Summary
Здесь мы представляем метод, чтобы изолировать надпочечники от мышей, исправления тканей, раздел их и выполнять иммунофлюоресценции пятнать.
Abstract
Иммунофлюоресценции устоявшихся техника для выявления антигенов в ткани с занятостью флюрохром конъюгированных антител и имеет широкий спектр приложений. Определение антигенов позволяет характеристика и идентификации нескольких типов клеток. Расположенный выше почки и инкапсулируется слой мезенхимальных клеток, надпочечников является эндокринного органа входят два различных тканей с различными эмбрионального происхождения, Вольфов промежуточных производные мезодермы наружной коры головного мозга и нервных гребень производные внутренний продолговатого мозга. Надпочечников выделяет стероиды (то есть, mineralocorticoids, глюкокортикоидов, половые гормоны), тогда как мозгового вещества надпочечников производит катехоламинов (то есть, адреналин, норадреналин). Во время проведения исследования коры надпочечников, важно иметь возможность различать уникальный клетки с различными функциями. Здесь мы предоставляем протокол разработан в нашей лаборатории, который описывает ряд последовательных шагов, необходимых для получения иммунофлюоресценции пятнать характеризовать типы клеток надпочечников. Сначала мы ориентируемся на рассечение мыши надпочечных желез, микроскопические удаление жира periadrenal следуют фиксации, обработки и встраивание парафин ткани. Затем мы опишем, вырезание из блоков ткани с микротом роторный. И наконец мы подробно протокол для immunofluorescent окрашивание надпочечных желез, которые мы разработали для сведения к минимуму неспецифической антитела связывая и аутофлюоресценция для достижения оптимального сигнала.
Introduction
Иммуногистохимия — это метод для обнаружения компонентов ткани с использованием антител к конкретным сотовой молекулы и последующее окрашивание методы для обнаружения конъюгированных антител1. Эта процедура иммуногистохимических требует конкретной фиксации и обработки тканей, которые часто эмпирически установлено для специфического антигена, ткани и антитела используются2. Фиксация имеет решающее значение для сохранения «оригинал» состояние ткани и тем самым сохраняя нетронутыми сотовых и внутриклеточных структур и шаблоны выражений. Для подготовки ткани для разрезания тонкими ломтиками, которые используются для гистологического исследования, с участием иммуногистохимия необходимы дальнейшие обработки и внедрение процедур.
Иммуноокрашивания могут быть выполнены с хромогенных или флуоресцентные обнаружения. Хромогенный обнаружения требует использования фермент с конвертировать soluble подложка в нерастворимые цветные продукт. Хотя этот фермент может конъюгированных к антителу, признавая антигена (основное антитело), он чаще всего конъюгированных к антителу, признавая основное антитело (то есть, вторичное антитело). Эта техника очень чувствительна; Цветные продукта в результате ферментативной реакции фотостабилен и требует только brightfield микроскоп для воображения. Однако Хромогенный иммуноокрашивания могут не подходить при попытке визуализировать две белки, которые совместно локализации, так как осаждения одного цвета может маскировать осаждения другой. В случае совместного окрашивание, иммунофлюоресценции оказался более выгодным. С появлением иммунофлюоресценции приписывается Альберта Кунса и коллег, которые разработали систему для выявления антигенов в ткани с помеченные флюоресцеином антитела и визуализировать их в секционного тканях под ультрафиолетового света3. Флуоресценции обнаружения основан на антитело проспряганное с Флюорофор, который испускает свет после возбуждения. Потому что есть несколько флуорофоров с выбросами на разных длинах волн (с перекрытием нет или мало), этот метод обнаружения идеально подходит для исследования нескольких белков.
Надпочечников это Парный орган расположен выше почки и характеризуется двумя embryologically отдельных компонентов, окруженный капсулу мезенхимальных. Внешней коры надпочечников, производный от Вольфов промежуточных мезодермы, выделяет стероидных гормонов, в то время как внутренний мозгового вещества, производные от нейронные крест, производит катехоламинов, включая адреналина, норадреналина и дофамина. Надпочечников гистологически и функционально разделены на три концентрических зон, с каждой зоной, секреции различных классов стероидных гормонов: внешней zona glomerulosa (ЖГ) производит mineralocorticoids, которые регулируют электролитного гомеостаза и внутрисосудистого объема; средняя зона fasciculata (zF), непосредственно под zG, выделяет глюкокортикоидов, которые посредником стрессовой реакции путем мобилизации магазины энергии для повышения глюкозы плазмы; и Внутренняя зона reticularis (zR), которые синтезирует Секс стероидного прекурсоров (то есть, дегидроэпиандростерона (ДГЭАС))4.
