Summary
Her presenterer vi en metode for å isolere binyrene fra mus, fikse vev, del dem og utføre immunofluorescence flekker.
Abstract
Immunofluorescence er en veletablert teknikk for påvisning av antigener i vev med ansettelse av fluorochrome-konjugerte antistoffer og har et bredt spekter av programmer. Påvisning av antigener gir karakterisering og identifikasjon av flere celletyper. Ligger ovenfor nyrer og innkapslet av en lag av mesenchymal celler, er binyrene en endokrine organ består av to ulike vev med forskjellige embryologiske opprinnelse, mesonephric mellomliggende mesoderm-avledet ytre cortex og den nevrale kam-avledet indre marg. Binyrebarken utskiller steroider (dvs. mineralkortikoider, glukokortikoider, sex hormoner), mens adrenal medulla produserer katekolaminer (dvs. adrenalin, noradrenalin). Mens drive adrenal forskning, er det viktig å kunne skille unike celler med ulike funksjoner. Her gir vi en protokoll utviklet i vårt laboratorium som beskriver en rekke sekvensielle trinn kreves for å få immunofluorescence flekker som karakteriserer i celletyper av det adrenalin kjortelen. Vi fokusere på Disseksjon av musen binyrene, mikroskopiske fjerning av periadrenal fett etterfulgt av fiksering, behandling og parafin innebygging av vev. Vi beskriver snitting av vev blokker med en roterende mikrotom. Til slutt, detalj vi en protokoll for immunofluorescent farging av binyrene som vi har utviklet for å redusere både ikke-spesifikke antistoffer bindende og autofluorescence for å oppnå en optimal signal.
Introduction
Immunohistochemistry er en teknikk for å oppdage vev komponenter med bruk av antistoffer mot bestemte mobilnettet molekyler og påfølgende flekker teknikker for å oppdage den konjugert antistoffer1. Denne immunohistochemical prosedyren krever bestemte fiksering og behandling av vev som bestemmes ofte empirisk for spesifikke antigen, vev og antistoff utnyttet2. Fixation er avgjørende for å bevare "originale" staten av vev og dermed opprettholde intakte mobilnettet og subcellular strukturer og uttrykk mønstre. Videre er behandling og innebygging prosedyrer pålagt å utarbeide vevet snitting i tynne skiver som brukes for histologic studier som involverer immunohistochemistry.
Immunostaining kan utføres med enten kromogent eller fluorescerende oppdagelsen. Kromogent oppdagelsen krever bruk av et enzym å konvertere et løselig substrat i en uløselig farget produkt. Mens dette enzymet kan være bøyd til antistoffer gjenkjenner antigen (primære antistoffer) er det oftere konjugert til antistoffer erkjenner det primære antistoffet (dvs., sekundær antistoffer). Denne teknikken er svært følsom; farget produktet som følge av den enzymatiske reaksjonen er photostable og krever bare et brightfield mikroskop for bildebehandling. Imidlertid kan kromogent immunostaining ikke være egnet når prøver å visualisere to proteiner som co Lokaliser, siden avsetning i én farge kan maskere avsettelsen av den andre. Ved co flekker, har immunofluorescence vist seg for å være mer fordelaktig. Ankomsten av immunofluorescence tilskrives Albert Svartfugl og kolleger, som har utviklet et system for å identifisere vev antigener med antistoffer merket med fluorescein og vise dem i inndelte vev under ultrafiolett lys3. Fluorescens gjenkjenning er basert på et antistoff konjugert med en fluorophore som sender ut lys etter eksitasjon. Fordi det finnes flere fluorophores med utslipp ved forskjellige bølgelengder (med ingen eller lite overlapp), denne oppdagelsen metoden er ideell for studiene i flere proteiner.
Binyrene er et par organ ligger over nyrene og preget av to embryologically forskjellige komponenter omgitt av en mesenchymal kapsel. Ytre binyrebarken, avledet fra det mesonephric mellomliggende mesoderm, utskiller steroidhormoner mens den indre margen, avledet fra neural toppen, produserer katekolaminer inkludert adrenalin, noradrenalin og dopamin. Binyrebarken er histologisk og funksjonelt delt i tre konsentriske soner, med hver sone sekresjon forskjellige klasser av steroidhormoner: ytre zona glomerulosa (zG) produserer mineralkortikoider som regulerer elektrolytt homeostase og intravascular volum; den midterste zona fasciculata (zF), utskiller direkte under zG, glukokortikoider som megle stressrespons gjennom mobilisering av energi butikker å øke plasma glukose; og de indre zona reticularis (zR), som syntetiserer sex steroid prekursorer (dvs. Dehydroepiandrosteron (DHEAS))4.
