Summary
Biz histochemical teknikleri ile kombine bir görüntü analiz sistemi kullanılarak sırasında kış uyuşukluk yumurtalık primordia tatlı kiraz (Prunus avium L.) içinde nişasta içeriğinde ölçmek için bir metodoloji mevcut.
Abstract
Nişasta küçük yapılarda üreme aşamaya döllenme ve meyve başlangıcı tozlaşma üzerinden de dahil olmak üzere çeşitli bitki gelişim süreçleri sırasında önemli olaylar ile ilişkili değişikliklerdir. Ancak, nişasta değişimler çiçek farklılaşma sırasında tamamen, çiçek primordia özellikle küçük yapıların nişasta içeriğinde miktarının esas zorluğu nedeniyle bilinmemektedir. Burada, farklı aşamaları ile nişasta içeriğinde değişiklikler ile ilgili sağlar mikroskop bağlı bir görüntü analiz sistemi kullanılarak yumurtalık primordia tatlı kiraz (Prunus avium L.) nişasta miktar için bir yöntemi açıklamak Bahar sonbahardan uyuşukluk. Bu amaçla, bud büyüme için kontrollü şartlar kış zamanında farklı anlarda transfer sürgünlerin değerlendirerek çiçek tomurcukları uyuşukluk durumu belirlenir. Yumurtalık primordia nişasta miktar için çiçek tomurcukları ardışık olarak toplanan, sabit, parafin balmumu içinde gömülü, kesitli ve ben ile lekeli2Kl (potasyum iyodür-iyot). Ürünleri mikroskop altında gözlenen ve açıkça nişasta kökenli ayıran bir Image analyzer tarafından incelendi. Nişasta içerik değerleri her bir pikselin optik yoğunluk okudu çerçeve nişasta içeriği bir tahmini olarak toplamı dikkate alınarak lekeli nişasta için karşılık gelen görüntü optik yoğunluk ölçerek elde edilir.
Introduction
Ilıman odunsu çok yıllık bitkiler için mevsim onların büyüme ve gelişme oransal uyum. Bahar ve yaz aylarında geliştirirken, Sonbahar Kış1' uyuyan gitmek sırasında büyüyen durdurmak. Uyuşukluk düşük kış ısılarda hayatta kalmak izin verecek, ancak, tüyler ürpertici bir bahar2uygun bir budburst için ön koşuldur. Uyuşukluk ılıman meyve üretim ve Ormancılık önemli etkileri çeşitli çabalarını belirlemek ve uyuşukluk dönem3tahmin açmıştır. Meyve ağacı türleri, ampirik deneyler koşulları ve çiçekli verilerine dayalı istatistiksel tahminler zorlama için sürgünler aktarma uyuşukluk, tahmin etmek araştırmacılar sağlayan kırılması tarihini belirlemek için güncel yaklaşımları vardır. her çeşidinde için gereksinimleri tüyler ürpertici. Ancak, biyolojik süreçleri dayalı uyuşukluk durumunu belirlemek nasıl belirsiz3kalır.
Tatlı kiraz (Prunus avium L.), gibi ılıman meyve ağaçlarında çiçeklenme yılda bir kez oluşur ve hakkında bir iki hafta sürer. Ancak, çiçekler ve dönüşüm sırasında önceki yaz4yaklaşık 10 ay önce geliştirmek için başlatın. Çiçek primordia sonbahar kış aylarında tomurcukları içinde hareketsiz kalır sırasında büyüyen durdurmak. Bu dönemde her çeşidinde uygun çiçekli4için belirli bir tüyler ürpertici gereklilik birikir gerekir. Kış aylarında tomurcukları phenological değişiklikler olmamasına rağmen çiçek primordia sırasında uyuşukluk fizyolojik aktif ve sıcaklık soğutma birikimi son zamanlarda nişasta birikimi dinamik ile ilişkili olduğu veya azaltmak Yumurtalık primordium hücrelerde uyuşukluk belirlenmesi5için yeni bir yaklaşım sunuyor. Ancak, küçük boyutu ve yumurtalık primordium konumunu özel bir metodoloji gerektirir.
Nişasta odunsu bitki tür6büyük depolama karbonhidrat var. Böylece, nişasta değişimler için karbonhidrat onların geliştirme7,8desteklemek için gereken çiçek dokuların etkinlik fizyolojik ile ilgili olduğu. Üreme sürecinde farklı önemli olaylar da nişasta içeriği Anter mayoz9, polen tüplerinin ile stil veya ovule fertilizasyon10büyüme gibi farklı çiçek yapılarda değişimler ilgilidir. Histochemical teknikleri nişasta tespiti sırasında uyuşukluk çiçek primordia her belirli doku sağlar. Ancak, zorluk birikimi/azaltma onun desen zamana veya nişasta karşılaştırma takiben dokuların, çeşitlerin veya yıl arasında içerik izin vermek o nişasta miktarının kalır. Bu doku için analitik teknikler11kullanılabilir küçük miktarda kaynaklanmaktadır. Alternatif olarak, görüntü analiz mikroskobu12 ' ye bağlı nişasta miktar bitki doku13çok küçük örnekleri sağlar.