Некоторые вариации в адренокортикальной зональности присутствует между видами: например, Mus musculus недостает zR. Уникальный послеродовой X-зоне м. musculus является пережитком плода коры характеризуется небольшой клетки липидов бедных с ацидофильной цитоплазматический5. X-zone исчезает в период полового созревания у мышей-самцов и после первой беременности у самок мышей, или постепенно вырождается в самок не разводят6,7. Кроме того извилистость и толщина zG экспонатов отмечены различия между видами как Организация периферических стволовых и прогениторных клеток в и прилегающие к zG. Крыса, в отличие от других грызунов, имеет видимый недифференцированные зоны (цу) между zG и zF что функции как стволовых клеток зоны или зоны переходных, усиливая прародителями. Ли цу является уникальным для крыс, или просто более четко организованной скопление клеток является неизвестным8,9.
Клетки коры надпочечников содержат липидного капель, содержащих холестерин эфиры, которые служат в качестве прекурсора всех стероидные гормоны10,11. Термин «стероидогенеза» определяет процесс производства стероидных гормонов из холестерина через серию ферментативных реакций, которые включают деятельность стероидогенных фактор 1 (SF1), выражением которого является маркером стероидогенных потенциал. В надпочечники Sf1 выражение присутствует только в клетках коры12. Интересные исследования нашли выражение эндогенный биотин в клетках коры надпочечников с стероидогенных потенциальных13. Хотя это может быть причиной повышенный фон на основе биотина/стрептавидина пятная методов, из-за обнаружения эндогенный биотин, антитело проспряганное с стрептавидина, эта характеристика может использоваться также различать стероидогенных клетки из других групп населения в пределах надпочечников, т.е., эндотелия, капсульного и клетки продолговатого мозга.
Иннервируются симпатических преганглионарных нейронов, мозгового вещества надпочечников характеризуется базофильная клетки с гранулированных цитоплазмой, содержащие адреналин и норадреналин. Продолговатый мозг клетки называются «хромаффинных» из-за высокое содержание катехоламинов, которые формируют коричневый пигмент после окисления14. Тирозин гидроксилазы (TH) является Фермент катализирует тариф ограничивая шаг в синтез катехоламинов и, надпочечников, выражается только в Продолговатый мозг15.
Здесь мы представляем собой протокол для изоляции мыши надпочечных желез, их обработки для встраивания в парафин и секционирование и метод для выполнения иммунофлюоресценции окрашивания на участках коры надпочечников с целью выявления клеточных типов составляющих надпочечников коры и мозгового вещества. Этот протокол является стандартом в нашей лаборатории для иммуноокрашивания с несколько антитела, которые регулярно используются в наших исследованиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы были исполнены в соответствии с институционально утвержденных протоколов под эгидой Комитета университета по использованию и заботе о животных в университете штата Мичиган.
1. Подготовка к операции
- В день до операции, подготовить параформальдегида 4% (PFA) / фосфат буфер солевой раствор (PBS). В случае замороженных аликвоты переходите к оттепели один и хранить при 4 ° C.
Примечание: 4% PFA не является стабильным в течение более чем 48 часов.
Предупреждение: PFA токсичных, избегать контакта с кожей и глазами и распоряжаться в соответствующем контейнере. - В день операции подготовить хирургических инструментов, стерилизации и ножницы пинцет с 70% этанола (EtOH) и дайте им высохнуть на бумажное полотенце.
- Место 24-ну тарелку заполнены с ПБС (1 мл/хорошо достаточно) в ведёрке со льдом.
Примечание: Надпочечников будут храниться в этом несколькими хорошо культуры блюдо после операции.
2. надпочечников рассечение
- Усыпить мыши после стандартных протоколов, одобренных институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC). Требуется дополнительный метод эвтаназии для обеспечения смерти (например, обезглавливание).
- Для эвтаназии, изофлюрановая передозировки, поместите курсор мыши в камере заполнены с изофлюрановая паров до прекращения дыхания, затем удалите мышь из камеры, положите его на поверхность и выполнять шейки матки дислокации.
Примечание: Большинство методов эвтаназии вызвать страдания животного и не подходят для исследования стресс, потому что они могут добавить смешанные переменную активации гипофизарно надпочечниковой оси и выпуска медуллярного катехоламинов. В этом случае обезглавливание методика предлагается принять.
- Для эвтаназии, изофлюрановая передозировки, поместите курсор мыши в камере заполнены с изофлюрановая паров до прекращения дыхания, затем удалите мышь из камеры, положите его на поверхность и выполнять шейки матки дислокации.
- Положите мыши лежачем, стерилизовать области разреза на животе и боках тела с 70% EtOH.
Примечание: Во время бритья мех увеличит стерильности, для этого конкретного приложения не стоит. - Вырезать кожу в середине живота, с помощью ножниц, отделить кожу от брюшины, deskin мыши, щипал кожу вокруг разреза и потянув его в двух противоположных направлениях (хвостовой и Ростральные). Затем вырежьте брюшины до достижения заднего левого и правого флангов.
- Удаление мышиных надпочечника резки вокруг окружающих жировой ткани и поместите его в 24-multiwell пластина заполнены с ПБС и хранится на льду.
