Summary
Burada, gut hormonu salgılanması ve bağırsak emilim temel moleküler mekanizmaları incelemek için güçlü ve fizyolojik bir modeli mevcut — izole sıçan periosteum ince bağırsak.
Abstract
Bağırsak vücudun iştahı ve gıda alımı, sindirim, besin emilimi ve dağıtım ve sonrası prandial glikoz geziler düzenleyen 15'den fazla farklı peptid hormonları üreten en büyük endokrin organıdır. Gut hormonu salgılanması düzenleyen moleküler mekanizmaları anlama anlama ve gut hormon Fizyoloji çeviri için esastır. Geleneksel olarak, gut hormonu salgılanması yatan mekanizmaları da içinde (deneysel hayvan veya insan) vivo incelendiği veya gut hormon salgılayan İlköğretim Mukozal kullanarak hücre kültürleri veya satırları hücre. Burada, bir izole sıçan periosteum ince bağırsak bağırsak hormonu salgılanması eğitim için alternatif bir yöntem olarak tanıtmak. Çoğu Fizyolojik açıdan önemli parametrelerden biri Mukozal polarizasyon, parakrin ilişkileri ve yolların da dahil olmak üzere içinde vivo çalışmalarda salgı sorumlu beyannamedir anlam bozulmamış gut yapılmasını gerektirecek ayarlamalardan bu model erdemleri vardır perfüzyon/uyarıcı pozlama. Buna ek olarak ve içinde vivo çalışmalar, aksine izole sıçan periosteum bağırsağın hemen hemen tam deneysel kontrol ve salgı doğrudan değerlendirilmesi için sağlar. Tüp Bebek çalışmaları aksine, büyüklüğü ve salgı ve ne uyaranlara salgı gut (luminal veya vasküler) hangi taraftan olduğunu farklı gut hormonların salgılanmasını neden gibi önemli soruları için dinamikleri çalışma mümkündür teşvik ve salgı yanıt arka plandaki ayrıntı moleküler sensörler çözümlemek için. Ayrıca, hazırlık, bağırsak emilim ve bağırsak emilim sorumlu taşıyıcılar da dahil olmak üzere dinamikleri ile ilgili detayları için güçlü bir modeldir.
Introduction
Bağırsak vücudun düzenleyen besin emilimi ve besin bırakma, bağırsak büyüme ve iştah1modüle 15'den fazla farklı peptid hormonları üreten en büyük endokrin organıdır. Gut hormonlar bu nedenle, birçok temel fizyolojik süreçlerinde söz konusu ve salgı ve ilgili hormon salgısını kontrol moleküler detaylar bu desen anlayışı böylece bizim temel fizyolojik önemlidir anlayış ve gut hormon eylemler translasyonel yönlerini adresleme için; Ama nasıl bir gut hormonu salgılanması temel moleküler algılama mekanizmaları eğitim alabilirim? Genel olarak, hormon salgılanması olduğu gibi organizmalar (insan veya deneysel hayvan), izole gut hazırlıklar veya gut hormon salgılayan birincil hücre kültürleri okudu olabilir veya hücre kültürleri2,3, ölümsüzleştirilmiş 4 , 5 , 6. en uygun zaman çözünürlüğü (salgı oranları herhangi bir saat ile belirlenen ile ayrıntılı olarak incelenecektir için gut hormonların salgılanmasını sağlar fizyolojik ilgili bir modeldir izole sıçan periosteum ince bağırsak bizim tercih edilen modelidir İkinci aşağı temel), ve sonuçları da muhtemel bir içinde vivo durum7için transferrable. Burada, biz bu yordamı gerçekleştirme konusunda detaylı bir protokol sağlar, ancak ilk gut hormonu salgılanması, faydaları ve sınırlamaları izole sıçan periosteum bağırsağın karşılaştırıldığında bu modellerin de dahil olmak üzere eğitim için diğer yöntemleri tartışacağız.
Eğer bir belirli bir bileşik bazı gut hormonların salgılanmasını düzenleyen kurmak dilek, çalışmalar insanlarda nihai hedefi vardır. Bunu doğruladı, böylece, bir bileşik kemirgen (VIVO veya perfusions) bir veya daha fazla gut hormonların salgılanmasını üzerinde büyük etkileri gösterir veya hormon salgılayan hücreleri (hücre hatları veya Primer hücre), bu etkiyi sadece tıp ve insan fizyolojisi için uygun olur insanlarda. Ancak, insanlarda yapılan çalışmalar türü için net sınırlar vardır ve içinde vivo çalışmalar deneysel hayvanlar üzerinde bu nedenle, bu tür çalışmalar için en iyi ikinci seçenek çoğu kez. Fare ve sıçanlar vardır muhtemelen nedeniyle uygun büyüklükleri, düşük maliyetli ve genetik olarak belirli çalışma soruları dahil olmak şüpheli genler değiştirmek için seçenek en sık kullanılan deneysel hayvan (örneğin, belirli bir ışınlama dışarı vurmak veya reseptör). Genel olarak, içinde vivo modelleri fizyolojik sağlam olmaktan yarar ama bazı sınırlamaları da mevcuttur. Çoğu deneyleri gut hormon miktar için en az 20 µL gerektiği en önemlisi, küçük kemirgen, özellikle fareler, kısıtlayıcı bir faktör büyüklüğünde plazma (ve genellikle çok daha fazlası), en az anlamını 100 µL kan bir yinelenen yapmak içine kapanık olması gerekiyor miktar. Bu nedenle, bu sadece çok az örnekleri temel örnekleri için karşılık gelen ve bir ya da iki sonrası stimülasyon örnekleri (20 g bir fare toplam kan hacmindeki ~1.4 mL'dir) elde etmek mümkündür. Sonuç olarak, potansiyel salgı yanıt (örneğin, hızlı bir şekilde veya geç meydana gelen yanıt) bu nedenle özledim.
