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Medicine

अलग perfused चूहे छोटी आंत का उपयोग आंत हार्मोन स्राव अंतर्निहित तंत्र

Published: February 26, 2019 doi: 10.3791/58533
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biomedical Sciences and NNF Centre for Basic Metabolic Research, The Panum Institute, University of Copenhagen

Summary

यहां, हम एक शक्तिशाली और शारीरिक के लिए आंत हार्मोन स्राव अंतर्निहित आणविक तंत्र और आंतों के अवशोषण का अध्ययन मॉडल वर्तमान-पृथक perfused चूहे छोटी आंत ।

Abstract

आंत शरीर का सबसे बड़ा अंतःस्रावी अंग है, जो 15 से अधिक विभिन्न पेप्टाइड हार्मोन का उत्पादन करता है जो भूख और भोजन का सेवन, पाचन, पोषक तत्व अवशोषण और वितरण को विनियमित करते हैं, और पोस्ट-पर्डियल ग्लूकोज भ्रमण करते हैं । आणविक तंत्र को समझना जो आंत हार्मोन स्राव को विनियमित करता है, आंत हार्मोन फिजियोलॉजी को समझने और अनुवाद करने के लिए मौलिक है । परंपरागत रूप से, आंत हार्मोन स्राव अंतर्निहित तंत्र या तो vivo में अध्ययन कर रहे हैं (प्रयोगात्मक जानवरों या मनुष्यों में) या आंत हार्मोन स्रावित प्राथमिक श्लेष्मल सेल संस्कृतियों या सेल लाइनों का उपयोग. यहां, हम आंत हार्मोन स्राव का अध्ययन करने के लिए एक वैकल्पिक विधि के रूप में एक अलग perfused चूहे छोटी आंत परिचय । इस मॉडल के गुण हैं कि यह बरकरार पेट पर निर्भर करता है, जिसका अर्थ है कि यह विवो अध्ययन में स्राव के लिए जिम्मेदार भौतिक रूप से महत्वपूर्ण मापदंडों के सबसे recapitulates, म्यूकोसल ध्रुवीकरण सहित, paracrine रिश्तों और मार्गों छिड़काव/ इसके अलावा, और विवो अध्ययन में विपरीत, पृथक perfused चूहे छोटी आंत लगभग पूरा प्रयोगात्मक नियंत्रण और स्राव के प्रत्यक्ष आकलन के लिए अनुमति देता है । इन विट्रो अध्ययनों के विपरीत, यह दोनों परिमाण और स्राव की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए और महत्वपूर्ण सवालों का पता करने के लिए संभव है, जैसे कि क्या उत्तेजकता अलग आंत हार्मोन के स्राव का कारण, आंत के किस तरफ से (luminal या संवहनी) स्राव है उत्तेजित, और विस्तार आणविक सेंसर स्रावी प्रतिक्रिया अंतर्निहित में विश्लेषण करने के लिए. इसके अलावा, तैयारी आंतों के अवशोषण और जिम्मेदार ट्रांसपोर्टरों सहित आंतों के अवशोषण की गतिशीलता के बारे में जानकारी के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली मॉडल है ।

Introduction

आंत शरीर के सबसे बड़े अंतःस्रावी अंग है, 15 से अधिक विभिन्न पेप्टाइड हार्मोन है कि पोषक तत्व अवशोषण और पोषक तत्व स्वभाव, आंतों के विकास को विनियमित और भूख मिलाना1उत्पादन. आंत हार्मोन, इसलिए कर रहे हैं, कई मौलिक शारीरिक प्रक्रियाओं में शामिल, और स्राव के इन नमूनों को समझने और संबंधित हार्मोन के स्राव नियंत्रण कि आणविक विवरण हमारे बुनियादी शारीरिक के लिए इस प्रकार महत्वपूर्ण है समझ और आंत हार्मोन क्रियाओं के स्थानांतरीय पहलुओं को संबोधित करने के लिए; लेकिन कैसे एक आंत हार्मोन स्राव अंतर्निहित आणविक संवेदन तंत्र का अध्ययन कर सकते हैं? सामान्य में, हार्मोन स्राव बरकरार जीवों में अध्ययन किया जा सकता है (मनुष्यों या प्रयोगात्मक जानवरों), पृथक आंत की तैयारी से या आंत हार्मोन से स्रावित प्राथमिक कोशिका संस्कृतियों या अमर सेल संस्कृतियों2,3, 4 , 5 , 6. हमारा पसंदीदा मॉडल अलग perfused चूहे छोटी आंत है, जो एक भौतिक रूप से प्रासंगिक मॉडल है कि आंत हार्मोन के स्राव को इष्टतम समय संकल्प के साथ विस्तार से अध्ययन करने की अनुमति देता है (स्राव दरें किसी भी समय के साथ निर्धारित किया जा सकता है दूसरा करने के लिए नीचे बेस), और परिणाम की संभावना एक vivo स्थिति7में transferrable हैं । यहाँ, हम कैसे इस प्रक्रिया को करने के लिए पर एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, लेकिन पहले हम आंत हार्मोन स्राव का अध्ययन करने के लिए अन्य तरीकों पर चर्चा करेंगे, लाभ और इन मॉडलों की सीमाओं अलग perfused चूहे छोटी आंत की तुलना में सहित.

यदि एक स्थापित करना चाहता है कि एक विशिष्ट यौगिक कुछ आंत हार्मोन के स्राव को नियंत्रित करता है, मनुष्यों में अध्ययन अंतिम लक्ष्य हैं. इस प्रकार, यदि एक यौगिक कृंतकों में एक या कई आंत हार्मोन के स्राव पर महान प्रभाव से पता चलता है (vivo या perfusions में) या हार्मोन स्रावित कोशिकाओं से (सेल लाइनों या प्राथमिक कोशिकाओं), यह प्रभाव केवल चिकित्सा और मानव शरीर क्रिया विज्ञान के लिए प्रासंगिक है अगर यह पुष्टि की जा सकती है मनुष्यों में । हालांकि, मनुष्यों में प्रदर्शन किए जा सकने वाले अध्ययनों के प्रकार के लिए स्पष्ट सीमाएं हैं, और प्रायोगिक जानवरों पर vivo अध्ययन में, इसलिए, अक्सर ऐसे अध्ययनों के लिए दूसरा सबसे अच्छा विकल्प होता है । चूहों और चूहों सबसे अक्सर इस्तेमाल प्रयोगात्मक उनके सुविधाजनक आकार, कम लागत और आनुवंशिक रूप से विशिष्ट अध्ययन के सवालों में शामिल होने का संदेह जीन में परिवर्तन करने के लिए विकल्प के कारण पशुओं रहे हैं (उदाहरण के लिए, एक निश्चित ट्रांसपोर्टर से बाहर दस्तक या रिसेप्टर) । सामांय में, vivo मॉडल में भौतिक रूप से बरकरार होने से लाभ, लेकिन यह भी कई सीमाएं हैं । सबसे महत्वपूर्ण बात, कृंतकों के छोटे आकार, विशेष रूप से चूहों, एक सीमित कारक है, के रूप में आंत हार्मोन परिमाणन के लिए सबसे assays प्लाज्मा (और अक्सर बहुत अधिक) के कम से 20 μl की आवश्यकता होती है, जिसका अर्थ है कि कम से १०० μl रक्त का एक डुप्लिकेट बनाने के लिए वापस ले लिया जाना है परिमाणन. इसलिए, यह केवल आधारभूत नमूनों और एक या दो के बाद उत्तेजना नमूने के लिए इसी बहुत कुछ नमूने प्राप्त करने के लिए संभव है (20 ग्राम के एक चूहे में कुल रक्त की मात्रा ~ १.४ मिलीलीटर है). नतीजतन, संभावित स्रावी प्रतिक्रियाओं (जैसे, तेजी से या देर से आने वाली प्रतिक्रियाओं) इसलिए याद किया जा सकता है.

