Summary
Hier presenteren we een methode om te isoleren van de bijnieren van muizen, repareren de weefsels, sectie hen en uitvoeren immunofluorescentie kleuring.
Abstract
Immunofluorescentie is een gevestigde techniek voor de detectie van antigenen in weefsel met de tewerkstelling van fluorescerende-geconjugeerde antilichamen en heeft een breed spectrum van toepassingen. Detectie van antigenen zorgt voor karakterisering en de identificatie van meerdere celtypen. Gelegen boven de nieren en ingekapseld door een laag mesenchymale cellen, is de bijnier een endocriene orgel, gecomponeerd door twee verschillende weefsels met verschillende embryologische oorsprong, de mesonephric tussentijdse mesoderm afkomstige buitenste cortex en de neurale Crest-afgeleide innerlijke medulla. De bijnierschors scheidt steroïden (dat wil zeggen, mineralocorticoids, glucocorticoïden, geslachtshormonen) Overwegende dat de medulla bijnier catecholamines (dat wil zeggen, adrenaline, noradrenaline produceert). Terwijl de bijnier onderzoek, is het belangrijk om te kunnen onderscheiden van unieke cellen met verschillende functies. Hier bieden we een protocol ontwikkeld in ons laboratorium dat een reeks opeenvolgende stappen die nodig zijn beschrijft voor het verkrijgen van de immunofluorescentie kleuring te karakteriseren van de celtypes van de bijnier. Eerst richten we ons op de dissectie van de muis bijnieren, de microscopische verwijdering van vet van periadrenal gevolgd door de fixatie, verwerking en paraffine inbedding van het weefsel. Vervolgens beschrijven we afdelen van het weefsel blokken met een roterende microtoom. Tot slot, we detail een protocol voor immunefluorescentie verkleuring van de bijnieren die we hebben ontwikkeld om te minimaliseren van zowel de niet-specifieke antilichaam binding en de autofluorescence met het oog op een optimale signaal.
Introduction
Immunohistochemistry is een techniek voor het opsporen van weefsel componenten met het gebruik van antilichamen tegen specifieke cellulaire moleculen en latere kleuring technieken te detecteren de geconjugeerde antilichamen1. Deze procedure immunohistochemische vereist specifieke fixatie en verwerking van weefsels die vaak empirisch bepaald voor het specifieke antigeen, weefsel en antilichaam gebruikt2. Fixatie is van cruciaal belang voor het behoud van de "originele" toestand van het weefsel en daardoor handhaven intact cellulaire en subcellular structuren en expressiepatronen. Verdere zijn verwerking en procedures te embedding verplicht te stellen van het weefsel voor segmenteren in dunne plakjes, die worden gebruikt voor histologische studies waarbij immunohistochemistry.
Immunokleuring kan worden uitgevoerd met chromogenic of fluorescerende detectie. Chromogenic detectie vereist het gebruik van een enzym een oplosbare substraat omzetten in een onoplosbare gekleurde product. Terwijl dit enzym kan worden geconjugeerd met het herkennen van het antigeen (primair antilichaam) antilichaam, is het vaker geconjugeerd met het herkennen van het primaire antilichaam (dat wil zeggen, het secundaire antilichaam) antilichaam. Deze techniek is zeer gevoelig; de gekleurde product dat verkregen wordt uit de enzymatische reactie is van photostable en vereist alleen een helderveld Microscoop voor imaging. Echter chromogenic immunokleuring mogelijk niet geschikt wanneer het proberen om te visualiseren van twee eiwitten die mede lokaliseren, aangezien de afzetting van één kleur de afzetting van de andere maskeren kan. In het geval van co kleuring, heeft immunofluorescentie bewezen voordeliger. De komst van immunofluorescentie wordt toegeschreven aan Albert Coons en collega's, die een systeem ontwikkelde voor het identificeren van weefsel antigenen met antistoffen gemarkeerd met fluoresceïne en hen visualiseren in het verdeelde weefsels onder ultraviolet licht3. Fluorescentie detectie is gebaseerd op een met een fluorophore die licht na excitatie uitzendt geconjugeerd antilichaam. Omdat er verschillende fluorophores met emissies bij verschillende golflengtes (met weinig of geen overlapping), deze detectiemethode is ideaal voor de studies van meerdere eiwitten.
De bijnier is een gepaarde orgaan gelegen boven de nieren en gekenmerkt door twee embryologisch afzonderlijke componenten, omgeven door een mesenchymale capsule. De buitenste bijnierschors, afgeleid van de mesonephric van de tussenliggende mesoderm, scheidt steroïdhormonen terwijl de innerlijke medulla, afgeleid van de neurale crest, produceert catecholamines waaronder adrenaline, noradrenaline en dopamine. De bijnierschors wordt histologisch en functioneel opgedeeld in drie concentrische zones, met elke zone verschillende klassen van steroïdhormonen afscheidende: de buitenste zona glomerulosa (zG) produceert mineralocorticoids die elektroliet homeostase regelen en intravasculaire volume; de middelste zona fasciculata (zF), scheidt direct onder de zG, glucocorticoïden die de stressrespons via de mobilisatie van energie winkels bemiddelen te verhogen van plasma glucose; en de innerlijke zona reticularis (zR), die synthetiseert sex steroïde precursoren (dat wil zeggen, Dehydroepiandrosteron (DHEAS))4.