Perfüzyon modelinde, bu sorunu aşmak, büyük örnek olarak birimleri elde edilen (akış hızı: 7,5 mL/dak) ve toplama aralıkları hızlı ve kısa ömürlü yanıt kaçırmayın emin olmak için gerektiği şekilde ayarlanabilir (biz toplamak örnekleri her dk)7 . Başka bir konuda Rodents vivo çalışmalarda çoğu gut hormonlar daha fazla hızla ortadan ya da daha sonraki biyokimyasal analiz karmaşık hale hangi insanlar8,9,10', metabolize edilir. Örneğin, GLP-1 farelerde insanlar bile daha hızlı bir oranda metabolize edilir (1-2 dk11T1/2 mi nerede) gösterdik ve daha da önemlisi, GLP-1 bölünme farelerde, N-terminal bölünme tarafından ek olarak içeren dipeptidyl-peptidaz-(büyük GLP-1 aşağılayıcı enzim insanlarda olan) 4 (DPP4), daha fazla bölünme enzim tarafsız endopeptidase 24.1112tarafından. Sonuç olarak, ya sağlam izoformu GLP-1 (7-36amide) veya DPP-4 i ciddi izoformu (9-39amide) temel alan, geçerli ticari deneyleri GLP-1, miktar için büyük ölçüde GLP-1 salgı farelerde hafife ve sonuçları yanıltıcı neden 12. izole sıçan periosteum bağırsakta salgılanan hormonlar, metabolizma çoğunu ortadan veya belirgin azaltılmış, plazma-aracılı bozulması kaçınılması ve karaciğer/böbrek/akciğer çıkarma/bozulması (çünkü engellenir gut bırakır olarak perfusate toplanır).
Tabii ki, önemli fikir genetiği değiştirilmiş hayvanlar, örneğin, sodyum-glikoz taşıyıcı-1 nakavt fareler13, kullanımıyla oluşturulabilir ancak moleküler sensörlerin salgı kez ilgili ayrıntılı bir değerlendirme gerektirir İyon kanalları için moleküler taşıyıcı ve farklı G protein birleştiğinde reseptörleri hücre içi proteinlere değişen birden fazla moleküler site dikkate. Örneğin, dokuz farklı moleküler sitelerin faaliyet moleküler sensörler glikoz uyarılmış GLP-1 salgı7için sorumlu çözülüyor zaman hedef. Benzer bir soruşturma mümkün içinde kullanılan bileşiklerin bazı belirsiz gibi vivo veya zararlı/ölümcül etkiler olmaz. Örneğin, perfused gut kullanırken, GLP-1 ve neurotensin salgılanması için içi hücresel glikoz metabolizmasının rol ATP oluşumu rolünün yanı sıra 2-4-dinitrophenol7,14 ile bloke ederek değerlendirmek mümkün Voltaj kalsiyum kanalları için safra asidi GLP-1, NT ve PYY salgısı3uyarılmış. Gerçekten de, çok zehirli sodyum kanal engelleyici Tetradotoksin perfüzyon çalışmaları başarılı bir şekilde uygulanabilir. Son olarak, perfüzyon modelinde bu doğrudan nerede gut belirli bir bileşik bir bazı hormon salgılanmasını araştırmacı sadece seçin ve istenen bölge sıvı için hazırlamak ve aynı zamanda bunun araştırılması gibi harekete geçirir tespit edilebilir olup olmadığını bir uyarıcı salgı moleküler sensörler etkinleştirme tarafından bağırsak3,15,16luminal veya vasküler taraftan neden olur.
Temel gut hormonu salgılanması da tarafından okudu salgı mekanizmaları (insan dokusu da dahil olmak üzere), gut doku parçaları (fare ve insan kaynaklı), hücre satırlarını salgılayan gut tarafından ölümsüzleştirilmiş birincil bağırsak kültürler (genellikle fareler), hormon kullanın. doku Ussing odaları ya da organoids (her ikisi de genellikle fareler)2,3,4,5,6,17,18monte. Bağırsak perfusions göre insan gut parçaları, birincil hücre kültürleri ve hücre hatları çalışmalar gerçekleştirmek teknik olarak daha kolay ve veri üreten bir daha hızlı ve daha ucuz yolu vardır ama tabii çalışma gut adet taze insan gut erişmesi numuneler. Ancak, bu modelleri bağırsak normal hücre kutuplaşma bu modeller moleküler sensörlerin normal harekete geçirmek değerlendirmek için kullanılamaz ve emme süreçleri de okudu değil doğal olarak kaybolur. Ayrıca, bu tür çalışmalar genellikle statik incubations istihdam (için birkaç saat kadar) olan son derece fizyolojik olmayan ve salgılanan ürün kaldırılmaz ve böylece geribildirim etkileyebilir çünkü hücrelerin normal salgı dinamikleri ile ilgisi yok hormonların salgılanmasını. İçinde emme ve salgı normal bir hızla oluşan bu yüzden transmucosal degradeler korunur sağlamak vivo, oldukları gibi buna ek olarak, perfused bağırsaklarda salgılanan ve absorbe molekülleri verimli Mukozal mikro tarafından kaldırılır. Ayrıca, hücre kültürlerinde hala rağmen onlar artık temsilcisi peptid içeriği açısından yerel hücre ve moleküler sensörler, ifade vardır anlamına gelir onların yerli enteroendocrine hücre arterin dedifferentiated söz konusu hormon salgılar. Bu, örneğin, GLP-1 salgılayan hücre hatları19böyledir.
