Summary
Aquí presentamos un método para aislar las glándulas suprarrenales de los ratones, reparar los tejidos, les sección y realizar tinción de inmunofluorescencia.
Abstract
La inmunofluorescencia es una técnica bien establecida para la detección de antígenos en los tejidos con el empleo de anticuerpos conjugados con fluorocromo y tiene un amplio espectro de aplicaciones. Detección de antígenos permite la caracterización y la identificación de múltiples tipos de células. Situado por encima de los riñones y encapsulado por una capa de células mesenquimales, la glándula suprarrenal es un órgano endocrino, compuesto por dos tejidos diferentes con diferente origen embriológico, la corteza externa de derivados del mesodermo intermediaria mesonephric y los nervios médula interna derivados de la cresta. La corteza suprarrenal segrega esteroides (es decir, mineralocorticoides, glucocorticoides, hormonas sexuales), mientras que la médula suprarrenal produce las catecolaminas (es decir, adrenalina, noradrenalina). Mientras realiza la investigación suprarrenal, es importante poder distinguir células únicas con diferentes funciones. Aquí proporcionamos un protocolo desarrollado en nuestro laboratorio que describe una serie de pasos secuenciales necesarios para obtención de tinción de inmunofluorescencia para caracterizar los tipos celulares de la glándula suprarrenal. Nos centramos primero en la disección de las glándulas suprarrenales de ratón, la eliminación microscópica del periadrenal grasa seguida de la fijación, la transformación y la inclusión en parafina de los tejidos. A continuación describimos de seccionamiento de los bloques de tejido con un micrótomo rotatorio. Por último, detallamos un protocolo para la tinción inmunofluorescente de las glándulas suprarrenales que hemos desarrollado para minimizar la Unión inespecífica del anticuerpo y autofluorescencia para obtener una señal óptima.
Introduction
Inmunohistoquímica es una técnica para la detección de componentes del tejido con el uso de anticuerpos contra moléculas celulares específicas y posteriores técnicas de tinción para detectar los anticuerpos conjugados1. Este procedimiento de inmunohistoquímica requiere fijación específica y procesamiento de los tejidos que están determinados a menudo empírico para el antígeno específico, tejidos y anticuerpos utilizados2. La fijación es crucial para preservar el estado "original" de los tejidos y manteniendo así intacta celular y estructuras subcelulares y patrones de expresión. Se necesitan adicionales de procesamiento y procedimientos de inclusión para preparar el tejido seccionado en rebanadas que se usan para estudios histológicos con inmunohistoquímica.
Inmunotinción puede realizarse con detección chromogenic o fluorescente. Detección cromógena requiere la utilización de una enzima para convertir un sustrato soluble en un producto coloreado insoluble. Mientras que esta enzima puede ser conjugada con el anticuerpo reconoce al antígeno (anticuerpo primario), más a menudo es conjugado con el anticuerpo que reconoce el anticuerpo primario (es decir, el anticuerpo secundario). Esta técnica es muy sensible; el producto coloreado que resultan de la reacción enzimática es Fotoestables y requiere sólo un microscopio de campo luminoso para la proyección de imagen. Sin embargo, immunostaining cromogénico puede no ser conveniente cuando se intenta visualizar dos proteínas que co localización, ya que la deposición de un solo color puede enmascarar la deposición de la otra. En el caso de coloración Co, inmunofluorescencia ha demostrado para ser más ventajosos. El advenimiento de la inmunofluorescencia se atribuye a Albert Coons y colegas, que desarrolló un sistema para identificar antígenos de tejidos con anticuerpos marcados con fluoresceína y visualizarlas en los tejidos seccionados bajo luz ultravioleta3. Detección de fluorescencia se basa en un anticuerpo conjugado con un fluoróforo que emite luz después de la excitación. Porque hay varios fluoróforos con emisiones en diferentes longitudes de onda (con poca o ninguna superposición), este método de detección es ideal para los estudios de múltiples proteínas.
La glándula suprarrenal es un órgano vinculado situado encima del riñón y caracterizado por dos componentes embriológicamente distintos rodeados por una cápsula mesenquimal. La corteza suprarrenal externa, derivada del mesodermo intermedio mesonephric, secretan hormonas esteroides mientras que la médula interna, derivada de la cresta neural, produce catecolaminas como adrenalina, noradrenalina y dopamina. La corteza suprarrenal se divide histológicamente y funcionalmente en tres zonas concéntricas, con cada zona secretoras de diferentes clases de hormonas esteroides: el exterior de la zona glomerular (zG) produce mineralocorticoides que regulan la homeostasis de electrolitos y volumen intravascular; la media de la zona fasciculada (zF), directamente debajo de la zG, segrega glucocorticoides que median la respuesta de estrés a través de la movilización de los almacenes de la energía para aumentar la glucosa en plasma; y la zona interna reticular (zR), que sintetiza precursores de esteroides (es decir, dehidroepiandrosterona (DHEAS))4.