3. Пери надпочечниковой удаление жира
- Под микроскопом рассечения поместите надпочечников на стекле базовый или чашку Петри на стадии табличке, позицию источника света, выберите масштаб и настроить фокус получить четкое представление о всей надпочечников.
Примечание: Используемый масштаб может варьироваться в зависимости от личных предпочтений. Общее увеличение 30 X с объективом план 1 X, zoom 3 X, и окуляра 10 X позволяет визуализировать всей железы с хорошим полем зрения. - Быстро удалите прилегающих жировой ткани с двумя иглами 25 G, избегая обезвоживания надпочечников. Если это происходит, прежде чем все жир удаляется, переместить надпочечников обратно в колодец с ПБС для 1 – 2 мин, а затем продолжить процесс удаления жира.
- Вымойте 2 x 2 мин в однократном ПБС.
4. ткань обработки и встраивание
- Исправить тканей в 4% PFA/PBS на 4 ° C на качающейся платформе за 2 ч.
- Удалите 4% PFA и стирка тканей с ПБС, 3 x 15 мин при 4 ° C.
Предупреждение: PFA токсичных и опасных отходов; Он должен быть обработаны с осторожностью под капотом химической и утилизировать в контейнер опасных отходов. - Инкубировать надпочечников в 50% EtOH при 4 ° C на качающейся платформе за 2 ч.
- Инкубировать надпочечников в 70% EtOH при 4 ° C на качающейся платформе для минимум 2 часа.
Примечание: Если не приступить к ткани, обработки для встраивания, надпочечников могут быть сохранены в 70% EtOH при 4 ° C. Во избежание длительного хранения в 70% EtOH и приступить к обработке ткани как можно скорее дает лучшее качество образцов. - Подготовьте надпочечников ткани, обработки, завернуть в марлю и заключив его в тканях, встраивание кассеты. Место кассеты в банку заполнены с 70% EtOH и хранить при 4 ° С до готовности двигаться к процессору ткани. Вставьте кассету в процессор ткани, запрограммированы как сообщается в таблице 1 и запустите программу.
- Перевести кассету в внедрения станции, заполнены с расплавленным парафином на 65 ° C. Если не доступен охлаждения станции, позиция холодной охлаждения лоток рядом с ним.
- Ярлык встраивание формы и открыть ткани, встраивание кассеты. Используя пару щипцов, развернуть марлю и место надпочечников мягко в нужной позиции в центре базы в встраивание формы. Залейте расплавленный парафин на надпочечники. При необходимости, провести надпочечников с щипцами для обеспечения свои позиции в формы в противном случае он может перемещаться внутри формы.
- Осторожно переместить встраивание формы охлаждения лоток и дождаться упрочнения парафина. После этого чтобы облегчить секционирование, храните вложения формы в прохладном месте.
5. вырезание с микротом роторный
- Проверьте, что микротома чист перед началом, отчищать все остатки отбрасываются парафин, убедитесь, что является затачивать нож (или лезвия), масло внутренний механизм и полностью убрать блок держатель, при необходимости.
- Этикетки серии скольжениях микроскопа (положительно обвинения или покрытием для предотвращения потери ткани (см. Таблицу материалы)), положите их на слайд с подогревом комплект при 37 ° C и отказаться от некоторых ячеистого типа 1 ультрачистая вода поверх каждого слайда.
- Раздел набора толщиной в 5 мкм.
- Вставьте микротом лезвие в держатель лезвий, контролировать угол лезвия, убедитесь, что лезвие прочно закреплен в держатель и проверить зазор парафин блок и блок держатель.
- Привести владельца блока в крайнее верхнее положение и, если возможно, замок дескриптора операционной, удалите блок парафин от плесени и поместите его в держатель блока, прочно закрепив его в зажим. Угол линии в центре лезвия с облицовочной поверхности блока должно быть около 20°. При необходимости, скорректировать блоком парафина.
Предупреждение: Лезвие является острым. - Если ранее заблокирован, разблокировать маховик и снижения парафина блок до тех пор, пока его лицо уровня с лезвием ножа микротома. Поверните маховик с устойчивый ритм. Выполнение первоначального обрезки для удаления парафина и подвергать надпочечников.
- Держите, поворачивая маховик и раздел до конца надпочечников. Используйте brightfield или рассекает микроскопом для проверки наличия ткани в разделах. Отсоединение ленты от лезвия и с помощью другой пары щипцов поместите его на воде, положил на стеклянное скольжение. Это может быть полезным для место ленты на поверхность, растянуть его внимательно и затем смонтировать его на слайде.
- Пусть сухой на горячей плите слайды. Затем положить их на слайд лотка и выпекать при 37 ° C на ночь или дольше, если вода все еще присутствует. После высыхания, храните слайды в коробке слайд при комнатной температуре.
- Убрать все оборудование и очистить микротома.
6. иммунофлуоресценции
- Выберите слайды для иммуноокрашивания и поместите их в слайд владельца.
