Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

अलगाव, निर्धारण, और माउस अधिवृक्क ग्रंथियों के इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग

Published: October 2, 2018 doi: 10.3791/58530
Automatic Translation
1, 1,2,3,4,5
1Department of Internal Medicine (Division of Metabolism, Endocrinology, and Diabetes), University of Michigan Health System, 2Department of Cell and Developmental Biology, University of Michigan Health System, 3Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Michigan Health System, 4Endocrine Oncology Program, University of Michigan Health System, 5Comprehensive Cancer Center, University of Michigan Health System

Summary

यहाँ हम चूहों से अधिवृक्क ग्रंथियों को अलग करने के लिए एक विधि वर्तमान, ऊतकों को ठीक, उन्हें अनुभाग, और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला प्रदर्शन.

Abstract

इम्यूनोफ्लोरेसेंस fluorochrome-संयुग्मित एंटीबॉडी के रोजगार के साथ ऊतकों में एंटीजन का पता लगाने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित तकनीक है और आवेदनों की एक व्यापक स्पेक्ट्रम है । एंटीजन का पता लगाने के लक्षण वर्णन और एकाधिक कोशिका प्रकार की पहचान के लिए अनुमति देता है । गुर्दे के ऊपर स्थित है और mesenchymal कोशिकाओं की एक परत से समझाया, अधिवृक्क ग्रंथि एक अंत में अलग embryological मूल के साथ दो अलग ऊतकों द्वारा रचित अंग है, mesonephric मध्यवर्ती मध्य त्वक स्तर-व्युत्पंन बाहरी प्रांतस्था और तंत्रिका शिखा-भीतरी मज्जा व्युत्पंन । अधिवृक्क प्रांतस्था स्टेरॉयड स्रावित करता है (यानी, mineralocorticoids, ग्लुकोकोर्तिकोइद, सेक्स हार्मोन), जबकि अधिवृक्क मज्जा उत्पादन catecholamines (यानी, एड्रेनालाईन, noradrenaline). अधिवृक्क अनुसंधान का संचालन करते समय, यह विभिन्न कार्यों के साथ अद्वितीय कोशिकाओं को भेद करने में सक्षम होना करने के लिए महत्वपूर्ण है. यहाँ हम एक हमारी प्रयोगशाला में विकसित प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं जो कि अधिवृक्क ग्रंथि के सेल प्रकार की विशेषता के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला प्राप्त करने के लिए आवश्यक क्रमिक चरणों की एक श्रृंखला का वर्णन करता है. हम माउस अधिवृक्क ग्रंथियों के विच्छेदन पर पहले ध्यान केंद्रित, periadrenal वसा के सूक्ष्म हटाने के निर्धारण, प्रसंस्करण और ऊतक के तेल embedding द्वारा पीछा किया । हम तो एक रोटरी microtome के साथ ऊतक ब्लॉकों के खंड का वर्णन । अंत में, हम विस्तार अधिवृक्क ग्रंथियों के धुंधला immunofluorescent के लिए एक प्रोटोकॉल है कि हम दोनों गैर विशिष्ट एंटीबॉडी बाध्यकारी और autofluorescence को कम करने के लिए एक इष्टतम संकेत प्राप्त करने के लिए विकसित किया है ।

Introduction

Immunohistochemistry विशिष्ट सेलुलर अणुओं और बाद में धुंधला तकनीक को संयुग्मित एंटीबॉडी1का पता लगाने के लिए एंटीबॉडी के उपयोग के साथ ऊतक घटकों का पता लगाने के लिए एक तकनीक है । इस immunohistochemical प्रक्रिया विशिष्ट निर्धारण और अक्सर विशिष्ट प्रतिजन, ऊतक और एंटीबॉडी2का उपयोग करने के लिए निर्धारित empirically है कि ऊतकों के प्रसंस्करण की आवश्यकता है । निर्धारण के लिए ऊतक के "मूल" राज्य के संरक्षण और इस तरह बरकरार सेलुलर और सेलुलर संरचनाओं और अभिव्यक्ति पैटर्न को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है । इसके अलावा प्रसंस्करण और embedding प्रक्रियाओं histologic immunohistochemistry शामिल अध्ययन के लिए उपयोग किया जाता है कि पतले स्लाइस में अनुभाग के लिए ऊतक तैयार करने के लिए आवश्यक हैं.

Immunostaining या तो chromogenic या फ्लोरोसेंट पता लगाने के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है । Chromogenic का पता लगाने के लिए एक घुलनशील सब्सट्रेट एक अघुलनशील रंग का उत्पाद में परिवर्तित करने के लिए एक एंजाइम के उपयोग की आवश्यकता है । हालांकि इस एंजाइम को प्रतिजन (primary एंटीबॉडी) पहचानने वाले एंटीबॉडी को संयुग्मित किया जा सकता है, लेकिन यह एंटीबॉडी पहचानने वाले प्राथमिक एंटीबॉडी (यानी, द्वितीयक एंटीबॉडी) को अधिक बार संयुग्मित है । यह तकनीक अति संवेदनशील है; रंगीन उत्पाद एंजाइमी प्रतिक्रिया से उत्पंन photostable है और इमेजिंग के लिए केवल एक brightfield माइक्रोस्कोप की आवश्यकता है । हालांकि, chromogenic immunostaining उपयुक्त नहीं हो सकता है जब दो प्रोटीन की कल्पना करने की कोशिश कर रहा है कि सह स्थानीयकरण, एक रंग के जमाव के बाद से एक दूसरे के जमाव मुखौटा कर सकते हैं । सह-दाग के मामले में, इम्यूनोफ्लोरेसेंस अधिक लाभप्रद साबित हुआ है । इम्यूनोफ्लोरेसेंस के आगमन अल्बर्ट कूनों और सहकर्मियों, जो एक प्रणाली fluorescein के साथ चिह्नित एंटीबॉडी और उंहें पराबैंगनी प्रकाश3के तहत खोदी ऊतकों में कल्पना के साथ ऊतक प्रतिजनों की पहचान करने के लिए विकसित करने के लिए जिंमेदार ठहराया है । प्रतिदीप्ति पता लगाना एक fluorophore है कि उत्तेजना के बाद प्रकाश का उत्सर्जन करता है के साथ एक एंटीबॉडी संयुग्मित पर आधारित है । क्योंकि वहां विभिंन तरंग दैर्ध्य (कोई या थोड़ा ओवरलैप के साथ) में उत्सर्जन के साथ कई fluorophores हैं, इस का पता लगाने विधि कई प्रोटीन के अध्ययन के लिए आदर्श है ।