Afwisseling in adrenocortical zonering aanwezig tussen soorten is: bijvoorbeeld, Mus musculus ontbreekt de zR. De unieke postnatale X-zone van M. musculus is een overblijfsel van de foetale cortex gekenmerkt door kleine lipide-armen cellen met acidophilic cytoplasms5. De X-zone verdwijnt in de puberteit in mannelijke muizen en na de eerste zwangerschap in vrouwelijke muizen of geleidelijk ontaardt in niet-gefokt vrouwtjes6,7. Bovendien, de tortuosity en de dikte van de zG exposities gekenmerkt variatie tussen soorten zoals organisatie van perifere stuurpen en voorlopercellen cellen in en grenzend aan de zG. De rat, in tegenstelling tot andere knaagdieren, heeft een zichtbare ongedifferentieerde zone (zU) tussen de zG en zF die functioneert als een zone van de cel van de stam en/of een zone van voorbijgaande aard progenitoren frequentiebanden te versterken. De zU is uniek voor ratten of gewoon een meer georganiseerde prominent cluster van cellen is onbekend8,9.
Cellen van de bijnierschors lipide druppeltjes die slaan cholesterol esters die als de voorloper van alle steroïdhormonen10,11 dienen. De term "steroidogenesis" definieert het procedé van vervaardiging van steroïdhormonen uit cholesterol via een reeks enzymatische reacties die betrekking hebben op de activiteit van steroidogenic factor 1 (SF1), waarvan de expressie een marker van steroidogenic potentieel is. In de bijnier is Sf1 expressie alleen in de cellen van de cortex12aanwezig. Een interessant onderzoek gevonden de uitdrukking van endogene Biotine in de adrenocortical cellen met steroidogenic potentiële13. Hoewel dit kan de oorzaak van een hogere achtergrond in Biotine/streptavidine gebaseerde kleuring methoden, als gevolg van de opsporing van endogene Biotine door antilichaam geconjugeerd met daar, kon dit kenmerk ook worden gebruikt om te onderscheiden van de steroidogenic cellen uit andere populaties in de bijnier, dat wil zeggen, endotheel, kapselvorming en medulla cellen.
De medulla bijnier wordt geïnnerveerd door sympathieke preganglionic neuronen, en wordt gekenmerkt door basofiele cellen met een korrelig cytoplasma met adrenaline en noradrenaline. Medulla cellen heten "chromaffin" als gevolg van het hoge gehalte aan catecholaminen die een bruin pigment na oxidatie14 vormen. Tyrosine hydroxylase (TH) is het enzym dat katalyseert de snelheidslimieten stap in de synthese van catecholamines en in de bijnier, alleen in de medulla15wordt uitgedrukt.
Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van muis bijnieren, de verwerking ervan voor het inbedden in paraffine en segmenteren, en een methode voor het uitvoeren van immunofluorescentie kleuring op bijnier secties teneinde de cellulaire typen vormen de bijnierschors en medulla. Dit protocol is een standaard in ons laboratorium voor immunokleuring met meerdere antilichamen routinematig gebruikt in ons onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle methodes werden uitgevoerd overeenkomstig institutioneel goedgekeurde protocollen onder de auspiciën van het Comité van de Universiteit voor gebruik en verzorging van dieren aan de Universiteit van Michigan.
1. voorbereiding op de operatie
- Bereiden op de dag vóór de operatie, 4% paraformaldehyde (PFA) / fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). In het geval van bevroren aliquots, gaat u verder met een ontdooien en bewaren bij 4 ° C.
Opmerking: 4% PFA is niet stabiel gedurende meer dan 48 uur.
Let op: PFA is giftig, contact met huid en ogen vermijden en gooi in een juiste container. - Op de dag van de operatie, bereiden de chirurgische instrumenten door het steriliseren van de schaar en pincet met 70% ethanol (EtOH) en laat ze drogen op een keukenrol.
- Plaats een 24-well plaat gevuld met 1 x PBS (1 mL/putje is voldoende) in een ijsemmer.
Opmerking: Bijnieren zal worden gehouden in dit gerecht multi goed cultuur na de operatie.
2. de bijnier dissectie
- Euthanaseren de muis na standaardprotocollen goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC). Een secundaire methode voor euthanasie om dood (bijvoorbeeld onthoofding) is vereist.
- Voor euthanasie door Isofluraan overdosis, plaatst u de muisaanwijzer in een kamer gevuld met Isofluraan dampen totdat ademhaling ophoudt, dan verwijderen van de muis uit de zaal, leg het op een oppervlak en uitvoeren van cervicale dislocatie.
Opmerking: De meeste euthanasie methoden veroorzaken nood aan het dier en zijn niet geschikt voor onderzoek van de stress omdat ze de storende variabele van de activering van de hypofyse-bijnier as en Wallenberg catecholamine release kunnen toevoegen. In dit geval is onthoofding de voorgestelde techniek te nemen.
- Voor euthanasie door Isofluraan overdosis, plaatst u de muisaanwijzer in een kamer gevuld met Isofluraan dampen totdat ademhaling ophoudt, dan verwijderen van de muis uit de zaal, leg het op een oppervlak en uitvoeren van cervicale dislocatie.
- Leggen van het muis liggende, steriliseren van de incisie gebied op de buik en flanken met 70% EtOH.
Opmerking: Terwijl scheren van de vacht tot steriliteit leiden zal, voor deze bepaalde toepassing het is niet nodig. - Snijden van de huid in het midden van de buik met behulp van schaar, scheiden van de huid van het buikvlies, deskin van de muis door knijpen van de huid rond de cut en trekken het in twee tegenovergestelde richtingen (caudal en rostraal). Knip het buikvlies tot het bereiken van de posterieure linker- en flanken.
- Verwijder het stekje lymfkliertest bijnier rond het omliggende vetweefsel en plaatst u deze in de 24-multiwell plaat gevuld met 1 x PBS en gehouden op ijs.