- На горячей плите принести стакан, наполненный цитрат 0,01 М при pH 2.0 до кипения. Объем буфера зависит от размера стакан и должно быть достаточно для покрытия в разделах на слайдах во время кипения (некоторые испарения необходимо принимать во внимание). Обложка стакан с алюминиевой фольгой.
Примечание: Другие методы для извлечения антигена, (см. обсуждение). - Deparaffinize слайды в 100% ксилола 2 x 5 мин. Увлажняет слайды, используя следующие серии: 100% EtOH 2 x 5 минут, 70% EtOH 2 x 5 мин, тип 1 ультрачистая вода для 5 мин.
Примечание: После депарафинизации, важно не дать высохнуть разделы: разделов ткани должны всегда быть покрыты буферов или решения до конца процедуры или структура ткани могут быть повреждены. - Для извлечения антигена место слайды в металла слайд владельца и вставьте его в стакан с кипящей цитрат без алюминиевой фольги. Пусть это варить 10 мин.
- Снимите стакан с горячей плиты и дайте ему остыть 20 мин убедитесь, что надпочечников по-прежнему разделов с буфером.
- Приготовляют раствор блокировки. Если использование коммерчески доступных пятнать комплект для Представителя результаты (см. Таблицу материалов), в пробирку добавить 1,25 мл ПБС, 1 капля (равный примерно 45 мкл) реагента блокировка мыши Ig, и 5% нормальной козьего сыворотки. Храните блокировки раствор при температуре 4 ° C или на льду во время работы.
Примечание: Сыворотка используется зависит от вида принимающих вторичное антитело. Здесь были использованы вторичные антитела, поднятые в козла. Для других антител могут потребоваться различные в сыворотке. Эмпирически определите правильный сывороточной концентрации путем тестирования несколько концентрации. - Перенести слайды в опарник Coplin содержащие ПБС и стирка 3 x 10 мин на рокер с плавное покачивание.
- Подготовьте камеру увлажненные для окрашивания.
- Осторожно стряхните PBS от одного слайда; Протрите слайд снизу ворса протрите удалить избыток PBS.
- С помощью специального маркера для слайдов с гидрофобными свойствами, нарисуйте круг вокруг каждой секции надпочечников, убедившись, что стеклянная поверхность сухой, чтобы избежать распространения чернила решения секции. При необходимости, тщательно протирают сухой поверхности. Место слайда в зале увлажненной.
- Быстро, Пипетка 50 мкл (или достаточно, чтобы покрыть секции) блокирования решения на каждый раздел. Инкубируйте 1 час при комнатной температуре.
Примечание: Блокирование объема раствора необходимо может варьироваться; важно, что хорошо разделов с решением. - Подготовка разбавителя решение от коммерчески доступных комплект с 7,5 мл ПБС, 600 мкл белка концентрата запасов раствора и 5% нормальной козьего сыворотки (или любые другие сыворотки и концентрации, используемые в решении блокировки). Храните разбавителя раствор при температуре 4 ° C или на льду во время работы.
- Подготовка решений основное антитело, разбавляя первичных антител в соответствующих концентрациях в решении разбавителя. Для совместного пятнать, добавить Алиготе каждого антитела в новой трубки и осторожно перемешать. Место антител и антитела решения на льду до готовой к использованию.
Примечание: Здесь мы использовали антитела анти SF1 вырос в кролика и антитела анти й вырос в мыши. Чтобы подготовить антитела рабочие решения следуйте.- Для SF1 рабочего раствора в одной из труб, добавьте 1 мкл антител анти SF1 до 999 мкл раствора разбавителя (конечная концентрация 1,5 мкг/мл). Для TH рабочего раствора в трубке, добавьте 1 мкл антител анти й в 499 мкл раствора разбавителя (по оценкам конечная концентрация 2-6 мкг/мл).
- Для SF1 + й антитела рабочей смеси, в свежих трубку, Пипетка 250 мкл рабочего раствора SF1 и 250 мкл рабочего раствора тыс. Смешайте нежно закупорить. Хранить на льду.
- Перенести слайды в опарник Coplin содержащие ПБС и мыть 3 x 5 мин на рокер с плавное покачивание.
- Слайды обратно в увлажненные камеру после вытирания избыток PBS, Пипетка SF1 + й антитела рабочей смеси (или других основное антитело решения) по каждому разделу, закрыть увлажненные камеру и оставить его на ночь при 4 ° C.
- На следующий день Переместите слайды в Coplin jar, содержащий ПБС и мыть 3 x 15 мин на рокер с плавное покачивание.
- При мытье слайды, подготовьте решение вторичное антитело разбавителя решения с использованием соответствующей концентрации. Если выполнение совместно окрашивание, добавьте равное количество каждого решения вторичного антитела в новой трубки. Смешайте нежно закупорить. Хранить на льду. Защитить трубы от света и хранить на льду до готовой к использованию.
