Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Måling af interaktioner af kugleformede og fintrådede proteiner af Kernemagnetisk resonans-spektroskopi (NMR) og individuel Thermophoresis (MST)

Published: November 2, 2018 doi: 10.3791/58537
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry, University of Alberta

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for produktion og oprensning af proteiner, der er mærket med stabile isotoper, og efterfølgende karakterisering af protein-protein interaktioner ved hjælp af Kernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi og individuel Thermophoresis (MST) eksperimenter.

Abstract

Trådformede proteiner som vimentin give organisation inden for celler ved at give en strukturel stillads med websteder, der binder proteiner der indeholder plakin gentages. Her, er en protokol til påvisning og måling af sådanne interaktioner beskrevet ved hjælp af domænet kugleformede plakin gentagelse af envoplakin og vimentin spiralformet spolen. Dette giver et grundlag for at afgøre, om et protein binder vimentin (eller lignende trådformede proteiner) og til måling af affinitet af interaktionen. Den kugleformede protein af interesse er mærket med 15N og titreres med vimentin protein i løsning. En to-dimensionel NMR-spektrum er erhvervet til at registrere interaktioner ved at observere ændringer i peak form eller kemiske Skift og belyse virkningerne af løsning betingelser herunder salt niveauer, som påvirker vimentin kvaternære struktur. Hvis interesse protein binder de trådformede ligand, er bindende interaktion kvantificeret af MST ved hjælp af de rensede proteiner. Tilgangen er en enkel måde til at bestemme, om et protein af interesse binder en glødetråd, og for at vurdere, hvordan forandringer, såsom mutationer eller løsning betingelser, påvirker samspillet.

Introduction

Interaktioner mellem proteiner tillader dannelsen af molekylære maskiner, der skaber orden i celler. De enkelte interaktioner er ofte svag men normalt bidrage til multivalent komplekser, der kan være samarbejdsvillig og dynamisk reguleret. Følsomme assays, der giver atomic opløsning og kvantitative oplysninger om sådanne komplekse interaktioner er nødvendige for at udlede mekanismer og design indgreb såsom narkotika-lignende molekyler. NMR spektroskopi er en effektiv metode til at opnå sådanne oplysninger om protein interaktioner, og også bruges til hurtig screening for ligander, herunder dem, der binder svagt1. NMR metoderne kan inddeles i dem, der er protein observere eller ligand observere. Dette manuskript bruger den tidligere tilgang, hvor et spektrum af en stabil-isotop mærket protein, der er forholdsvis små (normalt under 20 kDa) er erhvervet og de umærkede ligand titreres. Dette tillader mærket rester involveret i samspil kan kortlægges i gunstige tilfælde. En gang de komplekse former, der er ændringer i de kemiske miljøer af interagerende rester, der manifesterer sig som ændringer i det kemiske Skift og form af deres NMR-signaler. Omfanget af sådanne forandringer korrelerer med graden af involvering af disse grupper i interaktionen. Kemiske Skift perturbationer (CSP) kan måles ved at sammenligne en serie af NMR-spektre af protein indsamlet i fravær og tilstedeværelsen af forskellige mængder af en ligand. For større ligander eller komplekse samspil, kan ændringen i peak formen eller intensitet måles for at udlede interaktioner.

Den mest almindelige 2D eksperiment anvendes til at påvise ligand interaktioner er 15N-heteronuclear enkelt quantum korrelation (HSQC) eksperiment2. Dette kræver, at et protein mærkes ensartet med 15N, som opnås typisk ved at udtrykke dem som affinitet-tagged versioner i E. coli bakterie kulturer vokset i 15N-beriget medier. Bindende er tilsyneladende, når HSQC spektrene indsamlet under titreringen er overlejret, afslørende peak ændringer for en delmængde af restkoncentrationer involveret i komplekse dannelsen. Samspillet kan forekomme i hurtig udveksling regimet hvor fri og ligand-mættet stat signaler kollaps i en befolkning i gennemsnit peak. Alternativt, for langsomme udvekslingen mellem staterne, begge signaler er observeret med integraler, der repræsenterer deres relative mængder. Mens NMR lineshape analyse kan anvendes til at anslå de bindende tilhørsforhold i nogle tilfælde, metoder som MST har også vist sig praktisk og give cross-valideringen af ægte interaktioner.

Det viste eksempel er af to proteiner, der findes inden for desmosomes. De mægle kryds mellem celle overflader og cytoskelettet og mægle multivalent interaktioner mellem celle vedhæftning maskiner og mellemliggende filamenter at opretholde integriteten af huden og hjertet væv og modstå af shear styrker. Sygdomme kan medføre når desmosomal proteiner som desmoplakin eller vimentin er kompromitteret af mutationer eller autoantistoffer, fører til destabilisering af celle-celle vejkryds, og dermed deres interaktioner er af kritisk betydning3. Det strukturelle grundlag for ligand binding af desmosomal proteiner kan være kendetegnet ved NMR spektroskopi, mens interaktionerne kan kvantificeres af MST. Metoderne heri blev brugt til at karakterisere interaktioner mellem plakin gentage domæner (fattigdomsbetingede sygdomme), der ofte er til stede som tandem sæt, der tilbyder grundlæggende riller og vimentin, en mellemliggende glødetråd, der interagerer gennem en sure overflade tilbød af dens spiralformet bundt4. Disse komplekser er dannet på cellemembranen hvor de anker for mellemliggende filamenter af celle cytoskelettet til desmosomes, der opretter forbindelse til tilstødende celler, som danner et netværk af selvklæbende obligationer, der udstråler i hele en væv.