3. Peri-bijnier vet verwijderen
- Onder een Microscoop ontleden, plaats de bijnier op een glas basis of een petrischaal op de plaat van de fase, positie van de lichtbron, selecteert u de vergroting en past de focus voor een duidelijk zicht op de gehele bijnier.
Opmerking: De vergroting gebruikt kan variëren afhankelijk van persoonlijke voorkeuren. Een totale vergroting van 30 X met een plan lens 1 X, 3 X zoom en 10 X oculair kunt visualiseren van de hele klier met een goede gezichtsveld. - Verwijder snel de aangrenzende vet weefsel met twee naalden in 25 G, het vermijden van uitdroging van de bijnier. Als dit gebeurt voordat alle vet wordt verwijderd, zet de bijnier terug in de put met 1 x PBS voor 1-2 min, en gaat u verder met het vet verwijderingsproces.
- Wassen 2 x voor elke 2 min in 1 x PBS.
4. de weefsels verwerking en insluiten
- Bevestigen van de weefsels in 4% PFA/PBS bij 4 ° C op een rockende platform voor 2 h.
- Verwijderen van de 4% PFA en wassen de weefsels met 1 x PBS, 3 x 15 min bij 4 ° C.
Let op: PFA is giftig en is een gevaarlijke afvalstoffen; worden moet behandeld met de nodige voorzichtigheid onder een chemische motorkap en verwijderd in een gevaarlijk afval container. - Incubeer de bijnieren in 50% EtOH bij 4 ° C op een rockende platform voor 2 h.
- Incubeer de bijnieren in 70% EtOH bij 4 ° C op een rockende platform voor een minimum van 2 h.
Opmerking: Als u niet verdergaat met weefsel verwerking voor het insluiten, kunnen de bijnieren worden opgeslagen in 70% EtOH bij 4 ° C. Het vermijden van langdurige opslag in 70% levert EtOH en over te gaan tot het weefsel zo spoedig mogelijk verwerken betere kwaliteit monsters. - De bijnier voorbereiden weefsel verwerking door het te verpakken in gaas en het omsluiten van een cassette te embedding weefsel. Plaats de cassette in een pot gevuld met 70% EtOH en bewaren bij 4 ° C tot klaar om naar de processor weefsel. Plaats de cassette in de processor van de weefsel geprogrammeerd zoals vermeld in tabel 1 en start het programma.
- Breng de cassette in een insluiten station gevuld met gesmolten paraffine bij 65 ° C. Als een koeling station niet beschikbaar is, plaatst u een koude koeling lade ernaast.
- Label een insluiten schimmel en open het weefsel cassette te embedding. Met behulp van een paar pincet, uitpakken het gaas en plaats de bijnier zachtjes in de gewenste positie in het midden van de basis in de insluiten schimmel. Giet de gesmolten paraffine op de bijnier. Indien nodig, houdt u de bijnier met een tang om haar positie in de mal anders het kan verplaatsen binnen de mal veilig stellen.
- Zachtjes bewegen de insluiten schimmel aan het Dienblad van de koeling en wachten tot de verharding van de paraffine. Na dat, ter vergemakkelijking van afdelen, slaan insluiten mallen op een koele plaats.
5. afdelen met Rotary Microtome
- Controleer de microtoom is schoon voordat u begint, borstel weg alle afgedankte paraffine residuen, zorgen dat het mes (of mes) is aangescherpt, olie de interne mechanisme en de blok-houder volledig intrekken indien nodig.
- Label van een reeks Microscoop dia (positief geladen of bekleed om weefsel verlies te voorkomen (Zie Tabel van materialen)), leg ze op een warmere diareeks bij 37 ° C, en afzien van sommige gesteriliseerde met autoclaaf type 1 ultrazuiver water op de top van elke dia.
- Sectie dikte vastgesteldop 5 µm.
- De microtoom blade invoegen in de meshouder, de hoek van het mes, ervoor te zorgen dat het mes stevig in de houder is beveiligd en controleren van de goedkeuring van de paraffine blok en de houder van het blok.
- De blok-houder brengen haar hoogste positie en, indien mogelijk, operationele handgreepsteun vergrendelen, de paraffine blok uit de mal te verwijderen en leg deze in de blok-houder stevig vastzetten met de klem. De hoek van de middenlijn van het blad met de geconfronteerd oppervlak van het blok moet ongeveer 20°. Zo nodig passen de paraffine-blok.
Let op: Het mes is scherp. - Als eerder is vergrendeld, ontgrendelen het handwiel en lager de paraffine blok totdat haar gezicht niveau met de rand van het blad microtoom is. Draai het wieltje van de hand met een gestage ritme. Uitvoeren van initiële trimmen te ruimen de paraffine en bloot de bijnier.
- Houd het handwiel te draaien, en afdeling tot het einde van de bijnier. Gebruik een helderveld of ontrafeling van Microscoop om te controleren op de aanwezigheid van weefsel in de secties. Loskoppelen van het lint van het mes en met de hulp van een ander paar pincet plaats het op het water gelegd op het glasplaatje. Het kan zinvol zijn om de plaats van het lint op een oppervlak, zorgvuldig uitrekken en dit vervolgens op de dia koppelen.
- Laat die de dia's droog op de hete plaat. Vervolgens leg ze plat op een dia lade en bak bij 37 ° C's nachts of langer als het water is nog steeds aanwezig. Eenmaal droog, kunt u de dia's opslaan in een dia doos bij kamertemperatuur.
- Alle gebruikte apparatuur opgeborgen en reinig de microtoom.
6. immunofluorescentie
- Selecteer de dia's voor immunokleuring en plaats ze in een dia houder.