Callose14, mikrotüpler15, gibi bitki dokularında farklı bileşeninin içeriğini ölçmek veya özel tarafından boyanmış alanının boyutunu ölçerek16, nişasta için kullanılan mikroskobu ve görüntü analizi birleştirerek yaklaşımlar lekeleri. Nişasta için bu kolayca potasyum iyodür-iyot kullanarak tespit edilebilir (Ben2KI) tepki17. Bu yöntem son derece özeldir; Ben2KI nişasta taneleri Laminer yapısı içinde intercalates ve koyu mavi veya kırmızımsı kahverengi renk, nişasta18Amiloz içeriğine göre oluşturur. Bölümler ile lekeli2KI leke nişasta ve bir kesin nişasta algılama ve sonraki miktar görüntü analiz sistemi19tarafından izin arka plan doku arasında yeterli kontrast göster. Bu boya stokiometrik olmasa da, iyot birikimi son derece17değişebilir nişasta molekül uzunluğu ile doğru orantılıdır. Böylece, nişasta içeriği yüksek farklılıklar benzer boyutta lekeli alanlar içeren alanlar arasında bulunamadı bu yana piksel sayısı olarak ifade lekeli alanının boyutunu nişasta, içeriğini doğru yansıtmayabilir. Alternatif olarak, nişasta içeriği kayısı8,13 farklı dokularda bildirilmiştir gibi--dan mikroskop, elde edilen siyah beyaz görüntülerde lekeli granül optik yoğunluk ölçme tarafından değerlendirilecek , 19, avokado10,20ve zeytin21.
Burada, anlayış ve tahmin için yeni bir araç sunuyor nişasta içeriği yumurtalık primordium doku tatlı kiraz, Bahar sonbahardan miktar uyuşukluk durum deneysel belirlenmesi birleştiren bir metodoloji açıklamak biyolojik mekanizmaları çalışmaya dayanarak uyuşukluk ve uyuşukluk ile bağlantılı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. uyuşukluk belirlenmesi ve bitki malzeme toplama
- Çiçek tomurcukları alanında örnek. Uyuşukluk çalışmalar uzun süreli deneyler ve yetişkin tomurcukları toplamak için yeterince büyük ağaçlar ve ağaçlar geliştirme önümüzdeki bahar aylarında ödün vermeden bütün kış vuruyor gerektirir. Özel meyve bahçesi yönetimi eğitim sistemine bağlı olarak gerekli olabilir; Böylece, budama meyve üretim amaçları için daha az şiddetli olabilir.
- Her hafta, bud sonu, başlangıcı kadar Sonbahar başlangıcı toplamak ve 10 çiçek tomurcukları ağırlık.
- Bir kap ile 10 mL cam tüp içine yerleştirerek çiçek tomurcukları gidermek ve etanol/Asetik asit (3:1) için en az 24 Saat 4 ° C'de bir sabitleştirici çözümde örnekleri emmek Sonra sabitleştirici atmak ve % 75 etanol, cömertçe örnekleri gelebilmektedir sağlanması ekleyin. Örnekleri 4 ° C'de Bu çözümde kullanmak kadar korunmuş.
Not: Vakum infiltrasyon tomurcuk içinde hava kabarcıkları kaldırmak ve onları yüzen gelen engellemek için kullanılabilir. Bu sabitleştirici penetrasyon dokuları içine kolaylaştırır ancak yapısı dokuları zarar verebilir. Eğer gerekli değil önlemek için deneyin.
- Sürgünler alanında örnek.
- Her hafta, 15-30 cm uzunluğunda ve 5 mm çapında, en az 10 çiçek tomurcukları içeren üç sürgünler bud sonu, başlangıcı kadar Sonbahar başlangıcı almak. Onları suya batırılmış çiçekçi köpük 22 ± 1 ° C 12 h hafif photoperiod da adlı bir büyüme odasında yerleştirin.
- 10 gün içinde büyüme odası sonra al ve 10 çiçek tomurcukları sürgün tartın.
- Bud büyüme değerlendirmek ve uyuşukluk durumunu belirlemek. Konumu koşulları için ayarlanacak örnekleme süresi vardır. Orchard koşullarında (Zaragoza, İspanya, 41 ° 44'30 "N, 0 ° 47'00" W ve deniz seviyesinden 220 m), sürgünlerin örnekleme 30 Kasım Şubat sonu ya da Mart başında kadar üzerinden gerçekleştirilmiştir.