Protocol

1. rekombinante Protein udtryk

  1. Udtryk for Envoplakin PRD (E-PRD) og Vimentin 99-249 (VimRod)
    1. Transformer E. coli BL21(DE3) celler med plasmid som indeholder det ønskede gen. Sprede celler på agar plader der indeholder 100 µg/mL ampicillin. Inkuber plader ved 37 ° C natten over.
    2. Vælge en enkelt koloni og podes 20 mL af fantastisk bouillon (TB) indeholdende 100 µg/mL ampicillin vælge for plasmidet. Vokse kultur ved 37 ° C under omrystning (180 rpm) natten over.
    3. Overføre hele 20 mL kultur til 1 L TB indeholdende 50 µg/mL ampicillin. Inkuber kultur ved 37 ° C under omrystning på 180 rpm indtil OD600 = 0,6-0,8.
    4. Reducere temperaturen til 18 ° C og fremkalde protein udtryk ved at tilføje isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) til en endelig koncentration på 1 mM. Fortsætte inkubation ved 18 ° C under omrystning på 160 rpm natten at tillade protein udtryk.
    5. Høste cellerne ved centrifugering kultur på 8.000 x g i 15 min. Decant og supernatanten.
    6. Vask høstet cellerne af resuspending celle pellet i ca. 40 mL fosfat buffer saltopløsning (PBS: 20 mM fosfat buffer, pH 7,4, 120 mM NaCl). Overføre ophvirvling til en 50 mL tube. Centrifugeres igen ved 8.000 x g i 15 min.
    7. Syren fradekanteres, og supernatanten. Enten straks begynde rensning protokol eller fryse celle pellets ved-20 ° C til fremtidig brug.
  2. Udtryk for brændselsfremstilling navngivet Protein
    1. Omdanne E. coli BL21(DE3) celler og forberede en 20 mL starter kultur som i 1.1.1-1.1.2.
    2. Overføre hele 20 mL kultur til 1 L beriget TB indeholdende en ekstra 4,0 g trypton, 5.0 g NaCl og 100 µg/mL ampicillin. Inkuber kultur ved 37 ° C under omrystning på 160 rpm indtil OD600 = 1,6-1,9.
    3. Høste 1 L kultur ved centrifugering ved 8000 x g i 15 min. Decant og supernatanten.
    4. Afvaske den celle pellet ved forsigtigt resuspending i ca. 40 mL PBS og overføre ophvirvling til en 50 mL tube.
    5. Centrifugeres igen ved 8.000 x g i 15 min. Decant og supernatanten.
    6. Resuspenderes celle i 20 mL af M9 minimal medier (tabel 1) og overførsel til den resterende del af 950 mL af M9 minimal medier indeholdende 100 µg/mL ampicillin.
    7. Der tilsættes 50 mL filter steriliseret næringsstof mix (tabel 2 og 3).
    8. Akklimatisere kultur til 18 ° C i 30 min før du tilføjer IPTG til en endelig koncentration på 1 mM.
    9. Der inkuberes natten over ved 18 ° C under omrystning på 160 rpm.
    10. Høste cellerne som i afsnit 1.1.4-1.1.6.

2. immobiliseret Metal affinitet kromatografi (IMAC) rensning af VimRod og E-PRD

  1. Rensning af His6-mærket VimRod
    1. Resuspenderes celle i 5 mL/g PBS, som indeholder en protease hæmmer cocktail mangler EDTA. Omrystes med 12 streger i en Dounce væv homogeniseringsapparat at forbedre celle lysis i de følgende trin.
    2. På is, sonikeres cellesuspension ved en impuls på 1 s on/1 s off, 80% amplitude for i alt 1,5 min. Gentag sonikering to ekstra gange, hvirvlende forsigtigt på isen mellem kører til at forhindre overophedning.
    3. Centrifugeres prøve på 75.000 x g i 45 min. Decant og filtrere supernatanten ved hjælp af en sprøjte filter (0,45 µm).
    4. Blandingen henstår en 5 mL IMAC kolonne 5 kolonne mængder (CV) binding buffer (20 mM HEPES, pH 7,5, 500 mM NaCl, 10 mM imidazol) med en væskehastighed på 1 mL/min. ved hjælp af en hurtig protein væskekromatografi (FPLC) system.
    5. Indlæse den filtrerede supernatanten på kolonnen med en væskehastighed på 0,5 mL/min.
    6. Vaske kolonnen med 5 CV af vaske buffer (20 mM HEPES, pH 7,5, 500 mM NaCl, 50 mM imidazol) med en væskehastighed på 1 mL/min.
    7. Elueres protein med 3 CV eluering buffer (20 mM HEPES, pH 7,5, 500 mM NaCl, 350 mM imidazol) med en væskehastighed på 0,5 mL/min. indsamle 1,5 mL fraktioner. Hvis den er tilgængelig, skal du vælge up-flow eluering mode at øge koncentrationen af elueret protein.
    8. Identificere de fraktioner fra FPLC kromatogrammet, der indeholder protein af interesse af SDS-PAGE og bruge standard metoder til at måle protein koncentration5.
    9. Pool og koncentrere eluering fraktioner der indeholder de højeste mængder af protein ved hjælp af en centrifugal ultrafiltrering enhed (MWCO 3 kDa, 5 mL) til 2 mL. Der centrifugeres ved 21.000 x g til at fjerne enhver bundfald og passere gennem et 0,22 μm filter.
    10. Blandingen henstår en 120 mL størrelse udstødelse kromatografi (S) kolonne med 2 CV af S buffer (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,5, 0,5 mM TCEP) med en væskehastighed på 1 mL/min. ved hjælp af en FPLC.
    11. Injicere den koncentrerede protein fra 2.1.9 over på kolonnen og elueres med 1 CV på S buffer med en væskehastighed på 0,5 mL/min., indsamle 1 mL fraktioner.
    12. Identificere de fraktioner, der indeholder protein af interesse som før.
    13. Samle de fraktioner, der indeholder de højeste mængder protein.
    14. Opbevares ved 4 ° C til kort tids brug eller tilføje glycerol til 20% og opbevares ved-80 ° C i små prøver.
  2. Rensning af E-PRD Protein med His6 Tag fjernet
    1. Følg trinene i 2.1.1-2.1.8 til at rense His6-tagged E-PRD protein. Pool peak fraktioner og bestemme proteinkoncentration.
    2. Tilføje tobak etch virus (TEV) protease (1 mg/mL) på 2 µL/mg poolede protein. Overføre til dialyse slanger (6 kDa) og dialyze i S buffer natten over ved 4 ° C. Dette trin giver mulighed for spaltning af His6 tag og fjernelse af den imidazol, der vil forstyrre binding til Ni-NTA harpiks i næste trin.
    3. Reagensglasset 5 mL af Ni-NTA harpiks i en tyngdekraft kolonne med 3 CV af S buffer. Dræne overskydende buffer fra harpiks.
    4. Hæld den kløvet E-PRD protein på harpiks og Inkuber i 1 time på en vuggende platform til at give uncleaved His6-tagged E-PRD og kløvet His6 tag at binde. TEV protease er også His6-mærket og vil binde harpiks. Indsamle flow gennem, som indeholder de tag-gratis E-PRD. Vask harpiks med 2 CV af S buffer til at sikre alle E-PRD er genoprettet.
    5. Koncentrere sig E-PRD i flow gennem til 2 mL ved hjælp af en centrifugal ultrafiltrering enhed (MWCO 3 kDa, 5 mL). Der centrifugeres ved 21 000 x g til at fjerne enhver bundfald og passere gennem et 0,22 μm filter.
    6. Blandingen henstår en 120 mL S kolonne med 2 CV af S buffer (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,5, 0,5 mM TCEP for MST eller 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7 til NMR) med en væskehastighed på 1 mL/min. ved hjælp af en FPLC.
    7. Injicere det koncentrerede E-PRD protein fra 2.2.5 over på kolonnen og elueres med 1 CV på S buffer med en væskehastighed på 0,5 mL/min., indsamle 1 mL fraktioner.
    8. Identificere de fraktioner, der indeholder protein af interesse som før.
    9. Samle de fraktioner, der indeholder de højeste mængder protein.
    10. Opbevares ved 4 ° C til kort tids brug eller tilføje glycerol til 20% og opbevares ved-80 ° C i små prøver.