Noe variasjon i adrenocortical zonation finnes mellom arter: for eksempel Mus musculus mangler zR. Det unike postnatal X-sonen av M. musculus er rester av fetal cortex preget av små lipid-fattige celler med syre cytoplasms5. X-sonen forsvinner i puberteten i mannlige mus og etter det første svangerskapet i kvinnelige mus eller utarter gradvis i ikke-avlet kvinner6,7. Videre merket tortuosity og tykkelsen av zG utstillinger variasjon mellom arter som gjør organiseringen av eksterne stammen og stamfar celler i og ved siden av zG. Rotte, i motsetning til andre gnagere, har en synlig udifferensierte sone (zU) mellom zG og zF som fungerer som en stilk cellen sone eller en sone av forbigående forsterke progenitors. Om på zU er unik for rotter eller bare en mer fremtredende organisert klyngen av celler er ukjent8,9.
Celler av binyrebarken inneholder lipid dråper som lagrer kolesterol estere som tjener som forløperen til alle steroidhormoner10,11. Begrepet "steroidogenesis" definerer prosessen med produksjon av steroid hormoner fra kolesterol via en rekke enzymatiske reaksjoner som involverer aktiviteten til steroidogenic faktor 1 (SF1), hvis uttrykket er en steroidogenic potensial. I binyrene finnes Sf1 uttrykk bare i celler av cortex12. En interessant studie fant uttrykket av endogene biotin i adrenocortical celler med steroidogenic potensielle13. Mens dette kan være årsaken til høyere bakgrunn i biotin/streptavidin-baserte flekker metoder, på grunn av gjenkjenning av endogene biotin av antistoff konjugert med streptavidin, kan denne karakteristiske brukes også til å skille de steroidogenic celler fra andre populasjoner i binyrene, dvs. endothelial, capsular og forlengede celler.
Innerveres av sympatiske preganglionic nerveceller, er adrenal medulla preget av basophilic celler med en detaljert cytoplasma som inneholder adrenalin og noradrenalin. Forlengede celler kalles "chromaffin" på grunn av det høye innholdet av katekolaminer som danner en brun pigment etter oksidering14. Tyrosin hydroksylase (TH) er enzymet som gir hastighetsbegrensning trinnet i syntesen av katekolaminer og i binyrene, uttrykkes bare i medulla15.
Her presenterer vi en protokoll for isolering av musen binyrene, deres behandling for innebygging i parafin snitting og en metode for å utføre immunofluorescence flekker på adrenal deler for å identifisere hvilke mobilnettet utgjør den binyrebarken og forlengede. Denne protokollen er en standard i vårt laboratorium for immunostaining med flere antistoffer rutinemessig brukes i vår forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene ble utført i samsvar med institusjonelt godkjent protokoller under auspice av University på bruk og vare på dyrene på University of Michigan.
1. forberedelse til operasjon
- På dagen før kirurgi, forberede 4% paraformaldehyde (PFA) / fosfat bufret saltvann (PBS). Ved frossen dele, fortsette å tine en og lagre på 4 ° C.
NOTE 4% PFA er ikke stabil for mer enn 48 timer.
FORSIKTIG: PFA er giftig, unngå kontakt med hud og øyne, og kast i en egnet beholder. - På dagen for kirurgi, forberede de kirurgiske instrumentene av sterilisering saksen og tang med 70% etanol (EtOH) og la dem tørke på et papirhåndkle.
- Sted en 24-vel plate fylt med 1 x PBS (1 mL/godt er tilstrekkelig) i en isen bøtte.
Merk: Binyrene skal holdes i denne flere godt kultur parabolen etter operasjonen.
2. adrenal disseksjon
- Euthanize musen etter standardprotokoller godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC). En sekundær euthanasia å sikre død (for eksempel halshogging) er nødvendig.
- For euthanasia av isoflurane overdose, Plasser musen i et kammer fylt med isoflurane damp til åndedrett opphører, og deretter fjerner musen fra kammeret, legge den på en overflate og utføre cervical forvridning.
Merk: De fleste euthanasia metodene forårsake lidelse til dyret og er ikke egnet for stress studier fordi de kan legge forvirrende variabelen av aktivering av hypofysen-adrenalin akse- og medullær katekolaminer utgivelsen. I dette tilfellet er halshogging foreslåtte teknikken å adoptere.
- For euthanasia av isoflurane overdose, Plasser musen i et kammer fylt med isoflurane damp til åndedrett opphører, og deretter fjerner musen fra kammeret, legge den på en overflate og utføre cervical forvridning.
- Plasser musen supine, sterilisere snitt området på magen og flankene med 70% EtOH.
Merk: Mens barbering pelsen vil øke sterilitet, for dette programmet det er ikke nødvendig. - Kutt huden i magen med saks, skille huden fra peritoneum, deskin musen ved å knipe huden rundt kuttet og trekke det i to motsatte retninger (caudal og rostral). Deretter kuttet peritoneum fram de bakre venstre og høyre flanken.
- Fjern murine binyrene kutte rundt omkring fettvev, og plasser den i 24-multiwell plate fylt med 1 x PBS og holdt på is.
3. Peri-adrenalin fett fjerning
- Under dissecting mikroskop, plasser adrenalin til et glass base eller en Petriskål på scenen plate, plassere lyskilden, Velg forstørrelsen og justere fokus for å få en oversikt over den hele adrenalin.
