفراغ إزالة فقاعات الهواء داخل المهد ومنعها من الطفو. هذا تسهل تغلغل مثبت في الأنسجة، لكن يمكن أن يلحق الضرر هيكل الأنسجة. في محاولة لتجنب ذلك إذا لم يكن ذلك ضروريا.
- عينة يطلق النار في الميدان.
- كل أسبوع، من بداية الخريف حتى بداية كسر برعم، أخذ يطلق النار على ثلاثة من 15-30 سم في الطول و 5 مم في القطر، والتي تتضمن على الأقل 10 براعم الزهور كل. مكان لهم في رغوة الزهور غارقة في المياه في دائرة نمو في 22 ± 1 درجة مئوية مع كبيرة خفيفة ح 12.
- بعد 10 أيام في قاعة النمو، اختيار وتزن 10 براعم الزهور من يطلق النار.
- تقييم نمو برعم وتحديد حالة السكون. فترة أخذ العينات قد يتعين تعديلها لظروف الموقع. في شروط بستان (سرقسطة بإسبانيا، 41 ° 44 '30"N, 0 ° 47 '00" ث، و 220 متر فوق مستوى سطح البحر)، أخذ عينات من يطلق النار نفذت اعتبارا من 30 تشرين الثاني/نوفمبر حتى نهاية فبراير أو بداية مارس.
- أسبوعيا تقييم الاستجابة براعم الزهور لظروف النمو المناسبة للدائرة، ابتداء من خريف حتى البراعم في فصل الربيع، بمقارنة وزن 10 براعم التقطت من الميدان.
- إذا لا توجد فروق أو تلك الاختلافات هي أقل من 30%، نعتبر أن البراعم لم تف متطلبات تقشعر لها اﻷبدان وهي اندودورمانت22. إذا الاختلافات هي أكثر من 30 في المائة، نعتبر أن البراعم أوفت متطلبات تقشعر لها اﻷبدان، وهي اكودورمانت22.
2-مصنع إعداد المواد لتحديد مقدار النشا
- حدد براعم الثابتة حوالي ستة من كل العينات حتى الآن (راجع الخطوة 1، 1). اعتماداً على أصناف، يتضمن كل برعم زهرة الكرز الحلو يصل إلى خمسة زهرة بريمورديا.
- إزالة جداول برعم خارجي ووضع البرعم على الزجاج الساعات مع الإيثانول 75% لمنعها من الجفاف.
- تشريح مهدها واستخراج بريمورديوم زهرة واحدة على الأقل كل برعم بمساعدة الملقط الدقة ومشرط لعينين تحت مجهر مجسمة. بريمورديوم زهرة يمكن المحافظة عليها في أنبوب زجاج 10 مل مع الإيثانول 75% في 4 درجات مئوية، أو الشروع فورا في الخطوة التالية.
- يذوي العينات في سلسلة التعليم العالي بوتيل الكحول.
- استبدال الحل الإيثانول 75% مع 10 مل كحول بوتيل العالي 75% (TBA) تغطية العينات سخاء واحتضانها لهم عن 1.5 ح. ماصة باستور يمكن أن تكون مفيدة لتجاهل الحل.
- كرر الخطوة 2.2.1، مضيفاً TBA مع ارتفاع تركيزات (85%، 95% و 100%، v/v؛ و x 3 مع TBA الصرفة) في فرن تجفيف في 30 درجة مئوية مع استخراج الهواء، منذ TBA نقية كريستاليزيس في درجة حرارة الغرفة (< 20 درجة مئوية) وهي متقلبة للغاية والسامة. إذا كريستاليزيس القابلات التقليديات بالعينة، فإنه سيضر بالانسجة.
- تضمين هذه العينات في البارافين18.
- تذوب في البارافين بإدخال اللؤلؤ البارافين في فرن التجفيف عند 60 درجة مئوية مع استخراج الهواء في اليوم السابق. اللؤلؤ البارافين يمكن أن يكون ذاب أيضا على هوتبلت، ولكن ضمان أن البارافين السائل عند 60 درجة مئوية، وليس عند درجة حرارة أعلى، لتجنب تلف الأنسجة.