3. NMR metoder

  1. NMR prøveforberedelse
    1. Rense 15N-mærket wild-type eller R1914E E-PRD protein som tidligere beskrevet ved hjælp af 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7 som S buffer for trin 2.2.6. Protein stamopløsninger ligge normalt fra 0,3 til 1 mM med mængder af ca. 1 mL.
      Bemærk: Protein kan koncentreres til > 100 µM ved hjælp af en MWCO 3 kDa, 5 mL centrifugal ultrafiltrering enhed for at bringe koncentration i et passende udvalg til forberedelse af prøver.
    2. Rense en stikprøve af umærkede VimRod protein ved hjælp af 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7 som S buffer for trin 2.1.10.
    3. I en endelige mængden af 500 µL, tilføje wild-type eller mutant E-PRD protein til en endelig koncentration på 100µM, deuteriumoxid (D2O) til en slutkoncentration på 10% (v/v) og DSS (4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic syre) til en slutkoncentration på 20 µM. Bring sample volumen op til 500 µL ved hjælp af 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7. En repræsentativ stikprøve forberedelse er beskrevet i tabel 4.
      Bemærk: 0 ppm resonans af DSS bruges til at kalibrere de 1H kemiske Skift samt for indirekte henvisninger af 15N kemiske skift af protein6. D2O bruges til deuterium lås signal til at holde spektrometeret opererer på en konstant netto magnetfelt.
    4. Udgør et andet udsnit af E-PRD, D2O og DSS som i det forrige trin og tilføje VimRod til en slutkoncentration på 50 µM før at bringe volumen op til 500 µL.
    5. Overføre 500 µL prøverne til en 5 mm bred NMR rør til eksperimentet.
  2. NMR eksperimentel opsætning
    1. Tænde luftstrøm med skub ud-kommando "ej"; Dette vil bringe prøven op fra magneten. Nu, prøven inden for en spinner på toppen af magneten anbringes ved åbning og indsætte med kommandoen "ij". Vent, indtil prøven afregner inde magnet, før du fortsætter.
    2. Oprette et nyt datasæt ved hjælp af kommandoen "edc" og indlæse standard 1H NMR parametre ved at markere eksperiment "ZGPR" (figur 1). Udfyld navn, EXPNO (eksperiment nummer) og PROCNO (forarbejdede data omslag nummer) felter. Vælg opløsningsmidlet i feltet "Angiv opløsningsmiddel" og klik på "Udfør 'getprosol'" for at læse standard probehead og opløsningsmidler afhængige (prosol) parametre.
    3. Lås udsnit til deutereret solvent, dvs, D2O, ved hjælp af kommandoen "låse" og vent, indtil den er færdig fejer og opnår lås.
    4. Rette resonansfrekvens af magnet ved tuning prøven ved hjælp af automatisk tuning kommandoen "atma". Overvåge wobble kurve, indtil den automatisk tuning er fuldført.
    5. Afstandsstykket det magnetiske felt ved hjælp af TOPSHIM (kommandoen "topshim"). Shims er processen med justeringer til magnetfelt til at opnå ensartethed omkring prøven. Det er god praksis at gemme shim værdier med command "wsh" og læse dem ved hjælp af "rsh" før topshim, hvis du bruger de samme eller tilsvarende prøver.
    6. Justere modtager gevinst med "rga" kommando til at opnå maksimal signal / støjforhold.
    7. Placer midten af spektret på vand resonans offset (o1) og sætte 90 graders proton puls (p1) ved høj effekt ved hjælp af "calibo1p1".
    8. Indsamle proton spektrum ved hjælp af nul gå "zg" kommando og processen med "efp", som omfatter eksponentiel multiplikation ("em"), gratis induktion henfald (FID) indarbejde linje udvidelse, "ft" fourier transformation af FID og "pk" til at anvende fase korrektion.
    9. Anvend automatisk fase korrektion "apk" og automatiske baseline korrektion "absn" ved hjælp af polynomium uden mulighed for integration.
    10. Opret et nyt datasæt (som i 3.2.2) for SOFAST HMBC eksperiment ved at vælge "SFHMQC3GPPH" i eksperimentet.
    11. Kopi optimeret P1 og O1 fra proton spektrum og udfylde P1 afhængige pulser ved hjælp af kommandoen "getprosol 1H p1 plw1", hvor p1 er optimeret P1 værdien og plw1 er effektniveau for P1.
    12. Optimere CNST54 konstant for at angive forskydningen for AMID kemiske Skift og CNST55 til at definere båndbredden for at omfatte de spektrale regioner af interesse, som gør det muligt for modtageren gevinst at være optimeret (figur 2). For at vælge disse parametre, uddrag den første FID (gratis induktion decay) fra den todimensionale spektrum og kigge efter den observerede signal at definere dem. Derudover variere afslapning forsinkelse (D1), antal scanninger (NS) og dummy scanninger (DS) at opnå acceptable signal følsomhed med kommandoen "gs", som gør det muligt gå og scan for at overvåge datakvalitet i realtid.
    13. Optage spektrene ved hjælp af nul Go "zg".
  3. NMR databehandling
    1. Angive parametrene forarbejdning til størrelsen af den direkte F2 (1H) og indirekte F1 (15N) dimensioner af spektrum ved hjælp af "SI F2 = 2048, F1 = 512" med valgfri lineær forudsigelse i indirekte dimension (figur 3).
    2. Vælg "QSINE" som funktionen vindue og skriv en sinus bell Skift (SSB) af 2 til at behandle de to-dimensionelle frekvenser.
    3. Indtast kommandoen "xfb" for at behandle data i begge retninger med vindue funktion og fourier transformation.
    4. Brug kommandoen "apk2d" til at udføre automatiske fase korrektion i begge retninger. Hvis den automatiske proces ikke opnår en tilfredsstillende grad af fase korrektion, uddrag FIDs med kommandoen "rser", beregner fase værdier fra 1D forarbejdning og anvende dem til 2D-data.
    5. Rette baseline med funktionen automatisk baseline korrektion "abs2" for 2D data. Dette gælder et polynomium funktion mellem ppm værdier defineret i parametrene forarbejdning og vil producere en 2D spektrum for yderligere analyse.
    6. Hvis planlægger at udføre seriel behandling for sammenligning af interaktion data med et andet molekyle, gemme parametrene forarbejdning med kommando "wpar" og husker dem med "rpar". På denne måde alle datasæt vil blive behandlet med samme parametre og variationer vil ikke blive indført som følge af forarbejdning forskelle.
  4. NMR dataanalyse
    1. Indtast kommandoen "pp" for at begynde processen med peak plukning.
    2. Definere ppm rækkevidde og minimum intensitet/maksimum antallet af toppe baseret på forventede toppe (figur 4). Klik på OK og bekræfte resultaterne ved besigtigelse. Hvis det er nødvendigt, igen køre processen indtil resultaterne er tilfredsstillende baseret på spektre kvalitet.
    3. Generere en peaklist med kommandoen "pp".
      Bemærk: Denne peaklist indeholder oplysninger om højde/peak intensitet som standard og kan eksporteres til efterfølgende samfundsstrukturen og kan læses af andre programmer.
    4. Observere ændringer i de maksimale støtteintensiteter eller bevægelse i kemiske skift i proteiner HSQC spektrene, der angiver interaktion med et andet molekyle. Hvis de interagerende molekyle er store, Forvent reduktioner i peak intensiteter sammen med forsvinden af nogle toppe.
    5. Importere listen peak til den næste datasæt ved at klikke på fanen "toppe" og vælge "import" med et Højreklik i vinduet toppe.
    6. Visualisere toppene over spektret og evt skifte dem til nye placeringer. Klik på "Nulstil intensiteter" til "komplette tabel" til at generere en peaklist for spektret med intensiteter (figur 5). Denne peak liste vil bære over positionsoplysninger fra lagrede peak liste.
    7. Eksportere listerne peak fra forskellige datasæt til et regneark eller andre matematiske program til analyse ved at vælge "Eksporter"-funktionen.
    8. Beregne ændringen i peak intensiteter med funktionen "peak intensitet i komplekse spektrum/peak intensitet i protein spektrum" for hver top. Værdier kan blive konverteret til procentvise ændring af multiplikation af 100. Bemærk, at peak diskenheder er også nyttige, selvom peak intensiteter er nemmere at måle for toppe, der er placeret tæt på hinanden, som normalt er tilfældet for proteiner med en høj tæthed af relativt brede toppe.