- Haftalık çiçek tomurcukları yanıt odası, uygun büyüme koşullarına kadar budburst Bahar, sonbahar başlangıcından itibaren alanından aldım 10 tomurcukları ağırlık karşılaştırarak değerlendirin.
- Hiçbir farkı yoktur veya daha az % 30 bu farklılıklar vardır, tomurcuklar tüyler ürpertici gereksinimlerini yerine değil ve endodormant22vardır düşünün. Farklılıklar daha--dan %30, tomurcuklar tüyler ürpertici gereksinimlerini yerine getirdim ve ecodormant22düşünün.
2. bitki nişasta miktar malzeme hazırlığı
- Her örnekleme gelen Select altı sabit tomurcukları (bkz. Adım 1.1) Tarih. Çeşitlerin bağlı olarak, her tatlı kiraz çiçek tomurcuk beş çiçek primordia içerir.
- Dış bud ölçekler çıkarın ve tomurcuk kurumasını önlemek için % 75 etanol ile saatçi'nın camına yerleştirin.
- Tomurcuk teşrih ve hassas forseps yardımıyla ve stereoskopik mikroskop altında Oftalmolojik bir neşter ile bud başına en az bir çiçek primordium ayıklayın. Çiçek primordium bir 10 mL cam tüp 4 ° C'de % 75 etanol ile korunmuş veya hemen sonraki adıma geçin.
- Tersiyer Bütil alkol serisi örneklerinde kurutmak.
- % 75 etanol çözüm 10 mL % 75 Tersiyer Bütil alkol (TBA) 1,5 saat için kuluçkaya ve cömertçe örnekleri kapağı değiştirin. Pasteur pipet çözüm atmak yararlı olabilir.
- Saf TBA oda sıcaklığında (< 20 ° C) crystalizes ve çok uçucu ve toksik beri yükselen konsantrasyonlarda (% 85, % 95 ve % 100, v/v; ve saf TBA ile 3 x) ile TBA ekleme 2.2.1, 30 ° c ile hava emme, kurutma fırın içinde adımları yineleyin. TBA ile örnek crystalizes durumunda dokulara zarar.
- Parafin18' örnekleri katıştır.
- Parafin ile hava ayıklama önceki gün 60 ° C'de kurutma fırın içinde parafin inci tanıtarak eritebilir. Parafin inci de bir ocağın üzerinde erimiş olabilir, ama Sıvı parafin 60 ° C'de ve doku hasarı önlemek için daha yüksek bir sıcaklık, olduğundan emin olun.
- TBA TBA ve parafin yağı (1:1) karışımı ile değiştirin ve 60 ° C'de kurutma fırın içinde 24 h için kuluçkaya O zaman, TBA karışımı eski yerine koymak ve parafin yağı ile saf parafin eritin ve 60 ° C'de kurutma fırın içinde en az 6 h için kuluçkaya Tekrar 2 x ve en az 4-6 d için son değişikliği kuluçkaya.
- Her örnek üzerinde küçük bir metal temel kalıp ısı yüzey üzerinde yerleştirin parafin ve gömme kaset hızı gömülü. Soğuk bir yüzeye yerleştirin ve balmumu katılaşmış bir kez blok çıkarın.
- Bölüm ve hazırlıklar rehydrate.
- Haupt'ın yapıştırıcı hazırlamak: düz Knox jelatin 30 ° C'de; distile su 100 ml 1 g dağıtılması sonra 2 g fenol gevşek kristaller (C6H5OH) ve 15 mL gliserol ekleyin. Bir fırça ile bir cam slayt Haupt'ın yapıştırıcı yayılmış ve % 1 formaldehit çözüm bir damla ekleyin.
- Her parafin 10 µm çevirme microtome, blok ve cam slayt üzerine bölümleri yer bölümü Haupt'ın yapıştırıcı ile kaplı.
- Cam slaytlar bölümleri ile 35-40 ° c ısı yüzey kuru kadar yerleştirin; sonra cam slaytları bir slayt raf taşıyın.
- Dewax ve rehydration çözümleri hazırlayın. Histoclear II 200 mL yer üç yemekleri Cam Boyama, başka bir Histoclear II:ethanol (1:1, v/v) ile bir etanol serisi (% 100, % 70, % 40, v/v) ve son bir distile su yıkama.
- Üç yıkar, her 5 dk, Histoclear II ve Histoclear II:ethanol (1:1, v/v) bölümlerle dewax. Cam Boyama yemekleri çözüm tamamen slaytları kapsar sağlanması içinde slayt raf yerleştirin ve sonra slayt raf bir çözümden geçmek.
- Bölüm 2-min yıkar aşağıdaki bir dizi tarafından rehydrate: bir etanol serisi (% 100, % 70, % 40, v/v) ve son distile su yıkama. Son olarak, oda sıcaklığında cam slaytlar kuru.
- Bölüm18leke.