परफ्यूजन मॉडल में, इस समस्या को दूर है, के रूप में बड़े नमूना मात्रा प्राप्त कर रहे हैं (प्रवाह दर: ७.५ मिलीलीटर/मिनट) और संग्रह अंतराल के रूप में सुनिश्चित करें कि तेजी से और कम स्थायी प्रतिक्रियाओं याद नहीं कर रहे हैं करने के लिए आवश्यक के रूप में समायोजित किया जा सकता (हम नमूने हर मिनट इकट्ठा)7 . कुतर में vivo अध्ययन में एक और मुद्दा यह है कि सबसे आंत हार्मोन भी अधिक तेजी से सफाया कर रहे है या मनुष्यों की तुलना में metabolized8,9,10, जो बाद में जैव रासायनिक विश्लेषण जटिल हो सकता है । उदाहरण के लिए, हमने दिखाया है कि जीएलपी-1 चूहों में मनुष्यों की तुलना में एक भी तेजी से दर पर metabolized है (जहां टी1/2 1-2 ंयूनतम11है) और, और अधिक महत्वपूर्ण बात, कि glp-चूहों में 1 की दरार शामिल है, N-टर्मिनल दरार के अलावा द्वारा dipeptidyl-पेप्टाइडेस-4 (DPP4) (जो मनुष्यों में प्रमुख जीएलपी-1 अपमानजनक एंजाइम है), एंजाइम तटस्थ endopeptidase २४.११12द्वारा आगे दरार । फलस्वरूप, glp-1 के परिमाणन के लिए वर्तमान वाणिज्यिक assays, जो या तो जीएलपी-1 (7-36amide) या डीपीपी-4 cleaved समरूप (9-39amide) के अक्षुण्ण समरूप पर आधारित हैं, काफी चूहों में जीएलपी-1 स्राव को कम आँकना और भ्रामक परिणामों में परिणाम 12. पृथक perfused चूहे छोटी आंत में, स्रावित हार्मोन के चयापचय के अधिकांश समाप्त हो जाता है या स्पष्ट रूप से कम है, के बाद से प्लाज्मा-मध्यस्थता क्षरण से बचा जाता है, और जिगर/ इसे आंत के पत्तों के रूप में एकत्र किया जाता है) ।

बेशक, महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि आनुवंशिक रूप से संशोधित पशुओं के उपयोग द्वारा उत्पंन किया जा सकता है, जैसे, सोडियम ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर-1 पीटकर चूहों13, लेकिन आणविक स्राव में शामिल सेंसर का एक विस्तृत मूल्यांकन अक्सर की आवश्यकता है कई आणविक साइटों के विचार, आणविक ट्रांसपोर्टरों से आयन चैनलों और अलग जी से लेकर-प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स इंट्राकोशिलर प्रोटीन के लिए. उदाहरण के लिए, हमने नौ अलग आणविक साइटों की गतिविधि को लक्षित किया जब ग्लूकोज-उत्तेजित जीएलपी-1 स्राव7के लिए जिम्मेदार आणविक सेंसर को unraveling किया । वीवो में इसी तरह की जांच संभव नहीं होगी क्योंकि कुछ यौगिकों का उपयोग अविशिष्ट या हानिकारक/घातक प्रभाव है । उदाहरण के लिए, जब perfused आंत का उपयोग कर, यह 2-4-dinitrophenol7,14 के साथ ही की भूमिका के साथ एटीपी गठन अवरुद्ध द्वारा glp-1 और न्यूरोटेनसिन के स्राव के लिए अंतर-सेलुलर ग्लूकोज चयापचय की भूमिका का आकलन करने के लिए संभव था पित्त अम्ल के लिए वोल्टेज gated कैल्शियम चैनल उत्तेजित जीएलपी-1, एनटी और pyy स्राव3. दरअसल, अत्यधिक विषाक्त सोडियम चैनल अवरोधक टेट्रोडोटॉक्सिन सफलतापूर्वक छिड़काव अध्ययन में लागू किया जा सकता है । अंत में, छिड़काव मॉडल में यह सीधे मूल्यांकन किया जा सकता है जहां आंत में एक निश्चित यौगिक एक निश्चित हार्मोन के स्राव को उत्तेजित करता है, के रूप में अन्वेषक बस का चयन और perfuse करने के लिए वांछित क्षेत्र तैयार कर सकते हैं, और एक ही समय में यह जांच की जा सकती है क्या एक उत्तेजना आंत के luminal या संवहनी पक्ष से आणविक सेंसर के सक्रियण द्वारा स्राव का कारण बनता है3,15,16.

आंत हार्मोन स्राव अंतर्निहित स्रावी तंत्र भी आंत ऊतक टुकड़े का उपयोग करके अध्ययन किया जा सकता है (मानव ऊतक सहित), प्राथमिक आंतों संस्कृतियों (चूहों से आम तौर पर), अमर हार्मोन स्रावित कोशिका लाइनों (माउस या मानव मूल के), आंत द्वारा ऊतक ussing कक्षों में या organoids द्वारा घुड़सवार (दोनों सबसे चूहों से अक्सर)2,3,4,5,6,17,18। आंतों की तुलना में, मानव आंत के टुकड़ों पर अध्ययन, प्राथमिक कोशिका संस्कृतियों और सेल लाइनों के लिए तकनीकी रूप से आसान प्रदर्शन कर रहे है और डेटा पैदा करने का एक तेज और सस्ता तरीका है, लेकिन पाठ्यक्रम आंत टुकड़े के अध्ययन के लिए ताजा मानव आंत के लिए उपयोग की आवश्यकता है नमूनों. हालांकि, इन मॉडलों में आंत के सामान्य कोशिका ध्रुवीकरण स्वाभाविक खो दिया है, जिसका अर्थ है कि इन मॉडलों आणविक सेंसर के सामान्य सक्रियण का आकलन करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता, और अवशोषण प्रक्रियाओं भी अध्ययन नहीं किया जा सकता. इसके अलावा, इस तरह के अध्ययनों में आमतौर पर स्थिर इनक्यूबेशंस को रोजगार (कई एच के लिए) जो अत्यधिक गैर-शारीरिक है और कोशिकाओं की सामान्य स्रावी गतिशीलता के साथ कुछ नहीं करना पड़ता है, क्योंकि स्रावित उत्पाद को हटाया नहीं जाता है और इस प्रकार प्रतिक्रिया हो सकती है हार्मोन का स्राव. इसके विपरीत, सुगंधित आंत में, स्रावित और अवशोषित अणुओं को कुशलतापूर्वक म्यूकोसल माइक्रोपरिसंचरण द्वारा हटा दिया जाता है क्योंकि वे विवो में हैं, यह सुनिश्चित करना कि ट्रांसम्यूकोसल ग्रेडिएंट्स का रखरखाव किया जाता है, इसलिए अवशोषण और स्राव सामान्य दर से हो सकता है । इसके अलावा, कोशिका संस्कृतियों उनके देशी enteroendocrine कोशिका मूल से विभेदित हो सकता है, जिसका अर्थ है कि वे अब पेप्टाइड सामग्री और आणविक सेंसर की अभिव्यक्ति के मामले में देशी कोशिकाओं के प्रतिनिधि हैं, हालांकि वे अभी भी कर सकते हैं सवाल में हार्मोन छिपाना. यह है, उदाहरण के लिए, glp के लिए मामला-1 सेल लाइनों19स्राटिंग ।