Merk: Forstørrelsen brukt kan variere avhengig av personlige preferanser. En total forstørrelse på 30 X med en plan linse 1 X zoom 3 X og okularet 10 X kan visualisere hele kjertel med en god synsfelt. - Raskt fjerne tilstøtende fett vev med to 25 G pinner, unngå dehydration av adrenalin. Hvis dette skjer før alle fett fjernes, flytte adrenal tilbake i brønnen inneholder 1 x PBS for 1-2 min, og så fortsette med fjerningen av fett.
- Vask 2 x 2 min hver i 1 x PBS.
4. vev behandling og innebygging
- Fikse vev i 4% PFA/PBS på 4 ° C på en rocking plattform for 2T.
- Fjern 4% PFA og vask vev med 1 x PBS, 3 x i 15 min hver på 4 ° C.
FORSIKTIG: PFA er giftig og er en farlig avfall; Det bør håndteres med forsiktighet under kjemiske hette og kastes inn i en farlig avfall container. - Inkuber binyrene i 50% EtOH på 4 ° C på en rocking plattform for 2T.
- Inkuber binyrene i 70% EtOH på 4 ° C på en rocking plattform i minst 2 timer.
Merk: Hvis ikke fortsetter med vev behandling for innebygging, binyrene kan lagres i 70% EtOH på 4 ° C. Unngå langvarig lagring i 70% gir EtOH og fortsetter til vev behandling snarest bedre kvalitet prøver. - Forberede adrenalin vev behandling ved å pakke den i gasbind og sette det i en vev innebygging kassett. Sett kassetten i et glass fylt med 70% EtOH og butikk på 4 ° C helt klar til å flytte til vev prosessoren. Sett inn kassetten i vevsprosessor som er programmert som rapportert i tabell 1 og kjøre programmet.
- Overføre kassetten en innebygging Station fylt med smeltet parafin på 65 ° C. Hvis en avkjølende stasjon ikke er tilgjengelig, Plasser en kald kjøling skuff av.
- Merk en innebygging mold og åpne vevet innebygging kassett. Med en tang, pakke i gasbind og plasser adrenalin forsiktig i ønsket plassering i sentrum av base i innebygging mold. Helle smeltet parafinen på adrenalin. Eventuelt hold adrenalin med tang å sikre sin posisjon i mold ellers det kan bevege seg rundt inne mold.
- Forsiktig flytte innebygging mold til kjøling skuffen og vente på herding av parafinen. Etter det, for å lette skjæring, lagre innebygging former på et kjølig sted.
5. snitting med en roterende mikrotom
- Kontroller at mikrotomen er rene før du starter, børste vekk alle kasserte parafinrester, sikre at kniven (eller blad) er skjerpet, olje interne mekanismen og trekke fullt blokk abonnenten om nødvendig.
- Merke en rekke objektglass (positivt ladet eller belegg for å hindre tap av vev (se Tabell for materiale)), legge dem på et lysbilde varmere sett på 37 ° C og dispense noen autoklaveres type 1 ultrapure vann på hvert lysbilde.
- Angi snittykkelse på 5 µm.
- Inn mikrotomen bladet i bladholderen, kontrollerer vinkelen på bladet, sørg for at bladet sikres fast inn i holderen og kontroller mellomrommet parafin blokk og hindre holderen.
- Bringe blokk abonnenten til høyeste posisjon og, hvis mulig, låse operativsystemet håndtaket, Fjern parafin blokken fra mold og plasser den i blokk abonnenten sikre fast med klemme. Vinkelen på midtlinjen av bladet med motstående overflaten av blokken skal være ca 20°. Eventuelt justere parafin blokken.
FORSIKTIG: Bladet er skarp. - Hvis tidligere låst, låse opp hånden hjulet og redusere parafin blokken til dens ansikt er på nivå med kanten av mikrotomen bladet. Rotere hjulet hånd en jevn rytme. Utføre innledende trimmer fjerne parafinen og avsløre adrenalin.
- Hold vrir hånd, og seksjon til slutten av adrenalin. Bruk brightfield eller dissekere mikroskop for å sjekke etter vev i delene. Løsne båndet fra bladet, og med hjelp av et par pinsett plassere den på vannet lagt på av objektglass. Det kan være nyttig å plassere båndet på en overflate, strekke det nøye og deretter montere den på lysbildet.
- La lysbildene tørr på kokeplate. Deretter lå flatt på et lysbilde brett og stek ved 37 ° C over natten eller lenger hvis vannet er fortsatt til stede. Når tørr, lagrer du lysbildene i en lysbilde ved romtemperatur.
- Plassere alle utstyr og rengjør mikrotomen.
6. immunofluorescence
- Velg lysbilder for immunostaining og plassere dem i en lysbildeholderen.
- På en varm plate, bringe et beger fylt med 0,01 M citrate ved pH 2.0 å koke. Volumet av bufferen avhenger av kanne størrelsen og må være nok for å dekke delene på lysbildene under koking (noen fordampning må tas i betraktning). Dekk begeret med aluminiumsfolie.
Merk: Andre metoder for antigen henting er tilgjengelig (se diskusjon). - Deparaffinize lysbildene i 100% xylen 2 x i 5 min. Rehydrate lysbildene bruker følgende serie: 100% EtOH 2 x i 5 min, 70% EtOH 2 x i 5 min, type 1 ultrapure vann for 5 min.
Merk: Etter deparaffinization, er det viktig å ikke la delene tørke ut: vev deler må alltid være dekket med buffere eller løsninger til slutten av prosedyren eller vev strukturen kan være skadet. - For henting av antigen, plassere lysbilder i et metall lysbildeholderen og sett den i begeret med kokende citrate uten aluminiumsfolie. La det koke i 10 min.
- Fjern begeret fra kokeplate og la den avkjøles for 20 min. Sørg for at delene adrenal er fortsatt dekket med bufferen.
- Forberede blokkerer løsningen. Hvis bruker den kommersielt tilgjengelig flekker kit ansatt Representant resultater (se Tabell for materiale), i et rør legge 1,25 mL 1 x PBS, 1 dråpe (tilsvarer ca 45 µL) musen Ig blokkerer reagens og 5% av normal geit serum. Lagre blokkerer løsningen på 4 ° C eller på isen mens du arbeider.
Merk: Serum brukes, avhenger av den sekundære antistoff vert arter. Her har sekundære antistoffer i geit blitt brukt. For andre antistoffer, kan ulike serum konsentrasjoner være nødvendig. Empirisk bestemme riktig serum konsentrasjonen ved å teste flere konsentrasjoner. - Overføre lysbildene i en Coplin glasset som inneholder 1 x PBS og vask 3 x 10 min hver på en rocker med milde rocking.
- Forberede en fuktet kammer den flekker.
- Forsiktig, riste av PBS fra ett lysbilde; Tørk skyve bunnen med en lofri tørke fjerne overflødig PBS.
- Bruker en spesiell markør for lysbilder med hydrofobe egenskaper, tegne en sirkel rundt hver adrenal delen at glassoverflaten er tørr å unngå spredning av blekk løsningen delen. Om nødvendig må du tørke av tørr overflaten. Plass lysbildet i fuktet kammeret.
- Raskt, Pipetter 50 µL (eller nok til å dekke deler) for å blokkere løsning på hver seksjon. Inkuber 1t ved romtemperatur.
Merk: Blokkerer løsning volum nødvendig kan variere; Det er viktig at delene er godt dekket med løsningen. - Forberede fortynningsmiddel løsningen fra kommersielt tilgjengelige kit med 7,5 mL 1 x PBS, 600 µL av protein konsentrere lager løsning og 5% normal geit serum (eller andre serum og konsentrasjon i blokkering løsningen). Lagre fortynningsmiddel løsningen på 4 ° C eller på isen mens du arbeider.
- Klargjør de primære antistoff løsningene fortynne primære antistoffer i de aktuelle konsentrasjonene i fortynningsmiddel løsningen. Co flekker, legge til en aliquot hver antistoff i et nytt rør og bland forsiktig. Plasser antistoffer og antistoff løsninger på is til klar til bruk.
Merk: Her vi ansatt anti-SF1 antistoffer i kanin og en anti-TH antistoff i mus. For å forberede antistoffer Følg arbeider løsninger som anvist.- Legg 1 µL av anti-SF1 antistoffer til 999 µL fortynningsmiddel løsning (siste konsentrasjon på 1,5 µg/mL) i en tube, SF1 arbeider løsning. Legg 1 µL anti-TH antistoff 499 µL fortynningsmiddel løsning (beregnede endelige konsentrasjon på 2-6 µg/mL) i en tube, TH arbeider løsning.
- For SF1 + TH antistoff arbeider blanding, i en fersk tube, Pipetter 250 µL av SF1 fungerende løsning og 250 µL av TH fungerende løsning. Bland forsiktig ved pipettering. Lagre på is.
- Overføre lysbildene i en Coplin glasset som inneholder 1 x PBS og vaske 3 x i 5 min på en rocker med milde rocking.
- Lysbildene tilbake i fuktet kammeret etter tørke av overflødig på PBS, pipette SF1 + TH antistoff arbeider mix (eller andre primære antistoff løsning) på hver del, lukke fuktet kammeret og la den over natten på 4 ° C.
- Flytte lysbildene i en Coplin jar som inneholder 1 x PBS og vaske 3 x i 15 min på en rocker med milde rocking på dagen.
- Under vasking forberede lysbildene sekundære antistoff løsningen i fortynningsmiddel løsningen bruker riktig konsentrasjonen. Hvis utfører co flekker, legge like mye hvert sekundære antistoff-løsning i en ny tube. Bland forsiktig ved pipettering. Lagre på is. Beskytter rørene fra lys og lagre på is inntil klar til bruk.