Bu nedenle, birincil hücre kültürleri veya hücre çalışmaları çizgi bize göre en uygun amaçlar süzmek için ve gerçekleştirilen vivo içinde olamaz türleri deneyler gerçekleştirmek için veya izole perfused gut olduğunu. Örneğin, birincil hücre ve hücre satırı kültürler gerçek gücünü o intra hücresel ikincil olduğunu peygamberler (örneğin Ca2 +, kamp, NAD(P)H) gerçek zamanlı olarak izlenen ve elektrik hücreleri salgılayan hormon sinyal olabilir 20,21,22araştırıldı. Buna ek olarak, belirli inhibitörleri mevcut20,21,22,23,24değilseniz özellikle yararlı olan siRNA nakavt yapılabilir. Fareler Ussing odasında monte bağırsak dokusundan son zamanlarda kullanılan moleküler mekanizmaları safra asidi uyarılmış GLP-1 salgılanması ise bağırsak organoids (dan fareler) temel eğitim için ve insan gut parçaları da kullanılmıştır çalışmak için gut hormon salgısı17,25moleküler ayrıntıları. Oysa olmaktan eski faydaları2 polarize tümü bu modellerin statik incubations ilgilidir. Çalışmalar insan gut parçalar üzerinde ancak, doku ifade 7TM reseptörlerinin türler fark beri önemli olan insan yerine, kemirgen, doku kullanarak yararlı ve moleküler taşıyıcı farklı moleküler algılama yolları arasında neden olabilir bir tür. Aslında, bu alanda en çok veri domuz, fare ya da sıçan çalışmalar tarafından üretilen ve bu bulgular insanlar için transfer edilebilir zor kalır. Ancak, glikoz uyarılmış GLP-1 salgı altında yatan moleküler algılama mekanizmaları arasında fare, sıçan, adam, benzer gibi görünen güven verici olduğunu ve transcriptomic ve peptidomic fare ve insan L-hücreleri profil oluşturma ortaya güçlü küresel iki tür7,18,26,27arasındaki benzerlikler.
İzole sıçan periosteum ince bağırsak, ancak, aynı zamanda düşünülmesi gereken bazı sınırlamalar vardır. En önemlisi, bu olup olmadığını belirli bir salgı yanıt sonuçları hedeflenen hormon üreten hücrelerin test madde tarafından doğrudan harekete geçirmek ya da daha doğrusu dolaylı bir mekanizma tarafından neden belirlemek mümkün değildir. Örneğin, KCl anında perfused bağırsak7GLP-1 salgısı artar ama bu L hücrenin doğrudan depolarizasyon sonucu veya depolarizasyon nöronların L-hücreleri yakın veya etkileri sonuçları bilinmeyen kalır aynı anda parakrin uyarıcılar/inhibitörleri piyasaya. Veri olan salgı temel moleküler mekanizmaları aydınlatmak için amacı perfused bağırsak kullanarak çalışmalardan doğan bu nedenle, her zaman bağlam içine kurmak için yeteneğini artırmak için daha özel diğer modellerden elde edilen verilerle konması nedensellik. Örneğin, glikoz uyarılmış GLP-1 salgı GLP-1 secreting hücre kültürünü GLUTag28,29 ve birincil fare L-hücreleri glikoz taşıyıcı (SGLT1 ve GLUT2) faaliyete bağlıdır. Bu taşıyıcı periosteum sıçan küçük bağırsak engelleme salgı20glikoz uyarılmış GLP-1 salgılanması büyük ölçüde glikoz L-hücre üzerinde doğrudan eylemler tarafından aracılık ettiği olasılığı anlamına gelir, zayıflar. Başka bir önemli izole perfused bağırsak lipidler bazıları kendi hydrophobicity nedeniyle çalışma zordur kısıtlamasıdır. Son ürünler lipid sindirim (yağ asitleri, diacyl glycerols, lysophosphatidylglycerols, vb) araştırmak mümkündür ancak ve hazırlık lipidler intra cellularly ve belki de yeniden esterify ancak onları içine paketi silomikron, silomikron hücreleri ve onların sonraki alımı villus lacteals tarafından taşınması bozulur, izole gut lenf akışında güvenli olamaz beri. Hücrelerinde birikir absorbe ürünleri başladıktan sonra büyük olasılıkla, bu nedenle, lipid emme durdurulur. İn vitro hücre sistemleri kutuplaşma onların eksikliği nedeniyle daha az lipid çalışmalar için uygundur. Açıkçası, bu kısıtlama sadece emilir ve lacteals yolu ile taşınan lipidler için geçerlidir, bu bağırsak kan damarları yolu ile absorbe ise normal olarak ele alınması muhtemeldir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Danimarka hayvan deneyleri Müfettişliği (2013-15-2934-00833) ve yönergeleri hayvan deneme (1987) ve ulusal yöneten Danimarka mevzuatı uyarınca yerel etik kurul iznine sahip tüm çalışmalar yapılmıştır Sağlık (yayın numarası 85-23) Enstitüleri.
1. deneysel hayvan
- Erkek Wistar rats (250 g) elde etmek ve kafes, standart chow ve su, ad libitum erişim başına 2 ev ve bir 12: 12'korumak s koyu döngüsü. Bizim Hayvanlar imkanları olmayan tedavi su ve Alrtromin kemirgen chow (1319 FORTI, Brogaarden, Lynge, Danimarka) kullanır.
Not: hayvanlar iklimlendirme en az bir hafta izin.
2. ameliyat öncesi hazırlıklar
- Perfüzyon arabellek olun: Krebs-zil bikarbonat arabellek takıma % 0,1 BSA (kesir V), % 5 dextran T-70, 3.5 mmol/L glikoz ve 5 mmol/L pyruvate, fumarat ve (gerekirse) Glutamat; pH 7.4.
- Filtre uygun bir boyut süzülerek perfüzyon arabellek yeterli miktarda hazırlamak ve dropwise buna ek olarak 5 M HCl tarafından pH ~7.5 için ayarlayın.
- 3-İzobütil-1-methylxanthine (IBMX) (gerekirse) 10 µM son bir konsantrasyon için çalışma gününde arabelleğe doğrudan ekleyin.
Not: IBMX hassasiyet ve salgı uyarıcı hormon salgılayan açısından gut yanıt [kampı]ben artırır ve böylece bir fosfodiesteraz inhibitörü olduğunu. - Test isn'ta hazırlayın. Filtre uygulanmış ve pH-düzeltilir perfüzyon arabelleği istenen son konsantrasyonu daha yüksek konsantrasyon x 20 vasküler uyaranlara hazırlayın. Son konsantrasyon izotonik salin luminal test uyaranların hazırlayın.
- % 100 Dimetil sülfoksit (DMSO) kolayca çözünen bileşikler dağıtılması ve seyreltik perfüzyon arabellek veya izotonik salin daha fazla. Vasküler uyaranlara için son DMSO konsantrasyonu % 1 veya daha düşük, bu bağırsak zarar ve belirsiz gut hormonu salgılanması için neden olabilir konsantrasyonları yukarıdaki olarak tutmak. PH ölçmek ve gerekirse ~7.5 için ayarlayın.