4. individuel Thermophoresis (MST)

  1. Forberedelse af Ligand Protein E-PRD
    1. Udveksle liganden i en MST kompatibel buffer af dialyzing op til 800 μL af protein i en 3,5 kDa mini dialyse enhed suspenderet i 1 L 20 mm HEPES, pH 7,5, 10 mM NaCl, omrøring langsomt ved 4 ° C natten over.
    2. Koncentrere ligand ved hjælp af en centrifugal ultrafiltrering enhed (3 kDa MWCO) ved centrifugering ved. 14.000 x g i 10 min. overførsel koncentreret proteinet til en ren rør.
    3. Centrifugeres ligand på 21.000 x g i 10 min. og omhyggeligt overføre supernatanten til en ny slange til at fjerne enhver bundfaldne proteiner. Bestemme koncentrationen af ligand ved hjælp af absorbans på 280 nm og ligand extinction koefficient. Tilføje 10% Tween-20 til at give en endelig koncentration på 0.015%. Tween-20 er føjet til analysebuffer til hindre adsorption til kapillærerne. Den endelige analysebuffer, der bruges til MST eksperimenter er 20 mM HEPES, pH 7,5, 10 mM NaCl, 0.015% Tween-20.
  2. Forberedelse af Dye-mærket målet Protein VimRod
    1. Rekonstruere rød-tris-NTA farvestoffet ved at tilføje 50 μL 1 x PBS-T leveres med rød-tris-NTA en koncentration på 5 μM. Undvære 2 μl delprøver i 200 μl rør og opbevares ved-20 ° C.
    2. Fortynd target proteinet til 0,34 μM med analysebuffer. Tilføje 58 μL af målet til 2 μl alikvot af rød-tris-NTA farvestof og Inkuber i 30 min. ved stuetemperatur. Den endelige koncentration af dye-mærket målet er 0,33 μM. Centrifugeres mærket målet på 21.000 x g i 10 min. og omhyggeligt overføre supernatanten til en ny slange til at fjerne enhver bundfaldet. RØD-tris-NTA farvestof binder sig til proteiner gennem His6 tag og har en bindende dissociationskonstant (KD) i rækken sub-nanomolar. Det er faktisk 100% bundet til target proteinet så ingen yderligere rensning er nødvendig.
    3. Drej på MST instrument og åbne Control Software. Vælg indstillingen rød til rød-tris-NTA farvestof. Tænde temperaturkontrol til 25 ° C.
    4. Vælg anstille at validere mærkning af målet og tjekke for sammenlægning eller adsorption til kuvetter. En vurdering af disse parametre angives automatisk.
    5. Mix 17 μL analysebuffer og 3 μL af target protein og mix af pipettering. Udfylde to standard kapillærerne ved at dyppe dem i den fortyndede mål og udarbejdelsen af væske ind i midten af kapillar. Placer kapillærer i bakken og ind i instrumenterne. Start måling.
    6. Gennemse resultaterne på udkig efter et tilstrækkeligt niveau af fluorescens og ingen tegn på adsorptionen (forvrængning i figuren kapillær linje) eller sammenlægning (fordrejninger i sporingen af MST), som vil blive markeret i software analyse. Hvis resultaterne er positive skridt på liganden skridt, hvis ikke en anden buffer skal afprøves eller mængden af Tween-20 kan forhøjes til 0,05% eller højere.
  3. Forberedelse af E-PRD Ligand tofolds fortyndingsrække
    1. Forberede en fortyndingsrække ved mærkning 16, 200 μl rør fra 1-16.
    2. Tilføje 17 μL af en ligand på 1,17 x større koncentration end maksimal ligand koncentration ønskede at Tube1. Denne diskenhed er to gange den nødvendige beløb (8,5 μL) som en alikvot vil derefter blive overført til den næste rør i serien. Den endelige mængden af analysen er 10 μL så 8,5 μL af 1,17 x koncentration af ligand vil fortyndes til 1 x ved tilsætning af 1,5 μL af target proteinet, VimRod. Denne maksimale koncentration valgt bør være mindst 20 gange den anslåede KD værdi.
    3. Tilføje den 8,5 μL analysebuffer til Tubes2-16 ved hjælp af en ny pipette tip for hver delprøve. Genbruge pipette tips kan påvirke nøjagtigheden (for rådgivning om præcis pipettering se producentens instruktioner). Overføre 8,5 μL af ligand fra Tube1 til Tube2 langsomt frigiver løsningen i analysebuffer uden at skabe bobler. Bland ligand og buffer af pipettering op og ned på mindst 6 gange, igen uden at skabe bobler. E-PRD i den mest koncentrerede tube var 1,5 mM og af mærket VimRod var til stede i en endelig koncentration på 50 nM.
    4. 8,5 μL af ligand overføres fra Tube2 til Tube3 og bland med analysebuffer. Gentag seriel fortynding, indtil alle rør har haft ligand tilføjet. Kassér 8,5 μL fra Tube16, således at alle rør indeholder 8,5 μL af ligand i en serie af to-Folds fortyndinger.
  4. Forberedelse af det bindende reaktion og MST eksperiment
    1. Tilføj 1,5 μL af mærket target proteinet til hver af rør og bland forsigtigt af pipettering op og ned er omhyggelig med at undgå boblerne. Inkuber i 15 min.
    2. Vælg Expert Mode for bindende analysen og indtaste i parametrene for en seriel fortynding serier. Kontrollér temperaturkontrol er indstillet til 25 ° C, excitation magt er angivet til 40%, og MST magt til medium. Disse parametre skal være optimeret til andre bindende partnere undersøges.
    3. Fyld kapillærerne med bindende reaktioner og placere i den kapillære bakke. Indlæse bakken i instrumentet, vente til temperaturen til at genvinde 25 ° C og start måling.
  5. Dataanalyse
    1. Åbn filen bindende assay i affinitet analyse software. Anmeld kapillær scanninger; Fluorescens niveauer bør ikke variere mere end 10% fra gennemsnitlige, ingen sammenlægning eller adsorption bør påvises som beskrevet i afsnit 3.6.
    2. Vælg MST analyse på højre panel og træk assay data til analyse sæt. Hvis der er flere kørsler af samme mål-ligand bindende analysen på identiske betingelser kan de flettes ved at droppe i det samme sæt. Alternativt, hver kørsel kan være faldet ind i analyse uafhængigt.
    3. Flytte til fanen dosis svar passer diagram over dataene. Vælg KD model, hvis en enkelt bindingssted forventes. Modellens Hill er også en mulighed for flere bindingssteder med kooperativ adfærd. Outlier punkter, der ikke gik igennem kvalitetskontrol kan fjernes fra fit på dette stadium. Flet sæt med flere assays vil være gennemsnit og fejl beregnes som standardafvigelsen.
    4. Åbn den sidste fane og sammenligne resultater mellem alle parceller på en enkelt graf. Hent montering resultater for hver kurve fra den tabel, der er genereret. Eksportere data eller monteret kurver til andre præsentation eller analyse software, hvis det ønskes.