- Hazırlamak2KI leke: 2 g potasyum iyodür (KI) ve iyot 0.2 g dağıtılması (Ben2) 100 ml distile su. Bir damla taze uygulama ben2KI 5 min için bölümler üzerinde ve sonra leke fazlalığı ile Bloting kağıt emerek atın. Hızlı bir şekilde bir sonraki adıma geçin.
- Küçük bir damla bir sentetik montaj ortamının uygulama, küçük bir cam üzerine yerleştirin ve sert bastır. Montaj medya kurur sonra yumurtalık nişasta bir ön değerlendirme için alan parlak mikroskopla gözlemlemek.
Not: nişasta ile arka plan arasında daha iyi bir kontrast elde edilir, ancak bu adım zorunlu değildir. Bölümün diğer lekeleri ile nişasta miktar sonra yeniden kullanılabilir varsa, cam damla leke olarak yerleştirin ve Bloting kağıt ile emerek aşırı atmak (2.5.1 bakınız). Sonra nişasta miktar sonra yıkayın2KI benim leke distile su ve hazırlıklar bir ateşte 35-40 ° C kadar kuru yüzey yer ile.
3. miktar nişasta içeriği
- Optik koşullar kalibre.
Not: Image analyzer tarafından lekeli nişasta algılamak için kullanılan algılama düzeyleri ışık koşulları ve mikroskop büyütme üzerinde doğrudan bağlı olan; Böylece, bu koşullar için tüm hazırlıklar değerlendirildi düzeltmek. Burada mevcut mikroskop ve ışık koşulları için önerilen ayar uyum.- Diyafram diyafram 20 X büyütme ve Parlaklık kontrolü veya ışık yoğunluğunu ayarlayın.
- Filtre tutucu filtre olduğundan emin olun ve mikroskobu parlak alan koşulunu seçin. (Örneğin, 40 X tatlı kiraz yumurtalık primordium için) uygun bir büyütme düzeyini seçin.
- Görüntü edinme koşulları kontrol. Kamera ayarlarını doku ile görüntü olmadan lekeli bir hazırlık | Edinme | Ön görünüm.
- Parlaklığı % 50, kazanç 1.0'de düzeltmek x ve gamma değeri 1.00 ve kontrast at 0 - çubuk grafik göstergeleri 100, parlaklık dağıtım histogram sınırları ile sıraya.
- Dozun/pozlama iþlevini etkinleþtirmek ve overexposure limitte çekim hızı ayarlayın.
- Beyaz dengesi fonksiyonu tam görüntü düzeltilmiş ve homojen bir görüntü oluşturmak için herhangi bir renk tonu ve gölgelendirme düzeltme olmadan görüntünün tüm nötr renkli bileşenleri görüntülemek için tam görüntü uygulanır.
- Geçirgenliği (T) değerleri tarafından elde edilen farklı optik yoğunlukları (OD) gri düzeyi (0, siyah; 255, beyaz) denetim değerlerini elde etmek için görüntü analiz sistemi kalibre.
- Denetim beyaz kabul olmadan doku, lekeli bir hazırlık görüntüsünü elde etmek ve siyah beyaz görüntü ile ölçü gri düzeyini ölçmek | Gri ölçü birimi | Gri kalibre | Referans değeri = 0 | Ölçü birimi | Kalibre | Tamam. Bu % 100 geçirgenliği ile karşılık gelir; Böylece, bir optik yoğunluğu 0, OD göre = 2 - T. oturum
- 4 ışık miktarını azaltan bir 4N filtresiyle aynı hazırlık görüntüsünü elde x ve ölçü siyah beyaz görüntü ile ölçü gri düzeyi | Gri ölçü birimi | Gri kalibre | Referans değeri 0.6 = | Ölçü birimi | Kalibre | Tamam. Bu bir % 25 geçirgenliği ile karşılık gelir; Böylece, optik bir yoğunluğu 0,6, OD göre = 2 - T. oturum
- Işık, kabul siyah olmadan aynı hazırlık görüntüsünü elde etmek ve siyah beyaz görüntü ile ölçü gri düzeyini ölçmek | Gri ölçü birimi | Gri kalibre | Referans değeri = 1 | Ölçü birimi | Kalibre | Tamam. Bu bir % 0 geçirgenliği ile karşılık gelir; Böylece, optik bir 1, OD göre yoğunluğu = 2 - T. oturum
- Nişasta algılamak.
- TIFF formatında en az 300 nokta / inç (dpi) çözünürlüğe sahip ölçmek için alan bir renk görüntüsünü elde etmek.
- Lekeli alan karşılık gelen ikili bir resim oluşturun. Üç renk eşikleri ayarlamak (değerleri arasında 0 - 255 her biri için) ikili görüntü tam olarak gözlenen üzerinden görüntü lekeli nişasta granülleri yansıtır kadar | Tespit | Kırmızı, mavi ve yeşil eşikleri seçin | Tamam. Çeşitli hazırlıkları ve doku son algılama düzeyleri ayarlamak için tekrar tekrar görsel karşılaştırma yapmak. Depolayın ve bu düzeyleri için tüm hazırlıklar kullanın.