Примечание:, Вторичные антитела, которые используются здесь 488 нм флуоресцентные краситель меченых анти мыши вырос в козла и 549 флуоресцентные краситель меченых анти кролик вырос в козла. Вторичное антитело решения был подготовлен путем добавления 0,5 мкл каждого вторичного антитела в 799 мкл раствора разбавителя (окончательный концентрации 1,2 мкг/мл). - Поместить слайды обратно в зале увлажненной после удаления избытка PBS, быстро Пипетка вторичное антитело решение на участках коры надпочечников, закройте увлажненные палаты и защищать от света. Инкубируйте 1 час при комнатной температуре.
- Вымойте слайды в опарник Coplin с ПБС и мыть 3 x 15 мин на рокер с плавное покачивание, убедившись в том защитить их от света.
- Подготовить 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) решение для ядерных пятнать: 1 мкл DAPI (20 мг/мл) в 1 мл ПБС.
Примечание: Синий люминесцентные ядерных изображение может также быть достигнуто с помощью Хойста. - Пипетка DAPI раствор на секции надпочечников, покрытия из света и инкубации при комнатной температуре за 7 мин.
- Вымойте слайды в опарник Coplin с ПБС и мыть 3 x 5 мин на рокер с плавное покачивание защищая слайды от света.
- В районе, защищены от прямого света сложить покровным стеклом и Пипетка 60 мкл или около 3 капли монтажа агент подходит для иммунофлюоресценции вдоль поверхности стекла.
- Аккуратно протрите задней части слайда с ворса протрите, позиция слайд лицом вниз к покровным стеклом и параллель к ей, поэтому разделов ткани лицом покровным стеклом с установки агента на нем. Слегка нажмите слайд на Стекло покровное и убедитесь, что нет пузырьков воздуха в ловушке между покровным стеклом и слайд.
- При необходимости, дальнейшее давление для удаления пузырьков воздуха и избыток установки агента.
- Лег на слайд в темный контейнера и лекарство при комнатной температуре не менее 24 ч (или время, указанное в таблице информации установки агента, используемого), а затем приступить к визуализации.
7. обработка изображений
Примечание: Флуоресцентным микроскопом подключен к камере требуется для обнаружения и захвата флуоресценции, испускаемых в тканях после возбуждения на определенных длин волн. Хотя очевидно, важно помнить выбрать вторичное антитело проспряганное с флуорохромов чьи возбуждения и выбросов спектры совместимы с оборудованием. Параметры изображений зависит от Микроскоп и программное обеспечение, используемое для захвата изображений. Есть некоторые основные правила, которые применяются для визуализации надпочечников разделы, например, убедившись, что время экспозиции, камеры получить параметры, и интенсивность источника света являются неизменным.
- Включите источник света и камеры, запуска обработки изображений программное обеспечение следуя инструкциям производителя.
Примечание: Порядок этих действий может отличаться в зависимости от используемого оборудования. - Безопасный слайд на сцене, откройте затвор, и глядя в Микроскоп окуляры использовать ядерных окрашивание (DAPI) канал и малое увеличение (4 X) для выявления ткани на слайде: надпочечников разделы являются небольшими, и их визуализация может потребоваться некоторое время.
- Изменить на увеличение (10 X), фокус и закрыть затвор.
Примечание: Важно избежать неоправданно продолжительным под свет, который может вызвать Фотообесцвечивание, что приводит к потере сигнала. - С помощью программного обеспечения команд, выберите цель (10 X) и канальный (DAPI), настроить время экспозиции (1 s, может быть скорректирована, если сигнал слишком сильный или слабый). Если возможно, установите биннинга для живых изображений (не приобретение) '2 X 2', преобразование получить «середине», скорость считывания для ' 20 МГц». Если программное обеспечение используется не отобразить панель масштаба в конце изображений, выберите параметр Масштаб бар меню и позицию бар где желаемого.
- Откройте затвор, повторно настроить фокус, при необходимости и переключать каналы (FITC, TRITC, DAPI). Если Микроскоп не автоматизирован, взять фотографию надпочечников в каждом канале без перемещения на стадии и убедитесь, что настройки выбора канала в использовании. Закройте затвор после завершения.
Примечание: Запишите настройки, используемых в случае, если программное обеспечение не автоматически сохранять их. - Сохраните фотографии.
Примечание: Объединенные фотографии могут быть созданы часто с помощью микроскопа программного обеспечения или других графических редактора пакетов программного обеспечения. - Повтор изображения для других областей секции и/или с большим увеличением.
Примечание: 20 X увеличением часто требует более короткое время воздействия (т.е., 800 мс). - В конце обработки изображений выключите все оборудование в надлежащем порядке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1 представляет собой схематическое изображение всего протокола, описанных выше. Надпочечники собирают от мышей, прилегающих жировой ткани удаляется под микроскопом рассечения и надпочечников затем фиксируются в 4% PFA. После этого шага надпочечники обрабатываются и заливали в парафин и секционного с микротом чтобы орган нарезать тонкими ломтиками, которые осаждаются на скольжениях микроскопа. После высыхания секций, иммунофлюоресценции осуществляется и разделы отражаются в Микроскоп.