Representative Results

Domænet E-PRD (rester 1822-2014 klonet i pProEX-HTC) af det menneskelige envoplakin gen og VimRod domæne (restprodukter fra 99-249 klonet i pET21a) af menneskelige vimentin4 blev udtrykt med His6 tags og renset. Figur 6 og figur 7 viser niveauer af renheden af VimRod (18,8 kDa) og E-PRD (21.8 kDa) fremstillet af denne metode af protein oprensning. Fjernelse af His6 tag fra E-PRD konstruktion er afgørende for MST eksperimenter som VimRod protein markeres ved hjælp af et His6 tag bindende farvestof og enhver E-PRD bevarer sin His6 tag kan konkurrere om binding af farvestoffet. Den anden IMAC kolonne efter spaltning af tag med TEV protease fjerner TEV protease, kløvet tag og enhver uncleaved His6-E-PRD, der forblev. Den endelige polering trin i rensning er størrelse udstødelse kromatografi. Selvom det både proteiner er af samme størrelse, eluerer VimRod fra kolonnen på en 51 mL mens E-PRD eluering peak er centreret på 72 mL hvor et protein monomer af denne størrelse kan forventes. Den tilsyneladende stigning i størrelsen af VimRod er sandsynligvis skyldes den dens egenskaber som en tråddannende lang stang formet protein som analytisk ultracentrifuge eksperimenter viste, at VimRod var monomere4. Lavere udbytter af protein er fremstillet af de kulturer, dyrket i M9 end dem fra rige bouillon på grund af en lavere mængde af celler produceres i minimal medierne. Den indledende vækst af større starter kulturer for M9 præparater i TB giver mulighed for forbedring af celle udbytter samtidig opretholde omfanget af 15N mærkning nødvendige for NMR eksperimenter.

15N -1H HSQCs blev erhvervet for vildtype og R1914E mutant af E-PRD i tilstedeværelse eller fravær af VimRod (figur 8A-8 D). Spektret af E-PRD i figur 8A viser det forventede antal godt løst toppe, betegnende for et ordentligt foldet protein. I overværelse af VimRod (fig. 8B) viser spektret omfattende linje udvidelse og peak forsvinden, svarende til bindingen mellem E-PRD og VimRod. Bindingen er tabt ved mutation af R1914E som det fremgår af en sammenligning af figur 8 c og 8 D. Lille ændring er observeret i spektrum ved tilsætning af VimRod til den R1914E mutant med angivelse af en mangel på binding mellem denne mutant E-PRD og VimRod. E-PRD peak støtteintensiteter tilstedeværelse/manglende VimRod var sammenlignet og afbildet som relative peak intensiteterne i figur 8E, som angiver vifte af topforbredning i E-PRD kompleks. R1914E mutant af E-PRD (ikke vist) bevaret omkring 97% af toppe på 20% eller højere peak intensiteter i tilstedeværelse af VimRod i forhold til omkring 20% for vildtype (figur 8E). Dette udgør et tab af funktion punkt mutant, med yderligere mutanter med mellemliggende virkninger også har været undersøgt4.

Til at validere og kvantificere bindingen af VimRod og E-PRD MST analyse ved hjælp af His6-VimRod mærket med fluorescerende rød-tris-NTA farvestof som målet blandet med faldende koncentrationer af ligand E-PRD fra 1,28 mM til 39.1 nM blev udført. Tre bindende titreringer blev gennemført, og resultaterne er gennemsnit og vist i figur 9. Dataene blev passer med en standard model af en-webstedet ligand bindende og gav en KD 25,7 ± 2.1 μm. Evaluering af binding mellem VimRod og E-PRD af overflade plasmon resonans gav et lignende KD værdi af 19.1 ± 1,3 μM4.