अधिवृक्क ग्रंथि एक बनती अंग गुर्दे के ऊपर स्थित है और दो embryologically अलग एक mesenchymal कैप्सूल से घिरा घटकों द्वारा विशेषता है । बाहरी अधिवृक्क प्रांतस्था, mesonephric मध्यवर्ती मध्य त्वक स्तर से व्युत्पंन, भीतर मज्जा, तंत्रिका शिखा से व्युत्पंन, जबकि स्टेरॉयड हार्मोन स्रावित करता है, एड्रेनालाईन सहित catecholamines का उत्पादन, noradrenaline, और डोपामाइन. अधिवृक्क प्रांतस्था histologically और कार्यात्मक तीन गाढ़ा क्षेत्रों में विभाजित है, प्रत्येक क्षेत्र के साथ स्टेरॉयड हार्मोन के विभिन्न वर्गों स्रावित: बाहरी zona glomerulosa (zG) mineralocorticoids कि विनियमित इलेक्ट्रोलाइट homeostasis का उत्पादन और intravascular मात्रा; मध्य zona fasciculata (zF), सीधे zG के नीचे, ग्लुकोकोर्तिकोइद कि ऊर्जा भंडार के जुड़ाव के माध्यम से तनाव प्रतिक्रिया मध्यस्थता के लिए प्लाज्मा ग्लूकोज को बढ़ाने के लिए स्राव; और भीतरी zona reticularis (zR), जो सेक्स स्टेरॉयड अग्रदूतों (यानी, dehydroepiandrosterone (DHEAS))4संश्लेषित ।

adrenocortical zonation में कुछ भिन्नता प्रजातियों के बीच मौजूद है: उदाहरण के लिए, मस musculus zR का अभाव है । एम musculus के अद्वितीय जन्मोत्तर एक्स-जोन भ्रूण प्रांतस्था acidophilic cytoplasms5के साथ छोटे लिपिड गरीब कोशिकाओं द्वारा विशेषता के एक अवशेष है । एक्स जोन पुरुष चूहों में यौवन पर गायब हो जाता है और मादा चूहों में पहली गर्भावस्था के बाद, या धीरे-2 नहीं नस्ल6,7में पतित. इसके अलावा, tortuosity और zG की मोटाई प्रजातियों के बीच भिंनता के रूप में चिह्नित के रूप में परिधीय स्टेम और जनक कोशिकाओं में और zG के निकट के संगठन करता है । चूहा, अंय कुतर के विपरीत, zG और zF के बीच एक दृश्य विभेदक क्षेत्र (zU) है कि एक स्टेम सेल जोन और/या क्षणिक बढ़ाना progenitors के एक क्षेत्र के रूप में कार्य करता है । चाहे zU चूहों के लिए अद्वितीय है या बस कोशिकाओं के एक अधिक प्रमुखता से संगठित क्लस्टर8,9अज्ञात है ।

अधिवृक्क प्रांतस्था की कोशिकाओं लिपिड बूंदों कि कोलेस्ट्रॉल एस्टर की दुकान है कि सभी स्टेरॉयड हार्मोन10,11के अग्रदूत के रूप में सेवा होते हैं.  शब्द "steroidogenesis" एंजाइमी प्रतिक्रियाओं की एक श्रृंखला है कि steroidogenic फैक्टर 1 (SF1), जिसकी अभिव्यक्ति steroidogenic क्षमता का एक मार्कर है शामिल की एक सीरीज के माध्यम से स्टेरॉयड हार्मोन के उत्पादन की प्रक्रिया को परिभाषित करता है । अधिवृक्क ग्रंथि में, Sf1 अभिव्यक्ति केवल प्रांतस्था12की कोशिकाओं में मौजूद है । एक दिलचस्प अध्ययन में steroidogenic संभावित१३के साथ adrenocortical कोशिकाओं में अंतर्जात बायोटिन की अभिव्यक्ति पाई गई. हालांकि यह बायोटिन/streptavidin-आधारित धुंधला तरीकों में एक उच्च पृष्ठभूमि का कारण हो सकता है, streptavidin के साथ एंटीबॉडी संयुग्मित द्वारा अंतर्जात बायोटिन का पता लगाने के कारण, इस विशेषता भी steroidogenic भेद करने के लिए नियोजित किया जा सकता है अधिवृक्क ग्रंथि के भीतर अन्य आबादी से कोशिकाओं, यानी, endothelial, संपुटी, और मज्जा कोशिकाओं.

सहानुभूति preganglionic न्यूरॉन्स द्वारा Innervated, अधिवृक्क मज्जा कोशिका द्रव्य और एड्रेनालाईन युक्त एक दानेदार norepinephrine के साथ basophilic कोशिकाओं की विशेषता है. मज्जा कोशिकाओं का नाम है "chromaffin" catecholamines के उच्च सामग्री के कारण है कि ऑक्सीकरण14के बाद एक भूरे रंग वर्णक के रूप में । Tyrosine hydroxylase (गु) एंजाइम कि दर catalyzes catecholamines के संश्लेषण में कदम सीमित है और, अधिवृक्क ग्रंथि में, केवल मज्जा15में व्यक्त की है.

यहाँ हम चूहे अधिवृक्क ग्रंथियों के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद, आयल और अनुभाग में embedding के लिए उनके प्रसंस्करण, और एक विधि के लिए गठित सेलुलर प्रकार की पहचान करने के क्रम में अधिवृक्क वर्गों पर धुंधला इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रदर्शन करने के लिए अधिवृक्क प्रांतस्था और मज्जा. इस प्रोटोकॉल कई एंटीबॉडी नियमित रूप से हमारे अनुसंधान में इस्तेमाल के साथ immunostaining के लिए हमारी प्रयोगशाला में एक मानक है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी तरीकों को मिशिगन विश्वविद्यालय में उपयोग और जानवरों की देखभाल पर विश्वविद्यालय समिति के auspice के तहत संस्थागत अनुमोदित प्रोटोकॉल के साथ अनुसार प्रदर्शन किया गया ।

1. सर्जरी के लिए तैयारी

  1. शल्य चिकित्सा से पहले दिन पर, 4% paraformaldehyde (पीएफए)/phosphate बफर खारा (पंजाब) तैयार करते हैं । जमे हुए aliquots के मामले में, गल एक और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए आगे बढ़ें ।
    नोट: 4% पीएफए से अधिक ४८ एच के लिए स्थिर नहीं है ।
    चेतावनी: पीएफए विषाक्त है, त्वचा और आंखों के साथ संपर्क से बचने के लिए, और एक उपयुक्त कंटेनर में निपटाने ।
  2. शल्य चिकित्सा के दिन पर, कैंची और ७०% इथेनॉल (ेतोः) के साथ संदंश निष्फल और उंहें एक कागज तौलिया पर सूखी द्वारा शल्य चिकित्सा उपकरण तैयार करते हैं ।
  3. एक बर्फ की बाल्टी में एक 24-अच्छी तरह से 1x पंजाबियों से भरा थाली (1 मिलीलीटर/
    नोट: अधिवृक्क सर्जरी के बाद इस बहु अच्छी तरह से संस्कृति डिश में रखा जाएगा ।

2. अधिवृक्क विच्छेदन

  1. मानक संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल निंनलिखित माउस Euthanize । मौत सुनिश्चित करने के लिए इच्छामृत्यु की एक द्वितीयक विधि (उदाहरण के लिए decapitation) की आवश्यकता है ।
    1. isoflurane ओवरडोज से इच्छामृत्यु के लिए, एक isoflurane वाष्प से भरा कक्ष में माउस जगह जब तक श्वसन रहता है, तो चैंबर से माउस को हटाने, यह एक सतह पर रखना और गर्भाशय ग्रीवा के विस्थापन प्रदर्शन ।
      नोट: सबसे इच्छामृत्यु तरीकों जानवर के लिए संकट का कारण है और तनाव के अध्ययन के लिए उपयुक्त नहीं है क्योंकि वे पिट्यूटरी-अधिवृक्क धुरी और दिमाग़ी catecholamine रिहाई के सक्रियकरण की स्थापना चर जोड़ सकते हैं । इस उदाहरण में, decapitation को अपनाने के लिए सुझाए गए तकनीक है ।
  2. माउस लापरवाह करना, पेट और ७०% ेतोः के साथ पार्श्वों पर चीरा क्षेत्र निष्फल ।
    नोट: शेविंग करते समय फर बाँझता में वृद्धि होगी, इस विशेष आवेदन के लिए यह आवश्यक नहीं है.
  3. कैंची का प्रयोग कर पेट के बीच में त्वचा को काट लें, त्वचा को आँख से अलग करके, चमड़ी को काट के चारों ओर पिंच करके माउस को त्वचा पर लगाकर उसे दो विपरीत दिशाओं (caudal और rostral) में खींच लें. फिर पीछे छोड़ दिया और सही पार्श्वों तक पहुँचने जब तक कि योनि में कटौती ।
  4. आसपास के वसा ऊतक के आसपास murine अधिवृक्क ग्रंथि काटने निकालें और 1x पंजाबियों से भरे 24-multiwell प्लेट में जगह है और बर्फ पर रखा ।