यह है, इसलिए, हमारी राय है कि प्राथमिक कोशिका संस्कृतियों या सेल लाइन के अध्ययन के प्रयोजनों के स्क्रीनिंग के लिए सबसे उपयुक्त है और प्रकार के प्रयोगों है कि vivo में या अलग perfused आंत में नहीं किया जा सकता प्रदर्शन के लिए । उदाहरण के लिए, प्राथमिक कोशिका संस्कृतियों और सेल लाइन संस्कृतियों की एक असली ताकत है कि अंतर सेलुलर माध्यमिक संदेशवाहक (जैसे Ca2 +, शिविर, NAD (पी) एच) वास्तविक समय में निगरानी की जा सकती है, और हार्मोन स्राविटिंग कोशिकाओं के विद्युत संकेतन किया जा सकता है 20,21,22की जांच की । इसके अलावा, सिरना पछाड़ा किया जा सकता है, जो विशेष रूप से उपयोगी है अगर विशिष्ट अवरोही उपलब्ध नहीं हैं20,21,22,23,24. चूहों से आंत ऊतक ussing कक्षों में घुड़सवार हाल ही में पित्त-एसिड उत्तेजित glp-1 स्राव अंतर्निहित आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, जबकि आंतों organoids (चूहों से) और मानव आंत टुकड़े भी अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया है आंत हार्मोन के स्राव के आणविक विवरण17,25. जबकि इन मॉडलों के2 polarized जा रहा से पूर्व लाभ स्थैतिक इनसेबेशंस शामिल है । मानव आंत के टुकड़ों पर अध्ययन, तथापि, मानव का उपयोग करने के बजाय, rodent से लाभ, ऊतक जो 7tm रिसेप्टर्स और आणविक ट्रांसपोर्टरों की ऊतक अभिव्यक्ति में प्रजातियों के अंतर के बाद से महत्वपूर्ण है अलग आणविक संवेदन रास्ते में परिणाम हो सकता है प्रजातियां. वास्तव में, इस क्षेत्र में सबसे अधिक डेटा या तो सूअर, चूहों या चूहों पर अध्ययन द्वारा उत्पंन किया गया है, और यह मायावी रहता है कि क्या इन निष्कर्षों मनुष्यों को हस्तांतरित किया जा सकता है । यह है, तथापि, आश्वस्त है कि आणविक संवेदन तंत्र है कि आबाद ग्लूकोज-उत्तेजित glp-1 स्राव माउस, चूहा, आदमी, और transcriptomic और माउस और मानव एल कोशिकाओं के बीच समान होना प्रकट मजबूत वैश्विक पता चला दोनों प्रजातियों के बीच समानता7,18,26,27.

पृथक perfused चूहे छोटी आंत, तथापि, यह भी कुछ सीमाएं है कि विचार किया जाना चाहिए है । सबसे महत्वपूर्ण बात, यह निर्धारित करना असंभव है कि प्रत्यक्ष सक्रियण से एक दिया स्रावी प्रतिक्रिया परिणाम लक्षित हार्मोन उत्पादक कोशिकाओं के परीक्षण पदार्थ द्वारा या बल्कि एक अप्रत्यक्ष तंत्र के कारण होता है. उदाहरण के लिए, kcl तुरंत perfused आंत7से glp-1 स्राव बढ़ जाती है, लेकिन यह अज्ञात है कि क्या यह एल सेल के प्रत्यक्ष depolarization का परिणाम है या ंयूरॉंस के depolarization से परिणाम एल कोशिकाओं या प्रभाव के करीब है इसके साथ ही जारी किया गया पार्करइन उत्तेजक उत्तेजकों/ perfused आंत का उपयोग कर अध्ययन से उत्पन्न होने वाले डेटा जो आणविक तंत्र को स्पष्ट करने के लिए लक्ष्य होना चाहिए, इसलिए, हमेशा अन्य अधिक विशिष्ट मॉडल से प्राप्त डेटा के साथ संदर्भ में रखा जा करने के लिए स्थापित करने की क्षमता में वृद्धि भिन्न. उदाहरण के लिए, ग्लूकोज-उत्तेजित जीएलपी-1 स्राव से glp-1 स्रावित कोशिका लाइन glutag28,29 और प्राथमिक माउस से एल-कोशिकाओं ग्लूकोज ट्रांसपोर्टरों की गतिविधि पर निर्भर करता है (SGLT1 and GLUT2). perfused चूहा छोटी आंत में इन ट्रांसपोर्टरों को अवरुद्ध भी जठर20attenuates, जिसका अर्थ है कि यह संभावना है कि ग्लूकोज-उत्तेजित glp-1 स्राव काफी हद तक एल सेल पर ग्लूकोज की प्रत्यक्ष क्रियाओं द्वारा मध्यस्थता है. पृथक perfused आंत की एक और महत्वपूर्ण सीमा है कि लिपिड के कुछ उनके हाइड्रोफोबिसिटी के कारण अध्ययन करने के लिए मुश्किल कर रहे हैं । हालांकि यह लिपिड पाचन के अंतिम उत्पादों की जांच करने के लिए संभव है (फैटी एसिड, diacyl ग्लिसरीन, lysophosphatidylglycerols, आदि) और हालांकि तैयारी फिर से करने में सक्षम हो सकता है-लिपिड्स intra esterify और शायद उन्हें में पैक chylomicrons, कोशिकाओं से बाहर chylomicrons के परिवहन और उनके बाद की lacteals द्वारा आगे की तेज विली बाधित है, के बाद से अलग आंत में लिम्फ प्रवाह को सुरक्षित नहीं किया जा सकता है । सबसे अधिक संभावना है, इसलिए, लिपिड अवशोषण एक बार अवशोषित उत्पादों को कोशिकाओं में जमा करने के लिए शुरू रुक जाता है । इन विट्रो सेल सिस्टम भी कम है क्योंकि उनके ध्रुवीकरण की कमी के लिपिड अध्ययन के लिए उपयुक्त हैं । जाहिर है, इस सीमा केवल लिपिड कि अवशोषित कर रहे हैं और lacteals के माध्यम से ले जाया जाता है के लिए प्रासंगिक है, आंतों रक्त वाहिकाओं के माध्यम से अवशोषित उन जबकि सामान्य रूप से संभाला जा करने की संभावना है.

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Protocol

सभी अध्ययनों डेनिश पशु प्रयोगों से अनुमति के साथ आयोजित किया गया निरीक्षणालय (2013-15-2934-00833) और स्थानीय नैतिक समिति, डेनिश कानून के दिशा निर्देशों के अनुसार पशु प्रयोग शासी (१९८७) और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (प्रकाशन संख्या 85-23).