Удаление прилегающих жира (рисA) имеет важное значение для содействия дальнейшей обработки и секционирование надпочечников. Успешное удаление жировой ткани, окружающие показано в рисунке 2B, где надпочечников легко обнаружить и не лишний жир является видимым. На этом этапе очень важно, однако, чтобы не позволить надпочечника просохнет, или это может повредить структуру ткани. Сухость распознается при надпочечниковой предполагает морщинистой внешний вид (рис. 2C). Эта проблема может быть легко преодолеть станавливающим надпочечников в ПБС перед продолжением удаления жира.
Конечные результаты получены следующие этот протокол представлены на рисунке 3. Иммунофлюоресценции изображения иллюстрируют иммуноокрашивания надпочечника в двух различных увеличениях. Красный ядерной SF1 пятнать этикетки адренокортикальной клетки, цитоплазматических зеленой окраски этикетки клетки мозга, в то время как. Наружная капсула обозначены ядерных окрашивание в голубой (DAPI), так как это не стероидогенных (ПФ1 негативных).
Рисунок 1 : Схематическое представление протокола. После сбора урожая на надпочечники и удаление прилегающих жировой ткани, ткани фиксируются в 4% PFA, обрабатываются для встраивания парафин и секционного. Затем immunostained и секций образы с флуоресцентным микроскопом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Удаление жира Пери надпочечниковой. (A) жира окружающих надпочечников удаляется под микроскопом рассечение. (B) надпочечников после очистки. (C) пример ткани, высыхая и что требует гидратации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Иммунофлюоресценции томография надпочечников. Пример визуализации иммунофлюоресценции (при различных увеличениях) надпочечников, окрашенных с маркерами коры надпочечников (SF1, ядерная окрашивание) и мозгового вещества надпочечников (TH, цитоплазматических зеленый). Ядер (DAPI) помечены синим цветом. C: капсула; CO: коры; m: продолговатого мозга. Масштаб баров = 200 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Реагент | Станция | Температура | Продолжительность |
| 70% EtOH | 1 | RT | 1 ч |
| 90% EtOH | 2 | RT | 1 ч |
| 90% EtOH | 3 | RT | 1 ч |
| Абсолютная EtOH | 4 | RT | 1 ч |
| Абсолютная EtOH | 5 | RT | 1 ч |
| Абсолютная EtOH | 6 | RT | 1 ч |
| Абсолютная EtOH | 7 | RT | 1 ч |
| Ксилол нефтяной | 8 | RT | 1 ч |
| Ксилол нефтяной | 9 | RT | 1 ч |
| Ксилол нефтяной | 10 | RT | 1 ч |
| Парафин воск | 11 | 62 ° C | 1 ч |
| Парафин воск | 12 | 62 ° C | 1 ч |
| Парафин воск | 13 | 62 ° C | 1 ч |
Таблица 1: Ткани процессор программы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает метод для изоляции мыши надпочечники вместе с подготовки и окрашивание секционного парафин врезанных мыши надпочечников.
По сравнению с другими протоколами, мы проверили, этот протокол иммунофлюоресценции доказал подходит для большинства антитела, которые используются в нашей лаборатории. Однако в некоторых случаях может потребоваться некоторые коррективы, чтобы улучшить результаты окрашивания. Одна переменная, которая легко может быть изменена и испытаны — длина фиксации. В нашей лаборатории инкубации в 4% PFA может варьироваться от 1 h до 4 ч, в то время как в других лабораториях фиксации времени расширяется до 12-24 ч16. В наших руках однако, более длительное время фиксации привело к увеличению фоновый шум и не был оптимальным для несколько антитела, которые обычно используются в наших исследованиях.
PH антигена поиска может также играть роль в успехе окрашивания. Извлечения тепла индуцированной epitope (HIER) может осуществляться путем использования коммерчески доступных решений с pH, начиная от кислых щелочных, а также другие внутренние сделал буферов как цитрат (рН 6), Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА, pH 8), трис-ЭДТА (pH 9), трис (pH 10). Ферментативная обработка также может быть вариант для разоблачения антигена. Инкубации deparaffinized слайды для ограниченного времени раствором, содержащим надлежащей концентрации фермента (например протеиназы K) может быть альтернативный метод HIER. Однако, важно, титровать концентрации фермента и определить время идеальным инкубации, поскольку чрезмерная пищеварение может негативно сказаться на ткани17.
Выбор блокировки буфера является также другой переменной для устранения неполадок. Помимо использования нормальной козьего сыворотки и коммерчески доступных блокирующий буфер, упомянутых в настоящем Протоколе (удобно в этом случае при использовании антитела мыши на мышь ткани для предотвращения высокий фон вследствие эндогенного мыши IgG) есть Дополнительные опции доступны такие решения белка (бычьим сывороточным альбумином (БСА) или сухое молоко) или других коммерчески доступных буферов. Важно, чтобы убедиться, что буфер не содержат вещества, которые могут мешать окрашивание, например биотин при использовании биотин стрептавидина метод.