3. पेरि-अधिवृक्क वसा हटाने

  1. एक विदारक खुर्दबीन के नीचे, एक गिलास आधार या स्टेज प्लेट पर एक पेट्री-डिश पर अधिवृक्क जगह, प्रकाश स्रोत की स्थिति, आवर्धन का चयन करें और पूरे अधिवृक्क का एक स्पष्ट दृश्य प्राप्त करने के लिए ध्यान समायोजित.
    नोट: आवर्धन का उपयोग व्यक्तिगत प्राथमिकताओं के आधार पर भिंन हो सकते हैं । एक योजना लेंस 1x, ज़ूम 3x, और ऐपिस 10x के साथ 30एक्स का कुल इज़ाफ़ा देखने का एक अच्छा क्षेत्र के साथ पूरे ग्रंथि कल्पना करने के लिए अनुमति देता है ।
  2. जल्दी से आसंन वसा ऊतकों को हटाने २ २५ जी सुई, अधिवृक्क के निर्जलीकरण से परहेज । यदि ऐसा होता है इससे पहले कि सभी वसा को हटा दिया जाता है, अधिवृक्क पंजाबियों के लिए 1 – 2 मिनट के लिए अच्छी तरह से युक्त में वापस ले जाएँ, और फिर वसा हटाने की प्रक्रिया के साथ जारी.
  3. 1x पंजाब में 2 मिनट प्रत्येक के लिए 2x धो लो ।

4. ऊतक प्रसंस्करण और embedding

  1. 2 एच के लिए एक कमाल का मंच पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% पीएफए/
  2. 4% पीएफए निकालें और 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रत्येक 15 मिनट के लिए 1x पंजाबियों, 3x के साथ ऊतकों को धो लें ।
    चेतावनी: पीएफए विषाक्त है और एक खतरनाक अपशिष्ट है; यह एक रासायनिक डाकू के तहत सावधानी के साथ नियंत्रित किया जाना चाहिए और एक खतरनाक अपशिष्ट कंटेनर में निपटारा ।
  3. 2 एच के लिए एक कमाल का मंच पर 4 डिग्री सेल्सियस पर ५०% ेतोः में अधिवृक्क मशीन ।
  4. 2 एच की एक ंयूनतम के लिए एक कमाल का मंच पर 4 डिग्री सेल्सियस पर ७०% ेतोः में अधिवृक्क मशीन ।
    नोट: यदि एंबेडिंग के लिए ऊतक प्रसंस्करण के साथ आगे बढ़ने नहीं, अधिवृक्क 4 डिग्री सेल्सियस पर ७०% ेतोः में संग्रहित किया जा सकता है । ७०% ेतोः में लंबी अवधि के भंडारण से बचना और ऊतक प्रसंस्करण के लिए आगे बढ़ने के रूप में संभव पैदावार बेहतर गुणवत्ता के नमूने ।
  5. यह धुंध में लपेटकर और एक ऊतक embedding कैसेट में संलग्न द्वारा ऊतक प्रसंस्करण के लिए अधिवृक्क तैयार. एक ७०% ेतोः से भरे जार में कैसेट प्लेस और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान जब तक ऊतक प्रोसेसर के लिए ले जाने के लिए तैयार । ऊतक प्रोसेसर में कैसेट डालें के रूप में तालिका 1 में रिपोर्ट और कार्यक्रम चलाने के लिए क्रमादेशित ।
  6. ६५ डिग्री सेल्सियस पर पिघला तेल से भरा एक embedding स्टेशन में कैसेट स्थानांतरण । एक कूलिंग स्टेशन उपलब्ध नहीं है, तो यह करने के लिए अगले एक ठंडा शीतलन ट्रे की स्थिति ।
  7. लेबल एक एंबेडिंग मोल्ड और ऊतक एंबेडिंग कैसेट खोलो । संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करना, धुंध खोलना और जगह अधिवृक्क embedding मोल्ड में आधार के केंद्र में वांछित स्थिति में धीरे । अधिवृक्क पर पिघला आयल डालो । यदि आवश्यक हो, संदंश के साथ अधिवृक्क पकड़ मोल्ड में अपनी स्थिति को सुरक्षित अंयथा यह चारों ओर मोल्ड अंदर स्थानांतरित कर सकते हैं ।
  8. धीरे ठंडा ट्रे के लिए एंबेडिंग मोल्ड हटो और तेल की सख्त जब तक रुको । उसके बाद, अनुभाग की सुविधा के लिए, एक ठंडी जगह में embedding मोल्ड की दुकान ।

5. एक रोटरी Microtome के साथ खोदी

  1. जांच करें कि microtome शुरू करने से पहले साफ है, दूर सभी आयल अवशेषों ब्रश, सुनिश्चित करें कि चाकू (या ब्लेड) तेज है, तेल आंतरिक तंत्र और पूरी तरह से यदि आवश्यक हो तो ब्लॉक धारक वापस लेना ।
  2. लेबल माइक्रोस्कोप स्लाइड की एक श्रृंखला (सकारात्मक चार्ज या ऊतक हानि को रोकने के लिए लेपित ( सामग्री की तालिकादेखें)), उंहें ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेट गर्म एक स्लाइड पर रखना, और प्रत्येक स्लाइड के शीर्ष पर कुछ autoclaved प्रकार 1 ultrapure पानी बांटना ।
  3. 5 µm पर अनुभाग मोटाई सेट करें ।
  4. ब्लेड धारक में microtome ब्लेड डालें, ब्लेड के कोण को नियंत्रित करें, सुनिश्चित करें कि ब्लेड मजबूती से धारक में सुरक्षित है और आयल ब्लॉक और ब्लॉक धारक की मंजूरी की जांच करें ।
  5. अपने उच्चतम स्थिति के लिए ब्लॉक धारक लाओ और, यदि संभव हो तो, ऑपरेटिंग हैंडल ताला, मोल्ड से तेल ब्लॉक हटाने और यह मजबूती से दबाना के साथ इसे सुरक्षित ब्लॉक धारक में जगह है । ब्लॉक का सामना करना पड़ सतह के साथ ब्लेड के केंद्र लाइन के कोण के बारे में 20 डिग्री होना चाहिए । यदि आवश्यक हो, तो आयल ब्लॉक को पुनः समायोजित करें ।
    चेतावनी: ब्लेड तेज है ।
  6. यदि पहले बंद कर दिया, हाथ पहिया अनलॉक और आयल ब्लॉक कम जब तक इसके चेहरे microtome ब्लेड के किनारे के साथ स्तर है । एक स्थिर लय के साथ हाथ पहिया घुमाएँ । प्रारंभिक ट्रिमिंग करने के लिए तेल हटाने और अधिवृक्क बेनकाब करने के लिए ।
  7. अधिवृक्क के अंत तक हाथ पहिया, और अनुभाग मोड़ रखें. वर्गों में ऊतक की उपस्थिति के लिए जांच करने के लिए एक brightfield या विदारक माइक्रोस्कोप का प्रयोग करें । रिबन ब्लेड से अलग और संदंश की एक और जोड़ी की मदद से यह गिलास स्लाइड पर रखी पानी पर जगह है । यह एक सतह पर रिबन रखने के लिए उपयोगी हो सकता है, इसे ध्यान से खिंचाव, और फिर इसे स्लाइड पर माउंट ।
  8. स्लाइड को गर्म प्लेट पर सूखने दें । फिर उंहें एक स्लाइड ट्रे और ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेंकना रात भर या अब अगर पानी अभी भी मौजूद है पर फ्लैट करना । एक बार ड्राई होने पर, स्लाइड बॉक्स को कमरे के तापमान पर स्टोर करें ।
  9. दूर सभी प्रयुक्त उपकरणों रखो और microtome साफ ।