1. प्रायोगिक पशु

  1. पुरुष wistar चूहों (२५० ग्राम) और पिंजरे प्रति घर 2, मानक चाउ और पानी के लिए विज्ञापन libitum पहुंच के साथ प्राप्त है, और एक 12:12 एच प्रकाश में बनाए रखने के अंधेरे चक्र । हमारे जानवरों की सुविधा गैर इलाज पानी और alrtromin कृंतक चाउ (१३१९ forti, brogaarden, lynge, डेनमार्क) का उपयोग करता है ।
    नोट: पशुओं को acclimatization के कम से एक सप्ताह की अनुमति दें ।

2. preoperative तैयारी

  1. छिड़काव बफर बनाओ: krebs-घंटी बाइकरबोनेट बफर ०.१% bsa के साथ पूरक (अंश वी), 5% डेक्सट्रान टी-७०, ३.५ mmol/l ग्लूकोज, और 5 mmol/l pyruvate, फुमराते, और ग्लूटामेट (यदि आवश्यक हो); पीएच ७.४ ।
  2. फिल्टर के एक उचित आकार के माध्यम से इसे फ़िल्टर और 5 एम एचसीएल के बिंदुश: इसके अलावा द्वारा पीएच को समायोजित करने के द्वारा छिड़काव बफर की एक पर्याप्त राशि तैयार करें ।
  3. 3-आइसोब्यूटाइल-1-मेथयलक्सान्टाइन (ibmx) (यदि आवश्यक हो) को 10 μm की अंतिम एकाग्रता के लिए अध्ययन के दिन बफर में सीधे जोड़ें ।
    नोट: ibmx एक फॉस्फोडाईस्टेरेज अवरोधक है कि बढ़ जाती है [शिविर]मैं और इस तरह एक स्रावी उत्तेजना के लिए हार्मोन स्राव करने के मामले में संवेदनशीलता और आंत की जवाबदेही पुनर्स्थापित करता है.
  4. परीक्षण समाधान (ओं) तैयार करें । फ़िल्टर और पीएच-समायोजित छिड़काव बफर में वांछित अंतिम एकाग्रता की तुलना में एक 20x उच्च एकाग्रता पर संवहनी उत्तेजनियों को तैयार करें । अंतिम एकाग्रता में isotonic खारा में luminal परीक्षण उत्तेजनीय तैयार करें ।
  5. १००% डाइमेथिल सल्फॉक्साइड (डीएमएसओ) में आसानी से घुलनशील यौगिकों को भंग न करें और छिड़काव बफर या आइसोटॉनिक खारा में और अधिक पतला कर दे । संवहनी उत्तेजनाएं के लिए, अंतिम dmso एकाग्रता रखने के लिए 1% या नीचे, इस क्षति के ऊपर की सांद्रता के रूप में आंत और अविशिष्ट आंत हार्मोन स्राव के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. पीएच को मापने और अगर जरूरत ~ ७.५ करने के लिए समायोजित करें ।

3. ऑपरेशन और छिड़काव

नोट: चित्र 1में एक छिड़काव सेटअप का चित्रण प्रदान किया गया है ।

  1. एक संवेदनाहारी आहार का उपयोग करके चूहों को एनेस्थेटाइज़ करें जो हाइपोनॉर्म द्वारा 30-40 मिनट के लिए सर्जिकल संज्ञाहरण और एनाल्जेसिया बनाए रख सकते हैं (०.३ मिलीलीटर/100 ग्राम वजन प्रति मिलीलीटर: hypnorm: ०.०८ मिलीग्राम fentanyl, २.५ मिलीग्राम fluanisone, ०.४५ मिलीग्राम मिथाइल parahydroxybenzoate, ०.०५ मिलीग्राम propyl parahydroxybenzoate, मिडज़ोलम: १.२५ मिलीग्राम, मैट्रिक्स फार्मास्यूटिकल्स, hellerup, डेनमार्क)
  2. सजगता की कमी के लिए जाँच करें (पैर की अंगुली चुटकी), गर्म ऑपरेटिंग टेबल पर चूहे जगह और आंत का पर्दाफाश करने के लिए त्वचा का एक चीरा प्रदर्शन.
  3. छोटी आंत के रूप में अधिक से अधिक संभव के रूप में एक तरफ ले जाकर बृहदांत्र के टर्मिनल भाग का पर्दाफाश । बृहदांत्र के लिए vasculature आपूर्ति की टाई और यह धीरे से यह बृहदांत्र के टर्मिनल भाग से शुरू उत्पाद, छोटी आंत की ओर बढ़ रहा है ।
    1. यदि केवल छोटी आंत का एक निश्चित हिस्सा छिड़काव के लिए आवश्यक है (ऊपरी आधा), आबकारी गैर-आवश्यक खंडों को बंद करने के बाद vasculature की आपूर्ति । ऊतक क्षति को कम करने के लिए, आइसोटोनिक खारा के साथ आंत moisturize और संयोजी ऊतक को हटाने के लिए swabs का उपयोग करें ।
  4. एक प्लास्टिक ट्यूब डालें (लंबाई: ~ 15 सेमी, बाहरी व्यास: ~ ०.४ सेमी) आंतों लुमेन में (समीपस्तल भाग में) और यह ठीक से टाई sutures का उपयोग कर । काइम के लुमेन को खाली करने के लिए आइसोटॉनिक खारा (कमरे के तापमान) के साथ सावधानी से फ्लश करें ।
  5. एक सिरिंज पंप से जुड़े 10 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर, ०.२५ मिलीलीटर/मिनट के प्रवाह पर आइसोटॉनिक खारा के साथ लुमेन को perfuse करें ।
  6. एक तरफ आंत ले जाएँ तो ऊपरी mesenteric धमनी सुलभ है और धमनी को बेनकाब करने के लिए संयोजी और वसा ऊतक को दूर.
  7. महीन बिंदु के दंश का उपयोग करके दो टांके mesenteric धमनी के नीचे रखें; एक के लिए टांके धमनी उठाने के लिए है रक्तस्राव को नियंत्रित करने के लिए एक बार धमनी काट दिया गया है और अंय कैथेटर कि धमनी में रखा जा रहा है हासिल करने के लिए है । धमनी को छिद्री न करने के लिए सावधानी बरतें ।
  8. धातु कैथेटर है कि छिड़काव के लिए सजाना प्रवाह के संग्रह के लिए नस में रखा जा रहा है हासिल करने के लिए पोर्टल शिरा के तहत दो टांके प्लेस ।
  9. mesenteric धमनी में छेद काटने से पहले, सुनिश्चित करें कि कैथेटर कि धमनी में डाला जा रहा है के लिए हवा एम्बोलस गठन को रोकने के लिए छिड़काव बफर से भर जाता है ।
  10. सर्जिकल कैंची की एक जोड़ी का उपयोग कर mesenteric धमनी में एक छोटा सा छेद में कटौती और तुरंत बाद प्लास्टिक कैथेटर डालें ।
  11. तुरंत बाद कैथेटर सुरक्षित किया गया है, रोलर पंप शुरू करने से आंत के छिड़काव आरंभ (प्रवाह दर = ७.५ मिलीलीटर/
  12. पुष्टि करें कि आंत में रक्त वाहिकाओं कुछ सेकंड के भीतर पीला हो जाते हैं, और पोर्टल शिरा पीला हो जाता है ।
  13. तुरंत उचित छिड़काव के बाद स्थापित किया गया है, पोर्टल नस में एक छेद में कटौती, धातु कैथेटर डालें और सीवन के साथ इसे सुरक्षित ।
    नोट: कैथेटर जगह करने के लिए मुश्किल हो सकता है, लेकिन सावधानी से सबसे समीपस्तल सीवन खींच द्वारा नस उठाने में मदद करता है ।
  14. एक बार कैथैटर जगह में हैं और छिड़काव उत्पादन संतोषजनक है, डायाफ्राम वेध द्वारा चूहे को मारने, कैटर्स बाहर चीर करने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा.
  15. 1 मिनट के लिए छिड़काव उत्पादन लीजिए और मात्रा को मापने । दबाव रिकॉर्डिंग कार्यक्रम में क्लिक निष्पादित प्रयोग द्वारा परफ्यूजन दबाव अधिग्रहण/रिकॉर्डिंग शुरू करें ।
  16. यह प्रयोग के दौरान बाहर सुखाने से रोकने के लिए सिक्त ऊतक के साथ आंत को कवर ।
  17. सुनिश्चित करें कि आंत के बाहर का अंत अवरुद्ध नहीं है ताकि ल्यूमिनल प्रवाह बाहर निकल सके, अन्यथा आंत प्रफुल्लित होगा, एडीमा विकसित होगा, छिड़काव दबाव बढ़ेगा, और छिड़काव उत्पादन गिरा देगा ।
  18. प्रयोग आरंभ करने से पहले लगभग 30 मिनट के लिए तैयारी छोड़ दें ।
    नोट: आंत हार्मोन के स्रावी outputs के छिड़काव के पहले 15 मिनट के लिए बहुत अस्थिर कर रहे हैं, तो इस समानता कदम एक स्थिर आधार पाने के लिए आवश्यक है.