- Nişasta ölçmek. Orijinal renk görüntü görüntü analiz sistemi ile siyah beyaz bir görüntü dönüştürmek. İkili resim siyah beyaz görüntü ile görüntü üzerinde üst üste bir maske olarak kullanmak | İkili düzen. Optik yoğunluk maske ile ölçü birimi altında her pikselin toplamı ölçmek | Gri düzeyi | Tamam ve ölçülen alanın nişasta içerik olarak bu değeri göz önünde bulundurun.
- 3.4.1 - 3.4.3 dört yerleri yumurtalık primordia çiçek primordia yumurtalık nişasta içeriğinde temsil eden bir değer elde etmek için yineleyin.
- Tekrarlamak merdiven 3.4.1 - 3.4.3 ve 3.4.5 her toplama tarihi farklı çiçekler içinde adım.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Uyuşukluk çalışmalar ne zaman ürpertici koşulları yerine getirmek an belirlenmesi gerekir. Düşük sıcaklık altında belirli bir süre geçene phenological değişiklikleri alan koşullarında (şekil 1A) kış aylarında olmamasına rağmen uygun koşullarla büyüme kapasitesini kiraz ağaçları geri mi. Sürgünleri Kış saati sırasında kontrollü şartlar Odası (şekil 1B) için normal aktarım çiçek tomurcukları uyuşukluk durumunu değerlendirilmesi izin. Bud ağırlık artışı ölçerek çiçek tomurcuk büyüme değerlendirilmesi yapıldı. Uyuşukluk üstesinden oldu bir kez sırasında uyuşukluk, herhangi bir değişiklik uygun koşullar (şekil 1 c), 10 gün sonra gözlenen iken, tomurcuklar arttı ve büyüme odası (şekil 1 d) patladı. Bu incelemenin sonuçlarını kurulacak tomurcukları uyuşukluk durumu kullanılabilir. Kış aylarında meydana gelen farklı sıcaklıklarda nedeniyle uyuşukluk yıl bağlı olarak farklı tarihlerde üstesinden oldu. Süre çalışma ilk yıl boyunca, Ocak ayında, uyuşukluk kırılması oluştu ikinci yıl daha hafif bir kış sundu; Böylece, tüyler ürpertici yerine getirilmesi yaklaşık üç hafta sonra Şubat ayında oluştu.
Tatlı kiraz çiçek tomurcukları burada apikal bud bitkisel bir tomurcuk, çiçek tomurcukları (şekil 1 c ve 1 D) lateral kankayız spurs içinde taşımaktadır. Farklılaşmamış tomurcukları içine çiçek ya da bitkisel buds yaz sonunda ayırt etmek başladı ve kış döneminde uyuşukluk girdikleri zaman içinde belgili tanımlık gonca, çok sayıda yeşil ölçekler tarafından korunan ve kaplı kahverengi dış ölçekler () tarafından birkaç çiçek primordia kalır Şekil 1 c ve şekil 2A). Çiçek tomurcuk diseksiyon (şekil 2A) içinde küçük çiçek primordia gösterdi. Her çiçek tomurcuk en çok beş bireysel çiçek primordia (şekil 2B) içeriyordu. Her çiçek primordium küçük boyutu rağmen bir çiçek tüm parçaları ayrıştırılan ve ayırt edici olabilir: pistil, nedir, yaprakları ve sepals (şekil 2C). Histochemical teknikleri (alkol: asetik [3:1] fiksasyon, parafin gömme, microtome kesit ve iyot tabanlı nişasta boyama) çiçek içinde nişasta dağılımını primordium doku (şekil 2B uyması gereken izin ).
Yumurtalık primordium nişasta her bölümünde sayısal. 1337 µm2, 40 x büyütme, dört ölçü nişasta tatlı kiraz yumurtalık primordium (şekil 3A) genel düzenini temsil. Nişasta granülleri açıkça ayırt edici arka plandan sonra2(şekil 3B) Boyama KI. Nişasta nişasta granülleri gözlenen kadar eşikleri kırmızı, yeşil ve mavi (şekil 3 c) tanımlanmış renk parametreleri temel alınarak sistemi tarafından oluşturulan ikili görüntü tarafından kapsanan rengi ayarlayarak görüntü analiz sistemi tarafından tespit edilmiştir. Alınan nişasta içeriği değerleri her piksel maskesi siyah beyaz görüntüye (şekil 3D) altında optik yoğunluk ölçümü sonucu vardı.