Alguna variación en la zonación adrenocortical está presente entre las especies: por ejemplo, Mus musculus carece de la zR. La única zona X postnatal del M. musculus es un remanente de la corteza fetal caracterizado por pequeñas células pobres en lípidos con citoplasmas acidófilos5. La zona X desaparece en la pubertad en ratones machos y después del primer embarazo en ratones femeninos o degenera gradualmente en las hembras no crían6,7. Por otra parte, la tortuosidad y el espesor de los objetos expuestos de zG marcan variación entre las especies como la organización de las células madre y progenitoras periféricas en y adyacente a la zG. La rata, a diferencia de otros roedores, dispone de una zona indiferenciada visible (zU) entre la zG y zF que funciona como una zona de la célula de vástago o una zona de transitorios amplificando progenitores. El zU es único a las ratas o simplemente más prominente organizan grupo de células es desconocido8,9.
Las células de la corteza suprarrenal contienen gotitas de lípidos que almacenan los ésteres de colesterol que servir como el precursor de todas las hormonas esteroides10,11. El término "steroidogenesis" define el proceso de producción de las hormonas esteroides de colesterol a través de una serie de reacciones enzimáticas que involucran la actividad del factor steroidogenic 1 (SF1), cuya expresión es un marcador de potencial steroidogenic. En la glándula suprarrenal, Sf1 expresión sólo está presente en las células de la corteza12. Un interesante estudio encuentra la expresión de la biotina endógena en las células adrenocorticales con potencial steroidogenic13. Mientras que esto puede ser la causa de una mayor experiencia en métodos de tinción basada en biotina/estreptavidina, debido a la detección de la biotina endógena por el anticuerpo conjugado con estreptavidina, esta característica podría emplearse también para distinguir el steroidogenic células de otras poblaciones dentro de la glándula suprarrenal, es decir, endoteliales, capsular y las células de la médula.
Inervado por neuronas simpáticas preganglionares, la médula suprarrenal se caracteriza por células basófilas con un citoplasma granular que contiene epinefrina y norepinefrina. Las células de la médula se denominan "cromafines" debido al alto contenido de catecolaminas que forma un pigmento marrón después de oxidación14. Tirosina hidroxilasa (TH) es la enzima que cataliza el paso tarifa-limitador en la síntesis de catecolaminas y en la glándula suprarrenal, se expresa solamente en la médula15.
Aquí presentamos un protocolo para el aislamiento de las glándulas suprarrenales de ratón, su proceso de inclusión en parafina de seccionamiento y un método para realizar la inmunofluorescencia que manchaba en suprarrenales secciones con el fin de identificar los tipos celulares que constituyen el corteza suprarrenal y la médula. Este protocolo es un estándar en nuestro laboratorio para la inmunotinción con anticuerpos múltiples rutinariamente utilizados en nuestra investigación.
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Protocol
Todos los métodos fueron realizados según protocolos aprobados institucionalmente bajo el auspicio de la Comisión de la Universidad sobre el uso y cuidado de animales en la Universidad de Michigan.
1. preparación para la cirugía
- El día antes de la cirugía, preparar 4% paraformaldehido (PFA) / fosfato tampón salino (PBS). En el caso de alícuotas congeladas, proceder a descongelar uno y almacenar a 4 ° C.
Nota: 4% PFA no es estable por más de 48 h.
PRECAUCIÓN: PFA es tóxico, Evite contacto con piel y ojos y desechar en un contenedor apropiado. - En el día de la cirugía, preparar los instrumentos quirúrgicos de esterilizar las tijeras y pinzas con 70% de etanol (EtOH) y deje secar sobre una toalla de papel.
- Lugar una placa de 24 pocillos con PBS 1 x (1 mL/pocillo es suficiente) en un cubo de hielo.
Nota: Las glándulas suprarrenales se mantendrán en este plato de cultura múltiples bien después de la cirugía.
2. suprarrenal disección
- Eutanasia el ratón siguiendo protocolos estándar aprobados por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC). Se requiere un método secundario de la eutanasia para asegurar la muerte (por ejemplo decapitación).
- Eutanasia por sobredosis de isoflurano, coloque el ratón en una cámara llena de vapores de isoflurano hasta que cesa la respiración, a continuación, quite el ratón de la cámara, coloque sobre una superficie y realizar la dislocación cervical.
Nota: La mayoría métodos de eutanasia causan señal de socorro para el animal y no son adecuados para los estudios de estrés porque puede añadir la variable de confusión de la activación del eje hipófisis-suprarrenal y liberación medular de catecolaminas. En este caso, la decapitación es la técnica sugerida para adoptar.
- Eutanasia por sobredosis de isoflurano, coloque el ratón en una cámara llena de vapores de isoflurano hasta que cesa la respiración, a continuación, quite el ratón de la cámara, coloque sobre una superficie y realizar la dislocación cervical.
- Coloque el ratón supino, esterilizar el área de la incisión en el abdomen y los flancos con el 70% EtOH.
Nota: Mientras que afeitar la piel aumentará la esterilidad, para esta aplicación en particular no es necesario. - Cortar la piel en el abdomen usando tijeras, separar la piel de peritoneo, deskin el ratón pellizcando la piel alrededor de la corte y tirando en direcciones opuestas dos (caudal y rostral). Luego se corta el peritoneo hasta llegar a los flancos derecho e izquierdos posteriores.
- Eliminar el corte de glándula suprarrenal murino alrededor del tejido adiposo circundante y colocarlo en la placa multiwell 24 lleno de 1 x PBS y mantenido en hielo.
3. Peri-suprarrenales eliminación de grasa
- Con un microscopio de disección, coloque las suprarrenales en un vaso de base o un plato de Petri en la placa de la platina, coloque la fuente de luz, seleccione la ampliación y ajuste el enfoque para obtener una visión clara de la suprarrenal todo.