4. प्रयोग

  1. लगभग 30 मिनट का छिड़काव करने के बाद, एक अंश संग्राहक का उपयोग कर प्रथम आधारभूत नमूना एकत्रित कर प्रयोग प्रारंभ करें । वांछित समय अंतराल पर नमूने लीजिए (जैसे, हर मिनट, 6.5-7.5 मिलीलीटर आमतौर पर एकत्र किया जाता है) और कुछ मिनट के भीतर बर्फ पर उन्हें जगह.
  2. नियमित रूप से बुलबुला जाल का निरीक्षण करें और, अगर खाली कर दिया, यह छिड़काव बफर के साथ फिर से भरना ।
    1. तीन-तरफा मुर्गा-वाल्व के माध्यम से बफर इकट्ठा तुरंत इससे पहले कि यह अंग में प्रवेश करती है और पोर्टल शिरा में डाला कैथेटर से (के बाद यह अंग के माध्यम से perfused किया गया है) की पुष्टि करने के लिए कि अंग metabolically सक्रिय है. प्रयोग के शुरू और अंत में नमूनों को एकत्र करने के लिए प्रयोगों के दौरान व्यवहार्यता का आकलन ।
    2. नमूने जल्दी से उपाय, एक स्वचालित रक्त गैस विश्लेषक के साथ, के रूप में सबसे अधिक प्लास्टिक शामिल हैं/सीरिंज पूरी तरह से airtight नहीं कर रहे हैं, वायुमंडलीय हवा के साथ आदान प्रदान करने के लिए वृद्धि दे.
  3. आधार रेखा संग्रह के 10-15 मिनट के बाद, पहले परीक्षण पदार्थ के साथ उत्तेजित । तीन-तरफा स्टॉपकॉक के माध्यम से एक सिरिंज पंप के साथ अंतर-धमनी उत्तेजनाओं को प्रशासित करना (प्रवाह = ०.३५० मिलीलीटर/
  4. एक प्रारंभिक बोलस इंजेक्शन द्वारा luminal उत्तेजक प्रदर्शन (२.५ मिलीलीटर/मिनट पहले 5 मिनट से अधिक), isotonic खारा है कि luminal में पहले से ही है की जगह, परीक्षण समाधान के प्रशासन द्वारा पीछा एक कम प्रवाह दर (०.५ मिलीलीटर/
  5. यह सुनिश्चित करने के लिए कि लुमेन जल्दी से परीक्षण पदार्थ के खाली है एक बार लुमेन उत्तेजना अवधि खत्म हो गया है, ऊपर के रूप में एक ही प्रवाह दर लागू करने से isotonic खारा के साथ आंतों लुमेन फ्लश.
  6. अगले परीक्षण पदार्थ प्रशासित करने से पहले 15-30 मिनट के लिए आधारभूत नमूने एकत्रित करें । प्रोटोकॉल के आधार पर, 2-3 परीक्षण उत्तेजनी आमतौर पर प्रयोग के अनुसार शामिल किया जा सकता है । यदि प्रायोगिक प्रोटोकॉल में किसी दिए गए स्रागोग के प्रशासन के साथ-साथ किसी दी गई आणविक साइट की सक्रियण/संदमन शामिल है, तो वह हमेशा पूर्व-उत्प्रेरक के साथ उत्तेजित करता है/ सुनिश्चित करें कि आणविक साइट secretagogue अर्क की शुरुआत में हिचकते है ।
  7. प्रोटोकॉल के अंत में, (5-10 मिनट) एक उपयुक्त सकारात्मक नियंत्रण तैयारी की जवाबदेही के लिए परीक्षण करने के लिए प्रशासन और उत्तेजना की अवधि के बाद 10-15 मिनट आधारभूत नमूने इकट्ठा ।
    नोट: कई परीक्षण पदार्थों को सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, बढ़ाने के लिए उत्तेजकों [शिविर]मैं (जैसे, foskolin या ibmx), [Ca2 +]मैं (जैसे, बॉम्बिइन या neuromedin सी), एजेंटों depolarizing (जैसे, 30-50 मिमी kcl) या अधिक इस तरह के macronutrients के रूप में फिजियोलॉजिकल प्रासंगिक उत्तेजकता: ग्लूकोज, peptones, अमीनो एसिड, आदि. हालांकि, सकारात्मक नियंत्रण का चुनाव प्रायोगिक परिणाम पर निर्भर करता है । ग्लूकोज उदाहरण के लिए एक गरीब cholecystokinin (cck) सचिवालय है, जबकि bombesin ग्लूकोज-निर्भर इन्सुलिनोट्रोपिक पेप्टाइड (gip) स्राव30के लिए एक मजबूत सचिवालय नहीं है ।
  8. प्रयोग के अंत के बाद, perfused पेट उत्पाद, यह वजन और इसकी लंबाई को मापने । यह paraformaldehyde में रखो और यह स्टोर (4 ° c) ऊतक अखंडता के संभावित बाद में हिस्टोकेमिकल विश्लेषण के लिए/नुकसान, उदाहरण के लिए एच & ई धुंधला द्वारा ।