Nişasta miktar nişasta (şekil 4) kışın dinamik tutarlı bir desen ortaya koydu. Sürekli olarak, en fazla-120.000 ile 140.000 arasında bir değer her iki yıl içinde ulaştı erken kış nişasta miktarını bir optik yoğunluk değeri az 40.0003, sundu. En büyük değer ilk bir yılda (şekil 4A) Ocak ayında ulaşıldı, bunu ikinci yılında (şekil 4B) Şubat ayında oluştu. Uyuşukluk ten rengi ile bu sonuçlar zıt, nişasta miktarını kullanılazlar her iki yıl içinde ürpertici yerine getirilmesi ile oluştu.
Bu yaklaşım uyuşukluk durumu (şekil 5A) belirlenmesi kullanılazlar tarihinde yumurtalık dokusu (şekil 5B) nişasta miktar ile nişasta içeriği ile ilgili olarak uyuşukluk değişimler çerçeve için gerektirir.
Şekil 1: tatlı kiraz çiçek tomurcukları uyuşukluk durumunun belirlenmesi için deneysel set-up. (A)dalları, kış aylarında göstermek kapalı ve koyu kahverengi ölçekleri ile kaplı uyuyan tomurcukları. (B) bu panel büyüme odasına transfer sürgünler gösterir. Diğerleri büyümek mümkün iken Ocak ayında orta tomurcukları ile atıl kaldı bazı çeşitlerin hala (beyaz ok), kirinden tomurcukları (siyah ok) gösterilen kapalı. (C) bu panel uyuyan çiçek tomurcukları yanal bulunan ve teşvik apikal konumda bulunan tek bir bitkisel tomurcuk bir çekim detayını gösterir. Uyuşukluk 10 gün sonra büyüyen odasında üstesinden oldu bir kez (D) bu panel bud şişme gösterilen bir çekim ayrıntılarını gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: bitki nişasta miktar malzeme hazırlığı. İki çiçek primordia (fp) gösterilen bir çiçek tomurcuğu enine bir bölümünü çok sayıda ölçekler (sc) tarafından korunan (A) bu panel gösterir. (B) üç çiçek primordia (fp) çiçek tomurcuk içinde toplamak. (C) bu panel bir çiçek primordium enine bir bölümünü gösterir tüm düğümler ile ayrıştırılan: sepals (se), yaprakları (pe), nedir (bir) ve pistil (PI). Yumurtalık primordium (ok) pistil tabanında ayırt edilir. Bir çiçek primordium in (D) A orta kesiminde toplanan Ocak ayında sabit, parafin balmumu içinde gömülü, kesitli ve ben ile lekeli2KI (koyu kahverengi) nişasta için. Bu panel yumurtalık primordium (ok) gösterir. Ölçek Bar paneller A ve B 500 µm ve panelleri C ve D200 µm edilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: nişasta miktar tatlı kiraz yumurtalık primordium. (A) bu panel gösterir bir yumurtalık primordium orta bölümünü ben ile lekeli2KI, dört kare hangi nişasta içeriği gösterilen ölçüldü. (B) bu panel yumurtalık primordium ayrıntılarını gösterir. Nişasta granülleri koyu kahverengi lekeli. (C) bu panel gösterir hangi nişasta yalancı resimde mavi farklı tonları karşılık gelir. (D) bu panel kapsayan2nişasta KI lekeli bir ikili görüntü maskesi siyah beyaz özgün resmin üzerine (mavi) gösterir. Optik yoğunluk yalnızca maskeyle kaplı orijinal görüntünün piksel cinsinden ölçülür. Ölçek Bar panelinde A 100 µm ve panelleri B - D20 µm edilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: tatlı kiraz yumurtalık primordia nişasta miktar temsilcisi sonuçlarını bahar döneminde farklı kış sıcaklık koşullarında iki yıl için aylık sonbahar toplanan. (A) bu panel gösterir yıl 2010-2011, sonuçlarından bir soğuk kış vardı. Kullanılazlar nişasta miktarını ile Ocak ayında tüyler ürpertici yerine getirilmesi (kar tanesi) oluştu. (B) bu panel vardı hafif kış 2011-2012 yıl sonuçlarını gösterir. Kullanılazlar nişasta miktarını ile Şubat ayında tüyler ürpertici yerine getirilmesi (kar tanesi) oluştu. Ortalama ± standart hata ortalamaya değerlerdir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: tomurcukları ve tatlı kiraz yumurtalık primordia nişasta miktar uyuşukluk durumunu değerlendirmek için deneysel tasarım düzeni. (A) bu panel gösterir uyuşukluk durum belirleme iş akışları: bitki malzeme hazırlama, süreç ve elde edilen sonuçlar. (B) bu panel gösterir nişasta miktar iş akışları: nişasta, görüntü analiz algılama nişasta ve nişasta miktar mikroskobik bir gözlem histochemical tomurcuklar hazırlanması. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her ne kadar uyuşukluk arkasında biyolojik süreci belirsizliğini uyuşukluk içinde odunsu uzun ömürlü meyve üretiminde açık etkileri ve Ormancılık değişen bir iklimde sunar. Uyuşukluk çalışmaları farklı açılardan yaklaştı ama kış uyuşukluk biyolojik bir marker arıyorum araştırma son yılda şiddetlendi. Ancak, ne zaman bir tomurcuk uyuşukluk kırık vardır gösteren kesin bir gösterge bulmak için birçok girişimleri başarısız3olmuştur. Histochemical teknikleri18 analiz görüntüsüyle birleştirerek burada, açıklanan yöntemi belirli bir doku rezervlerinin karbonhidrat ve tatlı kiraz tomurcukları onun fizyolojik faaliyet arasındaki ilişkiyi incelemek çok yararlı oldu uyuşukluk5 farklı aşamaları ve diğer türler ve doku10,13,20' ye de uygulanabilir.