- Op een hete plaat, brengen een bekerglas gevuld met 0,01 M citraat bij pH 2.0 aan de kook. Het volume van de buffer is afhankelijk van de grootte van het bekerglas en moet volstaan voor de dekking van de secties op de dia's tijdens het koken (sommige verdamping moet rekening worden gehouden). Dek het bekerglas af met aluminiumfolie.
Opmerking: Andere methoden voor het ophalen van het antigeen zijn beschikbaar (Zie discussie). - Deparaffinize van de dia's in 100% xyleen 2 x voor elke 5 min. Hydrateren van de dia's met behulp van de volgende reeks: 100% EtOH 2 x voor 5 min, 70% EtOH 2 x voor 5 min, typ 1 ultrazuiver water gedurende 5 minuten.
Opmerking: Na deparaffinization, is het belangrijk om niet laten de secties uitdrogen: weefselsecties moeten altijd worden bedekt met buffers of oplossingen tot het einde van de procedure of de structuur van het weefsel kan worden beschadigd. - Voor het ophalen van het antigeen, plaats van dia's in een metalen dia houder en plaatst u deze in het bekerglas met kokend citraat zonder de aluminiumfolie. Laat het gedurende 10 minuten koken.
- Neem het bekerglas van de verwarmingsplaat en laat het afkoelen voor 20 min. ervoor te zorgen dat de bijnier secties zijn nog steeds bedekt met de buffer.
- Bereid de blokkerende oplossing. Als met behulp van de verkrijgbare kleuring ingezet voor de Vertegenwoordiger resultaten Kit (Zie de Tabel van materialen), in een buis toevoegen 1,25 mL 1 x PBS, 1 druppel (gelijk aan ongeveer 45 µL) van muis Ig blokkeren reagens, en 5% van de normale geit serum. De blokkerende oplossing bij 4 ° C of op ijs tijdens het werken opslaan.
Opmerking: Het serum gebruikt hangt af van het secundaire antilichaam host soorten. Hier zijn secundaire antilichamen opgegroeid in geit gebruikt. Voor andere antilichamen, kunnen verschillende serum concentraties nodig zijn. Empirisch bepalen de juiste serumconcentratie door het testen van verschillende concentraties. - Breng de dia's in een pot van de Coplin met 1 x PBS en wastafel 3 x 10 minuten, elk op een rocker met zachte rockende.
- Voorbereiden op een bevochtigde kamer de kleuring.
- Zacht, afschudden de PBS van de ene dia; Veeg de onderkant van de dia met een pluisvrije doekje te verwijderen van de overtollige PBS.
- Met behulp van een speciale markering voor dia's met hydrofobe eigenschappen, teken een cirkel rond elke bijnier sectie, ervoor te zorgen dat het glasoppervlak droog is om te voorkomen dat de verspreiding van de oplossing van de inkt naar de sectie. Indien nodig, zorgvuldig veeg droog het oppervlak. Plaats de dia in de bevochtigde zaal.
- Snel, Pipeteer 50 µL (of genoeg ter dekking van de secties) van het blokkeren van de oplossing op elke sectie. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
Opmerking: Het blokkeren van benodigde volume van de oplossing variëren; het is belangrijk dat de secties komen ruimschoots aan bod met de oplossing. - Bereid de verdunningsmiddel oplossing uit de verkrijgbare kit met 7,5 mL 1 x PBS, 600 µL van eiwit concentreren stock oplossing en 5% normaal geit serum (of elke andere serum en concentratie in de blokkerende oplossing gebruikt). De verdunningsmiddel oplossing bij 4 ° C of op ijs tijdens het werken opslaan.
- Het bereiden van de oplossingen van de primair antilichaam de primaire antilichamen op de juiste concentraties in de verdunningsmiddel oplossing te verdunnen. Voor co kleuring, voeg een aliquoot gedeelte van elke antilichaam in een nieuwe buis, en meng zachtjes. Plaats antilichamen en antilichaam oplossingen op ijs tot klaar voor gebruik.
Opmerking: Hier wij werkzaam anti-SF1 antilichaam opgegroeid in konijn en een anti-TH antilichaam aan de orde gesteld in de muis. Ter voorbereiding van het antilichaam volgen werkende oplossingen zoals voorgeschreven.- Toevoegen voor SF1 werkende oplossing, in één buis, 1 µL van anti-SF1 antilichaam aan 999 µL van verdunningsmiddel oplossing (eindconcentratie van 1,5 µg/mL). Voor TH werkoplossing, in een buis, voeg 1 µL anti-TH antilichaam in 499 µL van verdunningsmiddel oplossing (geschatte eindconcentratie van 2-6 µg/mL).
- Voor SF1 + TH antilichaam werken mix, in een verse buis, Pipetteer 250 µL van SF1 werkoplossing en 250 µL van TH werkende oplossing. Meng zachtjes door pipetteren. Opslaan op het ijs.
- Overdracht van de dia's in een pot van de Coplin met 1 x PBS en 3 x voor elke 5 min op een rocker met zachte rockende wassen.
- Plaats de dia's terug in de bevochtigde kamer na het afvegen van de overmaat van PBS, Pipet de SF1 + TH een antilichaam werken mix (of andere oplossing primair antilichaam) op elke sectie sluit de bevochtigde kamer en laten overnachten bij 4 ° C.
- De volgende dag, door de dia's in een Coplin jar bevattende 1 x PBS en 3 x voor 15 min te wassen op een rocker met zachte rockende te verplaatsen.
- Bereid de oplossing van de secundair antilichaam in de verdunningsmiddel oplossing om met de juiste concentratie tijdens het wassen van de dia's. Als mede kleuring wilt uitvoeren, toevoegen gelijke hoeveelheid elke secundair antilichaam-oplossing in een nieuwe buis. Meng zachtjes door pipetteren. Opslaan op het ijs. De buizen beschermen tegen licht en bewaren in de ijskast tot klaar voor gebruik.