3. işletme ve perfüzyon
Not: Perfüzyon Kur bir çizimi şekil 1' de verilmiştir.
- Cerrahi anestezi ve analjezi için 30-40 dk Hypnorm/Midazolam tarafından ayakta olabilir bir anestezik rejimi kullanımı tarafından fareler anestezi (ml başına 0.3 ml/100 g vücut ağırlığı: Hypnorm: 0,08 mg fentanil, 2.5 mg fluanisone, 0,45 mg metil Parahydroxybenzoate, 0,05 mg Propil Parahydroxybenzoate, Midazolam: 1.25 mg, matris ilaç, Hellerup, Danimarka)
- Refleksler (ayak tutam) olmaması için kontrol, ısıtılmış ameliyat masasında fare yerleştirin ve bağırsak ortaya çıkarmak için deri kesik gerçekleştirin.
-
İki nokta üst üste terminal kısmındaki bir kenara olabildiğince ince bağırsak taşıyarak maruz. Damarlara kolon ve tüketim için yavaş yavaş bağırsağın doğru hareket iki nokta üst üste, terminal kısmından başlayarak temin ettiğimi kravat.
- Sadece belirli bir kısmını bağırsağın perfüzyon (üst yarısı) için gereklidir, gerekli olmayan kesimleri damarlara sağlayan kapalı bağlama sonra tüketim. Doku hasarı en aza indirmek için izotonik salin ile bağırsak nemlendirmek ve temizleme bezi bağ dokusu kaldırmak için kullanın.
- Bir plastik tüp takın (uzunluk: ~ 15 cm, dış çap: ~0.4 cm) (proksimal bölümünde) intestinal Lümen ve kravat düzgün kullanarak tasarlamak. Dikkatle chyme Lümen boşaltmak için izotonik salin ile (oda sıcaklığında) sifonu çek.
- Lümen 0.25 mL/min, bir şırınga pompa bağlı bir 10 mL şırınga kullanarak bir akışı adlı izotonik salin ile sıvı.
- Üst Mezenterik arter erişilebilir kadar bağırsak kenara çekilin ve bağ ve yağ dokusu arter ortaya çıkarmak için kaldırın.
- İki dikiş Mezenterik arter altında para cezası nokta forseps kullanarak yerleştirebilirsiniz; dikiş arter kez atardamarı kesilmiş oldu ve diğer arter içinde yerleştirileceğini kateter sağlamak için kanama kontrolü için kaldırma için biridir. Arter sorgulamaktı değil dikkatli.
- İki dikiş perfüzyon atık koleksiyon için ven yerleştirilmesini gidiyor metal kateter güvenliğini sağlamak için portal ven altında yerleştirin.
- Mezenterik arter delik kesmeden önce arter için eklenen gidiyor kateter ile perfüzyon arabelleği hava embolisi oluşumunu önlemek için doldurulur olun.
- Cerrahi makas kullanarak Mezenterik arter küçük bir delik açın ve plastik kateter takın hemen sonra.
- Sonra hemen kateter güvenlik altına alındı, gut perfüzyon silindir pompa başlatarak başlatmak (akış hızı 7.5 mL/dk =).
- Kan damarları bağırsak kaç saniye içinde soluk açmak ve portal ven soluk döner onaylayın.
- Hemen uygun perfüzyon, portal ven delik kurulduktan sonra metal kateter takın ve sütür ile güvenli.
Not: Kateter yer ama damar yukarı kaldırarak ihtiyatlı en proksimal dikiş yardımcı olur çekerek için zor olabilir. - Bir kez Kateterler yerdesiniz ve perfüzyon çıkış tatmin edici, diyafram perforasyon, Kateterler rip değil dikkatli olmak tarafından fareyi öldür.
- Perfüzyon çıktı 1 dk. için toplamak ve birimin tedbir. Basınç kayıt programı Yürütmek deney tıklamayla perfüzyon basıncı edinme/kayda başlayın.
- Göbek deneme sırasında kurumasını önlemek için nemli dokusu de kapsar.
- Bağırsak distal sonuna böylece luminal atık çıkabilirsiniz, aksi takdirde bağırsak kabarma olacaktır, ödem gelişecektir, perfüzyon basıncı artacak ve perfüzyon çıkış düşecek bloke değildir olun.
- Yaklaşık 30 dakika için hazırlık deneme başlatmadan önce bırakın.
Not: Bu denge adım istikrarlı bir temel elde etmek için gerekli bu yüzden gut hormon salgı çıkışlarını perfüzyon, ilk 15 dk için çok kararsız.
4. deney
- Perfüzyon yaklaşık 30 dakika sonra bir kesir toplayıcı kullanarak ilk temel örnek toplayarak deneme başlayın. Örnekler toplamak istediğiniz zaman aralığında (örneğin, her dakika, 6,5-7,5 mL genellikle toplanır) ve birkaç dakika içinde buz koyun.
-
Kabarcık tuzak düzenli olarak inceleyin ve eğer boşalttı, perfüzyon arabellek ile doldurma.
- Üç yönlü horoz-valf aracılığıyla arabellek hemen organ girmeden önce ve sonra (Bu yayın organları periosteum) portal ven organ metabolik olarak aktif olduğunu doğrulamak için eklenen kateter toplamak. Başlangıç ve bitiş canlılığı deneme boyunca değerlendirmek için deney örnekleri toplamak.
- En plastik içerir/şırınga tamamen hava geçirmez değildir olarak örnekleri ile atmosferik hava değişimi için sebebiyet veren bir otomatik kan gazı analizörü ile hızlı bir şekilde ölçmek.
- Temel toplama 10-15 dk sonra ilk test madde ile teşvik. İntra Arteryel elektrodlar ile bir şırınga pompa üç yollu stopcock ile yönetmek (akış 0,350 mL/dk =).
- Luminal elektrodlar zaten test çözüm daha düşük Debi (0.5 mL/dk) yönetimi tarafından takip lümen, kullandığı izotonik salin değiştirmek için bir ilk bolus enjeksiyon (ilk 5 dk içinde 2.5 mL/dk), yerine getirilir.