Figure 1
Figur 1: Screen Capture af opsætningen af NMR eksperiment. Vinduet vist bruges til at oprette en standard eksperiment til at samle en HSQC dataset. Eksperimentparametre læses i støder op til eksperimentet. ZGPR forsøget vist er valgt som en indledende forsøg at indlæse standard og opløsningsmidler afhænger af proton parametre. Vinduet titel bruges til input eksperimentelle detaljer for journalføring formål. For at indsamle HSQC spektrum er ZGPR eksperiment erstattet med SFHMQC3GPPH. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: justering af NMR eksperimentelle parametre. Vinduet vist bruges til at angive de grundlæggende parametre for NMR puls sekvens for at optimere signalet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: NMR databehandling. Parametre, der anvendes til behandling af hver af de to dimensioner af NMR-spektrum er vist med pile, der angiver dem, der er typisk justeret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: parametre til NMR Peak pluk. De parametre, der bruges til plukning af NMR toppe i forarbejdede NMR-spektrum er vist med typiske værdier. Justere ppm rækkevidde, intensiteten og antallet af toppe til at optimere spektre. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: repræsentant Peaklist med intensiteter. Hver top, der er plukket i NMR-spektrum er givet en række, og dens 1H og 15N kemiske Skift og signal intensitet vises. Denne peaklist kan derefter bruges til at sammenligne spektre er fremstillet i en vekselvirkende partner tilstedeværelse eller mangler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: rensning af His6-mærket VimRod af IMAC og S. A. Af kromatogram til eluering fra kolonnen IMAC viser en større peak af VimRod. B. af kromatogram til eluering fra kolonnen S viser en større peak. C. SDS-PAGE af fraktioner indsamles i løbet af rensning: MW standarder med MW angivet i kDa til venstre for den gel (M), cell lysate (1), IMAC flow-gennem (2), vask (3), samles eluering (E1), samlet S eluering (E2). Bands synlige på højere Molekylær vægt i baner E1 og E2 er oligomerer i pure VimRod som bekræftet af vestlige skamplet (data ikke vist). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: rensning af E-PRD af IMAC og S. A. SDS-PAGE af IMAC rensning viser molekylvægt standarder med MW angivet i kDa til venstre for gel (M), og eluatet fra den første IMAC kolonne (E1), den TEV kavalergang-produkter (+ TEV), og flow igennem fra den anden IMAC kolonne (FT). B. kromatografen fra kolonnen S viser en større peak. C. SDS-PAGE molekylvægt standarder (M) og fraktioner fra S peak. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: HSQC spektre af Wild-type og R1914E Mutant af E-PRD tilstedeværelse og fravær af VimRod. HSQC spektre Vis wild-type E-PRD (100 µM) i 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, pH 7 i fravær (A) eller tilstedeværelsen af 50 µM VimRod (B). Paneler C og D er HSQC spektre af R1914E mutant (100µM) i fravær eller tilstedeværelse af 50 µM VimRod, henholdsvis. I panelet E relative 1H -15N peak er intensiteter af E-PRD med eller uden VimRod bindende vist som en funktion af peak-nummer, som er vilkårligt tildelt og ikke baseret på sekvensen holdning. Disse værdier kan bruges til at definere en betydning cutoff for peak intensitet reduktion ved tilsætning af en ligand. Hvis opgaver er tilgængelig, kan de væsentlige værdier ofte ses skal tilknyttes en bindende område. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9: bindende af E-PRD til VimRod. E-PRD blev fortyndet i en serie af to-Folds fortyndinger fra 1,28 mM til 39.1 nM og inkuberes med mærket VimRod før du udfører MST analyse. Data fra tre uafhængige assays blev kombineret. Dataene, der var egnede til en KD model giver en KD 25,7 μm med en KD tillid ± 2.1 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Reagens Mængde
Natrium fosfat, dibasiske (vandfri) 6,0 g
Kalium fosfat, monobasic (vandfri) 3,0 g
Natriumchlorid 0,5 g
H2O Op til 950 mL

Tabel 1. M9 medier til isotopisk mærkning.

Reagens Mængde
15 NH4Cl 1,0 g
Glukose (eller 13C-glucose) 2,0 g
1 M MgSO4 2 mL
50 mM CaCl2 4 mL
20 mg/mL thiamin 1,0 mL
3 mM FeCl3 400 ΜL
Metal blanding (tabel 3) 500 ΜL
H2O Op til 50 mL

Tabel 2. Næringsstof Mix for tilskud af M9 medier.

Reagens Mængde
4 mM ZnSO4 323 mg
1 mM MnSO4 75,5 mg
4,7 mM H3BO3 145 mg
0,7 mM CuSO4 55.9 mg
H2O Op til 500 mL

Tabel 3. Metal blanding Supplement til berigende MT næringsstof Mix.

Stikprøve 1 mM E-PRD i buffer A1 (µL) 1mM VimRod i buffer A (µL) Buffer en (µL) 200 µM DSS i D2O (µL) Buffer B2 (µL) Samlede volumen (µL)
E-PRD alene 50 0 50 50 350 500
E-PRD + VimRod 50 50 0 50 350 500
1 Buffer A: 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7
2 Buffer B: 23 mM Tris-HCl, 1,14 mM DTT, pH 7

Tabel 4. NMR prøveforberedelse.

Discussion

Den 2D 15N-løst NMR eksperiment er en af de mest udbredte metoder til at vise hvor to molekyler interagere. Det er den mest informationsrige metode, der giver mulighed for begge parter signaler overvåges løbende i hele en titrering eksperiment i løsning tilstand. Selvom typisk kvalitative for store komplekser, kan metoden også bruges i gunstige tilfælde måle bindende tilhørsforhold hvor NMR-signaler kan spores i høj opløsning spektre. Hvis tildelinger kan foretages bekvemt, kan som for mange proteiner under 20 kDa i størrelse, bindingsstederne også tilknyttes. Supplerende assays som MST kvantitative oplysninger om interaktioner i løsning og kræver mindre protein i umærkede stater. Sammenligning af mutant bindende oplysninger er nyttige for den kontrol for at sikre, at interaktioner dokumenteres NMR linje udvidelse er ægte og ikke artefakter af, for eksempel, sammenlægning eller viskositet ændringer.