Nota: El aumento utilizado puede variar dependiendo de preferencias personales. Un aumento total de 30 X con un lente de plan 1 X, zoom 3 X y ocular 10 X permite visualizar la glándula entera con un buen campo de visión. - Quite rápidamente el tejido graso adyacente con dos agujas de 25 G, evitando la deshidratación de la suprarrenal. Si esto sucede antes de que se quita toda la grasa, mover el suprarrenal detrás en el pozo que contiene 1 x PBS para 1-2 min y luego continuar con el proceso de eliminación de grasa.
- Lavar 2 x por 2 min en PBS 1 x.
4. tejido procesamiento e incrustación
- Fijar los tejidos en el 4% PFA/PBS a 4 ° C en una plataforma oscilante de 2 h.
- Quitar los 4% PFA y lavar los tejidos con PBS 1 x, 3 x 15 min a 4 ° C.
PRECAUCIÓN: PFA es tóxico y es un desperdicio peligroso; debe ser manejado con precaución bajo una campana química y desechar en un recipiente de residuos peligrosos. - Incubar las glándulas suprarrenales en el 50% EtOH a 4 ° C en una plataforma oscilante de 2 h.
- Incubar las glándulas suprarrenales en el 70% EtOH a 4 ° C en una plataforma oscilante para un mínimo de 2 h.
Nota: Si no proceder con el procesamiento para inclusión de tejidos, las glándulas suprarrenales pueden almacenarse en el 70% EtOH a 4 ° C. Evitar el almacenamiento a largo plazo en el 70% EtOH y proceder a tejido procesado tan pronto como sea posible da muestras de mejor calidad. - Preparar el suprarrenal para proceso envolviendo en Gasa y encerrando en un cassette para inclusión tisular del tejido. Coloque el cartucho en una jarra llenada con 70% EtOH y almacenar a 4 ° C hasta que esté listo para pasar al procesador de tejido. Inserte el casete en el procesador de tejido programado como registrados en la tabla 1 y ejecutar el programa.
- Transferir el casete en una estación de inclusión con parafina fundida a 65 ° C. Si no hay una estación de enfriamiento, coloque una bandeja de refrigeración frío junto a él.
- Un molde de inclusión de la etiqueta y abrir el cassette para inclusión tisular. Usando un par de pinzas, desenvolver la gasa y el suprarrenal suavemente en la posición deseada en el centro de la base en el molde de incrustación. Vierte la parafina derretida en el suprarrenal. Si es necesario, sostenga el suprarrenal con pinzas para asegurar su posición en el molde de lo contrario puede moverse dentro del molde.
- Suavemente mueva el molde de incrustación a la bandeja de refrigeración y esperar a que el endurecimiento de la parafina. Después de eso, para facilitar el seccionar, almacenar moldes de inclusión en un lugar fresco.
5. seccionar con un micrótomo rotatorio
- Verifique que el micrótomo esté limpio antes de comenzar, elimine todos los residuos de parafina desechados, asegurar que se afila el cuchillo (o lámina), el mecanismo interno del aceite y alimenten el soporte del bloque si es necesario.
- Etiqueta una serie de portaobjetos de microscopio (positivamente cargado o cubierto para evitar la pérdida de tejido (véase Tabla de materiales)), los ponen en un conjunto de calentador de portaobjetos a 37 ° C y dispensar agua ultrapura tipo autoclave 1 sobre cada diapositiva.
- Espesor de la sección set 5 μm.
- Inserte la cuchilla de micrótomo en sujetador de la cuchilla, el ángulo de la hoja de control, asegúrese de que la cuchilla está bien fijada en el soporte y Compruebe la holgura del soporte del bloque y bloque de parafina.
- Llevar el soporte del bloque a su posición más alta y, si es posible, bloquear la palanca de funcionamiento, retire el bloque de parafina en el molde y colóquelo en el soporte del bloque fijándolo firmemente con la pinza. El ángulo de la línea central de la hoja con la superficie del frente del bloque debe ser unos 20°. Si es necesario, vuelva a ajustar el bloque de parafina.
PRECAUCIÓN: La cuchilla es filosa. - Si previamente bloqueado, desbloquear el volante y baje el bloque de parafina hasta que su cara esté nivelada con el borde de la cuchilla de micrótomo. Gire la rueda de mano con un ritmo constante. Realizar el ajuste inicial para retirar la parafina y exponer el suprarrenal.
- Mantener girando la rueda de mano y la sección hasta el final del suprarrenal. Usar un microscopio de campo luminoso o disección para verificar la presencia de tejido en las secciones. Retire la cinta de la hoja y con la ayuda de otro par de pinzas para colocarlo en el agua sobre el portaobjetos de cristal. Puede ser útil para colocar la cinta sobre una superficie, estirar cuidadosamente y luego montarlo en la diapositiva.
- Deje que las diapositivas se seque en la placa. Luego los ponen en una bandeja deslizante y hornee a 37 ° C durante la noche o más si el agua está todavía presente. Una vez secas, guardar las diapositivas en una caja de diapositivas en temperatura ambiente.
- Guarde todo el equipo usado y limpie el microtomo.
6. inmunofluorescencia
- Seleccionar diapositivas de inmunotinción y colocarlos en un soporte de diapositivas.