- Luminal stimülasyon dönemi bittiğinde Lümen hızlı bir şekilde test madde boşaltılır emin olmak için yukarıdaki gibi aynı akış oranları uygulanarak intestinal Lümen izotonik salin ile yıkayın.
- Sonraki test madde yönetilir önce temel örnekleri için 15-30 dakika toplamak. İletişim kuralı bağlı olarak 2-3 testi uyaranlara genellikle deneme dahil edilebilir. Deneysel protokol harekete geçirmek/inhibisyonu verilen bir moleküler site belirli bir salgılatıcı İdaresi ile aynı anda içeriyorsa, her zaman harekete geçirmek/inhibitörü ile önceden uyarmak için salgılatıcı yönetim önce 10-15 dk Moleküler sitesi salgılatıcı infüzyon çok başında inhibe emin olun.
- Protokol sonunda (5-10 dk) uygun olumlu denetim stimülasyon döneminden sonra hazırlık yanıt için test etmek ve 10-15 dk temel örnekler toplamak için yönetmek.
Not: Birkaç test maddelerin kullanılabilir pozitif kontrol, örneğin, artan [kampı]ben (örneğin, foskolin veya IBMX), [Ca2 +]ben (örneğin, bombesin veya neuromedin C), için bir çekim gücü ajanlar depolarize (örneğin, 30-50 mM KCl) veya daha fazla macronutrients gibi fizyolojik alakalı uyaranlara: glikoz, peptones, amino asitler, vb. Ancak, seçtiğiniz bir pozitif kontrol deneysel sonucuna bağlı. Glikoz örneğin bir zavallı cholecystokinin (CCK) salgılatıcı bombesin glikoz bağımlı insulinotropic peptid (GIP) salgılanması30için güçlü salgılatıcı değil ise. - Deneme sonunda perfused gut tüketim, tartmak ve uzunluğu ölçmek. Paraformaldehyde içinde koymak ve (4 ° C) potansiyel daha sonra histochemical analiz doku bütünlüğü/hasarı, için örneğin H & E boyama saklayın.
5. biyokimyasal ölçümleri
- Bir in-house ya da ticari olarak mevcut radioimmunoassays (RIA) kullanımını tarafından salgılanan peptidler Venöz atık konsantrasyonları ölçmek ya da ELISA deneyleri. Bağırsak emilim araştırmak çalışmaları, ilgi, örneğin, glikoz veya amino asitler, Venöz atık molekülünün ölçmek.
Not: Perfusate genellikle enzimatik reaksiyonları (örneğin glikoz glucoseoxidase yöntemi tarafından miktar) dayanan deneyleri de dahil olmak üzere çoğu analizleri için iyi bir Bazal tampon var.
6. veri analizi
- Mevcut verileri farklı şekillerde, örneğin gerçek salgı çıkış gösteren bir zaman-konsantrasyon grafik (akış toplama x) ve toplam salgı temel ve yanıt dönemlerinde (genellikle 10-15 saat puan) çıkış gösteren sütun Arsa olarak.
- İlgili hormonlar gerçek ölçülen konsantrasyonu konsantrasyonu birimleri olarak çiz. (pmol/M),
Not: İçinde vivo çalışmalar, aksine bu model ile elde edilen değerler gerçek salgı çıktı (Sabit perfüzyon atık toplama nedeniyle) olduğu için bunun yerine verileri çıktı (fmol/dak) olarak ifade etmek için tercih edilir. - Bağlı olarak istatistiksel analiz edilecek grup sayısı, kullanım iki kuyruklu t-Testi (iki grup) eşleştirilmiş veya birden fazla karşılaştırma için bir uygun post-hoc testi tekrarlanan ölçüler (ikiden fazla gruplar) için tek yönlü ANOVA izledi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yetenek belirli bir uyarıcı ilgi gut hormon salgılanmasını neden olup olmadığını belirlemek için bir sabit temel salgı üzerinde dayanır. Ayrıca, uyarıcı yanıt gözlem yapılırsa, bir güçlü salgı kontrol tepki olarak pozitif test uyarana tepki eksikliği yanıt genel eksikliği yansıtacak dışlamak için belirgin olması gerekir. Şekil 2A ve 2B'yi gösterir kaliteli veri örneği; GLP-1 salgı izole sıçan periosteum ince bağırsak üzerinden 1 dk aralıklarla (anlamına gelir ± SEM) gösterilir. Bazal koşullar salgı sabit; önce ve sonra test uyarıcı (insülin) ve olumlu bir güçlü salgı yanıt yönetimi Denetim (bombesin (BBS)) belirgindir. Buna ek olarak, yanı sıra insülin sırasında ortalama salgı Bazal koşullar, GLP-1 salgı (dönemlerde insülin veya BBS yönetim önceki ilgili temel) ortalama ve BBS stimülasyon çubuk grafikler (anlamına gelir ± SEM) gösterilir. Salgı istatistiksel anlamlılık için tekrarlanan ölçümler için tek yönlü ANOVA tarafından test edildi. Kombine bu verilere dayanarak, o içi Arteryel insülin GLP-1 salgı dan izole sıçan periosteum ince bağırsak teşvik değil söylenebilir.
Şekil 2C ve 2D GLP-1 salgı dan izole sıçan periosteum ince bağırsak örneği gösterir. Şekil 2A ve 2B'yifarklı olarak, bu düşük kaliteli verilerdir; salgı Bazal koşullar kararsız ve madde idareleri sınamak için ilgisiz gibi görünen bir şekilde yukarı doğru boyunca sürükleniyor (içi luminal ve intra Arteryel fruktoz, sırasıyla) ve pozitif kontrol, BBS, içinde yol açmaz istatistiksel önemli GLP-1 salgısı artar. Bu, bu nedenle, fruktoz elektrodlar çıkmasına neden GLP-1 salgılanması için örneğin, olsun, vasküler fruktoz stimülasyon fruktoz-aracılı yanıt sonuna artan GLP-1 salgı ya da değil sonuçlandırmak mümkün değildir.