Karbonhidrat rezervleri nişasta şeklinde çiçek gelişme ve üreme süreci7,10,13,20,21,23 hem de önemli bir rol oynamaktadır ve ılıman odunsu uzun ömürlü6mevsimsellik içinde. Uyuşukluk üzerinde farklı çalışmalar tomurcukları24içinde nişasta dikkat. Ancak, kendi küçük boyutu nedeniyle birkaç tüm tomurcukları niceliksel analitik yöntemlerin kullanımı için gerekli olan ve belirli doku veya hücreleri nicel değişimler tespiti çevreleyen hücreleri maskeleme etkisiyle sınırlı. Görüntü analiz sistemi ile histochemical tekniklerin birleşimi içinde belgili tanımlık gonca farklı yapıların nişasta içerik değişiklikleri incelemek için iyi bir fırsat sunmaktadır.
Bu yöntem doku nişasta tam içeriği miktar önleme sınırlaması vardır ancak nicel nişasta değişiklikleri zaman25 takip etmek ve nişasta karşılaştırmak için sayısal göreli nişasta içerik, içerik sağlar farklı dokuların13,20, çeşitlerin veya yıl5. Alanları, doku ve tomurcukları arasındaki optik yoğunluk değerleri, sistem (ışık koşullarında, boyama yoğunluğu ve büyütme) Kalibrasyonu ve eşikleri doğru oluşturulmalıdır renk ayarı doğru karşılaştırma izin vermek için , saklanır ve tüm hazırlıkları kullanılır.
Nişasta boyama ve Potasyum iyot üzerinde temel miktar kısmındaki yıkandıktan sonra diğer lekeleri sonraki kullanımını sağlar. Böylece, farklı analizler ek hazırlıklar gerçekleştirilebilir ve5,20sentetik montaj medya değildir kullanılır. Aynı şekilde, xarakteristikaları ölçümleri26 nişasta birikimi farklı yapıları5,13büyüme ile ilgili olarak çerçeveli desen izin aynı hazırlıklar sonra yapılabilir. Yöntem diğer yapıları veya türler ile belgili tanımlık çözümlemek, küçük gruplar halinde hücreleri nişasta içerik değişiklikleri içeren diğer gelişim süreçlerini çalışma izin verebilirsiniz nişasta algılamak için renk düzeyleri düzeltilmesi için adapte edilebilir.
İlişki uyuşukluk yayın ve nişasta arasında ses olarak uyuşukluk ve tüyler ürpertici gereksinimleri5biyolojik temeli anlamak için bu yöntemin kullanılması tarafından örtüsünü açmak yumurtalık primordia birikimi sağlar. Ancak, nişasta miktar bölümlerinde parafin gömülü görüntü analizi tarafından çok hantal ve çok sayıda çeşitlerin tüyler ürpertici gereksinimlerini hesaplamak zaman alıcı olup çıkmak. Gelecekteki çabalar ağaç uyuşukluk durumunu kolayca gösterebilir güvenilir biyolojik göstergeleri çalışmaya odaklanmış olması gerek. Bu arada, nişasta varyasyonları uyuşukluk sırasında desenini daha fizyolojik ve genetik çalışmalar çerçeve için kullanılabilir ve burada açıklanan görüntü analizi ile histochemical tekniklerin birleşimi diğer odunsu çok yıllık bitkileri için kullanılabilir uyuşukluk ile ilgili olarak farklı dokuların nişasta içeriği ölçmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar minnetle Maria Herrero ve Eliseo Rivas onların yararlı tartışma ve tavsiye için teşekkürler. Bu eser "gayri resmi" de Economía y Competitividad tarafından desteklenen — Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu, Avrupa Birliği [grant numarası BES-2010-037992 E. f.]; Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria [grant numaraları RFP2015-00015-00, RTA2014-00085-00, RTA2017-00003-00]; ve Gobierno de Aragón — Avrupa Sosyal Fonu, Avrupa Birliği [Grupo Consolidado A12-17R].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Precision scale | Sartorius | CP225D | |
| Stereoscopic microscope | Leica Microsystems | MZ-16 | |
| Drying-stove | Memmert | U15 | |
| Paraffin Embedding station | Leica Microsystems | EG1140H | |
| Rotatory microtome | Reichert-Jung | 1130/Biocut | |
| Microtome blade | Feather | S35 | Stainless steel |
| Bright field microscope | Leica Microsystems | DM2500 | |
| Digital Camera | Leica Microsystems | DC-300 | |
| Image Analysis System | Leica Microsystems | Quantiment Q550 |
References
- Kurokura, T., Mimida, N., Battey, N. H., Hytönen, T. The regulation of seasonal flowering in the Rosaceae. Journal of Experimental Botany. 64 (14), 4131-4141 (2013).