Opmerking: De secundaire antilichamen gebruikt hier 488 nm fluorescerende kleurstof-geëtiketteerden-antimuis opgegroeid in geit en 549 fluorescerende kleurstof-geëtiketteerden anti-konijn opgegroeid in geit. Het secundaire antilichaam-oplossing was bereid door toevoeging van 0,5 µL van elke secundair antilichaam in 799 µL van verdunningsmiddel oplossing (eindconcentraties van 1.2 µg/mL). - Plaats van de dia's terug in de bevochtigde kamer na het verwijderen van teveel aan PBS, snel Pipetteer de secundair antilichaam-oplossing op de bijnier secties, sluit de bevochtigde kamer en beschermen tegen licht. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Wassen van de dia's in een Coplin pot met 1 x PBS en 3 x voor 15 min te wassen op een rocker met zachte rockende, ervoor zorgend om hen te beschermen tegen licht.
- Voorbereiden op de 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) oplossing nucleaire kleuring: 1 µL van de DAPI (20 mg/mL) in 1 mL 1 x PBS.
Opmerking: Blue-belichting fluorescerende nucleaire counterstain kan ook worden bereikt met behulp van Hoechst kleurstof. - Pipetteer DAPI oplossing op de bijnier secties, cover door licht en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 7 minuten.
- Wassen van de dia's in een Coplin pot met 1 x PBS en 3 x gedurende 5 minuten wassen op een rocker met zachte rockende terwijl de bescherming van de dia's van licht.
- In een gebied dat beschermd tegen direct licht, vast een glas cover en Pipetteer 60 µL of ongeveer 3 druppels voor montage agent geschikt voor immunofluorescentie langs het oppervlak van het glas van de cover.
- Veeg voorzichtig de achterkant van een dia met een pluisvrije doekje, positie de dia naar beneden richting het glas cover en parallel, zodat de weefselsecties het glas van de cover met de agent van de montage op het gezicht. Licht druk op de dia op de cover glas en ervoor te zorgen dat er geen luchtbel tussen de dia en het glas cover opgesloten ligt.
- Indien nodig, verdere pressiemiddelen om de luchtbellen en de overdaad aan montage agent te verwijderen.
- Vaststellen van de dia in een donkere container en uitharding bij kamertemperatuur gedurende ten minste 24 uur (of de tijd vermeld in het informatiebestand van de montage-agent gebruikt) en vervolgens overgaan tot imaging.
7. imaging
Opmerking: Een fluorescentie Microscoop aangesloten op een camera is vereist voor het opsporen en vastleggen van de fluorescentie die wordt uitgestraald door de weefsels na excitatie bij bepaalde golflengten. Hoewel duidelijk is, is het belangrijk om te onthouden om te kiezen van de secundaire geconjugeerd antilichaam met fluorochromes waarvan excitatie en emissie spectra verenigbaar zijn met de apparatuur beschikbaar. Imaging-instellingen is afhankelijk van de Microscoop en de software die wordt gebruikt voor het vastleggen van beelden. Er zijn enkele basisregels die gelden voor imaging-bijnier secties, zoals ervoor te zorgen dat de belichtingstijd, camera instellingen krijgen en lichtbron intensiteit constant worden gehouden.
- De lichtbron en de camera inschakelen, start de imaging software na aanwijzingen van de fabrikant.
Opmerking: De volgorde van deze acties kan verschillen afhankelijk van de gebruikte apparatuur. - Beveiligen van de dia in het werkgebied, open de sluiter, en op zoek naar de Microscoop oculairs nucleaire kleuring (DAPI) kanaal en lage zoomfactor (4 X) om te identificeren het weefsel op de dia: bijnier secties zijn klein, en hun visualisatie kan enige tijd nodig.
- Ga naar een hogere vergroting (10 X), focus, en sluit de sluiter.
Opmerking: Het is belangrijk te voorkomen dat onnodig lange expositie onder het licht dat leiden photobleaching tot kan, wat resulteert in verlies van signaal. - Met behulp van de opdrachten van de software, selecteer het doel (10 X) en het kanaal in gebruik (DAPI), belichtingstijd aanpassen (1 s, kan worden aangepast als het signaal te sterk of zwak). Indien beschikbaar, set weggooien voor levende imaging (geen overname) te '2 X 2', conversie winnen tot 'midden', uitlezing snelheid tot ' 20 MHz'. Als de software gebruikt de schaal bar niet wordt weergegeven aan het einde van de beeldvorming, selecteer de optie schaal bar in het menu en plaatst de bar waar gewenst.
- Open de sluiter, opnieuw de focus indien nodig aanpassen en schakelen kanalen (FITC, TRITC, DAPI). Als de Microscoop is niet geautomatiseerd, neem een foto van de bijnier in elk kanaal zonder te verplaatsen van het podium en zorg ervoor om de selectie van het kanaal in gebruik te passen. Sluit de sluiter eenmaal klaar.
Opmerking: Noteer de instellingen werkzaam in het geval dat de software wordt niet automatisch opgeslagen met hen. - De foto's opslaan.
Opmerking: Samengevoegde afbeeldingen kunnen worden vaak gemaakt met behulp van de Microscoop software of andere grafische editor softwarepakketten. - Herhaal imaging voor andere gebieden van de sectie en/of met een hogere vergroting.