Надпочечников является эндокринных органов, характеризуется высоким липидов содержание, которое может часто делают иммуноокрашивания сложной из-за высокой аутофлюоресценция липидов. Кроме того коре надпочечников от мышей и крыс, богаты autofluorescent внутриклеточное липофусцина, пигментированные гранулированных и аморфный материал, который колеблется в цвет от желтого до коричневого. Для преодоления этой проблемы, соединений как Судан черный B (SBB) может утолить флуоресценции, порожденных lipofuscins18. Еще один фактор, который подрывает итоги хорошее окрашивание является наличие крови клеток. Гемоглобин в эритроцитах поглощает свет волн < 600 Нм и может мешать флуорохромов, которые охватывают что волны19,20. Хотя перфузии методы могут использоваться для очистки клетки крови из сосудов ткани, использование меди сульфата 10 мм при рН 5 перед выполнением ядерной counterstaining также может помочь в подавлении нежелательные флуоресценции21.
Важнейшим шагом в этом протоколе является надпочечников рассечение. Надпочечников представляет собой орган, местоположение которых может быть трудно найти в situ: мышей, желез являются небольшими и их позиции несколько переменных. Особенно в старых животных надпочечники также окружены жировой ткани, что может помешать с обнаружением желез и их последующее изоляции, по этой причине крайне важно иметь четкое представление о районе во время этого шага протокола. Удаление удаление жира Пери надпочечниковой является деликатный шаг. Особое внимание следует уделить надпочечников при отсоединении жир чтобы не разрыв капсулы. Железы должны также храниться влажной с PBS во время процедуры, чтобы избежать повреждения тканей.
При резании, обнаружение присутствия небольшой части ткани надпочечников в разделах может быть сложным из-за ткани гипопигментация после шага обработки. Микроскоп очень полезно при резании для взыскательных ткани из воска.
Иммуноокрашивания на парафин врезанных секции весьма полезен для immunolabeling протеинов интереса при сохранении морфологии тканей. Представленные здесь метод основывается на флуоресцентным обнаружением и, хотя это особенно функциональных исследований, используя несколько первичных антител, сигнал флуоресценции светочувствительных и может быть легко потеряны или ослаблены, если не обрабатываются слайды правильно (то есть, длительного воздействия света Микроскоп или ненужного воздействия окружающего света). Кроме того мы можем заметить снижение качества самого флуоресцирования сигнала со временем. Этой проблемы можно избежать, используя хромогенных обнаружения, которая является фотостабилен и могут быть визуализированы на протяжении многих лет. Этот метод, однако, не хватает преимущества флуоресценции обнаружения, например выше маркировки точность и одновременного маркировки несколько белков в одном исследовании.
Встраивание парафин является удобным способом для обрабатывать и хранить несколько образцов тканей. Однако ткани, обработки парафином, встраивание сам не подходит для изображений флуоресцентные репортеров эндогенно выражена в некоторых трансгенных животных без использования специфического антитела против репортера. Криоконсервация является метод, чтобы избежать деградации флуоресцентный белок и разрешить его прямой визуализации под микроскопом. Отказ от использования дополнительной антитела могут представлять преимущество. С другой стороны криоконсервирования также может иметь ограничения, поскольку оно влияет на морфологию ткани; Это также требует различного оборудования для разрезания и хранения слайдов и блоков ткани возможен в морозильных камерах только.
Одним из основных ограничений визуализации псевдоразреза ткани является способность получения изображений структурных компонентов высокого пространственного разрешения. Состав ткани, в самом деле, является основной переменной в определении качества изображений, так как он влияет на проникновение света и может привести к плохой резолюции. Надпочечников является ткани богатых липидами, которые вызывают22рассеяния света. В мозге, который также имеет содержание высоким липидов, ткани очистка методы, такие как ясность, БЭББ, iDISCO и 3DISCO были разработаны для улучшения визуализации тканей, позволяющие лучше изображений и 3D ткани реконструкции23. Эти методы предоставляют высокое качество визуализации данных исследователей и адаптированы к ряду различных тканей, и в будущем, мы надеемся использовать эти методы для надпочечников изображений, а также.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим д-р Мохаммед Зубаир за его полезные предложения и техническую помощь в создании этого протокола. Эта работа была поддержана национального института диабета и пищеварения и болезни почек, национальные институты здравоохранения исследовательский грант 2R01-DK062027 (для G.D.H).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co. | 0412B | |