Merk: Her sekundære antistoffer brukes er 488 nm fluorescerende farge-merket anti-mus i geit og 549 fluorescerende farge-merket anti-kanin reist i geit. Sekundær antistoff løsningen ble utarbeidet ved å legge til 0,5 µL hvert sekundære antistoff 799 µL fortynningsmiddel løsning (siste konsentrasjoner av 1,2 µg/mL). - Plasser lysbildene i fuktet kammeret etter fjerning av PBS, raskt Pipetter sekundære antistoff løsningen på delene adrenal, lukke fuktet kammeret og beskytte mot lyset. Inkuber 1t ved romtemperatur.
- Vask lysbildene i en Coplin krukke med 1 x PBS og vaske 3 x i 15 min på en rocker med milde rocking, sørge for å beskytte dem mot lyset.
- Forberede 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) løsning for kjernefysisk flekker: 1 µL av DAPI (20 mg/mL) i 1 mL 1 x PBS.
Merk: Blue-fluorescerende kjernefysiske counterstain kan også oppnås ved hjelp av Hoechst fargestoff. - Pipetter DAPI løsning på delene adrenal, dekke fra lys og ruge ved romtemperatur i 7 min.
- Vask lysbildene i en Coplin krukke med 1 x PBS og vaske 3 x i 5 min på en rocker med milde rocking samtidig beskytte lysbildene fra lys.
- I et område skjermet fra lys, legge ned et cover glass og Pipetter 60 µL eller ca 3 dråper montering agent egnet for immunofluorescence langs overflaten av dekket glasset.
- Tørk forsiktig av baksiden av et lysbilde med en lofri tørke, posisjon lysbildet skriften ned mot dekselet glasset og parallelt med den, så delene vev ansikt dekket glasset med montering agent på den. Lett trykk lysbildet på dekket glasset og sørge for at ingen luftboble er fanget mellom lysbildet og dekke glass.
- Om nødvendig bruker du ytterligere press for å fjerne luftboblene og overflødig montering agent.
- Legge ned lysbildet i en mørk beholder kur i romtemperatur i minst 24 timer (eller tidspunktet som er angitt i informasjonsarket av montering agent brukes) og Fortsett til bildebehandling.
7. imaging
Merk: Fluorescens mikroskop koblet til et kamera er nødvendig for å oppdage og fange fluorescens slippes ut av vev etter eksitasjon på bestemt bølgelengder. Mens tydelig, er det viktig for å huske å velge sekundære antistoff konjugert med fluorochromes som eksitasjon og utslipp spectra er kompatible med utstyret tilgjengelig. Bildebehandling innstillingene variere mikroskopet og programvaren som brukes for å ta bilder. Det er noen grunnleggende regler som gjelder for imaging adrenal deler som å sørge for at eksponeringstid, kameraet få innstillinger og lyskilde intensitet holdes konstant.
- Slå på lyskilden og kameraet, lansere bildebehandlingsprogramvare følge retningslinjene fra produsenten.
Merk: Rekkefølgen av disse handlingene kan variere avhengig av utstyret som brukes. - Sikre lysbildet på scenen, åpne skodde og ser på mikroskopet okularene bruke kjernefysiske flekker (DAPI) kanal og lav forstørrelse (4 X) til å identifisere vev på lysbildet: adrenal deler er små, og deres visualisering krever litt tid.
- Bytt til en høyere forstørrelse (10 X), fokus, og lukke skodde.
Merk: Det er viktig å unngå unødvendig lang exposition under lys som kan forårsake photobleaching, noe som resulterer i tap av signal. - Bruke kommandoene programvare, Velg målsettingen (10 X) og kanalen i bruk (DAPI), justere eksponeringstid (1 s, kan justeres hvis signalet er for sterk eller svak). Hvis tilgjengelig, kan du angi binning for live bildebehandling (ikke acquisition) "2 X 2', konvertering få til 'mid', avlesning hastighet til ' 20 MHz'". Hvis programvaren brukes ikke viser baren skala på slutten av avbilding, velge bar skala fra menyen og plassere baren der ønsket.
- Åpne skodde, Juster fokus hvis nødvendig og bytte kanaler (FITC, TRITC, DAPI). Hvis mikroskopet ikke er automatisert, ta et bilde av adrenalin i hver enkelt kanal uten å flytte scenen og sørg for å justere merkingen av kanalen i bruk. Lukk nedleggelse når ferdig.
Merk: Skriv ned innstillingene ansatt i tilfelle programvaren ikke automatisk lagre dem. - Lagre bildene.
Merk: Flettede bilder kan ofte opprette visningskroppen programvare eller andre grafikk editor programvarepakker. - Gjenta bildebehandling for andre områder i delen / med en høyere forstørrelse.
Merk: En 20 X forstørrelse ofte krever en kortere eksponeringstid (dvs. 800 ms). - På slutten av imaging, slå av alt utstyr i riktig rekkefølge.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 representerer en skjematisk hele protokollen beskrevet ovenfor. Binyrene høstes fra mus tilstøtende fettvev fjernes under dissecting mikroskop og adrenalin er så fast i 4% PFA. Etter dette trinnet er binyrene behandlet og innebygd i parafin, og delt med en mikrotom å kutte orgelet i tynne skiver som settes på objektglass. Etter tørking av delene, immunofluorescence utføres og delene er fotografert i mikroskopet.