6. इम्यूनोफ्लोरेसेंस

  1. immunostaining के लिए स्लाइड्स का चयन करें और उन्हें किसी स्लाइड होल्डर में रखें.
  2. एक गर्म थाली पर, एक चोंच के लिए पीएच २.० में 0.01 m साइट्रेट से भरा लाने के लिए फोड़ा । बफर की मात्रा चोंच आकार पर निर्भर करता है और उबलते के दौरान स्लाइड पर वर्गों को कवर करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए (कुछ वाष्पीकरण को ध्यान में रखा जाना चाहिए). एल्यूमीनियम पंनी के साथ चोंच कवर ।
    नोट: antigen पुनर्प्राप्ति के लिए अंय विधियां उपलब्ध है ( चर्चादेखें) ।
  3. Deparaffinize 5 मिनट प्रत्येक के लिए १००% xylene 2x में स्लाइड । rehydrat निंनलिखित श्रृंखला का उपयोग कर स्लाइड: १०० 5 मिनट, 5 मिनट के लिए ७०% ेतोः 2x के लिए ेतोः 2x%, प्रकार 5 मिनट के लिए 1 ultrapure पानी ।
    नोट: deparaffinization के बाद, यह नहीं जाने के लिए महत्वपूर्ण है वर्गों को बाहर सूखी: ऊतक वर्गों हमेशा बफ़र्स या समाधान के साथ कवर किया जाना चाहिए जब तक प्रक्रिया या ऊतक संरचना के अंत तक क्षतिग्रस्त हो सकता है ।
  4. antigen पुनर्प्राप्ति के लिए, किसी मेटल स्लाइड होल्डर में स्लाइड रखें और बिना एल्यूमीनियम पन्नी को उबलते साइट्रेट के साथ चोंच में डालें । इसे 10 मिनट के लिए उबलने दें ।
  5. हॉट प्लेट से यूरिन निकालें और इसे 20 मिनट के लिए ठंडा होने दें. सुनिश्चित करें कि अधिवृक्क वर्गों अभी भी बफर के साथ कवर कर रहे हैं ।
  6. ब्लॉकिंग समाधान तैयार करें । यदि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध दाग के परिणाम के लिए कार्यरत किट का उपयोग कर ( सामग्री की तालिकादेखें), एक ट्यूब में 1x पंजाबियों के १.२५ मिलीलीटर, 1 ड्रॉप (के बारे में ४५ µ एल के बराबर) माउस ़ अवरुद्ध एजेंट की, और सामांय बकरी सीरम के 5% जोड़ें । काम करते समय 4 डिग्री सेल्सियस या बर्फ पर अवरुद्ध समाधान की दुकान ।
    नोट: इस्तेमाल किया सीरम माध्यमिक एंटीबॉडी की मेजबान प्रजातियों पर निर्भर करता है । यहां माध्यमिक बकरी में उठाया एंटीबॉडी इस्तेमाल किया गया है । अन्य एंटीबॉडी के लिए, विभिन्न सीरम सांद्रता आवश्यक हो सकता है. Empirically कई सांद्रता परीक्षण द्वारा सही सीरम एकाग्रता का निर्धारण ।
  7. 1x पंजाबियों से युक्त एक Coplin जार में स्लाइड हस्तांतरण और 3x 10 मिन कोमल कमाल के साथ एक झूली कुरसी पर प्रत्येक धो लो ।
  8. धुंधला के लिए एक humidified चैंबर तैयार करते हैं ।
  9. धीरे से, एक स्लाइड से पंजाबियों को हिला; अतिरिक्त पंजाबियों को दूर करने के लिए एक एक प्रकार का वृक्ष-मुक्त पोंछ के साथ स्लाइड नीचे पोंछ ।
  10. hydrophobic गुणों के साथ स्लाइड के लिए एक विशेष मार्कर का उपयोग करना, एक अधिवृक्क अनुभाग आसपास के एक सर्कल ड्रा, सुनिश्चित करें कि कांच की सतह खंड के लिए स्याही समाधान के प्रसार से बचने के लिए शुष्क है बना । यदि आवश्यक हो, ध्यान से सूखी सतह पोंछ । स्लाइड को humidified चैंबर में रखें ।
  11. जल्दी, पिपेट ५० µ एल (या पर्याप्त वर्गों को कवर करने के लिए) हर अनुभाग पर समाधान अवरुद्ध की । कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए मशीन ।
    नोट: ब्लॉकिंग समाधान वॉल्यूम आवश्यक भिन्न हो सकते हैं; यह महत्वपूर्ण है कि वर्गों के समाधान के साथ अच्छी तरह से कवर कर रहे हैं ।
  12. 1x पंजाबियों, ६०० µ एल के प्रोटीन के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट से मंदक समाधान तैयार शेयर समाधान और 5% सामांय बकरी सीरम ध्यान केंद्रित (या किसी अंय सीरम और एकाग्रता अवरुद्ध समाधान में इस्तेमाल किया) । काम करते समय 4 डिग्री सेल्सियस या बर्फ पर मंदक समाधान की दुकान ।
  13. मंदक समाधान में उचित सांद्रता पर प्राथमिक एंटीबॉडी कमजोर प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें । सह दाग के लिए, एक नई ट्यूब में प्रत्येक एंटीबॉडी के एक aliquot जोड़ने के लिए, और धीरे मिश्रण । जगह एंटीबॉडी और बर्फ पर एंटीबॉडी समाधान का उपयोग करने के लिए तैयार जब तक ।
    नोट: यहां हम विरोधी SF1 एंटीबॉडी खरगोश और एक विरोधी में उठाया-गु एंटीबॉडी माउस में उठाया कार्यरत हैं । एंटीबॉडी कार्य समाधान तैयार करने के लिए निर्देशित के रूप में पालन करें ।
    1. SF1 समाधान के लिए, एक ट्यूब में, एंटी-SF1 एंटीबॉडी के 1 µ l को µ सॉल्यूशन के ९९९ मंदक l में जोड़ें (१.५ µ g/एमएल का अंतिम एकाग्रता) । वें काम समाधान के लिए, एक ट्यूब में, जोड़ें 1 µ l विरोधी गु एंटीबॉडी में ४९९ µ l मंदक समाधान (अनुमानित अंतिम एकाग्रता की 2-6 µ g/
    2. SF1 के लिए + गु एंटीबॉडी वर्किंग मिक्स, एक ताजा ट्यूब में, पिपेट २५० µ एल के SF1 काम समाधान और २५० µ एल काम समाधान के । pipetting द्वारा धीरे से मिलाएं । बर्फ पर स्टोर ।
  14. 1x पंजाबियों से युक्त एक Coplin जार में स्लाइड स्थानांतरण और 5 मिनट के लिए 3x धो कोमल कमाल के साथ एक झूली कुरसी पर ।
  15. humidified चैंबर में वापस बंद पंजाबियों के अतिरिक्त पोंछते के बाद स्लाइड प्लेस, पिपेट SF1 + वें एंटीबॉडी काम मिश्रण (या अंय प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान) प्रत्येक अनुभाग पर, humidified कक्ष बंद करो और यह 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात छोड़ दें ।
  16. अगले दिन, एक Coplin 1x पंजाबियों से युक्त जार में स्लाइड ले जाएं और 15 मिनट के लिए 3x धो कोमल कमाल के साथ एक झूली कुरसी पर ।
  17. स्लाइडों को धोने के दौरान, द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान मंदक समाधान में उपयुक्त एकाग्रता का उपयोग कर तैयार करें । यदि सह-धुंधला प्रदर्शन, एक नई ट्यूब में प्रत्येक माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के बराबर राशि जोड़ें । pipetting द्वारा धीरे से मिलाएं । बर्फ पर स्टोर । प्रकाश से ट्यूबों की रक्षा और बर्फ पर स्टोर करने के लिए तैयार का उपयोग करें जब तक ।
    नोट: यहां, माध्यमिक इस्तेमाल किया एंटीबॉडी ४८८ एनएम फ्लोरोसेंट डाई लेबल विरोधी माउस को बकरी और ५४९ फ्लोरोसेंट डाई में उठाया-विरोधी खरगोश-बकरी में उठाया लेबल हैं । माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान मंदक समाधान (१.२ µ जी/एमएल के अंतिम सांद्रता) के ७९९ µ एल में प्रत्येक माध्यमिक एंटीबॉडी के ०.५ µ एल जोड़कर तैयार किया गया था ।
  18. humidified चैंबर में वापस स्लाइड के लिए पंजाबियों से अधिक हटाने के बाद जगह है, जल्दी से अधिवृक्क वर्गों पर माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान पिपेट, humidified चैंबर बंद करो और प्रकाश से बचाने के लिए । कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए मशीन ।
  19. 1x पंजाबियों के साथ एक Coplin जार में स्लाइड धो और 15 मिनट के लिए कोमल कमाल के साथ एक घुमाव पर 3x धो, उंहें प्रकाश से बचाने के लिए सुनिश्चित कर रही है ।
  20. परमाणु दाग के लिए 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) समाधान तैयार: 1x पंजाब के 1 मिलीलीटर में DAPI (20 मिलीग्राम/एमएल) के 1 µ एल ।
    नोट: ब्लू-फ्लोरोसेंट न्यूक्लियर counterstain भी Hoechst डाई का इस्तेमाल कर हासिल किया जा सकता है ।
  21. पिपेट DAPI अधिवृक्क वर्गों पर समाधान, प्रकाश से कवर और कमरे के तापमान पर 7 मिनट के लिए मशीन ।
  22. 1x पंजाबियों के साथ एक Coplin जार में स्लाइड धो लें और 5 मिनट के लिए कोमल कमाल के साथ एक घुमाव पर 3x धो जबकि प्रकाश से स्लाइड की रक्षा ।
  23. प्रत्यक्ष प्रकाश से परिरक्षण क्षेत्र में, एक कवर ग्लास लेट, और पिपेट ६० µ l या कवर ग्लास की सतह के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए उपयुक्त बढ़ते एजेंट के बारे में 3 बूंदें ।
  24. धीरे एक एक प्रकार का वृक्ष के साथ एक स्लाइड के पीछे पोंछ-मुक्त पोंछ, स्थिति को कवर कांच और यह समानांतर की ओर नीचे चेहरा, तो ऊतक वर्गों उस पर बढ़ते एजेंट के साथ कवर गिलास चेहरा । कवर ग्लास पर स्लाइड को हल्के से दबाएं और सुनिश्चित करें कि स्लाइड और कवर ग्लास के बीच कोई हवा का बुलबुला फंस गया है ।
    1. यदि आवश्यक हो, लागू करने के लिए हवाई बुलबुले और बढ़ते एजेंट के अतिरिक्त हटाने के लिए दबाव ।
  25. एक अंधेरे कंटेनर में स्लाइड लेट और 24 घंटे की एक ंयूनतम के लिए कमरे के तापमान पर इलाज (या समय बढ़ते एजेंट का इस्तेमाल की सूचना पत्रक में संकेत) और फिर इमेजिंग के लिए आगे बढ़ना ।