Protein udtryk

Strømline udtryk proces reducerer mængden af labor intensiv protein produktion. En del af denne optimeringsproces indebærer identificering af en passende stamme af E. coli i udtrykket rekombinante protein. Stamme præference afhænger elementer, herunder karakteren af vektoren i brug, og mere specifikt den ultimative stabilitet af rekombinante protein bliver udtrykt7. Risikoen for nedbrydning af heterolog protein af endogene E. coli proteaser kan reduceres ved brug af protease mangelfuld E. coli som BL21 stammen. For gener der indeholder sjældne kodon, kan en stamme som BL21-CodonPlus (DE3) RIPL være at foretrække. Denne stamme kombinerer protease mangelfuld karakter af BL21 stammen med yderligere endogene kopier af sjældne codon tRNAer for arginin, isoleucin, prolin og leucin. Alternativt, sjældne kodon, der kan kompromittere overekspression kan undgås ved at bestille en codon-optimeret konstruktion fra en kommerciel kilde. Mange stammer af E. coli er til rådighed for rekombinante genekspression, hver optimeret til omgåelse af et bestemt problem under udtryk7. I forbindelse med denne undersøgelse produceret standard protease mangelfuld stamme BL21(DE3) tilstrækkelige mængder af opløseligt protein for efterfølgende oprensning og analyse.

Protein oprensning

Rensning-protokollen for et bestemt protein er ofte unikke i den forstand, at hver protein forbliver stabil og opløselige under forskellige forhold såsom temperatur, salt koncentration eller pH. Den samlede effektivitet af rensning gennem affinitet kromatografi er også følsomme over for koncentrationen af fremstilling arter såsom imidazol på forskellige trin i rensningsprocessen. I dette arbejde var kritisk buffer betingelserne for IMAC pH for E-PRD og imidazol koncentration for VimRod. En pH-værdi på 7,5 var forpligtet til at undgå udfældning af E-PRD efter indledende eluering fra kolonnen IMAC. Til IMAC rensning af VimRod, blev øge koncentrationen af imidazol fra 30 til 50 mM i kolonne wash skridt fundet til at have en væsentlig forbedring i renheden af de endelige eluering fraktioner. For trinnet eluering blev øger koncentrationen af imidazol fra 250 til 350 mM også fundet til at forbedre udbyttet af den endelige eluering. Første forsøg på at eluere protein ved hjælp af 250 mM imidazol førte til ufuldstændige eluering af VimRod som det fremgår af en endelig 1 M imidazol strimmel af kolonnen (data ikke vist). Øger imidazol koncentrationen til 350 mM for eluering var tilstrækkeligt til at genoprette alle protein bundet til kolonnen. S kan tjene et dobbelt formål, fordi det fungerer som en polering skridt for protein oprensning mens samtidig udfører buffer exchange. Buffer exchange er et kritisk skridt for efterfølgende bindende analyse, da det fjerner imidazol bruges til elueres His6-mærkede protein. Det fungerer også som en mulighed for at ændre forhold såsom salt koncentration eller pH, hvilket kan påvirke effektiviteten af visse downstream teknikker eller assays. Protein, der termisk Skift (PTS) kan bruges til at identificere optimale buffere for downstream assays, især for dem, der kræver stabile protein for længerevarende perioder på stuetemperatur8,9.

Bindende analyse

Protein, som er frisklavet er kritisk for nøjagtig bindende assays, selvom frosne protein kan også bruges, så længe resultaterne sammenlignes. Trådformede proteiner som vimentin multimerize i en salt og pH afhængig af mode, og dermed løsningen betingelse skal optimeres og oligomere status vurderet af en metode som sek10,11, dynamiske lys spredning 12 eller analytisk ultracentrifugering13,14,15. NMR spektroskopi er velegnet til måling af ligand interaktioner af små proteiner med atomic opløsning. Men når et protein interagerer med større molekyle, langsommere tumbling ensues, og dette resulterer i tab af signaler, som kan bekræfte bindende, selvom det ikke nødvendigvis tillade kortlægning af bindende websteder, hvilket også kræver tildeling af mindst rygraden resonanser. I dette scenario tillader NMR eksperimenter ikke identifikation af webstedet interaktion. Dermed instrueret site mutagenese er anvendt til at identificere de kritiske restkoncentrationer behov for bindingen. Sådanne mutanter udviser derfor ikke tab af signal. I denne protokol, en mutant form med en substitution på position 1914 bevarer de maksimale intensiteter i tilstedeværelsen af VimRod og bekræfter derfor afbrydelse af samspillet mellem E-PRD og VimRod. Tildeling af rygraden og sidechain resonanser ville tilføje værdi til denne tilgang, især som struktur for den gratis E-PRD er blevet løst af røntgenkrystallografi4. Fremtidige anvendelser af NMR omfatter karakterisering af komplekse samspil mellem større molekyler og vil drage fordel af ultra høj felt magneter og brugen af andre observerbare grupper såsom 13C-mærket og trifluor methylgrupper som journalister.

MST har en række fordele for at studere bindende interaktioner16. De bindende partnere er gratis i løsning og ikke immobiliseret. Analyse af kvaliteten af prøverne, der er indbygget i software med kvalitetskontrol rapportering af sammenlægning, adsorption til kapillærer eller utilstrækkelig fluorescerende mærkning af target-molekylet. Små mængder af målet bruges typisk, koncentrationen af mærket målet er normalt mellem 20-50 nM i en 10-20 μL volumen/reaktion. Denne protokol bruger meget lille reaktion mængder (10 μL) at maksimere koncentrationen af ligand, der kan opnås i titreringer giver svag bindende interaktioner at karakteriseres. Dette nødvendiggør præcis pipettering og omhu til at undgå at indføre bobler samtidig stadig grundigt blanding. Passende blanding er kritisk for nøjagtige og ensartede fluorescens målinger langs sæt af serielle fortyndinger. Mængden af Tween-20 i MST eksperimenter blev reduceret fra en standard 0,05-0.015% lavere tendens til at skabe bobler og forbedre blanding.

RØD-Tris-NTA farvestof giver en hurtig, nem og bekvem måde at fluorescently mærke et protein, der har en hans tag. Mærkning er effektivt gennemført på kun 30 minutter og er meget stram, så ingen farvestof fjernelse procedure er nødvendig. Ingen ændringer er foretaget til aminosyrerester i det protein, der kan ændre ligand bindende egenskaber. En advarsel er, at kun protein til at være mærket skal have et His6 tag. Dette kræves kløvningen af tag fra ligand protein, E-PRD og fjernelse af tag og uncleaved E-PRD med en anden IMAC kolonne trin. Hvis det er muligt, ligand protein bør tilberedes uden brug af en hans tag. Alternativt, proteiner kan være kovalent mærket med en fluorophore gennem Amin kobling til lysin restkoncentrationer eller thiol kobling cystein restprodukter. Dog skal udvises forsigtighed, ved hjælp af sådanne systemer siden den kovalente tilknytning af en fluorophore kan påvirke elektrostatisk eller polar bindende interaktioner afhængige af lysin eller cystein restkoncentrationer. Kvantificering af bindende affinitet mellem VimRod og E-PRD af MST var usædvanligt følsom over for salt koncentration. Dette problem blev dæmpet af oprindeligt dialyzing både destinations- og ligand i det samme parti af analysebuffer. Mætning af MST bindende kurve kunne dog ikke blive nået, når du udfører MST assay i overværelse af 150 mM NaCl på grund af den komplekse opførsel af VimRod. Pålidelige og fuldstændige data er opnået når koncentrationen af NaCl blev sænket til 10 mM muliggør præcis beregning af KD. Dermed, omhyggelig optimering løsning betingelser og sammenligning med supplerende assays anbefales at opnå solide resultater. MST kan desuden bruges til at kvantificere den salt afhængighed for en given interaktion, kvantificere støkiometriske egenskaber af protein interaktioner, monitor proteinfoldning og sonde ind i enzym kinetik17.