Fjerning av tilstøtende fett (figur 2A) er viktig for å tilrettelegge ytterligere behandling og snitting av binyrene. Vellykket fjerning av omkringliggende fettvev vises i figur 2B, hvor av adrenalin er lett synlig og ikke ekstra fett er synlig. I dette trinnet er det kritisk, men å ikke la binyrene tørr eller dette kan skade vev strukturen. Tørrhet gjenkjennes når adrenalin forutsetter en rynkete utseende (figur 2C). Dette problemet kan lett overvinnes ved rehydrating adrenalin i 1 x PBS før du fortsetter med fett fjerning.
Resultatene oppnådd følgende denne protokollen vises i Figur 3. Immunofluorescence bildene illustrerer immunostaining av en binyrene på to ulike forstørrelser. Rød kjernefysiske SF1 flekker merker adrenocortical cellene, mens cytoplasma grønne flekker merker cellene i margen. Ytre kapselen er merket av kjernefysiske flekker i blått (DAPI) siden det ikke er steroidogenic (SF1-negativ).
Figur 1 : Skjematisk fremstilling av protokollen. Etter høsting binyrene og fjerne tilstøtende fettvev, vev er løst i 4% PFA, behandlet for parafin innebygging og delt. Delene er så immunostained og fotografert med fluorescens mikroskop. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Fjerning av peri-adrenalin fett. (A) fett rundt binyrene fjernes under disseksjon mikroskop. (B) binyrene etter opprydding. (C) eksempel på vev tørker opp og som krever hydration. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Immunofluorescence avbildning av binyrene. Eksempel på immunofluorescence imaging (ved ulike forstørrelser) av en binyrene beiset med markører av binyrebarken (SF1, kjernefysiske flekker) og adrenal medulla (TH, cytoplasmatiske grønn). Kjerner (DAPI) er merket i blått. C: kapsel; CO: cortex; m: margen. Skalere barer = 200 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Reagens | Stasjon | Temperatur | Varighet |
| 70% EtOH | 1 | RT | 1 h |
| 90% EtOH | 2 | RT | 1 h |
| 90% EtOH | 3 | RT | 1 h |
| Absolutt EtOH | 4 | RT | 1 h |
| Absolutt EtOH | 5 | RT | 1 h |
| Absolutt EtOH | 6 | RT | 1 h |
| Absolutt EtOH | 7 | RT | 1 h |
| Xylen | 8 | RT | 1 h |
| Xylen | 9 | RT | 1 h |
| Xylen | 10 | RT | 1 h |
| Parafin voks | 11 | 62 ° C | 1 h |
| Parafin voks | 12 | 62 ° C | 1 h |
| Parafin voks | 13 | 62 ° C | 1 h |
Tabell 1: Vev prosessor programmet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver en metode for isolering av musen binyrene sammen med utarbeidelse og flekker av appa parafin-innebygd mus binyrene.
Sammenlignet med andre protokoller vi testet, har denne immunofluorescence protokollen bevist egnet for fleste av antistoffer i vårt laboratorium. I enkelte tilfeller kan det imidlertid krever noen justeringer for å forbedre flekker resultatene. En variabel som lett kan endres og testet er lengden på fiksering. I vårt laboratorium, inkubasjon i 4% PFA kan variere fra 1 time til 4 h, mens i andre laboratorier fiksering tiden er utvidet til 12-24 h16. I våre hender, men lengre fiksering tid førte til økt bakgrunnsstøy og var ikke optimal for flere antistoffer rutinemessig brukes i vår forskning.
PH i antigen henting kan også spille en rolle i suksessen til farging. Varme-indusert epitope henting (HIER) kan utføres ved å bruke kommersielt tilgjengelige løsninger med pH mellom syreholdig til alkaliske, samt andre huset gjort buffere som citrate (pH 6), ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA, pH 8), Tris-EDTA (pH 9), Tris (pH 10). Enzymatisk behandling kan også være et alternativ for antigen avsløre. Rugende deparaffinized lysbilder for en begrenset tid med en løsning som inneholder en riktig konsentrasjon av et enzym (for eksempel proteinasen K) kan være en alternativ metode å HIER. Det er imidlertid viktig å sjarmere enzym konsentrasjonen og å finne den ideelle inkubasjon tiden, siden over fordøyelsen kan negativt påvirke vev17.
Valg av blokkering bufferen er også en annen variabel for feilsøking. Dessuten bruk av vanlig geit serum og kommersielt tilgjengelig blokkerer bufferen nevnt i denne protokollen (praktisk i dette tilfellet når du bruker primære muse-antistoffer på musen vev for å hindre høy bakgrunn på grunn av endogene musen IgG), er det flere alternativer tilgjengelig som protein løsninger (bovine serum albumin (BSA) eller tørr melk) eller andre tilsvarede buffere. Det er viktig å sørge for at bufferen ikke inneholder stoffer som kan påvirke farging, som biotin når bruker en biotin-streptavidin basert metode.
Binyrene er en endokrine organ preget av høy lipid innhold som kan ofte gjøre immunostaining utfordrende på grunn av høy autofluorescence av lipid. Videre er adrenal halvdelene fra mus og rotter rik på autofluorescent Intracytoplasmatisk lipofuscin, et pigmentert detaljert og amorfe materiale som varierer i farge fra gul til brun. Du løser dette problemet, kan forbindelser som Sudan svart B (SBB) slukke fluorescens generert av lipofuscins18. En annen faktor som kompromitterer utfallet av en god flekker er tilstedeværelsen av blodceller. Hemoglobin i Målestørrelsen på erytrocytter absorberer lys av bølgelengder < 600 nm og kan forstyrre fluorochromes som dekker den bølgelengde19,20. Mens perfusjon teknikker kan brukes å fjerne blod celler fra vev fartøy, kan bruk av 10 mM kobber sulfat ved pH 5 før du utfører kjernefysiske counterstaining også hjelpe i undertrykke uønskede fluorescens21.
Et viktig skritt i denne protokollen er adrenal dissection. Binyrene er et organ som plasseringen kan være vanskelig å finne i situ: i mus, kjertler er små og deres posisjon er noe variabel. Særlig i eldre dyr, er binyrene også omgitt av fettvev som kan påvirke påvisning av kjertler og deres påfølgende isolasjon, derfor er det avgjørende å ha et klart syn på området i dette trinnet av protokollen. Fjerning av peri-adrenalin fett fjerning er delikat. Spesiell oppmerksomhet bør betales til binyrene under frakobling fettet ikke å ruptur kapselen. Kjertel må også holdes fuktig med PBS under prosedyren for å unngå skade på vev.
Ved snitting, kan oppdage tilstedeværelsen av den lille delen av adrenal vev i delene være utfordrende på grunn av vev hypopigmentation etter behandling trinn. Mikroskop er svært nyttig under snitting for kresne vev fra voks.
Immunostaining på parafin-embedded deler er en verdifull teknikk for immunolabeling proteiner rundt samtidig bevare morfologi av vev. Metoden som presenteres her er basert på fluorescens oppdagelsen, og mens det er spesielt funksjonelle for studier ansette flere primære antistoffer, fluorescens signalet er lys-sensitive og kan lett tapt eller svekket hvis lysbildene ikke behandles riktig (dvs. langvarig eksponering for mikroskopet lys eller unødvendige eksponering for omgivelseslys). Videre kan vi merker en nedgang på kvaliteten på fluorescens signalet selv over tid. Dette problemet kan unngås ved hjelp av kromogent gjenkjenning, som er photostable og kan visualiseres i mange år. Denne metoden, men mangler fordelene fluorescens gjenkjenning, som merking høyere presisjon og samtidige merking av flere proteiner i en studie.
Parafininnstøper er en praktisk metode for å behandle og lagre flere vevsprøver. Vev behandling for parafin innebygging seg er imidlertid ikke egner seg for tenkelig av fluorescerende journalister endogenously uttrykt i noen transgene dyr uten bruk av et spesifikt antistoff målretting reporteren. Kryonisk bevaring er en metode for å unngå nedbrytning av fluorescerende protein og la sin direkte visualisering under et mikroskop. Unngå bruk av et ekstra antistoff kan representere en fordel. På den annen side, kan kryonisk bevaring også begrense siden det påvirker vev morfologi; det krever også forskjellige utstyr ved snitting, og lagring av lysbilder og vev blokker er mulig i fryser bare.