7. इमेजिंग

नोट: एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप एक कैमरा से जुड़ा का पता लगाने और निर्धारित तरंग दैर्ध्य पर उत्तेजना के बाद ऊतकों द्वारा उत्सर्जित प्रतिदीप्ति पर कब्जा करने के लिए आवश्यक है. जबकि स्पष्ट, यह fluorochromes जिसका उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा उपलब्ध उपकरणों के साथ संगत कर रहे है के साथ माध्यमिक एंटीबॉडी संयुग्मित का चयन याद रखना महत्वपूर्ण है । इमेजिंग सेटिंग्स माइक्रोस्कोप और छवियों पर कब्जा करने के लिए इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर के अनुसार बदलती हैं । वहां कुछ बुनियादी नियम है कि इमेजिंग अधिवृक्क वर्गों के लिए लागू होते हैं, जैसे कि जोखिम समय, कैमरा लाभ सेटिंग्स, और प्रकाश स्रोत तीव्रता लगातार रखा जाता है सुनिश्चित करने के रूप में ।

  1. प्रकाश स्रोत और कैमरा चालू करें, निर्माता के निर्देशों के बाद इमेजिंग सॉफ़्टवेयर लॉंच ।
    नोट: इन क्रियाओं के क्रम में प्रयुक्त उपकरणों के आधार पर अलग कर सकते हैं ।
  2. मंच पर स्लाइड सुरक्षित, शटर खोलने के लिए, और माइक्रोस्कोप में देख eyepieces उपयोग परमाणु धुंधला (DAPI) चैनल और कम आवर्धन (4x) स्लाइड पर ऊतक की पहचान करने के लिए: अधिवृक्क अनुभाग छोटे हैं, और उनके दृश्य कुछ समय की आवश्यकता हो सकती है.
  3. उच्च आवर्धन (10x), फ़ोकस, और शटर बंद करने के लिए परिवर्तित करें ।
    नोट: यह अनावश्यक रूप से बचने के लिए महत्वपूर्ण है कि प्रकाश के तहत लंबे समय तक प्रदर्शनी photobleaching पैदा कर सकता है, संकेत की हानि में जिसके परिणामस्वरूप.
  4. सॉफ्टवेयर आदेश का उपयोग करना, उद्देश्य (10x) और उपयोग में चैनल (DAPI) का चयन करें, प्रदर्शन समय समायोजित (1 एस, अगर संकेत भी मजबूत है या कमजोर है समायोजित किया जा सकता है) । यदि उपलब्ध हो, लाइव इमेजिंग के लिए सेट बिन्नी (अधिग्रहण नहीं) करने के लिए ' 2 एक्स 2 ', रूपांतरण लाभ के लिए ' मध्य ', readout गति करने के लिए ' 20 मेगाहर्ट्ज '. यदि उपयोग किया गया सॉफ़्टवेयर स्केल पट्टी को इमेजिंग के अंत में प्रदर्शित नहीं करता है, तो मेनू से स्केल बार विकल्प का चयन करें और जहां वांछित पट्टी की स्थिति चुनें ।
  5. शटर खोलें, यदि आवश्यक हो तो फ़ोकस पुन: समायोजित करें, और चैनल स्विच (FITC, TRITC, DAPI) । माइक्रोस्कोप स्वचालित नहीं है, तो मंच ले जाने के बिना प्रत्येक चैनल में अधिवृक्क की एक तस्वीर लेने के लिए और उपयोग में चैनल के चयन को समायोजित करने के लिए सुनिश्चित करें. शटर को एक बार समाप्त कर बंद करें ।
    नोट: सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से उन्हें नहीं बचा है मामले में कार्यरत सेटिंग्स नीचे लिखें.
  6. चित्र सहेजें ।
    नोट: मर्ज किए गए चित्रों अक्सर माइक्रोस्कोप के सॉफ्टवेयर या अन्य ग्राफिक्स संपादक सॉफ्टवेयर संकुल का उपयोग कर बनाया जा सकता है ।
  7. खंड और/या के साथ एक उच्च आवर्धन के अंय क्षेत्रों के लिए इमेजिंग दोहराएं ।
    नोट: एक 20X आवर्धन अक्सर एक छोटे जोखिम समय (यानी, ८०० ms) की आवश्यकता है ।
  8. इमेजिंग के अंत में, उचित क्रम में बंद सभी उपकरणों ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