Opmerking: Een 20 X vergroting vaak vereist een kortere belichtingstijd (dat wil zeggen, 800 ms). - Aan het einde van beeldvorming, zet u alle apparatuur in de juiste volgorde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 geeft een schematische voorstelling van het gehele protocol hierboven beschreven. Bijnieren worden geoogst van muizen, aangrenzende adipeus weefsel is verwijderd onder een Microscoop ontleden en de bijnier worden dan opgelost met 4% PFA. Na deze stap, zijn bijnieren verwerkt en ingesloten in paraffine en gesegmenteerd met een microtoom aan het orgel snijd in dunne plakjes die worden afgezet op Microscoop dia's. Na het drogen van de afdelingen, immunofluorescentie wordt uitgevoerd en de secties zijn beeld op de Microscoop.
De verwijdering van aangrenzende vet(Figuur 2)is belangrijk voor het bevorderen van de verdere verwerking en segmenteren van de bijnieren. Succesvolle verwijdering van de omliggende vetweefsel is afgebeeld in Figuur 2B, waar de bijnier is gemakkelijk aantoonbaar en geen extra vet is zichtbaar. Tijdens deze stap is het van cruciaal belang, echter, zodat niet de bijnier uitdrogen of dit kon beschadigen de structuur van het weefsel. Droogte is herkenbaar als de bijnier wordt verondersteld een rimpelige verschijning (Figuur 2C). Dit probleem kan gemakkelijk worden overwonnen door de bijnier in 1 x PBS vochtinbrengende voordat u verdergaat met het verwijderen van vet.
De eindresultaten verkregen na dit protocol worden gepresenteerd in Figuur 3. De beelden van de immunofluorescentie illustreren de immunokleuring van een bijnier in twee verschillende vergrotingen. Rode nucleaire SF1 kleuring etiketten de adrenocortical cellen, overwegende dat de cellen van de medulla cytoplasmatische groene kleuring etiketten. De buitenste capsule heet door nucleaire kleuring in blauw (DAPI) Aangezien er geen steroidogenic (SF1-negatief).
Figuur 1 : Schematische weergave van het protocol. Na het oogsten van de bijnieren en de aangrenzende adipeus weefsel verwijderen, de weefsels worden opgelost met 4% PFA, verwerkt voor het insluiten van paraffine, en gesegmenteerd. De secties zijn dan immunostained en beeld met een fluorescentie Microscoop. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Verwijderen van peri-bijnier vet. (A) het vet rond die de bijnier wordt verwijderd onder een Microscoop dissectie. (B) bijnier na het opschonen. (C) voorbeeld van weefsel opdrogen en dat vereist hydratatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Immunofluorescentie beeldvorming van de bijnier. Voorbeeld van de beeldvorming van de immunofluorescentie (in verschillende vergrotingen) van een bijnier gekleurd met markeringen van de bijnierschors (SF1, nucleaire kleuring) en van de bijnier medulla (TH, cytoplasmatische groen). Kernen (DAPI) worden aangeduid in blauw. C: de capsule; CO: cortex; m: medulla. Schaal bars = 200 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Reagens | Station | Temperatuur | Duur |
| 70% EtOH | 1 | RT | 1 h |
| 90% EtOH | 2 | RT | 1 h |
| 90% EtOH | 3 | RT | 1 h |
| Absolute EtOH | 4 | RT | 1 h |
| Absolute EtOH | 5 | RT | 1 h |
| Absolute EtOH | 6 | RT | 1 h |
| Absolute EtOH | 7 | RT | 1 h |
| Xyleen | 8 | RT | 1 h |
| Xyleen | 9 | RT | 1 h |
| Xyleen | 10 | RT | 1 h |
| Paraffine | 11 | 62 ° C | 1 h |
| Paraffine | 12 | 62 ° C | 1 h |
| Paraffine | 13 | 62 ° C | 1 h |
Tabel 1: Weefsel processor programma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft een methode voor de isolatie van de bijnieren muis samen met de voorbereiding en verkleuring van de verdeelde paraffine-ingebedde muis bijnieren.
Vergeleken met andere protocollen die we getest, heeft dit immunofluorescentie protocol geschikt voor de meerderheid van de antilichamen gebruikt in ons laboratorium bewezen. In bepaalde gevallen kan het echter enkele aanpassingen om de kleuring resultaten te verbeteren. Een variabele die gemakkelijk kan worden bewerkt en getest is de lengte van fixatie. In ons laboratorium, de incubatie in 4% PFA kan variëren van 1 uur tot 4 uur, terwijl in andere laboratoria de fixatie tijd is verlengd tot en met 12 – 24 h16. In onze handen, echter een langere fixatie tijd geleid tot hogere achtergrondruis en was niet optimaal is voor verschillende antilichamen routinematig gebruikt in ons onderzoek.
De pH van de herwinning van het antigeen kan ook een rol spelen in het succes van de kleuring. Warmte-geïnduceerde epitoop ophalen (HIER) kan worden uitgevoerd door gebruik te maken van commercieel beschikbare oplossingen met pH variërend van zuur tot alkalisch, evenals andere in-house gemaakte buffers zoals ammoniumcitraatoplossing (pH = 6), ethyleendiamminetetra zuur (EDTA, pH 8), Tris-EDTA (pH 9), Tris (pH 10). Enzymatische behandeling kunnen ook een optie voor antigeen ontmaskering. De deparaffinized van de dia's voor een beperkte tijd aan het broeden met een oplossing die een goede concentratie van een enzym (bijvoorbeeld proteïnase K) kunnen een alternatieve methode HIER. Het is echter essentieel Titreer de concentratie van enzym en te bepalen van de ideale incubatietijd, aangezien overmatige spijsvertering negatief effect op de weefsel17 hebben kan.