5. जैव रासायनिक मापन

  1. एक में घर या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रेडियोइम्यूनोएसेसेस (रिया) या एलिसा-assays के उपयोग द्वारा शिरापरक प्रवाह में स्रावित पेप्टाइड्स की सांद्रता की मात्रा । अध्ययन है कि आंतों के अवशोषण की जांच के लिए, ब्याज के अणु यों तो, जैसे, ग्लूकोज या एमिनो एसिड, शिरापरक प्रवाह में.
    नोट: perfusate आमतौर पर सबसे विश्लेषण के लिए एक अच्छा बेसल बफर है, assays कि एंजाइमी प्रतिक्रियाओं (जैसे glucoseoxidase विधि द्वारा ग्लूकोज के परिमाणन के रूप में) पर निर्भर करता है सहित ।

6. डेटा विश्लेषण

  1. विभिन्न तरीकों से वर्तमान डेटा, उदाहरण के लिए एक समय-एकाग्रता ग्राफ के रूप में वास्तविक स्रावी उत्पादन (प्रवाह एक्स एकाग्रता) दिखा रहा है और स्तंभ प्लॉट के रूप में आधारभूत और प्रतिक्रिया अवधि के दौरान कुल स्रावी उत्पादन (आमतौर पर 10-15 समय अंक) चित्रण.
  2. एकाग्रता इकाइयों के रूप में संबंधित हार्मोन की वास्तविक मापा एकाग्रता प्लॉट. (pmol/L),
    नोट: यह बजाय उत्पादन के रूप में डेटा व्यक्त करने के लिए बेहतर है (fmol/min) क्योंकि इस मॉडल के साथ, इसके विपरीत में vivo अध्ययनों में, प्राप्त मूल्यों वास्तविक स्रावी उत्पादन कर रहे हैं (क्योंकि छिड़काव के निरंतर संग्रह के प्रवाह).
  3. सांख्यिकीय विश्लेषण किए जाने वाले समूहों की संख्या के आधार पर, दो-पुच्छ युग्मित t-परीक्षण (दो समूह) या दोहराए गए मापन के लिए एक-तरफा anova (दो समूहों से अधिक) का उपयोग करके एकाधिक तुलनों के लिए एक उपयुक्त पोस्ट-हॉक परीक्षण के बाद.

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Representative Results

निर्धारित करने की क्षमता है कि क्या एक दिया उत्तेजना ब्याज की आंत हार्मोन के स्राव का कारण बनता है एक स्थिर आधारभूत स्राव पर निर्भर करता है. इसके अलावा, अगर उत्तेजना के लिए कोई प्रतिक्रिया नहीं मनाया जाता है, सकारात्मक नियंत्रण के लिए एक मजबूत स्रावी प्रतिक्रिया को बाहर करने के लिए स्पष्ट होना चाहिए कि परीक्षण उत्तेजना के जवाब की कमी जवाबदेही की एक सामान्य कमी को प्रतिबिंबित नहीं करता है । चित्रा 2a और 2a अच्छी गुणवत्ता डेटा का एक उदाहरण से पता चलता है; पृथक perfused चूहे छोटी आंत से glp-1 स्राव 1 मिनट के अंतराल पर दिखाए जाते हैं (± SEM का मतलब है) । आधारपाल परिस्थितियों में स्राव स्थिर होता है; परीक्षण उत्तेजना (इंसुलिन) के प्रशासन से पहले और बाद में, और सकारात्मक नियंत्रण (बॉम्बेन (bbs)) के लिए एक मजबूत स्रावी प्रतिक्रिया स्पष्ट है । इसके अलावा, बेसल शर्तों पर औसत जीएलपी-1 स्राव (इंसुलिन या बीबीएस प्रशासन से पहले संबंधित आधारभूत अवधि के दौरान) और इंसुलिन और बीबीएस उत्तेजना के दौरान औसत स्राव बार ग्राफ के रूप में दिखाया जाता है (± SEM का मतलब है) । स्राव दोहराया माप के लिए एक तरफा anova द्वारा सांख्यिकीय महत्व के लिए परीक्षण किया गया था. इन संयुक्त डेटा के आधार पर, यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि इंट्रा-धमनी इंसुलिन अलग perfused चूहे छोटी आंत से glp-1 स्राव को उत्तेजित नहीं करता है ।

चित्रा 2c और 2d अलग perfused चूहे छोटी आंत से glp-1 स्राव का एक उदाहरण से पता चलता है । चित्रा 2a और 2aके विपरीत, इन आंकड़ों के गरीब गुणवत्ता के हैं; स्राव बेसल की स्थिति में अस्थिर होता है और एक तरह से भर जाता है जो पदार्थ प्रशासनों का परीक्षण करने के लिए असंबंधित प्रतीत होता है (इंट्रा-ल्यूमिनल और इंट्रा-धमनी फ्रुक्टोज, क्रमशः) और सकारात्मक नियंत्रण, बीबीएस, परिणाम नहीं देता है सांख्यिकीय महत्वपूर्ण वृद्धि हुई glp-1 स्राव. इसलिए, यह निष्कर्ष निकालना असंभव है कि फ्रुक्टोज उद्दीपन जीएलपी-1 स्राव को जन्म देता है, उदाहरण के लिए, संवहनी फ्रुक्टोज उत्तेजना के अंत में बढ़ा हुआ जीएलपी-1 स्राव एक फ्रुक्टोज-मध्यस्थता प्रतिक्रिया या नहीं है ।

Figure 1
चित्रा 1: एक छिड़काव सेटअप का एक उदाहरण । प्रणाली एक सामिल खड़े, एक गर्म ऑपरेटिंग टेबल, बुलबुला जाल, एक दबाव गेज और छिड़काव दबाव समायोजन के लिए धुरी पंप में निर्माण के साथ एक गर्मी exchanger के होते हैं । छिड़काव प्रणाली एक थर्मास्टाटिक परिपत्र जो मार डाला (९५% हे2, 5% सह2) छिड़काव ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए बफर तपता से जुड़ा हुआ है । इसके अलावा, परफ्यूजन दबाव लगातार दर्ज की गई है और दबाव रिकॉर्डिंग ट्रांसड्यूसर और कल्पना और उपयुक्त सॉफ्टवेयर के साथ एक पीसी पर सहेजा द्वारा transduced । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: पृथक perfused चूहे छोटी आंत से डेटा । (a, B) एक अच्छी तरह से निष्पादित प्रयोगों और विश्वसनीय डेटा का एक उदाहरण है, (C, D) उप-इष्टतम डेटा का एक उदाहरण जहां छिड़काव दबाव में वृद्धि हुई है, और छिड़काव उत्पादन नाटकीय रूप से अध्ययन के समय पाठ्यक्रम में कमी आई है । (क) जीएलपी-1 (कुल) निर्गत (फमोल/न्यूनतम) को आधारीय स्थितियों में तथा इंट्रा-धमनी इंसुलिन प्रशासन (२०० तथा १,००० बजे) के उत्तर में दर्शाया गया है । एक प्रसिद्ध, शक्तिशाली जीएलपी-1 सचिवालय बॉम्बिइन (bbs), को प्रतिसादिता (pos. नियंत्रण) के लिए नियंत्रित करने के लिए प्रयोग के अंत में अंतर-धमनी का संचार किया गया था । आंकड़ों के रूप में प्रस्तुत कर रहे है ± SEM, n = 4 । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