चित्रा 1 ऊपर वर्णित पूरे प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध का प्रतिनिधित्व करता है. अधिवृक्क ग्रंथियों चूहों से काटा जाता है, आसंन वसा ऊतक एक विदारक खुर्दबीन के नीचे हटा दिया जाता है, और अधिवृक्क तो 4% पीएफए में तय कर रहे हैं । इस कदम के बाद, अधिवृक्क संसाधित और आयल में एंबेडेड रहे हैं, और एक microtome के साथ खोदी पतली स्लाइस है कि माइक्रोस्कोप स्लाइड पर जमा कर रहे है में अंग काट दिया । वर्गों के सूखने के बाद, इम्यूनोफ्लोरेसेंस बाहर किया जाता है और वर्गों माइक्रोस्कोप पर imaged कर रहे हैं ।

आसंन वसा को हटाने (चित्रा 2ए) आगे की प्रक्रिया को सुविधाजनक बनाने और अधिवृक्क ग्रंथियों के अनुभाग के लिए महत्वपूर्ण है । आसपास के वसा ऊतक के सफल हटाने चित्रा 2बी, जहां अधिवृक्क आसानी से जासूसी की है और कोई अतिरिक्त वसा दिखाई है में दिखाया गया है । इस कदम के दौरान यह महत्वपूर्ण है, हालांकि, अधिवृक्क ग्रंथि बाहर सूखी या यह ऊतक संरचना को नुकसान पहुंचा सकता है नहीं करने के लिए । जब अधिवृक्क एक wrinkly उपस्थिति (चित्रा 2सी) मान लिया सूखापन पहचानने योग्य है । इस मुद्दे को आसानी से दूर किया जा सकता है के लिए वसा हटाने के साथ जारी रखने से पहले 1x पंजाब में अधिवृक्क rehydrat ।

इस प्रोटोकॉल के बाद प्राप्त अंतिम परिणाम चित्रा 3में प्रस्तुत किए गए हैं । इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों दो अलग आवर्धन पर एक अधिवृक्क ग्रंथि के immunostaining वर्णन । लाल परमाणु SF1 धुंधला adrenocortical कोशिकाओं लेबल, जबकि cytoplasmic हरी धुंधला मज्जा के लेबल कोशिकाओं । बाहरी कैप्सूल ब्लू (DAPI) में परमाणु दाग से लेबल है क्योंकि यह steroidogenic (SF1-नकारात्मक) नहीं है ।

Figure 1
चित्रा 1 : प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । अधिवृक्क ग्रंथियों कटाई और आसंन वसा ऊतक को हटाने के बाद, ऊतकों 4% पीएफए में तय कर रहे हैं, तेल embedding के लिए कार्रवाई की, और खोदी । वर्गों तो immunostained रहे है और एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ छवि । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : पेरि-अधिवृक्क वसा को हटाने. (एक) अधिवृक्क ग्रंथि आसपास वसा एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत हटा दिया जाता है. (ख) सफाई के बाद अधिवृक्क ग्रंथि । (ग) ऊतक सुखाने का उदाहरण है और कि जलयोजन की आवश्यकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : अधिवृक्क ग्रंथि के इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग। इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग का उदाहरण (विभिंन आवर्धन पर) अधिवृक्क प्रांतस्था (SF1, परमाणु धुंधला) और अधिवृक्क मज्जा (गु, cytoplasmic ग्रीन) के मार्करों के साथ सना हुआ एक अधिवृक्क ग्रंथि के । नाभिक (DAPI) नीले रंग में लेबल हैं । सी: कैप्सूल; सह: प्रांतस्था; मी: मज्जा. स्केल बार्स = २०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । 

अभिकर्मक स्टेशन तापमान अवधि
७०% ेतोः 1 आरटी 1 ज
९०% ेतोः 2 आरटी 1 ज
९०% ेतोः 3 आरटी 1 ज
निरपेक्ष ेतोः 4 आरटी 1 ज
निरपेक्ष ेतोः 5 आरटी 1 ज
निरपेक्ष ेतोः 6 आरटी 1 ज
निरपेक्ष ेतोः 7 आरटी 1 ज
Xylene 8 आरटी 1 ज
Xylene 9 आरटी 1 ज
Xylene 10 आरटी 1 ज
आयल वैक्स 11 ६२ ° c 1 ज
आयल वैक्स 12 ६२ ° c 1 ज
आयल वैक्स 13 ६२ ° c 1 ज

तालिका 1: ऊतक प्रोसेसर कार्यक्रम ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस प्रोटोकॉल की तैयारी और खोदी गई आयल-एंबेडेड माउस अधिवृक्क के धुंधला के साथ एक साथ माउस अधिवृक्क ग्रंथियों के अलगाव के लिए एक विधि का वर्णन है ।

अंय प्रोटोकॉल हम परीक्षण की तुलना में, इस इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल हमारी प्रयोगशाला में इस्तेमाल एंटीबॉडी के बहुमत के लिए उपयुक्त साबित कर दिया है । हालांकि, कुछ मामलों में यह धुंधला परिणाम में सुधार करने के लिए कुछ समायोजन की आवश्यकता हो सकती है । एक चर है कि आसानी से संशोधित किया जा सकता है और परीक्षण निर्धारण की लंबाई है । हमारी प्रयोगशाला में, 4% पीएफए में मशीन 1 एच से 4 एच के लिए भिन्न हो सकते हैं, जबकि अन्य प्रयोगशालाओं में निर्धारण समय 12 – 24 ज16के लिए विस्तारित है. हमारे हाथ में, तथापि, एक लंबा निर्धारण समय वृद्धि की पृष्ठभूमि शोर का नेतृत्व किया और कई नियमित रूप से हमारे अनुसंधान में इस्तेमाल एंटीबॉडी के लिए इष्टतम नहीं था ।

प्रतिजन का पीएच भी दाग की सफलता में एक भूमिका निभा सकता है़ । गर्मी प्रेरित epitope पुनर्प्राप्ति (HIER) से बाहर किया जा सकता है व्यावसायिक रूप से उपलब्ध समाधान के साथ पीएच अम्लीय से लेकर क्षारीय करने के लिए, के रूप में अच्छी तरह के रूप में अन्य घर में किए गए बफ़र्स जैसे साइट्रेट (पीएच 6), ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA, पीएच 8), Tris-EDTA (पीएच 9), Tris (पीएच 10) । एंजाइमी उपचार भी प्रतिजन बेपर्दा के लिए एक विकल्प हो सकता है । एक एंजाइम की एक उचित एकाग्रता (उदाहरण के लिए proteinase कश्मीर) युक्त एक समाधान के साथ एक सीमित समय के लिए विनिहित स्लाइडों की मशीन HIER करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका हो सकता है । यह है, तथापि, आवश्यक एंजाइम एकाग्रता अनुमापन करने के लिए और आदर्श मशीन समय निर्धारित करने के लिए, के बाद से अधिक पाचन नकारात्मक17ऊतक प्रभाव कर सकते हैं.