- استبدال يضاف مزيج زيت البارافين والقابلات التقليديات (1:1) واحتضانها ح 24 داخل فرن تجفيف عند 60 درجة مئوية. ثم استبدال هذا المزيج من القابلات التقليديات وزيت البارافين مع نقية تذوب البارافين واحتضانها لمالا يقل عن 6 ح داخل فرن تجفيف عند 60 درجة مئوية. كرر أنه 2 x واحتضان التغيير الأخير على الأقل 4-6 د.
- ضع كل عينة على قالب قاعدة معدنية صغيرة على سطح حرارة، جزءا لا يتجزأ في شمع البارافين، ووتيرة كاسيت التضمين. وضعه على سطح بارد وإزالة الكتلة مرة واحدة هو توطد الشمع.
- الفرع وترطيب في الأعمال التحضيرية.
- إعداد مادة لاصقة في هوبت: حل 1 غرام جيلاتين نوكس عادي في 100 مل ماء المقطر عند 30 درجة مئوية؛ ثم إضافة 2 ز الفينول بلورات فضفاضة (ج6ح5OH) و 15 مل من الجلسرين. تنتشر مادة لاصقة هوبت على شريحة زجاجية مع فرشاة وإضافة قطره حل 1% فورمالدهايد.
- قسم البارافين كل كتلة في 10 ميكرون في مبضع الدنمارك ووضع المقاطع على شريحة زجاجية مغطاة مادة لاصقة هوبت ب.
- ضع الشرائح الزجاجية مع الفروع فوق سطح حرارة عند 35-40 درجة مئوية حتى الجاف؛ ثم نقل الشرائح الزجاجية لحامل شريحة.
- إعداد الحلول دو والاماهه. ضع 200 مل هيستوكليار الثاني في ثلاثة أطباق تلطيخ زجاج، واحد آخر مع هيستوكليار II:ethanol (1:1، v/v)، عبارة عن سلسلة إيثانول (100%، 70%، 40%، v/v)، ويغسل الماء المقطر نهائي.
- دو المقاطع مع ثلاثة يغسل، كل 5 دقائق، في الثاني هيستوكلير وفي هيستوكلير II:ethanol (1:1، v/v). وضع على الرف الشرائح داخل الأطباق تلطيخ زجاج، ضمان أن الحل الذي يغطي تماما الشرائح، وثم نقل رف شريحة من حل واحد إلى التالي.
- ترطيب الأجزاء من السلسلة التالية من يغسل 2-دقيقة: عبارة عن سلسلة إيثانول (100%، 70%، 40%، v/v) ويغسل الماء المقطر نهائي. وأخيراً، جاف الشرائح الزجاجية في درجة حرارة الغرفة.
- وصمة عار في المقاطع18.
- إعداد أنا وصمة عار كي2: حل ز 2 من يوديد البوتاسيوم (كي) و 0.2 جم من اليود (أنا2) في 100 مل ماء المقطر. ضع قطره جديد أنا2كي عبر المقاطع لمدة 5 دقائق وثم تجاهل الفائض من وصمة عار باستيعاب ذلك بورقة نشاف. بسرعة للانتقال إلى الخطوة التالية.
- تطبيق قطره صغيرة من وسائل الإعلام تصاعد الاصطناعية، ضع كوب غطاء صغير في الأعلى والضغط الثابت. عندما يجف تركيب وسائل الإعلام، مراقبة تحت مجهر مشرق المجال لإجراء تقييم أولى للنشا المبيض.
ملاحظة: هذه الخطوة غير إلزامية، على الرغم من أن يتم الحصول على النقيض أفضل بين النشا والخلفية. إذا كان المقطع يتم استخدامها مع بقع أخرى بعد القياس الكمي النشا، ضع الزجاج غطاء على قطره من وصمة عار وتجاهل الزائدة التي تستوعب ذلك بورقة نشاف (انظر 2.5.1). ثم، بعد تحديد مقدار النشا، يغسل بها الأول2كي وصمة عار مع الماء المقطر ومكان الأعمال التحضيرية على مدى حرارة السطحية في 35-40 درجة مئوية حتى الجاف.