Resim 1: bir perfüzyon kurulum örneği. Sistem bir pleksiglas stand, ısıtmalı bir ameliyat masasına, bir ısı eşanjörü ile kurmak kabarcık tuzak, basınç göstergesi ve Milli pompa perfüzyon basıncı ayarı için oluşur. Perfüzyon sistemi gassed (% 95'i O2, % 5 CO2) ısıtır termostatik bir sirkülatörün için bağlı olduğu perfüzyon arabellek ile 37 ° c Buna ek olarak, perfüzyon basıncı sürekli olarak kaydedilir ve basınç kayıt detektörler tarafından transduced ve görüntülenir ve uygun yazılım ile bir PC kurtardı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: izole sıçan periosteum ince bağırsak verilerden. (a, B) bir örnek iyi gerçekleştirilen deneyler ve güvenilir veriler, (C, D) nerede perfüzyon basıncı ve perfüzyon çıkış düşmüştür büyük ölçüde çalışma zamanı boyunca alt-optimal veri örneği. (A)GLP-1 (Toplam) çıktı (fmol/dak) Bazal koşullar ve yanıt intra Arteryel insülin Yönetim (belirtildiği gibi 200 ve 1000 pM,) olarak gösterilir. Bombesin (BBS), iyi bilinen, güçlü GLP-1 salgılatıcı intra arterially duyarlılık (poz kontrol) için denetlemek için deney sonunda infüzyon. Veri sunulmuştur aracı olarak ± SEM, n = 4. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İzole sıçan periosteum ince bağırsak dinamikleri ve moleküler mekanizmaları gut hormonu salgılanması ayrıntılı olarak incelenecektir için temel sağlayan bir güçlü araştırma araçtır. Bu modeli ile veri başarılı üretim için en önemli adım cerrahi işlemdir. Gut kullanımı kaçınılmaz olarak bazı bağırsak zarar ve bu nedenle mutlak bir minimum tutulmalıdır. Daha da önemlisi, işlem hızı, Mezenterik arter kateter yerleştirme süre açısından özellikle anahtarıdır. Bizim deneyim kateter başarılı bir şekilde yer almalıdır ve perfüzyon birkaç dk içinde gemi delik kesme sonra başlatılan var. Kateter yerleştirme işlemi en zorlu kısmı ve Mezenterik arter küçük boyutu ve portal ven ince duvar tarafından karmaşıktır ve bu adımı biraz pratik gerektirir. Venöz kateter hızlı ekleme olduğunu, ancak, Mezenterik arter için durum olarak acil, gut değil şimdi derin ve yaşatılmaktadır. Deneme gerçekleştirmek için önemli bir adım olduğunu. İşlem başarıyla gerçekleştirildi, perfused gut genellikle gelişmek ve en fazla 3 saat ve perfüzyon basıncı için duyarlı ve çıkış tüm deney genellikle sabit kalır. Bu aşamada başarılı bir deneme için en önemli faktör bu hangi anında azaltır veya ortadan kaldırır perfüzyon çıkış hava embolizasyon neden olur bu yana Başlarken sistemi kabarcıklar kaçınmaktır. Perfüzyon arabellek BSA içerir ve perfused gut için yeterli oksijen teslim edilmesini sağlamak için benzin gibi tamamen baloncuklar oluşumunu önlemek zordur. Kabarcıklar olması gerektiğini ancak, sistemleri kabarcık kapana sıkışmış ama bu yavaş yavaş zaman içinde (daha fazla kabarcıklar, daha hızlı tahliye) boşaltır ve bu nedenle üzerinde kabarcık tuzak yakından takip ve gerektiğinde perfüzyon önbellekle yedek önemlidir. Perfusate pH 7.5 aşağıda tutmanız önemlidir — pH artırmaya, kalsiyum karbonat precipitates, kılcal damar akışı tıkayan ve perfüzyon basıncı ciddi bir artış neden oluşabilir.
Perfused bağırsak oldukça sağlam bir hazırlıktır ama deterjanlar safra asitlerinin, etanol ve DMSO gibi yüksek konsantrasyonda tahammül etmez. Bu nedenle, deterjan kullanımı tercihen kaçınılmalıdır ama bazen kötü çözünen bileşikleri çözüm almak için gereklidir. Perfused gut genellikle yönetilen deterjanlar'in tolerans göstereceği içi-luminally içi vascularly daha iyi. Örneğin, 1 mM taurodeoxycholic asit (bir ikincil, konjuge safra asidi) yönetim de intraluminally infüzyon ama anında bloke perfüzyon intra arterially teslim2çıkış sonuçlandı tolere. Vasküler elektrodlar için son DMSO konsantrasyonu % 1 aşağıda (DMSO, örneğin, GLP-1 salgılanmasını uyarır) belirsiz salgı yanıt-e doğru önlemek için ve artan perfüzyon basıncı sonucu ve perfüzyon azalır doku hasarına neden önlemek için tutmak çıktı. Deneyler % 20'den fazla perfüzyon basıncı artarsa, perfüzyon çıktı fazla % 20 oranında çalışma boyunca azalýrsa veya ödem geliştirirse gözardı. (Hızlı ekleme kateterin Mezenterik arter dahil) bu makroskopik başarı ölçütleri bağlılığı genellikle sonuç ~14/15 deneylerde iyi kalitede.
Deneme tamamladıktan sonra kritik bir sonraki yordama uygun yöntem ve tahlil miktar faiz hormone(s) için tercih etmektir. Yüksek yerine aracılığıyla peptid hormonları raporlaması yürütülen uzun kullanarak: radioimmunoassay veya ELISA. Her neyse, tüm ticari olarak mevcut deneyleri duyarlılık, özgüllük ve doğruluk açısından tatmin edici gerçekleştirirken onları örnek miktar için kullanmadan önce ilgili deneyleri doğrulamak için önerilir (örnekler için ilgili GLP-131). Özgüllük ile ilgili olarak, olan, her zaman, bir endişe 's. Belirsiz girişim ve matris etkileri genellikle yapay perfusates plazma için karşılaştırıldığında ile daha az belirgindir. Duyarlılık açısından, genellikle çok da perfüzyon atık sistemik dolaşıma seyreltilmiş değil çünkü in vivo çalışmalar peptid olarak konsantrasyonları yüksek çoğu kez daha ve çünkü perfusions güvenilir veri elde etmek daha kolay Eleme işlemler (karaciğer/akciğer/böbrek tarafından) kaçınılmalıdır. Genellikle, çoğu deneyleri daha düşük çalışma aralığı içinde yalan Venöz atıkları konsantrasyonlarda temel (GLP-1 (Toplam), neurotensin (Toplam) ve PYY (Toplam) durumunda: 8-15 pmol/L) iken teşvik yanıt olarak 200-300 pmol/L3yüksek ulaşabilirsiniz.