| Disposable needles 25 G x 5/8" | Exel International | 26403 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Paraplast plus | McCormik scientific | 39502004 | Paraffin for tissue embedding |
| Shandon biopsy cassettes II with attached lid | Thermo scientific | 1001097 | Cassettes for tissue processing |
| High Profile Microtome Blades | Accu-Edge | 4685 | Disposable stainless steel blades |
| Peel-a-way disposable plastic tissue embedding molds | Polysciences Inc. | 18986 | Truncated, 22 mm square top tapered to 12 mm bottom |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
| Xylene | Fisher Chemical | X5P1GAL | |
| 200 Proof Ethanol | Decon Labs, Inc. | ||
| Certi-Pad Gauze pads | Certified Safety Mfg, Inc | 231-210 | 3" x 3. Sterile latex free gauze pads |
| M.O.M kit | Vector laboratories | BMK-2202 | For detecting mouse primary antibodies on mouse tissue |
| KimWipes | Kimtech | 34155 | Wipes 4.4 inch x 8.4 inch |
| Super PAP PEN | Invitrogen | 00-8899 | Pen to draw on slides |
| Microscope cover glass | Fisherbrand | 12-544-D | Size: 22 x 50 x 1.5 |
| DAPI | Sigma | D9542 | (Prepared in 20 mg/mL stock) |
| ProLong Gold antifade reagent | Molecular Probes | P36930 | Mounting agent for immunofluorescence |
| X-cite series 120Q | Lumen Dynamics | Light source | |
| Coolsnap Myo | Photometrics | Camera | |
| Optiphot-2 | Nikon | Microscope | |
| microtome | American Optical | ||
| Tissue embedder | Leica | EG1150 H | |
| Tissue processor | Leica | ASP300S | |
| Normal goat serum | Sigma | G9023 | |
| Mouse anti-TH | Millipore | MAB318 | Primary antibody |
| Rabbit anti-SF1 | Ab proteintech group (PTGlabs) | custom made | Primary antibody |
| Alexa-488 Mouse IgG raised goat | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | Secondary antibody |
| Dylight-549 Rabbit IgG raised goat | Jackson ImmunoResearch | 111-505-003 | Secondary antibody |
| Citrate acid anhydrous | Fisher Chemical | A940-500 | |
| NIS-Elements Basic Research | Nikon | Software for imaging |
References
- Brandtzaeg, P. The increasing power of immunohistochemistry and immunocytochemistry. Journal of Immunological Methods. 216 (1-2), 49-67 (1998).
- Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- Lerario, A. M., Finco, I., LaPensee, C., Hammer, G. D. Molecular Mechanisms of Stem/ Progenitor Cell Maintenance in the Adrenal Cortex. Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).
- Yates, R., et al. Adrenocortical Development, Maintenance, and Disease. Endocrine Gland Development and Disease. 106, 239-312 (2013).
- Jones, I. C. Variation in the Mouse Adrenal Cortex with Special Reference to the Zona Reticularis and to Brown Degeneration, Together with a Discussion of the Cell Migration Theory. Quarterly Journal of Microscopical Science. 89 (1), 53 (1948).
- Sucheston, M. E. C., Samuel, M. The Transient-Zone in the Human and Mouse Adrenal Gland. The Ohio Journal of Science. 72, n2 (March, 1972) 120-126 (1972).
- Guasti, L., Paul, A., Laufer, E., King, P. Localization of Sonic hedgehog secreting and receiving cells in the developing and adult rat adrenal cortex. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 117-122 (2011).
- Pihlajoki, M., Dorner, J., Cochran, R. S., Heikinheimo, M., Wilson, D. B. Adrenocortical zonation, renewal, and remodeling. Frontiers in Endocrinology. 6, 27 (2015).
- Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid Droplets Finally Get a Little R-E-S-P-E-C-T. Cell. 139 (5), 855-860 (2009).
- Shen, W. J., Azhar, S., Kraemer, F. B. Lipid droplets and steroidogenic cells. Experimental Cell Research. 340 (2), 209-214 (2016).
- Finco, I., LaPensee, C. R., Krill, K. T., Hammer, G. D. Hedgehog signaling and steroidogenesis. Annual Review of Physiology. 77, 105-129 (2015).
- Paul, A., Laufer, E. Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).
- Lowe, J., Anderson, P. Stevens & Lowe's Human Histology, 4th Edition. , Elsevier/Mosby. 263-285 (2015).
- Nagatsu, T. Genes for human catecholamine-synthesizing enzymes. Neuroscience Research. 12 (2), 315-345 (1991).
- Berthon, A., et al. Age-dependent effects of Armc5 haploinsufficiency on adrenocortical function. Human Molecular Geneticst. 26 (18), 3495-3507 (2017).
- Brown, C. Antigen retrieval methods for immunohistochemistry. Toxicologic Pathology. 26 (6), 830-831 (1998).
- Billinton, N., Knight, A. W. Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).
- Hirsch, R. E., San George, R. C., Nagel, R. L. Intrinsic fluorometric determination of the stable state of aggregation in hemoglobins. Analytical Biochemistry. 149 (2), 415-420 (1985).
- Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of Red Blood Cell Autofluorescence for Immunocytochemistry on Fixed Embryonic Mouse Tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 28 (2017).
- Watson, J. Suppressing autofluorescence of erythrocytes. Biotechnic & Histochemistry. 86 (3), 207 (2011).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