3-التحديد الكمي لمحتوى النشا
- معايرة الشروط الضوئية.
ملاحظة: مستويات الكشف المستخدمة من قبل محلل الصورة للكشف عن النشا الملون تعتمد اعتماداً مباشرا على ظروف الإضاءة والتكبير من المجهر؛ وهكذا، إصلاح هذه الشروط لجميع الأعمال التحضيرية تقييمها. التكيف مع التسوية المقترحة هنا بالمجهر المتاحة وظروف الإضاءة.- ضبط فتحه الحجاب الحاجز في 20 X التكبير والتحكم بالسطوع أو شدة الضوء.
- تأكد من أن هناك أية عوامل تصفية على حامل الفلتر، وحدد شرط مشرق الميدانية في المجهر. حدد تكبير مناسبة (مثلاً، 40 X الكرز الحلو المبيض بريمورديوم).
- التحكم في شروط الحصول على الصورة. قم بضبط إعدادات الكاميرا مع تحضير الملون دون الأنسجة عن طريق الصورة | اكتساب | عرض ما قبل.
- إصلاح السطوع في 50%، الكسب في 1.0 x، ومؤشرات الرسم البياني قيمة غاما في 1.00، وعلى النقيض من 0-100، يصطفون مع حدود الرسم البياني توزيع السطوع.
- تنشيط وظيفة التعرض المفرط/ناقص وضبط وقت التعرض في الحد من التعرض المفرط.
- تطبيق الدالة توازن اللون الأبيض على صورة كاملة لعرض جميع عناصر محايدة الملون من الصورة دون أي نغمة اللون وتصحيح التظليل إلى الصورة الكاملة لإنشاء صورة متجانسة والمصوبة.
- معايرة "نظام تحليل الصور" الحصول على قيم عنصر التحكم لمستوى الكثافة البصرية المختلفة (OD) التي يتم الحصول عليها من القيم منافذه (T) رمادي (0، أسود؛ 255، بيضاء).
- الحصول على صورة لتحضير الملون دون الأنسجة، تعتبر السيطرة البيضاء، وقياس مستوى رمادية صورة بالأبيض والأسود عن طريق التدبير | رمادي التدبير | معايرة غراي | تشير القيمة = 0 | التدبير | معايرة | موافق. وهذا يتوافق مع منافذه 100%؛ وهكذا، بكثافة بصرية 0، وفقا للتطوير التنظيمي = 2-سجل ت.
- الحصول على صورة من إعداد نفسه مع عامل تصفية 4N، مما يقلل من كمية الضوء 4 x، وقياس مستوى رمادية صورة بالأبيض والأسود عن طريق التدبير | رمادي التدبير | معايرة غراي | تشير قيمة = 0.6 | التدبير | معايرة | موافق. وهذا يتوافق مع منافذه 25%؛ وهكذا، بكثافة بصرية من 0.6، وفقا للتطوير التنظيمي = 2-سجل ت.
- الحصول على صورة من إعداد نفسه دون الأسود الضوء، نظرت، وقياس مستوى رمادية صورة بالأبيض والأسود عن طريق التدبير | رمادي التدبير | معايرة غراي | تشير القيمة = 1 | التدبير | معايرة | موافق. وهذا يتوافق مع منافذه 0%؛ وهكذا، بكثافة بصرية 1، وفقا للتطوير التنظيمي = 2-سجل ت.
- الكشف عن النشا.
- الحصول على صورة ملونة من الميدان لقياس في تنسيق TIFF بدقة على الأقل 300 نقطة في البوصة (dpi).
- قم بإنشاء صورة ثنائي المقابلة لمنطقة الملون. تعيين عتبات الألوان الثلاثة (القيم بين 0-255 لكل منهما) حتى تعكس الصورة الثنائية بالضبط حبيبات النشا الملون، عبر الصورة ولاحظ | كشف | تحديد العتبات من الأحمر والأزرق والأخضر | موافق. إجراء مقارنات بصرية مرارا وتكرارا في مختلف الأعمال التحضيرية والأنسجة لضبط مستويات الكشف النهائي. تخزين واستخدام هذه المستويات لجميع الأعمال التحضيرية.