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Discussion

पृथक perfused चूहा छोटी आंत एक शक्तिशाली अनुसंधान उपकरण है कि गतिशीलता और आणविक आंत हार्मोन स्राव अंतर्निहित तंत्र विस्तार से अध्ययन करने की अनुमति देता है । इस मॉडल के साथ डेटा के सफल उत्पादन के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम शल्य चिकित्सा आपरेशन है । आंत की हैंडलिंग अनिवार्य रूप से आंत को कुछ नुकसान का कारण होगा और इसलिए एक निरपेक्ष ंयूनतम करने के लिए रखा जाना चाहिए । इससे भी अधिक महत्वपूर्ण बात, आपरेशन की गति महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से mesenteric धमनी में कैथेटर प्लेसमेंट के लिए समय के संबंध में. हमारा अनुभव है कि कैथेटर सफलतापूर्वक रखा जाना चाहिए, और छिड़काव पोत में छेद काटने के बाद मिनट के एक जोड़े के भीतर शुरू किया जाना चाहिए । कैथीटर की नियुक्ति आपरेशन के सबसे चुनौतीपूर्ण हिस्सा है और mesenteric धमनी और पोर्टल शिरा की पतली दीवार के छोटे आकार से जटिल है, और इस कदम के कुछ अभ्यास की आवश्यकता है । शिरापरक कैथेटर की त्वरित प्रविष्टि हालांकि, mesenteric धमनी के लिए मामले के रूप में के रूप में तत्काल नहीं है, आंत अब perfused किया जा रहा है और जीवित रखा के रूप में । प्रयोग को पूरा करने के लिए अगला महत्वपूर्ण कदम है । ऑपरेशन सफलतापूर्वक किया गया था, तो perfused आंत आमतौर पर कामयाब और अप करने के लिए 3 ज के लिए उत्तरदायी हो जाएगा, और छिड़काव दबाव और उत्पादन आमतौर पर पूरे प्रयोग पर स्थिर रहेगा. इस स्तर पर एक सफल प्रयोग के लिए सबसे महत्वपूर्ण कारक प्रणाली में हो रही बुलबुले से बचने के लिए है, क्योंकि यह हवा embolization जो या तो तुरंत कम कर देता है या छिड़काव उत्पादन समाप्त का कारण बनता है । के रूप में छिड़काव बफर bsa शामिल है और perfused पेट के लिए पर्याप्त ऑक्सीजन वितरण सुनिश्चित करने के लिए मार डाला है, यह पूरी तरह से बुलबुले के गठन को रोकने के लिए मुश्किल है । बुलबुले, तथापि, सिस्टम ' बुलबुला जाल में फंस जाना चाहिए, लेकिन यह समय के साथ (अधिक बुलबुले, तेजी से खाली) खाली हो जाता है और यह बुलबुला जाल पर एक करीबी घड़ी रखने के लिए और जब जरूरत है यह छिड़काव बफर के साथ फिर से भरना महत्वपूर्ण है । यह भी करने के लिए ७.५ से नीचे perfusate पीएच रखने के लिए महत्वपूर्ण है-पीएच बढ़ाने पर, कैल्शियम कार्बोनेट precipitates फार्म हो सकता है, केशिका प्रवाह में बाधा डाल और छिड़काव दबाव में एक गंभीर वृद्धि के कारण ।

perfused आंत एक बल्कि मजबूत तैयारी है, लेकिन यह इस तरह के पित्त एसिड, इथेनॉल और dmso के रूप में डिटर्जेंट की उच्च सांद्रता बर्दाश्त नहीं करता है । इसलिए, डिटर्जेंट के उपयोग को अधिमानतः टाला जाना चाहिए, लेकिन कभी-कभार समाधान में खराब घुलनशील यौगिकों को प्राप्त करने की आवश्यकता होती है । perfused आंत आम तौर पर डिटर्जेंट इंट्रा-vascularly से इंट्रा-luminally बेहतर प्रशासित सहन करता है । उदाहरण के लिए, 1 मिमी टैरोडीऑक्सीकोलिक एसिड (एक द्वितीयक, संयुग्मित पित्त एसिड) को प्रशासन ने तब अच्छी तरह से सहन किया जब इंट्राएलुमीनाली का संचार हुआ, लेकिन तुरन्त अवरुद्ध छिड़काव उत्पादन में हुआ जब इंट्रा-धमनी2दिया गया । संवहनी उत्तेजनाओं के लिए, अविशिष्ट स्रावी प्रतिक्रियाओं से बचने के लिए 1% से नीचे अंतिम dmso एकाग्रता रखने (dmso उत्तेजित करता है, उदाहरण के लिए, glp-1 स्राव) और ऊतक क्षति के कारण से बचने के लिए वृद्धि हुई छिड़काव दबाव में जिसके परिणामस्वरूप और कम छिड़काव आउटपुट. अगर छिड़काव का दबाव 20% से अधिक बढ़ जाता है या अगर एडीमा विकसित होता है, तो प्रयोगों को नजरअंदाज किया जाना चाहिए, यदि परफ्यूजन आउटपुट अध्ययन के दौरान 20% से अधिक कम हो जाता है । इन स्थूल सफलता मापदंड का पालन (mesenteric धमनी में कैथेटर के त्वरित प्रविष्टि सहित) आमतौर पर अच्छी गुणवत्ता में ~ 14/15 प्रयोगों में परिणाम ।

प्रयोग पूरा करने के बाद, अगले महत्वपूर्ण प्रक्रिया के लिए उचित विधि और हार्मोन का परिमाणन के लिए परख का चयन है (s) ब्याज की । उच्च के माध्यम से डाल पेप्टाइड हार्मोन का आसादन किया जा सकता immunoassays का उपयोग कर: radioimmunoassay या elisa. किसी भी दर पर, यह उच्च नमूना quantification के लिए उपयोग करने से पहले संबंधित assays सत्यापित करने के लिए सिफारिश की है, के रूप में नहीं सभी वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध assays संवेदनशीलता के संबंध में संतोषजनक प्रदर्शन, विशिष्टता और सटीकता (के बारे में उदाहरण के लिए जीएलपी-131) । विशिष्टता के संबंध में, क्रॉस-जेट हमेशा की तरह, एक चिंता का विषय है । अविशिष्ट हस्तक्षेप और मैट्रिक्स प्रभाव आम तौर पर कम कृत्रिम प्लाज्मा की तुलना में perfusates के साथ स्पष्ट कर रहे हैं । के साथ संवेदनशीलता का संबंध है, यह अक्सर बहुत आसान है के रूप में पेप्टाइड सांद्रता अक्सर उच्च रहे है क्योंकि perफ्यूजन प्रवाह प्रणालीगत परिसंचरण में पतला नहीं है और क्योंकि विवो अध्ययन में से से perfusions से विश्वसनीय डेटा प्राप्त करने के लिए क्योंकि उन्मूलन प्रक्रियाओं (यकृत/फेफड़ों/गुर्दे) से बचा जाता है । आमतौर पर, शिरापरक बहि में आधारभूत सांद्रता सबसे assays के निचले कार्य रेंज के भीतर झूठ (जीएलपी के मामले में-1 (कुल), न्यूरोटेनसिन (कुल) और pyy (कुल): 8-15 pmol/l) जबकि प्रेरित प्रतिक्रियाओं के रूप में के रूप में उच्च तक पहुँच सकते हैं 200-300 pmol/l3.