- Rohde, A., Bhalerao, R. P.
- Fadón, E., Rodrigo, J. Unveiling winter dormancy through empirical experiments. Environmental and Experimental Botany. 152, 28-36 (2018).
- Fadón, E., Rodrigo, J., Herrero, M. Is there a specific stage to rest? Morphological changes in flower primordia in relation to endodormancy in sweet cherry (Prunus avium L.). Trees - Structure and Function. , In Press (2018).
- Fadón, E., Herrero, M., Rodrigo, J. Dormant flower buds actively accumulate starch over winter in sweet cherry. Frontiers in Plant Science. 9 (171), (2018).
- Loescher, W. H., Mccamant, T., Keller, J. D. Carbohydrate reserves, translocation and storage in woody plant roots. HortScience. 25 (3), 274-281 (1990).
- Hedhly, A., et al. Starch turnover and metabolism during flower and early embryo development. Plant Physiology. , (2016).
- Rodrigo, J., Hormaza, J. I., Herrero, M. Ovary starch reserves and flower development in apricot (Prunus armeniaca). Physiologia Plantarum. 108 (1), 35-41 (2000).
- Julian, C., Rodrigo, J., Herrero, M. Stamen development and winter dormancy in apricot (Prunus armeniaca). Annals of Botany. 108 (4), 617-625 (2011).
- Alcaraz, M. L., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Pistil starch reserves at anthesis correlate with final flower fate in avocado (Persea americana). PLoS One. 8 (10), e78467 (2013).
- Smith, A. M., Zeeman, S. C. Quantification of starch in plant tissues. Nature Protocols. 1 (3), 1342-1345 (2006).
- Eliceiri, K. W., et al.
- Rodrigo, J., Herrero, M. Influence of intraovular reserves on ovule fate in apricot (Prunus armeniaca L.). Sexual Plant Reproduction. 11, 86-93 (1998).
- Zhou, J., Spallek, T., Faulkner, C., Robatzek, S. CalloseMeasurer: A novel software solution to measure callose deposition and recognise spreading callose patterns. Plant Methods. 8 (1), (2012).
- Faulkner, C., et al. An automated quantitative image analysis tool for the identification of microtubule patterns in plants. Traffic. 18 (10), 683-693 (2017).
- Kuhn, B. F. Determination of starch in ovules of the sour cherry cv. "Stevnsbaer.". European Journal of Horticultural Science. 71 (3), 120-124 (2006).
- Johansen, D. A. Plant microtechnique. , McGraw-Hill. New York, NY. (1940).
- Ruzin, S. E. Plant microtechnique and microscopy. , Oxford University Press. New York, NY. (1999).
- Rodrigo, J., Rivas, E., Herrero, M. Starch determination in plant tissues using a computerized image analysis system. Physiologia Plantarum. 99 (1), 105-110 (1997).
- Alcaraz, M. L., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Ovary starch reserves and pistil development in avocado (Persea americana). Physiologia Plantarum. 140 (4), 395-404 (2010).
- Suarez, C., Castro, A. J., Rapoport, H. F., Rodriguez-García, M. I. Morphological, histological and ultrastructural changes in the olive pistil during flowering. Sexual Plant Reproduction. 25, 133-146 (2012).
- Lang, G. A., Early, J. D., Martin, G. C., Darnell, R. L. Endodormancy, paradormancy, and ecodormancy - Physiological terminology and classification for dormancy research. HortScience. 22 (3), 371-377 (1987).
- Hedhly, A., Vogler, H., Eichenberger, C., Grossniklaus, U. Whole-mount clearing and staining of arabidopsis flower organs and siliques. Journal of Visualized Experiments. 2018 (134), 1-10 (2018).
- Kaufmann, H., Blanke, M. Changes in carbohydrate levels and relative water content (RWC) to distinguish dormancy phases in sweet cherry. Journal of Plant Physiology. 218 (July), 1-5 (2017).
- Herrero, M., Dickinson, H. G. Pollen-pistil incompatibility in Petunia hybrida: changes in the pistil following compatible and incompatible intraspecific crosses. Journal of Cell Science. 36, 1-18 (1979).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).