- تحديد كمية النشا. تحويل لون الصورة الأصلية إلى صورة أبيض وأسود مع نظام تحليل الصورة. استخدام الصورة الثنائية كقناع فرضه صورة بالأبيض والأسود في عن طريق الصورة | تحرير ثنائي. قياس مجموع الكثافة البصرية لكل بكسل تحت قناع عبر التدبير | الرمادي مستوى | موافق وتنظر هذه القيمة كمحتوى النشا في الحقل المقاسة.
- كرر الخطوات 3.4.1-3.4.3 في أربعة أماكن primordia المبيض للحصول على قيمة تمثيلية لمحتوى النشا في المبيض من زهرة بريمورديا.
- كرر الخطوات 3.4.1-3.4.3 والخطوة 3.4.5 في الزهور المختلفة لكل تاريخ جمع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
دراسات السكون يتطلب البت في هذه اللحظة عندما يتم الوفاء بمتطلبات تقشعر لها اﻷبدان. وعلى الرغم من عدم وجود تغييرات phenological خلال فصل الشتاء في ظل أوضاع ميدانية (الشكل 1A)، أشجار الكرز عدم استرداد قدرة النمو في ظروف مناسبة حتى تمر فترة زمنية معينة تحت درجات الحرارة المنخفضة. نقل منتظمة من يطلق النار على دائرة ظروف خاضعة للرقابة (الشكل 1B) خلال فصل الشتاء يسمح بتقييم حالة السكون من براعم الزهور. وكان يتم تقييم نمو برعم زهرة بقياس الزيادة في الوزن برعم. في حين، أثناء السكون، يمكن ملاحظة لا تغييرات بعد 10 أيام ظروف مناسبة (الشكل 1)، بعد أن تم التغلب على السكون، البراعم تضخمت وانفجر في غرفة النمو (الشكل 1). نتائج هذا التحليل يسمح بحالة السكون البراعم التي ستنشأ. بسبب درجات الحرارة المختلفة التي تحدث أثناء فصل الشتاء، تم التغلب على السكون في تواريخ مختلفة، اعتماداً على السنة. في حين، خلال السنة الأولى من الدراسة، حدث كسر السكون في كانون الثاني/يناير، قدمت السنة الثانية فصل شتاء أكثر اعتدالا؛ وهكذا، وقع الوفاء تقشعر لها اﻷبدان حوالي ثلاثة أسابيع بعد، في شباط/فبراير.
الكرز الحلو يحمل براعم الزهور في توتنهام، حيث مهدها قمي برعم الخضري وبراعم جانبية براعم الزهور (الشكل 1 ود 1). بدأت براعم غير متمايزة تفرق في الأزهار أو البراعم الخضري في نهاية فصل الصيف، وعندما أدخل السكون في فصل الشتاء، تبقى عدة زهرة primordia داخل المهد، المحمية بموجب جداول الخضراء عديدة وتغطيها (الميزان الخارجي البنى الرقم 1 و الشكل 2 أ). وأظهر التشريح برعم زهرة primordia زهرة صغيرة داخل (الشكل 2A). كل برعم زهرة الوارد واحد إلى خمسة زهرة فردية primordia (الشكل 2). على الرغم من صغر حجم كل زهرة بريمورديوم، جميع أجزاء زهرة تكون متباينة ويمكن تمييزها: في المدقة، في أنثيرس وتلات وكاسيه (الشكل 2). باستخدام تقنيات histochemical (الكحول: الخليك [3:1] التثبيت وشمع البارافين التضمين وتمزيقها مبضع وتلطيخ النشا المستندة إلى اليود) يسمح بتوزيع النشا داخل الزهرة بريمورديوم الأنسجة التي يتعين مراعاتها (الشكل 2D ).