इसकी तुलना में, स्वस्थ मनुष्यों, चूहे या चूहों से प्लाज्मा में एक ही हार्मोन की आधारभूत मूल्यों आम तौर पर कर रहे हैं और 5-10 pmol/l जबकि प्रतिक्रिया मान रहे हैं 15-30 pmol/l3,३२.

यदि पूर्वनिर्धारित सफलता मानदंडों का पालन कर रहे हैं, उत्पंन छिड़काव डेटा अच्छी गुणवत्ता के आम तौर पर कर रहे है और सांख्यिकीय विश्लेषण तो सीधा है । पृथक perfused चूहे या माउस अग्ंयाशय से ग्लूकागन, इंसुलिन और सोमेटोस्टेटिन के स्राव की तुलना में, आंत हार्मोन का बेसल स्राव स्थिर है, और बल्कि मापा सांद्रता के बारे में प्रयोगों के बीच समान है, और स्राव नहीं है स्पष्टतः पुलस्टिले. सामूहिक रूप से, डेटा सेट में भिन्नता इसलिए न्यूनतम है और तीन छिड़काव प्रयोगों के रूप में कम के रूप में एक नमूना आकार अक्सर सांख्यिकीय महत्व तक पहुँचने के लिए पर्याप्त है. हालांकि, मानकीकरण और प्रकार-2-त्रुटियों से बचने के लिए, साथ ही कम अच्छी तरह से स्पष्ट प्रतिक्रियाओं की अनदेखी की संभावना को कम करने के लिए, छह से आठ का एक नमूना आकार की सिफारिश की है.

संक्षेप में, पृथक perfused चूहा छोटी आंत एक महत्वपूर्ण है, भौतिक रूप से प्रासंगिक, प्रयोगात्मक मॉडल है कि आंत हार्मोन के स्राव पर एक दिए गए पदार्थ के प्रत्यक्ष प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. महत्वपूर्ण मौलिक प्रश्न, जैसे आंत में जहां एक सचिवालय स्राव को उत्तेजित करता है, चाहे वह luminally या basolaterally स्थित सेंसर के सक्रियण के माध्यम से स्राव को उत्तेजित करता है, और जो आणविक सेंसर सक्रिय कर रहे हैं और इस प्रकार के लिए जिम्मेदार इस मॉडल के साथ स्राव को विस्तार से संबोधित किया जा सकता है । यह, तथापि, मांयता प्राप्त होना चाहिए कि दाता जानवर से आंत के वियुग्मन, कुछ अध्ययन के सवालों के लिए, प्रासंगिकता का हो सकता है । उदाहरण के लिए, आंत जिगर के साथ बारीकी से सूचना का आदान प्रदान (आंत-जिगर अक्ष) और मस्तिष्क (आंत-मस्तिष्क अक्ष), और तंत्र है कि इस पार बात पर भरोसा इसलिए इस मॉडल के साथ जांच नहीं की जा सकती. आपरेशन की गुणवत्ता डेटा की गुणवत्ता के लिए महत्वपूर्ण कारक है और एक सफल आपरेशन के लिए सबसे महत्वपूर्ण कारक है एक ंयूनतम करने के लिए आंत की हैंडलिंग रखने के लिए और जल्दी आंत का छिड़काव शुरू करने के लिए एक बार mesenteric धमनी काट दिया गया है । यह हमारे अनुभव है कि अच्छी गुणवत्ता के डेटा का उत्पादन कर रहे है इससे पहले कि यह अभ्यास के 2-4 महीने लगते हैं । हालांकि, एक बार तकनीक सीखा गया है, इस विधि की संभावनाओं लगभग अंतहीन है और केवल परीक्षण पदार्थों की घुलनशीलता और किसी भी संभावित हानिकारक प्रभाव परीक्षण पदार्थों के द्वारा सीमित perfused ऊतक पर हो सकता है ।

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Disclosures

इस काम के लेखक इस लेख के लिए प्रासंगिक ब्याज की कोई संभावित टकराव की घोषणा ।

Acknowledgments

इस काम के लिए एक अप्रतिबंधित अनुदान द्वारा समर्थन किया गया था प्रो जेंस मूल चयापचय अनुसंधान (नोवो nordisk फाउंडेशन, डेनमार्क), के लिए novo nordisk फाउंडेशन से एक अलग अनुदान के लिए novo nordisk केंद्र से कृंतक परफ्यूजन अध्ययन (अनुदान सं । NNF15OC0016574), यूरोपीय अनुसंधान परिषद (अनुदान सं 695069) और अनुसंधान, प्रौद्योगिकीविकास, और प्रदर्शन गतिविधियों (अनुदान no. २६६४०८) के रूप में अच्छी तरह के रूप में एक postdoc के लिए सातवीं रूपरेखा कार्यक्रम से प्रो holst के लिए एक अनुदान लुंडबेक फाउंडेशन (R264-2017-3492) से रूण ई. कुहरे को अनुदान । हम सावधान प्रूफरीडिंग के लिए jenna ई. हंट और कैरोलिन एफ deacon धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals for perfusion buffer
Bovine serum albumin (BSA) Merck 1.12018.0500
Calcium chloride dihydrate (CaCl2 x 2 H2O) Merck 102382
Dextran 70 Pharmacosmos 40014
Fumaric acid disodium salt (C44H2Na2O4) Sigma Aldrich F9642
Glucose (C6H12O6) Merck 108342
Magnesium sulfate hepatahydrate (MgSO4) Merck 105886
Potasium chloride (KCl) Merck 104936
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) Merck 104873
Pyruvic acid sodium salt (C3H3NaO4) Merck 106619
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Merck
Sodium chloride (NaCl) Merck 106404
Sodium L-glutamate monohydrate (C5H8NNaO4 x H2O) Merck 106445
Name Company Catalog Number Comments
Perfusion equitment
Universial perfusion system Harvard Bioscience, Inc. 732316
BASIC UNIT UNIPER UP-100, TYPE 834 Harvard Bioscience, Inc.
Roller Pump, with four channels Harvard Bioscience, Inc. 730100
Windkessel Harvard Bioscience, Inc. 732068
Thermostatic Circulator,Bath Volume 3L, 230V/50Hz Harvard Bioscience, Inc. 730125
Operating table, heated on tripod stand, type 873 Harvard Bioscience, Inc. 733776
Cannula with basked, OD = 2.0 mm, ID = 1.0 mm Harvard Bioscience, Inc. 733313

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References

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चिकित्सा मुद्दा १४४ पृथक perfused चूहे छोटी आंत आणविक सेंसर आंत हार्मोन स्राव पोषक तत्व अवशोषण अक्षुण्ण सेलुलर ध्रुवीकरण ग्लूकागन-जैसे pepide-1 आंत हार्मोन स्राव का अध्ययन करने के लिए तरीके.
अलग perfused चूहे छोटी आंत का उपयोग आंत हार्मोन स्राव अंतर्निहित तंत्र
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Kuhre, R. E., Holst, J. J. Mechanisms Underlying Gut Hormone Secretion Using the Isolated Perfused Rat Small Intestine. J. Vis. Exp. (144), e58533, doi:10.3791/58533 (2019).

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