- En una placa caliente, traer un vaso de precipitados llenado de citrato de 0.01 M a pH 2.0 a hervir. El volumen del buffer depende del tamaño del vaso y debe ser suficiente para cubrir las secciones de las diapositivas durante la ebullición (algunos evaporación debe tenerse en cuenta). Cubrir el vaso con papel de aluminio.
Nota: Otros métodos para la recuperación de antígeno están disponible (ver discusión). - Desparafinizar el portaobjetos en xileno 100% 2 x durante 5 minutos. Rehidratar las diapositivas utilizando la siguiente serie: 100% EtOH 2 x durante 5 minutos, 70% EtOH 2 x durante 5 minutos, tipo 1 agua ultrapura durante 5 minutos.
Nota: Después de parafina, es importante no dejar que seque las secciones: las secciones de tejido deben cubrirse siempre con amortiguadores o soluciones hasta el final del procedimiento o puede dañarse la estructura del tejido. - Para la recuperación de antígeno, coloque los portaobjetos en un sostenedor de la diapositiva del metal e introdúzcalo en el vaso con hervir citrato sin el papel de aluminio. Dejar hervir durante 10 minutos.
- Retire el vaso de la placa y dejar enfriar para 20 minutos Asegúrese de que las secciones suprarrenales están todavía cubiertas con el buffer.
- Prepare la solución de bloqueo. Si utilizando la tinción comercialmente disponible kit empleadas para el Representante de resultados (véase la Tabla de materiales), en un tubo añadir 1,25 mL de PBS 1 x, 1 gota (equivalente a unos 45 μL) de reactivo de bloqueo de Ig de ratón y el 5% de suero normal de cabra. Almacenar la solución de bloqueo a 4 ° C o en hielo durante el trabajo.
Nota: El suero utilizado depende de la especie del anticuerpo secundario. Aquí se han utilizado anticuerpos secundarios en cabra. Para otros anticuerpos, las concentraciones séricas diferentes pueden ser necesarias. Empíricamente para determinar la concentración correcta prueba varias concentraciones. - Transfiera los portaobjetos a un frasco de Coplin conteniendo PBS 1 x y lavado 3 x 10 min cada uno en un eje de balancín con suave balanceo.
- Preparar una cámara humidificada para tinción.
- Sacuda suavemente el PBS de una diapositiva; Limpie la parte inferior de la diapositiva con un trapo sin pelusa para quitar el exceso PBS.
- Utilizando un marcador especial para diapositivas con propiedades hidrofóbicas, dibuje un círculo alrededor de cada sección suprarrenal, asegurándose de que la superficie esté seca para evitar la propagación de la solución de tinta a la sección. Si es necesario, cuidadosamente seque la superficie. Colocar el portaobjetos en la cámara humidificada.
- Rápidamente, pipetee 50 μl (o suficiente para cubrir las secciones) de bloquear la solución sobre cada sección. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente.
Nota: Bloqueo de volumen de solución necesario puede variar; es importante que las secciones están bien cubiertas con la solución. - Preparar la solución diluyente del kit disponible comercialmente con 7,5 mL de PBS 1 x, 600 μl de proteína concentrado acción solución y 5% de suero normal de cabra (o cualquier otro suero y concentración en la solución de bloqueo). Almacenar la solución diluyente a 4 ° C o en hielo durante el trabajo.
- Preparar las soluciones de anticuerpo primario dilución de los anticuerpos primarios en las concentraciones apropiadas de la solución diluyente. Para la tinción de Co, añadir una alícuota de cada anticuerpo en un nuevo tubo y mezcle suavemente. Coloque los anticuerpos y anticuerpos soluciones en hielo hasta que esté listo para usar.
Nota: Aquí empleamos anticuerpo anti-SF1 en conejo y un anticuerpo anti-TH en ratón. Para el anticuerpo de preparar soluciones de trabajo siguen como se indica.- Para la solución de trabajo de SF1, en un tubo, añadir 1 μl de anticuerpo anti-SF1 a 999 μl de la solución diluyente (concentración final de 1.5 μg/mL). Para la solución de trabajo de TH, en un tubo, añadir anticuerpo de anti-TH de 1 μL en 499 μl de la solución diluyente (concentración final estimado de 2 a 6 μg/mL).
- Para SF1 + TH mezcla de trabajo de anticuerpo, en un nuevo tubo, pipetear 250 μl de solución de trabajo de SF1 y 250 μl de solución de trabajo de TH. Mezclar suavemente por pipeteo. Almacenar en hielo.
- Transferir las diapositivas en una jarra de Coplin conteniendo 1 x PBS y 3 x 5 min en un eje de balancín con suave balanceo.
- Coloque el portaobjetos de vuelta en la cámara de vapor después de limpiar el exceso de PBS, pipeta el SF1 + mezcla de trabajo de anticuerpo (u otra solución de anticuerpo primario) en cada sección, cerrar la cámara humidificada y dejarlo toda la noche a 4 ° C.
- Al día siguiente, mueva las diapositivas en un Coplin jar que contiene 1 x PBS y lavan 3 x 15 min en un eje de balancín con suave balanceo.
- Mientras lavar los portaobjetos, preparar la solución de anticuerpo secundario en la solución diluyente utilizar la concentración adecuada. Si se realiza tinción de Co, añadir igual cantidad de cada solución de anticuerpo secundario en un tubo nuevo. Mezclar suavemente por pipeteo. Almacenar en hielo. Proteger los tubos de la luz y almacenar en hielo hasta que esté listo para usar.
Nota: Aquí, los anticuerpos secundarios utilizados son 488 nm fluorescente tinte etiquetado anti-ratón planteado en cabra y 549 fluorescente tinte etiquetado anti-conejo en cabra. La solución de anticuerpo secundario se preparó agregando 0,5 μl de cada anticuerpo secundario en 799 μl de la solución diluyente (concentración final de 1,2 μg/mL). - Vuelva a colocar las diapositivas en la cámara de vapor después de quitar el exceso de PBS, rápidamente pipetear la solución de anticuerpo secundario en las secciones de suprarrenales, cerrar la cámara humidificada y proteger de la luz. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente.
- Lave los portaobjetos en una jarra de Coplin con 1 x PBS y lavar 3 x 15 min en un eje de balancín con un balanceo suave, asegurándose de proteger de la luz.
- Preparar a los 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) solución para tinción nuclear: 1 μl de DAPI (20 mg/mL) en 1 mL de PBS 1 x.
Nota: Contratinción nuclear azul fluorescente puede también lograrse utilizando colorante Hoechst. - Pipetear la solución de DAPI sobre las secciones suprarrenales, cubierta de la luz e incubar a temperatura ambiente durante 7 minutos.
- Lavar los portaobjetos en una jarra de Coplin con 1 x PBS y lavar 3 veces durante 5 minutos en un eje de balancín con suave balanceo mientras que proteger el portaobjetos de la luz.
- En un área protegido de la luz directa, colocar un cubierta de vidrio y pipeta 60 μL o unas 3 gotas de agente de montaje adecuado para inmunofluorescencia a lo largo de la superficie de la cubierta de vidrio.
- Limpie suavemente la parte posterior de una diapositiva con una toallita libre de pelusas, posición de la diapositiva hacia abajo hacia el vidrio de cubierta y paralelo a él, por lo que las secciones de tejido enfrentan el vidrio de la cubierta con el agente de montaje. Ligeramente que conducirlo en el cristal de la tapa y asegúrese de que no está atrapada ninguna burbuja de aire entre la diapositiva y el vidrio de la cubierta.
- Si es necesario, aplique más presión para eliminar las burbujas de aire y el exceso de medio de montaje.
- Colocar el portaobjetos en un recipiente oscuro y cura a temperatura ambiente durante un mínimo de 24 h (o el tiempo indicado en la hoja de información del agente de montaje utilizado) y luego proceder a la proyección de imagen.
7. la proyección de imagen
Nota: Un microscopio de fluorescencia conectado a una cámara es necesario para la detección y captura de la fluorescencia emitida por los tejidos después de la excitación en determinadas longitudes de onda. Aunque obvio, es importante recordar que elegir el secundario anticuerpos conjugan con fluorocromos cuya excitación y espectros de emisión son compatibles con el equipo disponible. Proyección de imagen de configuración varía según el microscopio y el software utilizado para capturar imágenes. Hay algunas reglas básicas que se aplican para la proyección de imagen suprarrenales secciones, como asegurándose de que el tiempo de exposición, cámara gana ajustes e intensidad fuente de luz se mantiene constante.
- Encienda la fuente de luz y la cámara, iniciar el software de imágenes siguiendo las instrucciones del fabricante.
Nota: El orden de estas acciones puede diferir dependiendo del equipo utilizado. - Garantizar la diapositiva en el escenario, abra el obturador, y mirando por los oculares del microscopio uso canal de (DAPI) tinción nuclear y ampliación baja (4 X) para identificar el tejido en la diapositiva: secciones suprarrenales son pequeñas y su visualización puede requerir algún tiempo.
- Cambiar a un mayor aumento (10 X), enfoque y cerrar el obturador.
Nota: Es importante evitar innecesariamente larga exposición a la luz que puede causar el fotoblanqueo, resultando en pérdida de señal. - Utilizando los comandos del software, seleccionar el objetivo (10 X) y el canal en uso (DAPI), ajustar el tiempo de exposición (1 s, se puede ajustar si la señal es demasiado fuerte o débil). Si está disponible, establezca binning para la proyección de imagen viva (no adquisición) a '2 X 2', conversión de ganancia a media, velocidad de lectura a 20 MHz'. Si el software utilizado no aparece la barra de escala al final de la proyección de imagen, seleccione la opción de barra de escala en el menú y la barra de la posición donde desee.
- Abra el obturador, vuelva a ajustar el foco si es necesario y cambie los canales (FITC, TRITC, DAPI). Si el microscopio no es automatizado, tomar una foto de la suprarrenal en cada canal sin necesidad de mover el escenario y asegúrese de ajustar la selección del canal en uso. Cierre el obturador una vez terminada.
Nota: Anote los ajustes empleados en caso de que el software no guarda automáticamente les. - Guardar las imágenes.
Nota: Cuadros combinados pueden a menudo crear usando software del microscopio u otros paquetes de software de editor de gráficos. - Repetir la proyección de imagen de otras áreas de la sección o con un aumento mayor.
Nota: Un aumento de X 20 a menudo requiere un menor tiempo de exposición (es decir, ms de 800). - Al final de la proyección de imagen, apague todos los equipos en el orden adecuado.
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Representative Results
La figura 1 representa un esquema del protocolo completo descrito anteriormente. Las glándulas suprarrenales son extraídas de ratones, tejido adiposo adyacente se quita con un microscopio de disección y el suprarrenal entonces se fijan en el 4% PFA. Después de este paso, las glándulas suprarrenales son procesadas embebidas en parafina y seccionadas con un micrótomo para cortar el órgano en rodajas finas que se depositan sobre los portaobjetos de microscopio. Después del secado de las secciones, inmunofluorescencia se lleva a cabo y las secciones son imágenes en el microscopio.
La eliminación de la grasa adyacente (figura 2A) es importante para facilitar la mayor transformación y seccionamiento de las glándulas suprarrenales. Eliminación exitosa del tejido adiposo circundante se muestra en la figura 2B, donde es fácilmente detectable el suprarrenal y la grasa no es visible. Durante este paso es fundamental, sin embargo, para no dejar que la glándula suprarrenal seque o esto podría dañar la estructura del tejido. Sequedad es reconocible cuando el suprarrenal asume un aspecto arrugado (figura 2C). Este problema se puede superar fácilmente por rehidratación del suprarrenal en 1 x PBS antes de continuar con la eliminación de grasa.
Los resultados finales obtienen siguiendo este protocolo se presentan en la figura 3. Las imágenes de inmunofluorescencia muestran inmunotinción de una glándula suprarrenal en dos diferentes aumentos. La coloración nuclear rojo SF1 etiquetas las células adrenocorticales, mientras que la tinción citoplasmática verde etiquetas de células de la médula. La cápsula externa es marcada por tinción nuclear en azul (DAPI) ya que no es steroidogenic (SF1-negativo).
Figura 1 : Representación esquemática del protocolo. Después de la cosecha de las glándulas suprarrenales y eliminar el tejido adiposo adyacente, los tejidos se fijan en el 4% PFA, procesaron para inclusión en parafina y seccionado. Las secciones son entonces immunostained y fotografiada con un microscopio de fluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Eliminación de la grasa peri-suprarrenal. (A) la grasa que rodea que la glándula suprarrenal se extrae bajo un microscopio de disección. (B) las glándulas suprarrenales después de la limpieza. (C) ejemplo de secado del tejido y requiere hidratación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Imágenes de inmunofluorescencia de la glándula suprarrenal. Ejemplo de proyección de imagen de inmunofluorescencia (en diferentes aumentos) de una glándula suprarrenal manchado con los marcadores de la corteza suprarrenal (SF1, tinción nuclear) y de la médula suprarrenal (TH, verde citoplasmática). Núcleos (DAPI) están marcados en azul. C: cápsula; CO: corteza; m: médula. Barras de escala = 200 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Reactivo de | Estación de | Temperatura | Duración |
| 70% EtOH | 1 | RT | 1 h |
| 90% EtOH | 2 | RT | 1 h |
| 90% EtOH | 3 | RT | 1 h |
| EtOH absoluto | 4 | RT | 1 h |
| EtOH absoluto | 5 | RT | 1 h |
| EtOH absoluto | 6 | RT | 1 h |
| EtOH absoluto | 7 | RT | 1 h |
| Xileno | 8 | RT | 1 h |
| Xileno | 9 | RT | 1 h |
| Xileno | 10 | RT | 1 h |
| Cera de parafina | 11 | 62 ° C | 1 h |
| Cera de parafina | 12 | 62 ° C | 1 h |
| Cera de parafina | 13 | 62 ° C | 1 h |
Tabla 1: Programa de procesador de tejido.
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Discussion
Este protocolo describe un método para el aislamiento de las glándulas suprarrenales de ratón junto con la preparación y tinción de las glándulas suprarrenales seccionado ratón embebido en parafina.
Comparado con otros protocolos que hemos probado, este protocolo de la inmunofluorescencia ha sido conveniente para la mayoría de los anticuerpos utilizados en nuestro laboratorio. Sin embargo, en algunos casos puede requerir algunos ajustes para mejorar los resultados de la tinción. Una variable que puede ser fácilmente modificada y probada es la longitud de la fijación. En nuestro laboratorio, la incubación en el 4% PFA puede variar de 1 h a 4 h, mientras que en otros laboratorios el tiempo de fijación se prolonga a 12 – 24 h16. En nuestras manos, sin embargo, un tiempo de fijación condujo a mayor ruido y no era óptimo para varios anticuerpos rutinariamente utilizados en nuestra investigación.
El pH de la recuperación de antígeno también puede desempeñar un papel en el éxito de la coloración. Calor del epítopo (HIER) puede llevarse a cabo mediante el empleo de soluciones disponibles en el mercado que van desde ácidos a alcalinos, así como otros búferes hechos internos tales como citrato (pH 6), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, pH 8), Tris-EDTA pH (pH 9), Tris (pH 10). Tratamiento enzimático también puede ser una opción para el desenmascaramiento del antígeno. Incubar los portaobjetos deparaffinized por un tiempo limitado con una solución que contiene una adecuada concentración de una enzima (por ejemplo proteinasa K) puede ser un método alternativo al HIER. Sin embargo, es esencial para valorar la concentración de enzima y para determinar el tiempo de incubación ideal, ya que la digestión excesiva puede afectar el tejido17.
La elección de la solución amortiguadora de bloqueo también es otra variable para solucionar problemas. Además el uso de suero normal de cabra y el amortiguador de bloqueo disponible en el mercado mencionado en el presente Protocolo (conveniente en este caso al usar anticuerpos de ratón primario en tejidos de ratón para evitar alta fondo por endógeno ratón IgG), hay opciones adicionales disponibles como soluciones de proteínas (albúmina de suero bovino (BSA) o leche en polvo) u otros búferes disponibles comercialmente. Es fundamental asegurarse de que el buffer no contiene sustancias que pueden interferir con la tinción, como la biotina cuando utilizando una biotina-estreptavidina método basado en.
La glándula suprarrenal es un órgano endocrino caracterizado por contenido lipídico alto que a menudo puede hacer el immunostaining desafiante debido a la alta autofluorescencia de los lípidos. Por otra parte, las cortezas suprarrenales de las ratas y ratones son ricas en autofluorescent lipofuscin intracitoplásmica, un material granular y amorfo pigmentado que se extiende en color de amarillo a marrón. Para superar este problema, compuestos como el Sudán negro B (SBB) pueden calmar la fluorescencia generada por lipofuscins18. Otro factor que compromete el resultado de una buena tinción es la presencia de células de la sangre. Hemoglobina presente en los eritrocitos absorbe luz de longitudes de < 600 nm y puede interferir con fluorocromos que eso longitud de onda de19,20. Mientras que las técnicas de perfusión pueden utilizarse para eliminar las células de la sangre de los vasos del tejido, el uso de sulfato de cobre de 10 mM a pH 5 antes de realizar la contratinción nuclear también puede ayudar en la supresión de la fluorescencia no deseados21.
Un paso crítico en este protocolo es la disección de la suprarrenal. La glándula suprarrenal es un órgano cuya localización puede ser difícil de localizar en situ: en los ratones, las glándulas son pequeñas y su posición es algo variable. Especialmente en animales viejos, las glándulas suprarrenales también están rodeadas por tejido adiposo que pueden interferir con la detección de las glándulas y su consecuente aislamiento, por ello es crucial tener una visión clara de la zona durante este paso del protocolo. Retiro de retiro de la grasa peri-suprarrenal es un paso delicado. Particular debe prestarse atención a las glándulas suprarrenales al separar la grasa para que no se rompa la cápsula. La glándula debe mantenerse húmeda con PBS durante el procedimiento para evitar daños en los tejidos.
Cuando seccionamiento, detectar la presencia de la pequeña porción de tejido suprarrenal en las secciones puede ser difícil debido a tejido hipopigmentación tras el paso de proceso. Un microscopio es muy útil durante el seccionamiento para discernir el tejido de la cera.
Inmunotinción de secciones parafina-encajadas es una valiosa técnica de inmunomarcación proteínas de interés preservando la morfología del tejido. El método presentado aquí se basa en la detección de fluorescencia y, aunque es particularmente funcional para los estudios que emplean anticuerpos primarios múltiples, la señal de fluorescencia es sensible a la luz y puede ser fácilmente perdido o debilitado si las diapositivas no se manipulan correctamente (es decir, prolongada exposición a la luz del microscopio o exposición a la luz ambiental). Por otra parte, podemos notar una disminución de la calidad de la señal de fluorescencia sí mismo con el tiempo. Este problema puede evitarse mediante el uso de detección cromogénica, Fotoestables y puede ser visualizada por muchos años. Este método, sin embargo, carece de las ventajas de la detección de la fluorescencia, como etiquetado mayor precisión y simultánea de varias proteínas en un estudio.
Inclusión en parafina es un método conveniente para procesar y almacenar múltiples muestras de tejido. Sin embargo, el proceso de parafina inclusión sí mismo del tejido no es adecuado para la proyección de imagen de reporteros fluorescentes endógeno expresado en algunos animales transgénicos sin el uso de un anticuerpo específico contra el reportero. La criopreservación es un método para evitar la degradación de la proteína fluorescente y permitir su visualización directa al microscopio. Evitar el uso de un anticuerpo adicional puede representar una ventaja. Por otra parte, la criopreservación también puede ser limitante puesto que afecta la morfología del tejido; también requiere diferentes equipos de seccionamiento y en congeladores sólo es posible el almacenamiento de portaobjetos y bloques de tejido.
Una limitación importante de la imagen de un tejido seccionado es la capacidad para obtener imágenes de los componentes estructurales de alta resolución espacial. Composición del tejido, de hecho, es una variable importante en la determinación de la calidad de la proyección de imagen ya que influye en la penetración de la luz y puede llevar a la pobre resolución. La glándula suprarrenal es un tejido rico en lípidos causantes de la luz dispersión22. En el cerebro, que también tiene un contenido alto de lípidos, se han desarrollado técnicas de remoción de tejido como claridad, BABB, iDISCO 3DISCO para mejorar la visualización del tejido, permitiendo mejor proyección de imagen y 3D la reconstrucción del tejido23. Estas técnicas ofrecen investigadores de alta calidad de datos y se está adaptando a una variada gama de tejidos, y en el futuro, nos espero a emplear estos métodos de imagen suprarrenales así.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Damos las gracias por sus sugerencias y asistencia técnica en el establecimiento de este protocolo Dr. Mohamad Zubair. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Diabetes y digestivo y enfermedades del riñón, institutos nacionales de salud Research Grant 2R01-DK062027 (para G.D.H).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co. | 0412B | |
| Disposable needles 25 G x 5/8" | Exel International | 26403 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Paraplast plus | McCormik scientific | 39502004 | Paraffin for tissue embedding |
| Shandon biopsy cassettes II with attached lid | Thermo scientific | 1001097 | Cassettes for tissue processing |
| High Profile Microtome Blades | Accu-Edge | 4685 | Disposable stainless steel blades |
| Peel-a-way disposable plastic tissue embedding molds | Polysciences Inc. | 18986 | Truncated, 22 mm square top tapered to 12 mm bottom |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
| Xylene | Fisher Chemical | X5P1GAL | |
| 200 Proof Ethanol | Decon Labs, Inc. | ||
| Certi-Pad Gauze pads | Certified Safety Mfg, Inc | 231-210 | 3" x 3. Sterile latex free gauze pads |
| M.O.M kit | Vector laboratories | BMK-2202 | For detecting mouse primary antibodies on mouse tissue |
| KimWipes | Kimtech | 34155 | Wipes 4.4 inch x 8.4 inch |
| Super PAP PEN | Invitrogen | 00-8899 | Pen to draw on slides |
| Microscope cover glass | Fisherbrand | 12-544-D | Size: 22 x 50 x 1.5 |
| DAPI | Sigma | D9542 | (Prepared in 20 mg/mL stock) |
| ProLong Gold antifade reagent | Molecular Probes | P36930 | Mounting agent for immunofluorescence |
| X-cite series 120Q | Lumen Dynamics | Light source | |
| Coolsnap Myo | Photometrics | Camera | |
| Optiphot-2 | Nikon | Microscope | |
| microtome | American Optical | ||
| Tissue embedder | Leica | EG1150 H | |
| Tissue processor | Leica | ASP300S | |
| Normal goat serum | Sigma | G9023 | |
| Mouse anti-TH | Millipore | MAB318 | Primary antibody |
| Rabbit anti-SF1 | Ab proteintech group (PTGlabs) | custom made | Primary antibody |
| Alexa-488 Mouse IgG raised goat | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | Secondary antibody |
| Dylight-549 Rabbit IgG raised goat | Jackson ImmunoResearch | 111-505-003 | Secondary antibody |
| Citrate acid anhydrous | Fisher Chemical | A940-500 | |
| NIS-Elements Basic Research | Nikon | Software for imaging |
References
- Brandtzaeg, P. The increasing power of immunohistochemistry and immunocytochemistry. Journal of Immunological Methods. 216 (1-2), 49-67 (1998).
- Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- Lerario, A. M., Finco, I., LaPensee, C., Hammer, G. D. Molecular Mechanisms of Stem/ Progenitor Cell Maintenance in the Adrenal Cortex. Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).
- Yates, R., et al. Adrenocortical Development, Maintenance, and Disease. Endocrine Gland Development and Disease. 106, 239-312 (2013).
- Jones, I. C. Variation in the Mouse Adrenal Cortex with Special Reference to the Zona Reticularis and to Brown Degeneration, Together with a Discussion of the Cell Migration Theory. Quarterly Journal of Microscopical Science. 89 (1), 53 (1948).
- Sucheston, M. E. C., Samuel, M. The Transient-Zone in the Human and Mouse Adrenal Gland. The Ohio Journal of Science. 72, n2 (March, 1972) 120-126 (1972).
- Guasti, L., Paul, A., Laufer, E., King, P. Localization of Sonic hedgehog secreting and receiving cells in the developing and adult rat adrenal cortex. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 117-122 (2011).
- Pihlajoki, M., Dorner, J., Cochran, R. S., Heikinheimo, M., Wilson, D. B. Adrenocortical zonation, renewal, and remodeling. Frontiers in Endocrinology. 6, 27 (2015).
- Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid Droplets Finally Get a Little R-E-S-P-E-C-T. Cell. 139 (5), 855-860 (2009).
- Shen, W. J., Azhar, S., Kraemer, F. B. Lipid droplets and steroidogenic cells. Experimental Cell Research. 340 (2), 209-214 (2016).
- Finco, I., LaPensee, C. R., Krill, K. T., Hammer, G. D. Hedgehog signaling and steroidogenesis. Annual Review of Physiology. 77, 105-129 (2015).
- Paul, A., Laufer, E. Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).
- Lowe, J., Anderson, P. Stevens & Lowe's Human Histology, 4th Edition. , Elsevier/Mosby. 263-285 (2015).
- Nagatsu, T. Genes for human catecholamine-synthesizing enzymes. Neuroscience Research. 12 (2), 315-345 (1991).
- Berthon, A., et al. Age-dependent effects of Armc5 haploinsufficiency on adrenocortical function. Human Molecular Geneticst. 26 (18), 3495-3507 (2017).
- Brown, C. Antigen retrieval methods for immunohistochemistry. Toxicologic Pathology. 26 (6), 830-831 (1998).
- Billinton, N., Knight, A. W. Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).
- Hirsch, R. E., San George, R. C., Nagel, R. L. Intrinsic fluorometric determination of the stable state of aggregation in hemoglobins. Analytical Biochemistry. 149 (2), 415-420 (1985).
- Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of Red Blood Cell Autofluorescence for Immunocytochemistry on Fixed Embryonic Mouse Tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 28 (2017).
- Watson, J. Suppressing autofluorescence of erythrocytes. Biotechnic & Histochemistry. 86 (3), 207 (2011).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