De keuze van de buffer met blokkerend is ook een andere variabele voor het oplossen van problemen. Naast het gebruik van normale geit serum en de verkrijgbare blokkeerbuffer in dit protocol (handig in dit geval bij het gebruik van primaire muisknop antilichamen op de weefsels van de muis om te voorkomen dat hoge achtergrond als gevolg van endogene muis IgG) genoemd, zijn er extra opties beschikbaar, zoals eiwit oplossingen (bovien serumalbumine (BSA) of droge melk) of andere verkrijgbare buffers. Het is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de buffer geen stoffen die interfereren bevat kunnen met de kleuring, zoals biotine als methode met behulp van een Biotine-streptavidine gebaseerd.
De bijnier is een endocriene orgel gekenmerkt door hoog vetgehalte, die vaak immunokleuring uitdagend vanwege de hoge autofluorescence van de lipide kunt maken. Bijnier cortices van muizen en ratten zijn bovendien rijk aan autofluorescent intracytoplasmatische lipofuscin, een gepigmenteerde korrelig en Amorf materiaal dat in kleur van geel tot bruin varieert. Om dit probleem te verhelpen, stoffen zoals Soedan zwart B (SBB) kunnen het doven van de fluorescentie gegenereerd door lipofuscins18. Een andere factor die het resultaat van een goede kleuring compromissen is de aanwezigheid van cellen van het bloed. Hemoglobine aanwezig in de erythrocyten absorbeert licht van golflengtes < 600 nm en kan interfereren met de fluorochromes die zich uitstrekken over dat golflengte19,20. Terwijl perfusie technieken kunnen worden gebruikt om cellen van het bloed van weefsel vaartuigen, kan het gebruik van kopersulfaat 10 mM met een pH van 5 voor het uitvoeren van nucleaire counterstaining ook helpen bij het onderdrukken van de ongewenste fluorescentie-21.
Een cruciale stap in dit protocol is de bijnier dissectie. De bijnier is een orgaan waarvan de positie moeilijk worden kan te vinden in situ: in muizen, de klieren zijn klein en hun positie is enigszins variabel. Vooral bij oudere dieren, zijn bijnieren ook omgeven door vetweefsel dat met de opsporing van de klieren en de daaruit voortvloeiende isolatie, om deze reden is het cruciaal interfereren kan om een duidelijk beeld van het gebied tijdens deze stap van het protocol. Verwijdering van peri-bijnier vet verwijdering is een delicate stap. Bijzondere aandacht moet uitgaan naar de bijnieren terwijl het loskoppelen van het vet niet te scheuren van de capsule. De klier ook moet vochtig met PBS tijdens de procedure om weefselschade te voorkomen.
Bij het segmenteren, kan opsporen van de aanwezigheid van het kleine gedeelte van de bijnier weefsel in de secties lastig zijn als gevolg van de verdikking van het weefsel na de verwerking stap. Een microscoop is zeer nuttig tijdens het segmenteren voor comforthotel van het weefsel van de wax.
Immunokleuring van paraffine-ingebedde secties is een waardevolle techniek voor immunolabeling proteïnen van belang met behoud van de morfologie van het weefsel. De methode die hier gepresenteerd is gebaseerd op de detectie van de fluorescentie en, hoewel het vooral functioneel voor studies met meerdere primaire antilichamen, de fluorescentie-signaal is lichtgevoelig en kan gemakkelijk worden verloren of verzwakt als de dia's worden niet behandeld goed (dat wil zeggen, langdurige blootstelling aan de lichte Microscoop of onnodige blootstelling aan omgevingslicht). Bovendien kunnen we een daling van de kwaliteit van de fluorescentie-signaal zich na verloop van tijd merken. Dit probleem kan worden voorkomen door gebruik te maken van de detectie van de chromogenic, die is photostable en gedurende vele jaren kan worden gevisualiseerd. Deze methode, mist echter de voordelen van de fluorescentie-detectie, zoals hoger labeling precisie en gelijktijdige labeling van verschillende eiwitten in een studie.
Het insluiten van paraffine is een handige methode voor het verwerken en opslaan van meerdere weefselmonsters. De verwerking voor paraffine inbedding zich weefsel is echter niet geschikt voor beeldvorming van fluorescerende verslaggevers endogeen uitgedrukt in sommige transgene dieren zonder het gebruik van een specifiek antilichaam gericht op de verslaggever. Cryopreservatie is een methode om te voorkomen van achteruitgang van de fluorescente proteïne en haar directe visualisatie onder een microscoop. Het vermijden van het gebruik van een extra antilichaam kan vertegenwoordigen een voordeel. Aan de andere kant, kan cryopreservatie ook beperken aangezien het betrekking heeft op de morfologie van het weefsel; het vereist ook verschillende apparatuur voor segmentering, en de opslag van de dia's en weefsel blokken is mogelijk in diepvriezers alleen.