وكان كمياً النشا في بريمورديوم المبيض في كل قسم. أربعة تدابير 1337 ميكرومتر2، في 40 x التكبير، مثل التخطيط العام للنشا في بريمورديوم المبيض الكرز الحلو (الشكل 3A). حبيبات النشا تم التمييز بوضوح بين الخلفية بعد2كي تلطيخ (الشكل 3B). وحدد نظام تحليل الصور، النشا بضبط لون الحدود الدنيا من الأحمر والأخضر والأزرق حتى لاحظ جميع الحبيبات النشا مشمولة بالصورة الثنائية التي تم إنشاؤها بواسطة النظام استناداً إلى معايير محددة بلون (الشكل 3). كانت قيم النشا المحتوى التي تم الحصول عليها نتيجة لقياس الكثافة الضوئية لكل بكسل تحت قناع على صورة أبيض وأسود (3D الشكل).
التحديد الكمي للنشا تكشف عن نمط ثابت من النشا الحيوية خلال فصل الشتاء (الشكل 4). كمية النشا في أوائل فصل الشتاء قدم باستمرار، قيمة كثافة ضوئية 40,000 أقل من3، بينما بلغ الحد الأقصى لمقدار قيمة تتراوح بين 120 و 140,000 في كل سنة. وفي حين تم التوصل إلى الحد الأقصى للقيمة في كانون الثاني/يناير خلال السنة الأولى (الشكل 4 أ)، أنه وقع في شباط/فبراير في السنة الثانية (الشكل 4 باء). وبمقارنة هذه النتائج مع البشرة من السكون، حدث الحد الأقصى لمقدار النشا في الوقت ذاته مع وفاء تقشعر لها اﻷبدان في كل سنة.
ويتطلب هذا النهج البت في وضع السكون (الشكل 5A) متزامنا مع التقدير الكمي النشا على أنسجة المبيض (الشكل 5B) بغية وضع إطار التغييرات في محتوى النشا فيما يتصل بالسكون.
رقم 1: الإعداد التجريبية لتحديد حالة السكون من براعم زهرة الكرز الحلو. فروع (A)، خلال فصل الشتاء، تظهر براعم نائمة مغلقة وتشملها جداول البنى الداكن. (ب) هذا الفريق يظهر يطلق النار على نقلها إلى دائرة النمو. في منتصف كانون الثاني/يناير، بعض الأصناف التي ظلت نائمة مع البراعم لا تزال مغلقة (السهم الأبيض)، بينما كان آخرون قادرة على النمو، تظهر براعم تضخمت (السهم الأسود). (ج) يظهر هذا الفريق تفصيل من تبادل لإطلاق النار مع براعم الزهور نائمة تقع جانبياً وبرعم الخضري واحد يقع في موقف قمي حفز. (د) هذا الفريق يبين تفصيل من تبادل لإطلاق النار مرة واحدة وتم التغلب على السكون بعد 10 أيام في قاعة المتزايد، يظهر تورم برعم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: مصنع إعداد المواد لتحديد مقدار النشا. (أ) هذا الفريق يظهر مقطع مستعرضة برعم زهرة، عرض اثنين زهرة بريمورديا (fp) المحمية بموجب جداول عديدة (sc). (ب) ثلاثة زهرة بريمورديا (fp) جمع في برعم زهرة. (ج) يظهر هذا الفريق قسم مستعرضة من بريمورديوم زهرة، مع جميع جدلات متباينة: كاسية (جنوب شرق) وتلات (pe)، أنثيرس (an) والمدقة (pi). ويتميز بريمورديوم المبيض في قاعدة المدقة (السهم). (د) القسم الأوسط من بريمورديوم زهرة كان جمعها وثابتة في كانون الثاني/يناير وجزءاً لا يتجزأ من شمع البارافين ومقطوع وملطخة بانا2كي (بني غامق) للنشا. ويبين هذا الفريق primordium المبيض (السهم). أشرطة مقياس هي 500 ميكرومتر في لوحات A و B و 200 ميكرومتر في لوحات ج ود. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: النشاء الكمي في الكرز الحلو المبيض بريمورديوم. (أ) هذا الفريق يظهر قسم الأوسط من بريمورديوم المبيض ملطخة بانا قيس2كي، عرض الإطارات الأربع الذي نشأ في المحتوى. (ب) هذا الفريق يوضح تفصيل بريمورديوم المبيض. حبيبات النشا ملطخة بالبنى الداكن. (ج) هذا الفريق يظهر صورة بسيودوكولور في النشا الذي يتوافق مع ظلال مختلفة من اللون الأزرق. (د) هذا الفريق يظهر قناع صورة ثنائية تغطي أنا النشا الملون كي2(أزرق) على الصورة الأصلية أبيض وأسود. يتم قياس الكثافة البصرية فقط في بكسل الصورة الأصلية المشمولة بالقناع. هي أشرطة مقياس 100 ميكرومتر في الفريق A و 20 ميكرومتر في لوحات ب - د. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: نتائج تمثيلية للتحديد الكمي النشا في الكرز الحلو المبيض primordia المجمعة شهريا من الخريف إلى الربيع خلال سنتين ظروف درجة الحرارة شتاء مختلف. (أ) هذا الفريق يظهر النتائج من سنة 2010-2011، الذي كان فصل شتاء بارد. وفاء تقشعر لها اﻷبدان (الثلج) وقع في كانون الثاني/يناير، متزامنا مع الحد الأقصى لمقدار النشا. (ب) هذا الفريق يوضح النتائج من سنة 2011-2012، الذي كان فصل شتاء معتدل. وفاء تقشعر لها اﻷبدان (الثلج) وقعت في شباط/فبراير، متزامنا مع الحد الأقصى لمقدار النشا. أن القيم هي ± يعني الخطأ المعياري للوسط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: مخطط لتصميم تجريبي لتقييم حالة السكون براعم وتقدير كمية النشا في بريمورديا المبيض في الكرز الحلو. (أ) هذا الفريق يوضح مهام سير العمل لتحديد حالة السكون: إعداد المواد النباتية والعملية، والنتائج التي تم الحصول عليها. (ب) هذا الفريق يوضح مهام سير العمل لتحديد مقدار النشا: إعداد البراعم histochemical لملاحظة مجهرية من النشا وكشف تحليل الصورة من النشا والنشا التحديد الكمي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويعرض السكون في والجنيبات آثار واضحة في إنتاج الفاكهة والغابات في تغير مناخ، على الرغم من أن هذه العملية البيولوجية وراء السكون لا يزال غير واضح. دراسات السكون يمكن تناولها من وجهات نظر مختلفة، ولكن البحث ابحث عن علامة بيولوجية للسكون الشتوية كثفت خلال السنوات الماضية. ومع ذلك، كانت معظم المحاولات الرامية إلى إيجاد مؤشرا لا لبس فيها تبين عندما برعم قد كسر السكون فاشلة3. المنهجية الموضحة هنا، الجمع بين تقنيات histochemical18 مع تحليل الصورة، كانت مفيدة جداً دراسة العلاقة بين احتياطي الكربوهيدرات لنسيج معين ونشاطها الفسيولوجية في براعم الكرز الحلو وخلال المراحل المختلفة من السكون5 ويمكن تطبيقها أيضا على سائر الأنواع والأنسجة10،،من1320.
احتياطي الكربوهيدرات في شكل نشاء تلعب دوراً هاما في التنمية زهرة وفي العملية الإنجابية7،10،13،20،،من2123 و في موسمية المعتدلة والجنيبات6. دراسات مختلفة عن السكون اهتماما للنشا داخل براعم24. ومع ذلك، نظراً لصغر حجمها، براعم كامل عدة مطلوبة لاستخدام أساليب التحليل الكمي، ومحدود الكشف عن التغيرات الكمية في أنسجة معينة أو الخلايا بإخفاء تأثير الخلايا المحيطة. مجموعة التقنيات histochemical مع نظام تحليل الصور يوفر فرصة طيبة لدراسة التغيرات في محتوى النشا هياكل مختلفة داخل المهد.