बफ़र को अवरोधित करने का विकल्प भी समस्या निवारण के लिए एक चर है । सामांय बकरी सीरम और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अवरुद्ध बफर के उपयोग के अलावा इस प्रोटोकॉल में उल्लेख किया (सुविधाजनक इस उदाहरण में जब माउस के ऊतकों पर प्राथमिक माउस एंटीबॉडी का उपयोग कर उच्च अंतर्जात माउस आईजीजी के कारण पृष्ठभूमि को रोकने के लिए), वहां रहे है प्रोटीन समाधान (गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) या सूखा दूध) या अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बफ़र्स जैसे अतिरिक्त विकल्प उपलब्ध हैं । यह सुनिश्चित करें कि बफ़र पदार्थ है कि धुंधला के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, जैसे कि बायोटिन के रूप में एक बायोटिन-streptavidin आधारित विधि का उपयोग करते समय शामिल नहीं है करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

अधिवृक्क ग्रंथि अक्सर लिपिड के उच्च autofluorescence के कारण immunostaining चुनौतीपूर्ण बना सकते हैं कि उच्च लिपिड सामग्री द्वारा विशेषता एक अंत: स्रावी अंग है । इसके अलावा, चूहों और चूहों से अधिवृक्क cortices intracytoplasmic lipofuscin में अमीर हैं, एक pigmented दानेदार और अमली सामग्री है कि पीले से भूरे रंग में पर्वतमाला. इस समस्या को दूर करने के लिए, सूडान काले बी (SBB) जैसे यौगिकों18lipofuscins द्वारा उत्पंन प्रतिदीप्ति बुझाने कर सकते हैं । एक और पहलू है कि एक अच्छा दाग के परिणाम समझौता रक्त कोशिकाओं की उपस्थिति है । एरिथ्रोसाइट्स में मौजूद हीमोग्लोबिन तरंग दैर्ध्य के प्रकाश को अवशोषित करता है < 600 एनएम और fluorochromes के साथ हस्तक्षेप कर सकते है कि अवधि कि तरंग दैर्ध्य19,20। जबकि छिड़काव तकनीकों को ऊतक वाहिकाओं से रक्त कोशिकाओं को साफ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, परमाणु counterstaining प्रदर्शन से पहले पीएच 5 में 10 मिमी तांबे सल्फेट का उपयोग भी अवांछित प्रतिदीप्ति को दबाने में मदद कर सकते हैं21.

इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम अधिवृक्क विच्छेदन है । अधिवृक्क ग्रंथि, जिसका स्थान सीटू मेंखोजने के लिए मुश्किल हो सकता है एक अंग है: चूहों में, ग्रंथियों छोटे हैं और उनकी स्थिति कुछ चर रहा है. विशेष रूप से पुराने जानवरों में, अधिवृक्क भी वसा ऊतक है कि ग्रंथियों और उनके फलस्वरूप अलगाव का पता लगाने के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, इस कारण यह प्रोटोकॉल के इस कदम के दौरान क्षेत्र का एक स्पष्ट दृष्टिकोण है करने के लिए महत्वपूर्ण है से घिरा हुआ है । पेरि-अधिवृक्क वसा हटाने के हटाने के एक नाजुक कदम है । जबकि कैप्सूल टूटना करने के लिए नहीं के रूप में वसा को अलग जबकि विशेष रूप से ध्यान अधिवृक्क के लिए भुगतान किया जाना चाहिए. ग्रंथि भी ऊतक नुकसान से बचने के लिए प्रक्रिया के दौरान पंजाबियों के साथ नम रखा जाना चाहिए ।

जब अनुभाग, वर्गों में अधिवृक्क ऊतक के छोटे हिस्से की उपस्थिति का पता लगाने के प्रसंस्करण कदम के बाद ऊतक hypopigmentation के कारण चुनौतीपूर्ण हो सकता है. एक खुर्दबीन मोम से ऊतक समझदार के लिए अनुभाग के दौरान बहुत उपयोगी है ।

Immunostaining पर तेल-एंबेडेड वर्गों ब्याज की immunolabeling प्रोटीन के लिए एक मूल्यवान तकनीक है, जबकि ऊतक की आकृति विज्ञान के संरक्षण । विधि यहां प्रस्तुत प्रतिदीप्ति का पता लगाने पर आधारित है और, जबकि यह विशेष रूप से कई प्राथमिक एंटीबॉडी रोजगार के अध्ययन के लिए कार्यात्मक है, प्रतिदीप्ति संकेत प्रकाश संवेदनशील है और आसानी से खो दिया जा सकता है या कमजोर अगर स्लाइड नहीं संभाला है ठीक से (यानी, लंबे समय तक प्रदर्शन माइक्रोस्कोप प्रकाश या परिवेश प्रकाश करने के लिए अनावश्यक जोखिम के लिए) । इसके अलावा, हम समय के साथ ही प्रतिदीप्ति संकेत की गुणवत्ता का एक गिरावट नोटिस कर सकते हैं । chromogenic डिटेक्शन का उपयोग करके इस समस्या से बचा जा सकता है, जो photostable है और कई वर्षों तक विज़ुअलाइज़ किया जा सकता है. इस विधि, तथापि, इस तरह के उच्च लेबलिंग परिशुद्धता और एक अध्ययन में कई प्रोटीन के साथ लेबल के रूप में प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लाभों का अभाव है ।

आयल embedding प्रक्रिया और कई ऊतक नमूनों की दुकान करने के लिए एक सुविधाजनक तरीका है । हालांकि, तेल के लिए ऊतक प्रसंस्करण ही embedding फ्लोरोसेंट पत्रकारों की इमेजिंग के लिए उपयुक्त नहीं है endogenously एक विशिष्ट रिपोर्ट को लक्षित एंटीबॉडी के उपयोग के बिना कुछ ट्रांसजेनिक पशुओं में व्यक्त की है । Cryopreservation एक विधि के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन की गिरावट से बचने और एक खुर्दबीन के नीचे इसके प्रत्यक्ष दृश्य की अनुमति है । एक अतिरिक्त एंटीबॉडी के उपयोग से बचना एक लाभ का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं । दूसरी ओर, cryopreservation भी सीमित किया जा सकता है के बाद से यह ऊतक आकृति विज्ञान को प्रभावित करता है; यह भी अनुभाग के लिए विभिंन उपकरणों की आवश्यकता है, और स्लाइड और ऊतक ब्लॉकों का भंडारण केवल फ्रीजर में संभव है ।

इमेजिंग की एक बड़ी सीमा एक खोदी ऊतक उच्च स्थानिक संकल्प पर संरचनात्मक घटकों की छवियों को प्राप्त करने की क्षमता है । ऊतक संरचना, वास्तव में, इमेजिंग की गुणवत्ता के निर्धारण में एक प्रमुख चर के बाद से यह प्रकाश पैठ को प्रभावित करता है और गरीब संकल्प के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । अधिवृक्क ग्रंथि एक ऊतक लिपिड में अमीर है कि प्रकाश बिखरने22कारण है । मस्तिष्क में, जो भी एक उच्च लिपिड सामग्री है, जैसे स्पष्टता, BABB, iDISCO के रूप में ऊतक समाशोधन तकनीक, और 3DISCO ऊतक दृश्य में सुधार करने के लिए विकसित किया गया है, बेहतर इमेजिंग और 3 डी ऊतक पुनर्निर्माण23के लिए अनुमति देता है । इन तकनीकों शोधकर्ताओं उच्च गुणवत्ता इमेजिंग डेटा प्रदान कर रहे हैं, और ऊतकों की एक विभिंन रेंज के लिए अनुकूलित किया जा रहा है, और, भविष्य में, हम अधिवृक्क इमेजिंग के लिए इन तरीकों के रूप में अच्छी तरह से रोजगार की उंमीद है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम इस प्रोटोकॉल की स्थापना में अपने उपयोगी सुझावों और तकनीकी सहायता के लिए डॉ मोहम्द जुबैर का शुक्रिया अदा करते हैं । इस काम को राष्ट्रीय मधुमेह और पाचन और गुर्दे के रोगों के संस्थान, स्वास्थ्य अनुसंधान अनुदान 2R01 के राष्ट्रीय संस्थानों-DK062027 (जी. डी. एच.) द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-well cell culture plate Nest Biotechnology Co. 0412B
Disposable needles 25 G x 5/8" Exel International 26403
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich  P6148
Paraplast plus  McCormik scientific 39502004 Paraffin for tissue embedding
Shandon biopsy cassettes II with attached lid Thermo scientific 1001097 Cassettes for tissue processing
High Profile Microtome Blades Accu-Edge 4685 Disposable stainless steel blades
Peel-a-way disposable plastic tissue embedding molds Polysciences Inc. 18986 Truncated, 22 mm square top tapered to 12 mm bottom
Superfrost Plus Microscope Slides Fisherbrand 12-550-15 75 mm x 25 mm x 1 mm
Xylene Fisher Chemical X5P1GAL 
200 Proof Ethanol Decon Labs, Inc.
Certi-Pad Gauze pads  Certified Safety Mfg, Inc 231-210 3" x 3. Sterile latex free gauze pads
M.O.M kit  Vector laboratories BMK-2202 For detecting mouse primary antibodies on mouse tissue
KimWipes Kimtech 34155 Wipes 4.4 inch x 8.4 inch
Super PAP PEN Invitrogen  00-8899 Pen to draw on slides
Microscope cover glass  Fisherbrand 12-544-D Size: 22 x 50 x 1.5
DAPI Sigma D9542  (Prepared in 20 mg/mL stock)
ProLong Gold antifade reagent Molecular Probes P36930 Mounting agent for immunofluorescence
X-cite series 120Q Lumen Dynamics Light source
Coolsnap Myo Photometrics Camera
Optiphot-2  Nikon Microscope
microtome American Optical
Tissue embedder Leica EG1150 H 
Tissue processor  Leica ASP300S
Normal goat serum Sigma G9023
Mouse anti-TH Millipore MAB318 Primary antibody
Rabbit anti-SF1 Ab proteintech group (PTGlabs)  custom made Primary antibody
Alexa-488 Mouse IgG  raised goat Jackson ImmunoResearch 115-545-003  Secondary antibody
Dylight-549 Rabbit IgG raised goat Jackson ImmunoResearch 111-505-003 Secondary antibody
Citrate acid anhydrous Fisher Chemical A940-500
NIS-Elements Basic Research  Nikon Software for imaging

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brandtzaeg, P. The increasing power of immunohistochemistry and immunocytochemistry. Journal of Immunological Methods. 216 (1-2), 49-67 (1998).
  2. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).
  3. Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
  4. Lerario, A. M., Finco, I., LaPensee, C., Hammer, G. D. Molecular Mechanisms of Stem/ Progenitor Cell Maintenance in the Adrenal Cortex. Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).
  5. Yates, R., et al. Adrenocortical Development, Maintenance, and Disease. Endocrine Gland Development and Disease. 106, 239-312 (2013).
  6. Jones, I. C. Variation in the Mouse Adrenal Cortex with Special Reference to the Zona Reticularis and to Brown Degeneration, Together with a Discussion of the Cell Migration Theory. Quarterly Journal of Microscopical Science. 89 (1), 53 (1948).
  7. Sucheston, M. E. C., Samuel, M. The Transient-Zone in the Human and Mouse Adrenal Gland. The Ohio Journal of Science. 72, n2 (March, 1972) 120-126 (1972).
  8. Guasti, L., Paul, A., Laufer, E., King, P. Localization of Sonic hedgehog secreting and receiving cells in the developing and adult rat adrenal cortex. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 117-122 (2011).
  9. Pihlajoki, M., Dorner, J., Cochran, R. S., Heikinheimo, M., Wilson, D. B. Adrenocortical zonation, renewal, and remodeling. Frontiers in Endocrinology. 6, 27 (2015).
  10. Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid Droplets Finally Get a Little R-E-S-P-E-C-T. Cell. 139 (5), 855-860 (2009).
  11. Shen, W. J., Azhar, S., Kraemer, F. B. Lipid droplets and steroidogenic cells. Experimental Cell Research. 340 (2), 209-214 (2016).
  12. Finco, I., LaPensee, C. R., Krill, K. T., Hammer, G. D. Hedgehog signaling and steroidogenesis. Annual Review of Physiology. 77, 105-129 (2015).
  13. Paul, A., Laufer, E. Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).
  14. Lowe, J., Anderson, P. Stevens & Lowe's Human Histology, 4th Edition. , Elsevier/Mosby. 263-285 (2015).
  15. Nagatsu, T. Genes for human catecholamine-synthesizing enzymes. Neuroscience Research. 12 (2), 315-345 (1991).
  16. Berthon, A., et al. Age-dependent effects of Armc5 haploinsufficiency on adrenocortical function. Human Molecular Geneticst. 26 (18), 3495-3507 (2017).
  17. Brown, C. Antigen retrieval methods for immunohistochemistry. Toxicologic Pathology. 26 (6), 830-831 (1998).
  18. Billinton, N., Knight, A. W. Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).
  19. Hirsch, R. E., San George, R. C., Nagel, R. L. Intrinsic fluorometric determination of the stable state of aggregation in hemoglobins. Analytical Biochemistry. 149 (2), 415-420 (1985).
  20. Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of Red Blood Cell Autofluorescence for Immunocytochemistry on Fixed Embryonic Mouse Tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 28 (2017).
  21. Watson, J. Suppressing autofluorescence of erythrocytes. Biotechnic & Histochemistry. 86 (3), 207 (2011).
  22. Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
  23. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).

Tags

इम्यूनोलॉजी और संक्रमण मुद्दा १४० अधिवृक्क ग्रंथि इम्यूनोफ्लोरेसेंस माउस के ऊतकों निर्धारण आयल खोदी
अलगाव, निर्धारण, और माउस अधिवृक्क ग्रंथियों के इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Finco, I., Hammer, G. D. Isolation,… More

Finco, I., Hammer, G. D. Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands. J. Vis. Exp. (140), e58530, doi:10.3791/58530 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter