Vi præsenterer her, en kraftfuld og fysiologiske model for at studere de molekylære mekanismer bag gut hormon sekretion og intestinale absorption — isoleret perfunderet rotte tyndtarmen.
Tarmen er de største endokrine organ i kroppen, producerer mere end 15 forskellige peptid hormoner, der regulerer appetit og mad indtagelse, fordøjelse, næringsstof absorption og distribution og post prandial glukose udflugter. Forstå de molekylære mekanismer, der regulerer gut hormon sekretion er grundlæggende for at forstå og oversætte gut hormon fysiologi. Traditionelt, de underliggende gut hormon sekretion mekanismer er enten undersøgt in vivo (på forsøgsdyr eller mennesker) eller ved hjælp af gut hormon-secernerende primære slimhinde celle kulturer eller cellelinjer. Her introducerer vi en isoleret perfunderet rotte tyndtarmen som en alternativ metode til at studere gut hormon sekretion. Dyder af denne model er, at det bygger på intakt tarmen, hvilket betyder, at det indeholder de fleste af de fysiologisk vigtige parametre ansvarlig for udskillelsen i in vivo-undersøgelser, herunder slimhinde polarisering, paracrine forhold og ruter i perfusion/stimulus eksponering. Desuden, og i modsætning til in vivo-undersøgelser, tyndtarmen isolerede perfunderet rat giver mulighed for næsten fuldstændig eksperimentelle kontrol og direkte vurdering af sekretion. I modsætning til in vitro-undersøgelser er det muligt at studere både omfanget og dynamikken af sekretion og at behandle vigtige spørgsmål, såsom hvad stimuli forårsager udskillelsen af forskellige tarmhormoner, fra hvilken side af tarmen (luminale eller vaskulære) er sekretion stimuleres, og at analysere i detaljer molekylære sensorer bag den sekretoriske svar. Derudover er forberedelse en kraftfuld model for studiet af intestinale absorption og detaljer om dynamikken i intestinal absorption, herunder de ansvarlige transportvirksomheder.
Tarmen er de største endokrine organ i kroppen, producerer mere end 15 forskellige peptid hormoner, der regulerer næringsstof absorption og næringsstof disposition, intestinal vækst og modulere appetit1. Tarmhormoner derfor involveret i mange grundlæggende fysiologiske processer, og at forstå disse mønstre af sekretion og molekylær detaljer, der styrer udskillelsen af de respektive hormoner er således vigtige for vores grundlæggende fysiologiske forståelse og for adressering translationel aspekter af gut hormon handlinger; men hvordan kan man studere de underliggende gut hormon sekretion molekylære sensing mekanismer? I almindelighed, hormon sekretion kan studeres i intakt organismer (mennesker eller forsøgsdyr), fra isolerede gut præparater eller fra gut hormon-secernerende primære cellekulturer eller udødeliggjort celle kulturer2,3, 4 , 5 , 6. vores foretrukne model er isolerede perfunderet rotte tyndtarmen, som er en fysiologisk relevante model, der tillader sekretion af tarmhormoner studeres i detaljer med optimal tidsopløsning (sekretion satser kan fastsættes med enhver tid base ned til andet), og resultaterne er sandsynligvis overføres til en in vivo situation7. Her, vi leverer en detaljeret protokol om, hvordan du udfører denne procedure, men først vil vi diskutere andre metoder til at studere gut hormon sekretion, herunder fordele og begrænsninger af disse modeller i forhold til den isolerede perfunderet rotte tyndtarmen.
Hvis man ønsker at fastslå, om en bestemt sammensatte regulerer udskillelsen af visse tarmhormoner, er undersøgelser hos mennesker det ultimative mål. Således, hvis et stof, der viser store effekter på sekretion af én eller flere tarmhormoner i gnavere (i vivo eller perfusions) eller fra hormon hemmelig celler (cellelinjer eller primærelementer), denne effekt er kun relevante for medicin og human fysiologi hvis det kan bekræftes hos mennesker. Men der er klare grænser for typen af undersøgelser, der kan udføres på mennesker, og in vivo-undersøgelser på forsøgsdyr er derfor ofte den næstbedste løsning for sådanne undersøgelser. Mus og rotter er de hyppigst anvendte forsøgsdyr formentlig på grund af deres bekvemme størrelse, lave omkostninger og mulighed for at genetisk ændre de gener, der mistænkes for at være involveret i de konkrete undersøgelse spørgsmål (f.eks. banke ud af en visse transporter eller receptor). I almindelighed, in vivo modeller drage fordel af fysiologisk intakt, men har også flere begrænsninger. Vigtigst, den lille størrelse af gnavere, især mus, er en begrænsende faktor, da de fleste assays til gut hormon kvantificering kræver mindst 20 µL plasma (og ofte meget mere), hvilket betyder, at mindst 100 µL af blod har tilbage at gøre en dublet kvantificering. Derfor er det kun muligt at opnå meget få prøver svarende til baseline prøver og en eller to efter stimulation prøver (total blodvolumen i en mus på 20 g er ~1.4 mL). Derfor potentielle sekretoriske reaktioner (fx, hurtigt eller sene forekommende svar) kan derfor blive savnet.
I modellen perfusion problemet er overvundet, som stor stikprøve diskenheder er opnået (strømningshastighed: 7,5 mL/min) og samling intervaller kan justeres efter behov for at sikre, ikke glip af de hurtige og korte langvarige svar (vi indsamle prøver hver min)7 . Et andet problem med i vivo studier i gnavere er at de fleste tarmhormoner er endnu mere hurtigt elimineret eller metaboliseres end i mennesker8,9,10, hvilket kan komplicere den efterfølgende biokemiske analyser. For eksempel, vi viste at GLP-1 metaboliseres i mus i en endnu hurtigere tempo end i mennesker (hvor T1/2 er 1-2 min.11) og endnu vigtigere, at kløvningen af GLP-1 i mus omfatter, ud over N-terminale spaltning af dipeptidyl-peptidase-4 (DPP4) (som er den store GLP-1 nedværdigende enzym i mennesker), yderligere spaltning af enzymet neutrale endopeptidase 24.1112. Derfor, nuværende kommercielle assays til kvantificering af GLP-1, som enten er baseret på den intakte isoform af GLP-1 (7-36amide) eller DPP-4 kløvet isoform (9-39amide), langt undervurdere GLP-1 sekretion i mus og resultere i misvisende resultater 12. i tyndtarmen isolerede perfunderet rotte de fleste af metabolismen af udskilles hormoner er elimineret eller markant reduceret, da plasma-medieret nedbrydning er undgået, og lever/nyre/lunge udvinding/nedbrydning forhindres fordi ( perfusate er indsamlet som det forlader tarmen).
Selvfølgelig vigtigt indsigt kan genereres ved hjælp af genetisk modificerede dyr, fx, natrium-glucose transporter-1 knockout mus13, men en detaljeret vurdering af de molekylære sensorer involveret i sekretionen ofte kræver betragtning af flere molekylære sites, spænder fra molekylære transportvirksomheder til ionkanaler og fra forskellige G-protein-koblede receptorer til intracellulære proteiner. For eksempel, målrettet vi aktivitet af ni forskellige molekylære sites når optrevling molekylære sensorerne ansvarlig for glucose-stimuleret GLP-1-sekretion7. En lignende undersøgelse ville ikke være muligt in vivo, som nogle af de forbindelser der anvendes har uspecifik eller skadelige/dødelige virkninger. For eksempel, når du bruger den perfused gut, var det muligt at vurdere intra cellulære glukosemetabolismen for udskillelsen af GLP-1 og neurotensin rolle ved at blokere ATP dannelse med 2-4-dinitrophenol7,14 samt rolle spænding-gated calcium kanaler for galdesyre stimuleret GLP-1, NT og PYY sekretion3. Stærkt giftige natrium-kanal blokker tetrodotoxin kan faktisk blive anvendt med succes i perfusion undersøgelser. Endelig, i perfusion model det kan direkte vurderes hvor i tarmen en visse sammensatte stimulerer sekretion af et bestemt hormon, som investigator kan blot vælge og forberede den ønskede region til perfuse, og samtidig kan det undersøges hvorvidt en stimulus forårsager udskillelsen ved aktivering af molekylære sensorer fra den luminale eller vaskulær side af tarmen3,15,16.
De sekretoriske mekanismer underliggende gut hormon sekretion kan også studeres ved brug af gut væv stykker (herunder humant væv), primære intestinal kulturer (normalt fra mus), udødeliggjort hormon secernerende cellelinjer (af musen eller menneskelig oprindelse), af gut væv monteret i Ussing kamrene eller af organoids (både oftest fra mus)2,3,4,5,6,17,18. I forhold til tarm perfusions, undersøgelser på menneskelige gut stykker, primære cellekulturer og cellelinjer er teknisk nemmere at udføre og er en hurtigere og billigere måde at generere data, men selvfølgelig studiet af gut stykker kræver adgang til friske menneskelige gut prøver. Men i disse modeller normal celle polariseringen af tarmen er i sagens natur tabt, hvilket betyder, at disse modeller kan ikke bruges til at vurdere normal aktivering af molekylære sensorer, og absorption processer kan også undersøges. Derudover sådanne undersøgelser normalt anvender statisk inkubationer (for op til flere h) som er meget ikke-fysiologisk og har intet at gøre med de celler normale sekretoriske dynamik, fordi det udskilles produkt ikke er fjernet og dermed kan feedback påvirke den udskillelsen af hormoner. Derimod i perfused tarmen, er udskilles og optages molekyler effektivt fjernet af slimhinde mikrocirkulationen som de er in vivo, sikre at transmucosal forløb så absorption og sekretion kan forekomme ved en normal sats. Derudover kan cellekulturer have dedifferentiated fra deres indfødte enteroendocrine celle oprindelse, hvilket betyder at de ikke længere er repræsentant for de oprindelige celler peptid indhold og udtryk for Molekylær sensorer, selv om de kan stadig udskille hormonet pågældende. Dette er eksempelvis tilfældet for GLP-1 secernerende celle linjer19.
Det er derfor, vores opfattelse, at primære cellekulturer eller celle linje undersøgelser er mest egnet til screening og til at udføre typer eksperimenter, der ikke kan udføres i vivo eller i den isolerede perfused gut. For eksempel, en sande styrke af primære cellekulturer og cellekulturer linje er at intra cellulære sekundære budbringere (f.eks. Ca2 +, lejr, NAD(P)H) kan overvåges i realtid, og elektrisk signalering af hormonet hemmelig celler kan være undersøgt20,21,22. Derudover kan være gjort siRNA knockdown, hvilket er særligt nyttigt, hvis specifikke hæmmere ikke er tilgængelige20,21,22,23,24. Gut væv fra mus monteret i Ussing kamrene er for nylig blevet brugt til at studere de molekylære mekanismer bag galdesyre stimuleret GLP-1-sekretion, mens tarm organoids (fra mus) og menneskelige gut stykker er også blevet brugt til at studere den Molekylær detaljer gut hormon sekretion17,25. Mens de foerstnaevnte ydelser fra at være polariseret2 omfatter alle disse modeller statisk inkubationer. Undersøgelser på menneskelige gut stykker, dog drage fordel af ved hjælp af menneskelige, snarere end gnavere, væv, som er vigtigt siden arter forskel i væv udtryk af 7TM receptorer og molekylær transportvirksomheder kan resultere i forskellige molekylære sensing veje mellem arter. Faktisk de fleste dataene i dette felt er blevet genereret af undersøgelser på enten svin, mus eller rotter, og det er stadig undvigende om disse resultater kan overføres til mennesker. Det er imidlertid betryggende at de molekylære sensing mekanismer, der ligger til grund for glucose-stimuleret GLP-1 sekretion synes at være ens mellem mus, rotte, mand, og transkriptom og peptidomic profilering af mus og menneskelige L-celler afsløret stærke globale ligheder mellem to arter7,18,26,27.
Tyndtarmen isolerede perfunderet rotte har dog også nogle begrænsninger, der bør overvejes. Vigtigst af alt, er det umuligt at afgøre, om en given sekretoriske reaktion skyldes direkte aktivering af test-kemikaliet i de målrettede hormon-producerende celler eller rettere er forårsaget af en indirekte mekanisme. For eksempel, KCl øger straks GLP-1 sekretion fra perfused tarmen7, men det er stadig ukendt, om dette er en konsekvens af direkte depolarisering af L-celle eller resultater fra depolarisering af neuroner tæt på L-celler eller effekter af Samtidig udgav paracrine Stimulatorer/hæmmere. Data, der opstår fra undersøgelser ved hjælp af perfused tarmen, som har til formål at belyse de molekylære mekanismer bag sekretion bør derfor altid sættes i forbindelse med data fra andre mere specifikke modeller at øge evnen til at etablere kausalitet. For eksempel, glucose-stimuleret GLP-1 sekretion fra GLP-1 secernerende cellelinie GLUTag28,29 og primære mus L-celler afhænger af aktiviteten af glucose transportører (SGLT1 og GLUT2). Blokere disse transportører i tyndtarmen perfunderet rotte også dæmper sekretion20, hvilket betyder, at det er sandsynligt, at glucose-stimuleret GLP-1 sekretion i vid udstrækning er medieret af direkte aktioner af glucose på L-celle. En anden vigtig begrænsning af isolerede perfused tarmen er, at nogle af lipider er vanskelige at studere på grund af deres hydrophobicity. Selv om det er muligt at undersøge de endelige produkter af lipid fordøjelsen (fedtsyrer, diacyl glycerols, lysophosphatidylglycerols, etc.) og selvom præparatet kan muligvis re esterify af lipider intra-cellularly og måske pakke dem ind i Chylomichroner, transport af Chylomichroner ud af cellerne og deres efterfølgende udbredelse af lacteals af af villi er afbrudt, da den lymfe flow i den isolerede gut ikke kan sikres. Mest sandsynlige, derfor lipid absorption er standset når de absorberede produkter begynder at ophobe sig i cellerne. In vitro celle-systemer er endnu mindre egnet til lipid undersøgelser på grund af deres manglende polarisering. Naturligvis, denne begrænsning er kun relevant for lipider, som er absorberet og transporteret via lacteals, mens dem, der absorberes via de intestinale blodkar er tilbøjelige til at blive behandlet normalt.
Isolerede perfunderet rotte tyndtarmen er en kraftfuld forskningsværktøj, der giver dynamik og molekylære mekanismer bag gut hormon sekretion studeres i detaljer. Det mest afgørende skridt for den vellykkede produktion af data med denne model er den kirurgiske operation. Håndtering af tarmen medfører uundgåeligt nogle skader på tarmen og bør derfor holdes på et absolut minimum. Endnu vigtigere, er hastigheden af operation nøglen, især med hensyn til tidspunktet for kateter placering i den mesenterica arterie….
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af en ubegrænset tilskud til Prof. Jens Juul Holst fra Novo Nordisk Center for metaboliske grundforskning (Novo Nordisk Fonden, Danmark), en særskilt bevilling fra Novo Nordisk Fonden for at gøre gnaver perfusion undersøgelser (give nr. NNF15OC0016574), et tilskud til at Prof. Holst fra European Research Council (Grant no.695069) og det europæiske EU ‘s syvende rammeprogram for forskning, teknologiske og demonstrationsaktiviteter (Grant nr. 266408) samt en postdoc give Rune E. Kuhre fra Lundbeckfonden (R264-2017-3492). Vi takker Jenna E. Hunt og Carolyn F. Deacon for omhyggelig korrekturlæsning.
Chemicals for perfusion buffer | |||
Bovine serum albumin (BSA) | Merck | 1.12018.0500 | |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2 x 2 H2O) | Merck | 102382 | |
Dextran 70 | Pharmacosmos | 40014 | |
Fumaric acid disodium salt (C4H2Na2O4) | Sigma Aldrich | F9642 | |
Glucose (C6H12O6) | Merck | 108342 | |
Magnesium sulfate hepatahydrate (MgSO4) | Merck | 105886 | |
Potasium chloride (KCl) | Merck | 104936 | |
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Merck | 104873 | |
Pyruvic acid sodium salt (C3H3NaO4) | Merck | 106619 | |
Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | ||
Sodium chloride (NaCl) | Merck | 106404 | |
Sodium L-glutamate monohydrate (C5H8NNaO4 x H2O) | Merck | 106445 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Perfusion equitment | |||
Universial perfusion system | Harvard Bioscience, Inc. | 732316 | |
BASIC UNIT UNIPER UP-100, TYPE 834 | Harvard Bioscience, Inc. | ||
Roller Pump, with four channels | Harvard Bioscience, Inc. | 730100 | |
Windkessel | Harvard Bioscience, Inc. | 732068 | |
Thermostatic Circulator,Bath Volume 3L, 230V/50Hz | Harvard Bioscience, Inc. | 730125 | |
Operating table, heated on tripod stand, type 873 | Harvard Bioscience, Inc. | 733776 | |
Cannula with basked, OD= 2.0mm, ID= 1.0mm | Harvard Bioscience, Inc. | 733313 |