Fare ya da fareler vardır genellikle karşılaştırıldığında, temel değerlerini plazma sağlıklı insanlardan aynı hormonların ve 5-10 pmol/L ise 15-30 pmol/M3,32yanıt değerlerdir.
Önceden tanımlanmış başarı ölçütleri yapıştırılır vardır Eğer oluşturulan perfüzyon veri genellikle iyi bir kaliteye sahip ve istatistiksel analiz sonra basittir. Glukagon, insülin ve somatostatin salgılanmasını izole sıçan periosteum veya fare pankreas ile karşılaştırıldığında, Bazal gut hormonların salgılanmasını kararlı ve ölçülen konsantrasyonları ile ilgili deneyler arasında oldukça benzer, ve salgı değil açıkça pulsatil. Topluca, varyasyon veri seti bu nedenle en az ve üç perfüzyon deneyler düşük bir örnek boyutu kez istatistiksel anlamlılık ulaşmak için yeterli. Ancak, standartlaştırmak ve tip-2-hataları önlemek için aynı zamanda daha az iyi belirgin yanıt-e doğru bakan olasılığını azaltmak için altı ya da sekiz örneklem büyüklüğü önerilir.
Özet olarak, izole sıçan periosteum ince bağırsak bağırsak hormonu salgılanması doğrudan belirli bir maddenin etkilerini araştırmak için kullanılan bir önemli, fizyolojik ilgili, deneysel modelidir. Nerede gut bir salgılatıcı salgılanmasını uyarır, ister bu uyarır salgı aktivasyonu ile luminally veya basolaterally gibi önemli temel soru bulunan sensörler ve hangi moleküler sensörler harekete geçirmek ve böylece sorumlu salgı bu model ile ayrıntılı olarak ele alınması. Bu, ancak, gut donör hayvan uncoupling bazı çalışma sorular için alaka olabilir kabul edilebilir. Örneğin, gut yakından (gut-karaciğer eksen) karaciğer ve beyin (gut-beyin eksen) ile etkileşim kurar ve bu çapraz-konuşma itimat mekanizmaları bu nedenle bu model ile araştırılması olamaz. İşlem kalitesini veri kalitesi için kritik bir faktördür ve başarılı bir operasyon için en önemli faktörlerden en az bağırsak taşıma tutmak için ve gut perfüzyon Mezenterik arter kesilmiş oldu bir kez hızlı bir şekilde başlamak için. Önce veri iyi kalitede üretilmektedir, bu 2-4 ay uygulama alır bizim deneyimdir. Tekniği öğrendim sonra ancak, bu yöntemin neredeyse sonsuz ve tek limited tarafından çözünürlük testi maddeler ve etkileri test maddeler perfused doku üzerinde olabilir zarar herhangi bir potansiyel olasılıklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Bu eser yazarlar hiçbir potansiyel çıkar çatışmaları bu makale ile ilgili ilan ediyorum.
Acknowledgments
Bu eser tarafından sınırsız ödenekle Prof. Dr. Jens Juul Holst Novo Nordisk Merkezi'nden temel metabolik araştırma (Novo Nordisk Vakfı, Danimarka), Novo Nordisk Vakfı (Hayır ver. kemirgen perfüzyon çalışmaları yapmak için ayrı bir hibe için desteklenen NNF15OC0016574), Avrupa Araştırma Konseyi (Grant no.695069) ve theEuropean Birliği'nden Prof. Holst için bir hibe yanı sıra bir doktora sonrası araştırma, TechnologicalDevelopment ve gösteri faaliyetleri (Grant No. 266408) yedinci Çerçeve Programı'nın Rune E. Kuhre için Lundbeck Vakfı'ndan (R264-2017-3492) verin. Biz Jenna E. Hunt ve Carolyn F. Deacon dikkatli proofreading için teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals for perfusion buffer | |||
| Bovine serum albumin (BSA) | Merck | 1.12018.0500 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2 x 2 H2O) | Merck | 102382 | |
| Dextran 70 | Pharmacosmos | 40014 | |
| Fumaric acid disodium salt (C44H2Na2O4) | Sigma Aldrich | F9642 | |
| Glucose (C6H12O6) | Merck | 108342 | |
| Magnesium sulfate hepatahydrate (MgSO4) | Merck | 105886 | |
| Potasium chloride (KCl) | Merck | 104936 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Merck | 104873 | |
| Pyruvic acid sodium salt (C3H3NaO4) | Merck | 106619 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | ||
| Sodium chloride (NaCl) | Merck | 106404 | |
| Sodium L-glutamate monohydrate (C5H8NNaO4 x H2O) | Merck | 106445 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion equitment | |||
| Universial perfusion system | Harvard Bioscience, Inc. | 732316 | |
| BASIC UNIT UNIPER UP-100, TYPE 834 | Harvard Bioscience, Inc. | ||
| Roller Pump, with four channels | Harvard Bioscience, Inc. | 730100 | |
| Windkessel | Harvard Bioscience, Inc. | 732068 | |
| Thermostatic Circulator,Bath Volume 3L, 230V/50Hz | Harvard Bioscience, Inc. | 730125 | |
| Operating table, heated on tripod stand, type 873 | Harvard Bioscience, Inc. | 733776 | |
| Cannula with basked, OD = 2.0 mm, ID = 1.0 mm | Harvard Bioscience, Inc. | 733313 |
References
- Rindi, G., Leiter, A. B., Kopin, A. S., Bordi, C., Solcia, E. The "normal" endocrine cell of the gut: changing concepts and new evidences. Annals of the New York Academy of Sciences. 1014, 1-12 (2004).
- Brighton, C. A., et al. Bile Acids Trigger GLP-1 Release Predominantly by Accessing Basolaterally Located G Protein-Coupled Bile Acid Receptors. Endocrinology. 156, 3961-3970 (2015).