هذا الأسلوب القيد منع التحديد الكمي للمحتوى الدقيق للنشا في الأنسجة ولكن تسمح بمحتوى النشا النسبي كمياً لتتبع التغيرات الكمية نشأ على مر الوقت25 ومقارنة النشا المحتوى من أنسجة مختلفة13،20أو الأصناف أو سنوات5. من أجل السماح بمقارنة صحيحة لقيم الكثافة البصرية بين الحقول، والأنسجة، وبراعم، ومعايرة النظام (ظروف الإضاءة والمصبوغة كثافة والتكبير)، وتحديد لون عتبات يجب أن توضع بدقة ، تخزين، وتستخدم لجميع الأعمال التحضيرية.
تلطيخ النشا والتقدير الكمي استناداً إلى اليود البوتاسيوم يسمح باستخدام اللاحقة من البقع الأخرى بعد الغسيل للقسم. وهكذا، يمكن إجراء تحليلات مختلفة دون الاستعدادات إضافية وتصاعد الاصطناعية وسائل الإعلام لا تستخدم5،20. وبالمثل، يمكن أن يتم شكلي القياسات26 بعد التحضيرات نفسه، مما يتيح نمط تراكم النشا أن تكون مؤطرة بالنسبة لنمو هياكل مختلفة5،13. الأسلوب يمكن تكييفها للهياكل أو الأنواع مع تعديل مستويات الألوان باستخدام المحلل للكشف عن النشا، التي يمكن أن تسمح دراسة العمليات الإنمائية الأخرى التي تنطوي على تغييرات في محتوى النشا في مجموعات صغيرة من الخلايا الأخرى.
العلاقة بين الإفراج عن السكون والنشا تراكم في primordia المبيض النقاب عن طريق استخدام هذا الأسلوب يوفر أساسا سليما لفهم الأساس البيولوجي للسكون وتقشعر لها اﻷبدان متطلبات5. ومع ذلك، يمكن أن تتحول الكمي النشا بتحليل الصور في أقسام جزءا لا يتجزأ من البارافين أن تكون مرهقة للغاية وتستغرق وقتاً طويلاً لتقدير الاحتياجات تقشعر لها اﻷبدان لعدد كبير من الأصناف. الجهود المستقبلية يجب أن تركز على دراسة موثوقة المؤشرات البيولوجية التي يمكن بسهولة الإشارة إلى حالة السكون من الشجرة. ومن ناحية أخرى، يمكن استخدام نمط التغيرات النشا أثناء السكون لتأطير إجراء مزيد من الدراسات الفسيولوجية والجينية، ويمكن استخدام مزيج تقنيات histochemical مع تحليل الصورة الموضحة هنا في سائر المحاصيل المعمرة الخشبية تقدير محتوى النشا من أنسجة مختلفة فيما يتعلق بالسكون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون امتنان هيريرو ماريا وريفاس ايليسيو على المناقشة المفيدة والمشورة. هذا العمل كان يدعمها ص دي وزارة الاقتصاد كومبيتيتيفيداد-"الصندوق الأوروبي للتنمية الإقليمية"، الاتحاد الأوروبي منحة العدد [بس--2010--037992 واو هاء]؛ نعم المعهد الوطني لبحوث التكنولوجيا الزراعي y اليمنتيريا [منح أرقام RFP2015-00015-00، RTA2014-00085-00، RTA2017-00003-00]؛ والحكومة دي أراغون – "الصندوق الاجتماعي الأوروبي"، والاتحاد الأوروبي [Grupo تسبب A12-17R].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Precision scale | Sartorius | CP225D | |
| Stereoscopic microscope | Leica Microsystems | MZ-16 | |
| Drying-stove | Memmert | U15 | |
| Paraffin Embedding station | Leica Microsystems | EG1140H | |
| Rotatory microtome | Reichert-Jung | 1130/Biocut | |
| Microtome blade | Feather | S35 | Stainless steel |
| Bright field microscope | Leica Microsystems | DM2500 | |
| Digital Camera | Leica Microsystems | DC-300 | |
| Image Analysis System | Leica Microsystems | Quantiment Q550 |
References
- Kurokura, T., Mimida, N., Battey, N. H., Hytönen, T. The regulation of seasonal flowering in the Rosaceae. Journal of Experimental Botany. 64 (14), 4131-4141 (2013).
- Rohde, A., Bhalerao, R. P.