Een belangrijke beperking van imaging een verdeelde weefsel is de mogelijkheid om beelden van constructiedelen bij hoge ruimtelijke resoluties. Weefsel samenstelling, in feite, is een belangrijke variabele bij het bepalen van de kwaliteit van de beeldvorming, aangezien het beïnvloedt licht penetratie en tot slechte resolutie leiden kan. De bijnier is een weefsel rijk aan lipiden waardoor licht verstrooiing van22. In de hersenen, die ook een hoog vetgehalte heeft, weefsel-clearing technieken zoals helderheid, BABB, iDISCO en 3DISCO ontwikkeld ter verbetering van weefsel visualization, waardoor beter beeldvorming en 3D weefsel wederopbouw23. Deze technieken onderzoekers hoge kwaliteit imaging gegevens zijn verstrekt, en worden aangepast aan verschillende allerlei weefsels en in de toekomst willen wij deze methoden voor imaging-bijnier ook in dienst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We danken Dr Mohamad Zubair voor zijn nuttige suggesties en technische bijstand bij de opstelling van dit protocol. Dit werk werd gesteund door het nationale Instituut van Diabetes en de spijsverterings en nierziekten, nationale instituten van gezondheid onderzoeksbeurs 2R01-DK062027 (voor G.D.H).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co. | 0412B | |
| Disposable needles 25 G x 5/8" | Exel International | 26403 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Paraplast plus | McCormik scientific | 39502004 | Paraffin for tissue embedding |
| Shandon biopsy cassettes II with attached lid | Thermo scientific | 1001097 | Cassettes for tissue processing |
| High Profile Microtome Blades | Accu-Edge | 4685 | Disposable stainless steel blades |
| Peel-a-way disposable plastic tissue embedding molds | Polysciences Inc. | 18986 | Truncated, 22 mm square top tapered to 12 mm bottom |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
| Xylene | Fisher Chemical | X5P1GAL | |
| 200 Proof Ethanol | Decon Labs, Inc. | ||
| Certi-Pad Gauze pads | Certified Safety Mfg, Inc | 231-210 | 3" x 3. Sterile latex free gauze pads |
| M.O.M kit | Vector laboratories | BMK-2202 | For detecting mouse primary antibodies on mouse tissue |
| KimWipes | Kimtech | 34155 | Wipes 4.4 inch x 8.4 inch |
| Super PAP PEN | Invitrogen | 00-8899 | Pen to draw on slides |
| Microscope cover glass | Fisherbrand | 12-544-D | Size: 22 x 50 x 1.5 |
| DAPI | Sigma | D9542 | (Prepared in 20 mg/mL stock) |
| ProLong Gold antifade reagent | Molecular Probes | P36930 | Mounting agent for immunofluorescence |
| X-cite series 120Q | Lumen Dynamics | Light source | |
| Coolsnap Myo | Photometrics | Camera | |
| Optiphot-2 | Nikon | Microscope | |
| microtome | American Optical | ||
| Tissue embedder | Leica | EG1150 H | |
| Tissue processor | Leica | ASP300S | |
| Normal goat serum | Sigma | G9023 | |
| Mouse anti-TH | Millipore | MAB318 | Primary antibody |
| Rabbit anti-SF1 | Ab proteintech group (PTGlabs) | custom made | Primary antibody |
| Alexa-488 Mouse IgG raised goat | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | Secondary antibody |
| Dylight-549 Rabbit IgG raised goat | Jackson ImmunoResearch | 111-505-003 | Secondary antibody |
| Citrate acid anhydrous | Fisher Chemical | A940-500 | |
| NIS-Elements Basic Research | Nikon | Software for imaging |
References
- Brandtzaeg, P. The increasing power of immunohistochemistry and immunocytochemistry. Journal of Immunological Methods. 216 (1-2), 49-67 (1998).
- Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- Lerario, A. M., Finco, I., LaPensee, C., Hammer, G. D. Molecular Mechanisms of Stem/ Progenitor Cell Maintenance in the Adrenal Cortex. Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).
- Yates, R., et al. Adrenocortical Development, Maintenance, and Disease. Endocrine Gland Development and Disease. 106, 239-312 (2013).
- Jones, I. C. Variation in the Mouse Adrenal Cortex with Special Reference to the Zona Reticularis and to Brown Degeneration, Together with a Discussion of the Cell Migration Theory. Quarterly Journal of Microscopical Science. 89 (1), 53 (1948).
- Sucheston, M. E. C., Samuel, M. The Transient-Zone in the Human and Mouse Adrenal Gland. The Ohio Journal of Science. 72, n2 (March, 1972) 120-126 (1972).
- Guasti, L., Paul, A., Laufer, E., King, P. Localization of Sonic hedgehog secreting and receiving cells in the developing and adult rat adrenal cortex. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 117-122 (2011).
- Pihlajoki, M., Dorner, J., Cochran, R. S., Heikinheimo, M., Wilson, D. B. Adrenocortical zonation, renewal, and remodeling. Frontiers in Endocrinology. 6, 27 (2015).
- Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid Droplets Finally Get a Little R-E-S-P-E-C-T. Cell. 139 (5), 855-860 (2009).
- Shen, W. J., Azhar, S., Kraemer, F. B. Lipid droplets and steroidogenic cells. Experimental Cell Research. 340 (2), 209-214 (2016).
- Finco, I., LaPensee, C. R., Krill, K. T., Hammer, G. D. Hedgehog signaling and steroidogenesis. Annual Review of Physiology. 77, 105-129 (2015).
- Paul, A., Laufer, E. Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).
- Lowe, J., Anderson, P. Stevens & Lowe's Human Histology, 4th Edition. , Elsevier/Mosby. 263-285 (2015).
- Nagatsu, T. Genes for human catecholamine-synthesizing enzymes. Neuroscience Research. 12 (2), 315-345 (1991).
- Berthon, A., et al. Age-dependent effects of Armc5 haploinsufficiency on adrenocortical function. Human Molecular Geneticst. 26 (18), 3495-3507 (2017).
- Brown, C. Antigen retrieval methods for immunohistochemistry. Toxicologic Pathology. 26 (6), 830-831 (1998).
- Billinton, N., Knight, A. W. Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).
- Hirsch, R. E., San George, R. C., Nagel, R. L. Intrinsic fluorometric determination of the stable state of aggregation in hemoglobins. Analytical Biochemistry. 149 (2), 415-420 (1985).
- Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of Red Blood Cell Autofluorescence for Immunocytochemistry on Fixed Embryonic Mouse Tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 28 (2017).
- Watson, J. Suppressing autofluorescence of erythrocytes. Biotechnic & Histochemistry. 86 (3), 207 (2011).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