Ettall større begrensningen Imaging en delt vev er muligheten til å få bilder av strukturelle komponenter på høy romlig oppløsning. Vev komposisjon er faktisk en viktig variabel å bestemme kvaliteten på avbilding siden det påvirker lys gjennomtrenging og kan føre til dårlig oppløsning. Binyrene er en vev rik på lipider at lys spredning22. I hjernen, som også har en høy lipid innhold, er vev-clearing teknikker som KLARHET, BABB, iDISCO og 3DISCO utviklet for å forbedre vev visualisering, tillater for bedre tenkelig og 3D vev rekonstruksjon23. Disse teknikkene gir forskere høykvalitets bildebehandling data, og tilpasses for ulike typer vev, og i fremtiden, håper vi å ansette metodene for adrenal imaging også.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Mohamad Zubair for hans forslag og teknisk assistanse i etableringen av denne protokollen. Dette arbeidet ble støttet av National Institute Diabetes og fordøyelsesenzymer og nyre sykdommer, nasjonale institutter for helse Research Grant 2R01-DK062027 (til G.D.H).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co. | 0412B | |
| Disposable needles 25 G x 5/8" | Exel International | 26403 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Paraplast plus | McCormik scientific | 39502004 | Paraffin for tissue embedding |
| Shandon biopsy cassettes II with attached lid | Thermo scientific | 1001097 | Cassettes for tissue processing |
| High Profile Microtome Blades | Accu-Edge | 4685 | Disposable stainless steel blades |
| Peel-a-way disposable plastic tissue embedding molds | Polysciences Inc. | 18986 | Truncated, 22 mm square top tapered to 12 mm bottom |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
| Xylene | Fisher Chemical | X5P1GAL | |
| 200 Proof Ethanol | Decon Labs, Inc. | ||
| Certi-Pad Gauze pads | Certified Safety Mfg, Inc | 231-210 | 3" x 3. Sterile latex free gauze pads |
| M.O.M kit | Vector laboratories | BMK-2202 | For detecting mouse primary antibodies on mouse tissue |
| KimWipes | Kimtech | 34155 | Wipes 4.4 inch x 8.4 inch |
| Super PAP PEN | Invitrogen | 00-8899 | Pen to draw on slides |
| Microscope cover glass | Fisherbrand | 12-544-D | Size: 22 x 50 x 1.5 |
| DAPI | Sigma | D9542 | (Prepared in 20 mg/mL stock) |
| ProLong Gold antifade reagent | Molecular Probes | P36930 | Mounting agent for immunofluorescence |
| X-cite series 120Q | Lumen Dynamics | Light source | |
| Coolsnap Myo | Photometrics | Camera | |
| Optiphot-2 | Nikon | Microscope | |
| microtome | American Optical | ||
| Tissue embedder | Leica | EG1150 H | |
| Tissue processor | Leica | ASP300S | |
| Normal goat serum | Sigma | G9023 | |
| Mouse anti-TH | Millipore | MAB318 | Primary antibody |
| Rabbit anti-SF1 | Ab proteintech group (PTGlabs) | custom made | Primary antibody |
| Alexa-488 Mouse IgG raised goat | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | Secondary antibody |
| Dylight-549 Rabbit IgG raised goat | Jackson ImmunoResearch | 111-505-003 | Secondary antibody |
| Citrate acid anhydrous | Fisher Chemical | A940-500 | |
| NIS-Elements Basic Research | Nikon | Software for imaging |
References
- Brandtzaeg, P. The increasing power of immunohistochemistry and immunocytochemistry. Journal of Immunological Methods. 216 (1-2), 49-67 (1998).
- Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- Lerario, A. M., Finco, I., LaPensee, C., Hammer, G. D. Molecular Mechanisms of Stem/ Progenitor Cell Maintenance in the Adrenal Cortex. Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).
- Yates, R., et al. Adrenocortical Development, Maintenance, and Disease. Endocrine Gland Development and Disease. 106, 239-312 (2013).
- Jones, I. C. Variation in the Mouse Adrenal Cortex with Special Reference to the Zona Reticularis and to Brown Degeneration, Together with a Discussion of the Cell Migration Theory. Quarterly Journal of Microscopical Science. 89 (1), 53 (1948).
- Sucheston, M. E. C., Samuel, M. The Transient-Zone in the Human and Mouse Adrenal Gland. The Ohio Journal of Science. 72, n2 (March, 1972) 120-126 (1972).
- Guasti, L., Paul, A., Laufer, E., King, P. Localization of Sonic hedgehog secreting and receiving cells in the developing and adult rat adrenal cortex. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 117-122 (2011).
- Pihlajoki, M., Dorner, J., Cochran, R. S., Heikinheimo, M., Wilson, D. B. Adrenocortical zonation, renewal, and remodeling. Frontiers in Endocrinology. 6, 27 (2015).
- Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid Droplets Finally Get a Little R-E-S-P-E-C-T. Cell. 139 (5), 855-860 (2009).
- Shen, W. J., Azhar, S., Kraemer, F. B. Lipid droplets and steroidogenic cells. Experimental Cell Research. 340 (2), 209-214 (2016).
- Finco, I., LaPensee, C. R., Krill, K. T., Hammer, G. D. Hedgehog signaling and steroidogenesis. Annual Review of Physiology. 77, 105-129 (2015).
- Paul, A., Laufer, E. Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).
- Lowe, J., Anderson, P. Stevens & Lowe's Human Histology, 4th Edition. , Elsevier/Mosby. 263-285 (2015).
- Nagatsu, T. Genes for human catecholamine-synthesizing enzymes. Neuroscience Research. 12 (2), 315-345 (1991).
- Berthon, A., et al. Age-dependent effects of Armc5 haploinsufficiency on adrenocortical function. Human Molecular Geneticst. 26 (18), 3495-3507 (2017).
- Brown, C. Antigen retrieval methods for immunohistochemistry. Toxicologic Pathology. 26 (6), 830-831 (1998).
- Billinton, N., Knight, A. W. Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).
- Hirsch, R. E., San George, R. C., Nagel, R. L. Intrinsic fluorometric determination of the stable state of aggregation in hemoglobins. Analytical Biochemistry. 149 (2), 415-420 (1985).
- Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of Red Blood Cell Autofluorescence for Immunocytochemistry on Fixed Embryonic Mouse Tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 28 (2017).
- Watson, J. Suppressing autofluorescence of erythrocytes. Biotechnic & Histochemistry. 86 (3), 207 (2011).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