- Fadón, E., Rodrigo, J. Unveiling winter dormancy through empirical experiments. Environmental and Experimental Botany. 152, 28-36 (2018).
- Fadón, E., Rodrigo, J., Herrero, M. Is there a specific stage to rest? Morphological changes in flower primordia in relation to endodormancy in sweet cherry (Prunus avium L.). Trees - Structure and Function. , In Press (2018).
- Fadón, E., Herrero, M., Rodrigo, J. Dormant flower buds actively accumulate starch over winter in sweet cherry. Frontiers in Plant Science. 9 (171), (2018).
- Loescher, W. H., Mccamant, T., Keller, J. D. Carbohydrate reserves, translocation and storage in woody plant roots. HortScience. 25 (3), 274-281 (1990).
- Hedhly, A., et al. Starch turnover and metabolism during flower and early embryo development. Plant Physiology. , (2016).
- Rodrigo, J., Hormaza, J. I., Herrero, M. Ovary starch reserves and flower development in apricot (Prunus armeniaca). Physiologia Plantarum. 108 (1), 35-41 (2000).
- Julian, C., Rodrigo, J., Herrero, M. Stamen development and winter dormancy in apricot (Prunus armeniaca). Annals of Botany. 108 (4), 617-625 (2011).
- Alcaraz, M. L., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Pistil starch reserves at anthesis correlate with final flower fate in avocado (Persea americana). PLoS One. 8 (10), e78467 (2013).
- Smith, A. M., Zeeman, S. C. Quantification of starch in plant tissues. Nature Protocols. 1 (3), 1342-1345 (2006).
- Eliceiri, K. W., et al.
- Rodrigo, J., Herrero, M. Influence of intraovular reserves on ovule fate in apricot (Prunus armeniaca L.). Sexual Plant Reproduction. 11, 86-93 (1998).
- Zhou, J., Spallek, T., Faulkner, C., Robatzek, S. CalloseMeasurer: A novel software solution to measure callose deposition and recognise spreading callose patterns. Plant Methods. 8 (1), (2012).
- Faulkner, C., et al. An automated quantitative image analysis tool for the identification of microtubule patterns in plants. Traffic. 18 (10), 683-693 (2017).
- Kuhn, B. F. Determination of starch in ovules of the sour cherry cv. "Stevnsbaer.". European Journal of Horticultural Science. 71 (3), 120-124 (2006).
- Johansen, D. A. Plant microtechnique. , McGraw-Hill. New York, NY. (1940).
- Ruzin, S. E. Plant microtechnique and microscopy. , Oxford University Press. New York, NY. (1999).
- Rodrigo, J., Rivas, E., Herrero, M. Starch determination in plant tissues using a computerized image analysis system. Physiologia Plantarum. 99 (1), 105-110 (1997).
- Alcaraz, M. L., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Ovary starch reserves and pistil development in avocado (Persea americana). Physiologia Plantarum. 140 (4), 395-404 (2010).
- Suarez, C., Castro, A. J., Rapoport, H. F., Rodriguez-García, M. I. Morphological, histological and ultrastructural changes in the olive pistil during flowering. Sexual Plant Reproduction. 25, 133-146 (2012).
- Lang, G. A., Early, J. D., Martin, G. C., Darnell, R. L. Endodormancy, paradormancy, and ecodormancy - Physiological terminology and classification for dormancy research. HortScience. 22 (3), 371-377 (1987).
- Hedhly, A., Vogler, H., Eichenberger, C., Grossniklaus, U. Whole-mount clearing and staining of arabidopsis flower organs and siliques. Journal of Visualized Experiments. 2018 (134), 1-10 (2018).
- Kaufmann, H., Blanke, M. Changes in carbohydrate levels and relative water content (RWC) to distinguish dormancy phases in sweet cherry. Journal of Plant Physiology. 218 (July), 1-5 (2017).
- Herrero, M., Dickinson, H. G. Pollen-pistil incompatibility in Petunia hybrida: changes in the pistil following compatible and incompatible intraspecific crosses. Journal of Cell Science. 36, 1-18 (1979).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).