- Kuhre, R. E., et al. Bile acids are important direct and indirect regulators of the secretion of appetite- and metabolism-regulating hormones from the gut and pancreas. Molecular Metabolism. , (2018).
- Roberge, J. N., Brubacker, P. L. Secretion of Proglucagon-Derived Peptides in Response to Intestinal Luminal Nutrients. Endocrinology. 128, 3169-3174 (1991).
- Brubaker, P. L., Schloos, J., Drucker, D. J. Regulation of glucagon-like peptide-1 synthesis and secretion in the GLUTag enteroendocrine cell line. Endocrinology. 139, 4108-4114 (1998).
- Jacobsen, S., et al. Changes in Gastrointestinal Hormone Responses, Insulin Sensitivity, and Beta-Cell Function Within 2 Weeks After Gastric Bypass in Non-diabetic Subjects. Obesity Surgery. 22, 1084-1096 (2012).
- Kuhre, R. E., Frost, C. R., Svendsen, B., Holst, J. J. Molecular mechanisms of glucose-stimulated GLP-1 secretion from perfused rat small intestine. Diabetes. 64, 370 (2014).
- Svendsen, B., Holst, J. J. Regulation of gut hormone secretion. Studies using isolated perfused intestines. Peptides. 77, 47-53 (2016).
- Ratner, C., et al. Effects of Peripheral Neurotensin on Appetite Regulation and Its Role in Gastric Bypass Surgery. Endocrinology. 157, 3482-3492 (2016).
- Wewer Albrechtsen, N. J., et al. Dynamics of glucagon secretion in mice and rats revealed using a validated sandwich ELISA for small sample volumes. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 311, E302-E309 (2016).
- Vilsboll, T., Agerso, H., Krarup, T., Holst, J. J. Similar elimination rates of glucagon-like peptide-1 in obese type 2 diabetic patients and healthy subjects. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 88, 220-224 (2003).
- Windelov, J. A., et al. Why is it so difficult to measure glucagon-like peptide-1 in a mouse? Diabetologia. 60, 2066-2075 (2017).
- Gorboulev, V., et al. Na+-d-glucose Cotransporter SGLT1 is Pivotal for Intestinal Glucose Absorption and Glucose-Dependent Incretin Secretion. Diabetes. 61, 187-196 (2012).
- Kuhre, R. E., Bechmann, L. E., Wewer Albrechtsen, N. J., Hartmann, B., Holst, J. J. Glucose stimulates neurotensin secretion from the rat small intestine by mechanisms involving SGLT1 and GLUT2, leading to cell depolarization and calcium influx. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 308, E1123-E1130 (2015).
- Kuhre, R. E., Christiansen, C. B., Saltiel, M. Y., Wewer Albrechtsen, N. J., Holst, J. J. On the relationship between glucose absorption and glucose-stimulated secretion of GLP-1, neurotensin, and PYY from different intestinal segments in the rat. Physiological Reports. 5, (2017).
- Svendsen, B., et al. An analysis of cosecretion and coexpression of gut hormones from male rat proximal and distal small intestine. Endocrinology. 156, 847-857 (2015).
- Goldspink, D. A., et al. Mechanistic insights into the detection of free fatty and bile acids by ileal glucagon-like peptide-1 secreting cells. Molecular Metabolism. 7, 90-101 (2018).
- Sun, E. W., et al. Mechanisms Controlling Glucose-Induced Glp-1 Secretion in Human Small Intestine. Diabetes. , (2017).
- Kuhre, R. E., et al. Peptide production and secretion in GLUTag, NCI-H716 and STC-1 cells: a comparison to native L-cells. Journal of Molecular Endocrinology. 56, 11 (2016).
- Reimann, F., et al. Glucose sensing in L cells: a primary cell study. Cell Metabolism. 8, 532-539 (2008).
- Reimann, F., et al. Characterization and functional role of voltage gated cation conductances in the glucagon-like peptide-1 secreting GLUTag cell line. The Journal of Physiology. 563, 161-175 (2005).
- Kuhre, R. E., et al. Fructose stimulates GLP-1 but not GIP secretion in mice, rats and humans. American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 306, G622-G630 (2014).
- Reimann, F., Tolhurst, G., Gribble, F. M. G-Protein-Coupled Receptors in Intestinal Chemosensation. Cell Metabolism. 15, 421-431 (2012).
- Parker, H. E., et al. Molecular mechanisms underlying bile acid-stimulated glucagon-like peptide-1 secretion. British Journal of Pharmacology. 165, 414-423 (2012).
- Petersen, N., et al. Generation of L cells in mouse and human small intestine organoids. Diabetes. 63, 410-420 (2014).
- Parker, H., et al. Predominant role of active versus facilitative glucose transport for glucagon-like peptide-1 secretion. Diabetologia. 55, 2445-2455 (2012).
- Roberts, G. P., et al. Comparison of Human and Murine Enteroendocrine Cells by Transcriptomic and Peptidomic Profiling. Diabetes. , (2019).
- Reimann, F., Gribble, F. M. Glucose-Sensing in Glucagon-Like Peptide-1-Secreting Cells. Diabetes. 51, 2757-2763 (2002).
- Drucker, D. J., Jin, T., Asa, S. L., Young, T. A., Brubaker, P. L. Activation of proglucagon gene transcription by protein kinase-A in a novel mouse enteroendocrine cell line. Molecular Endocrinology. 8, Baltimore, Md. 1646-1655 (1994).
- Svendsen, B., et al. GLP1- and GIP-producing cells rarely overlap and differ by bombesin receptor-2 expression and responsiveness. The Journal of Endocrinology. 228, 39-48 (2016).
- Bak, M. J., et al. Specificity and sensitivity of commercially available assays for glucagon-like peptide-1 (GLP-1): implications for GLP-1 measurements in clinical studies. Diabetes, Obesity & Metabolism. 16, 1155-1164 (2014).
- Jacobsen, S. H., et al. Effects of gastric bypass surgery on glucose absorption and metabolism during a mixed meal in glucose-tolerant individuals. Diabetologia. 56, 2250-2254 (2013).