Disclosures

Forfatterne afslører ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette projekt har været støttet af NSERC RGPIN-2018-04994, Campus Alberta Innovation Program (RCP-12-002 C) og Alberta Prion Research Institute / Alberta innoverer Bio Solutions (201600018), tildelt til M.O og genom Canada og Canada Foundation for Innovation tilskud til The Metabolomics Innovation Centre (TMIC) og NANUC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Monolith NT.115, includes control and analysis software NanoTemper Technologies MO-G008 Instrument for microscal thermophoresis
His-Tag Labeling Kit RED-Tris-NTA NanoTemper Technologies MO-L008 RED-tris-NTA dye for MST
Standard capillaries NanoTemper Technologies MO-K022 capillaries for MST
HisTrap HP, 5 mL GE Healthcare 17524801 IMAC column
HisPur Ni-NTA resin, 100 mL Thermo Fisher Scientific 88222 IMAC resin
HiLoad 16/600 Superdex 75 pg GE Healthcare 28989333 SEC column
TEV protease Sigma Aldrich T4455 cleavage of his tag from E-PRD
BL21(DE3) Competent E. coli New England Biolabs C2527H cells for protein expression
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets EDTA-Free Sigma Aldrich 11873580001 protease inhibitors for protein purification by IMAC
TCEP, Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Sigma Aldrich C4706 reducing agent for protein purification
Reagents (HEPES, NaCl, etc) Sigma Aldrich various Preparation of media and buffers
Ammonium chloride (15N, 99%) Cambridge Isotope Laboratories NLM-467 isotope labelling for NMR
D2O, Deuterium Oxide (D, 99.8%) Cambridge Isotope Laboratories DLM-2259 NMR sample preparation
DSS, Sodium 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-D6 (D,98%) Cambridge Isotope Laboratories DLM-8206 reference for NMR
Precision 5 mm NMR Tubes, 7” long SJM/Deuterotubes BOROECO-5-7 NMR tubes
NMR spectrometer (14.1 Tesla) Bruker acquisition of NMR data
TCI 5mm z-PFG cryogenic probe Bruker acquisition of NMR data
Name Company Catalog Number Comments
Software
Bruker TopSpin 4.0.1 Bruker processing of NMR data
MO.Control NanoTemper Technologies included with Monlith NT.115
MO.Affinity Analysis NanoTemper Technologies included with Monlith NT.115

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vinogradova, O., Qin, J. NMR as a unique tool in assessment and complex determination of weak protein-protein interactions. Topics in Current Chemistry. 326, 35-45 (2012).
  2. McKercher, M. A., Wuttke, D. S. NMR Chemical Shift Mapping of SH2 Peptide Interactions. Methods in Molecular Biology. 1555, Clifton, N.J. 269-290 (2017).
  3. Al-Jassar, C., Bikker, H., Overduin, M., Chidgey, M. Mechanistic Basis of Desmosome-Targeted Diseases. Journal of Molecular Biology. 425 (21), 4006-4022 (2013).
  4. Fogl, C., et al. Mechanism of intermediate filament recognition by plakin repeat domains revealed by envoplakin targeting of vimentin. Nature Communications. 7, (2016).
  5. The Protein Protocols Handbook. Walker, J. M. , 2nd ed, Humana Press. (2002).
  6. Wishart, D. S., et al. 1H, 13C and 15N chemical shift referencing in biomolecular NMR. J. Biomol. NMR. 6, 135-140 (1995).
  7. Casali, N. Escherichia coli Host Strains. E. coli Plasmid Vectors. , Humana Press. 27-48 (2003).
  8. Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., DeTitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).
  9. Kozak, S., et al. Optimization of protein samples for NMR using thermal shift assays. Journal of Biomolecular Nmr. 64, 281-289 (2016).
  10. Burgess, R. R. A brief practical review of size exclusion chromatography: Rules of thumb, limitations, and troubleshooting. Protein Expression and Purification. , In Press (2018).
  11. Kunji, E. R. S., Harding, M., Butler, P. J. G., Akamine, P. Determination of the molecular mass and dimensions of membrane proteins by size exclusion chromatography. Methods. 46 (2), 62-72 (2008).
  12. Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences. Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).
  13. Patel, T. R., Winzor, D. J., Scott, D. J. Analytical ultracentrifugation: A versatile tool for the characterisation of macromolecular complexes in solution. Methods. 95, 55-61 (2016).
  14. Pearson, J. Z., et al. Chapter One - Next-Generation AUC Adds a Spectral Dimension: Development of Multiwavelength Detectors for the Analytical Ultracentrifuge. Methods in Enzymology. Cole, J. L. 562, Academic Press. 1-26 (2015).
  15. Gorbet, G. E., Pearson, J. Z., Demeler, A. K., Cölfen, H., Demeler, B. Chapter Two - Next-Generation AUC: Analysis of Multiwavelength Analytical Ultracentrifugation Data. Methods in Enzymology. Cole, J. L. 562, Academic Press. 27-47 (2015).
  16. Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nature Communications. 1, 100 (2010).
  17. Jerabek-Willemsen, M., et al. MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond. Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).

Tags

Biokemi sag 141 celle adhesiondesmosome desmoplakin trådformede protein mellemliggende glødetråd individuel thermophoresis Kernemagnetisk resonans-spektroskopi protein interaktion vimentin
Måling af interaktioner af kugleformede og fintrådede proteiner af Kernemagnetisk resonans-spektroskopi (NMR) og individuel Thermophoresis (MST)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Winkelaar, G., Trieber, C., Kumar,… More

Winkelaar, G., Trieber, C., Kumar, J., Overduin, M. Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST). J. Vis. Exp. (141), e58537, doi:10.3791/58537 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter