Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Mäta interaktion av klotformig och fintrådiga proteiner av kärnmagnetisk resonansspektroskopi (NMR) och hur provtagningsutrustningen skall Thermophoresis (MST)

Published: November 2, 2018 doi: 10.3791/58537
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry, University of Alberta

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för produktion och rening av proteiner som är märkta med stabila isotoper och efterföljande karaktärisering av protein-protein interaktioner med hjälp av kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi och hur provtagningsutrustningen skall Thermophoresis (MST) experiment.

Abstract

Trådformiga proteiner såsom vimentin ger organisation inom celler genom att tillhandahålla en strukturell byggnadsställning med platser som binder proteiner som innehåller plakin upprepas. Här beskrivs ett protokoll för att upptäcka och mäta sådana interaktioner med klotformig plakin upprepa domänen envoplakin och spiralformade spolen för vimentin. Detta ger en grund för att fastställa huruvida ett protein som binder vimentin (eller liknande fintrådiga proteiner) och för mätning av frändskapet av interaktionen. Globulära protein av intresse är märkt med 15N och titreras med vimentin protein i lösning. En tvådimensionella NMR spectrumen förvärvas att upptäcka interaktioner genom att observera förändringar i topp form eller kemiska förskjutningarna och belysa effekterna av lösning villkor inklusive salthalt, som påverkar vimentin Kvartära struktur. Om proteinet av intresse binder fintrådiga liganden, kvantifieras bindande interaktionen i MST använder de renade proteinerna. Tillvägagångssättet är ett enkelt sätt för att fastställa huruvida ett protein av intresse binder en glödtråd och bedöma hur ändringar, såsom mutationer eller lösning villkor, påverkar samspelet.

Introduction

Interaktioner mellan proteiner tillåta bildandet av molekylära maskiner som skapar ordning inom celler. De enskilda interaktionerna är ofta svag men vanligtvis bidra till multivalenta komplex som kan vara samarbetsvillig och dynamiskt reglerat. Känsliga analyser som ger atomär upplösning och kvantitativ information om sådana komplexa interaktioner behövs för att härleda mekanismer och utforma insatser såsom drog-liknande molekyler. NMR spektroskopin är en effektiv metod för att erhålla sådan information om proteininteraktioner, och också används för snabb screening för ligander inklusive de som binder svagt1. De NMR-metoder som används kan delas in sådana som är protein iaktta eller ligand iaktta. Detta manuskript använder den tidigare strategi där ett spektrum av en stabil-isotop märkt protein som är jämförelsevis små (vanligtvis under 20 kDa) förvärvas och omärkt liganden titreras. Detta att de märkta resterna inblandad i interaktionen mappas i gynnsamma fall. En gång de komplexa formerna, det finns förändringar i kemiska miljöer av samverkande restprodukter som visar sig som förändringar i den kemiska förskjutningen och formen på sina NMR-signaler. Omfattningen av sådana förändringar korrelerar med grad av inblandning av dessa grupper i samspelet. Kemisk förskjutning störningar (CSP) kan mätas genom att jämföra en serie av NMR-spektra av proteinet i frånvaro och närvaro av varierande mängder av liganden. För större ligander eller komplexa samspel, kan förändring i topp form eller intensitet mätas för att härleda interaktioner.

Vanligaste 2D experimentet används för att upptäcka ligand interaktioner är 15N-heteronuclear enda quantum korrelation (HSQC) experiment2. Detta kräver att ett protein jämnt vara märkt med 15N, vilket vanligtvis uppnås genom att uttrycka dem som affinitet-taggade versioner i E. coli bakteriekulturer odlas i 15N-berikad media. Bindande framgår när HSQC spektra som samlats in under titreringen är överlagrade, avslöjande topp ändringar för en delmängd av rester medverkar vid komplexa uppkomst. Interaktionen kan uppstå i snabb exchange regimen där fri och ligand-mättade stat signalerna kollapsa i en befolkning i genomsnitt peak. Alternativt, när det gäller långsam utbyte mellan staterna, båda signalerna observeras med integraler som representerar deras relativa belopp. Medan NMR lineshape analys kan användas för att uppskatta de bindande tillhörighet i vissa fall, metoder såsom MST har också visat sig vara bekväm och ge cross-validering av äkta interaktioner.

Det exempel som ges är av två proteiner som finns inom desmosomes. De förmedlar korsningar mellan cellytan och cytoskelettet och medla multivalenta interaktioner mellan cell adhesion maskiner och mellanliggande glödtrådar att upprätthålla integriteten av hud och hjärta vävnader och motstå av skeva styrkor. Sjukdomar kan uppstå när desmosomal proteiner såsom desmoplakin eller vimentin äventyras genom mutationer eller autoantikroppar, leder till destabilization av cell-cell korsningar, och därmed deras interaktioner är av avgörande betydelse3. Den strukturella grunden för ligand bindning av desmosomal proteiner kan karakteriseras av NMR spektroskopi, medan interaktioner kan kvantifieras genom MST. Metoder häri användes för att beskriva samspelet mellan plakin upprepa domäner (PRDs) som ofta förekommer som tandem uppsättningar som erbjuder grundläggande grooves och vimentin, en mellanliggande glödtråden som samverkar genom en sura yta som erbjuds av dess spiralformade paket med4. Dessa komplex bildas vid cellmembranet där de ankare för mellanliggande glödtrådar av cell cytoskelettet till desmosomes som ansluter till angränsande celler, och utgör därmed ett nätverk av självhäftande obligationer som strålar hela en vävnad.

Protocol

1. rekombinant proteinuttryck

  1. Uttryck för Envoplakin PRD (E-PRD) och Vimentin 99-249 (VimRod)
    1. Omvandla E. coli BL21(DE3) celler med plasmiden som innehåller den önskade genen. Sprida cellerna på agarplattor som innehåller 100 µg/mL ampicillin. Inkubera plattorna vid 37 ° C över natten.
    2. Plocka en enda koloni och Inokulera 20 mL av fantastisk buljong (TB) innehållande 100 µg/mL ampicillin välja för Plasmiden. Växer kulturen vid 37 ° C under skakning (180 rpm) över natten.
    3. Överför hela 20 mL kulturen till 1 L TB innehållande 50 µg/mL ampicillin. Inkubera kulturen vid 37 ° C med skakningar vid 180 rpm tills den OD600 = 0,6-0,8.
    4. Minska temperaturen till 18 ° C och framkalla proteinuttryck genom att lägga till isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) till en slutlig koncentration på 1 mM. Fortsätt inkubation vid 18 ° C under skakning på 160 rpm över natten tillåter proteinuttryck.
    5. Skörda cellerna genom centrifugering kulturen vid 8000 x g i 15 min. Dekantera och Kassera supernatanten.
    6. Tvätta de skördade cellerna av omblandning cellpelleten i ca 40 mL fosfat buffrad koksaltlösning (PBS: 20 mM fosfatbuffert, pH 7,4, 120 mM NaCl). Överföra resuspension till en 50 mL tub. Centrifugera igen vid 8 000 x g i 15 min.
    7. Dekantera och kasta bort supernatanten. Antingen omedelbart påbörja protokollet rening eller frysa cell pellets vid-20 ° C för framtida bruk.
  2. Uttryck av Isotopically märkta proteinet
    1. Förvandla E. coli BL21(DE3) celler och förbereda en 20 mL förrätt kultur som i 1.1.1-1.1.2.
    2. Överför hela 20 mL kulturen till 1 L berikad TB som innehåller en ytterligare 4,0 g trypton, 5,0 g NaCl och 100 µg/mL ampicillin. Inkubera kulturen vid 37 ° C under skakning på 160 rpm tills den OD600 = 1,6-1,9.
    3. Skörda 1 L kulturen genom centrifugering vid 8000 x g i 15 min. Dekantera och kasta bort supernatanten.
    4. Tvätta cellpelleten genom att försiktigt omblandning i ca 40 mL PBS och överföra resuspension till en 50 mL tub.
    5. Centrifugera igen vid 8 000 x g i 15 min. Dekantera och kasta bort supernatanten.
    6. Återsuspendera cellpelleten i 20 mL M9 minimal media (tabell 1) och överföring till resten av de 950 mL av M9 minimal media som innehåller 100 µg/mL ampicillin.
    7. Tillsätt 50 mL filter steriliseras näringsämne blandning (tabellerna 2 och 3).
    8. Acklimatisera sig kulturen till 18 ° C i 30 min innan du lägger IPTG till en slutlig koncentration på 1 mM.
    9. Inkubera över natten vid 18 ° C under skakning på 160 rpm.
    10. Skörda cellerna som i avsnitt 1.1.4-1.1.6.

2. orörlig metall affinitet kromatografi (IMAC) rening av VimRod och E-PRD

  1. Rening av His6-taggade VimRod
    1. Återsuspendera cellpelleten i 5 mL/g PBS som innehåller en proteas hämmare cocktail saknar EDTA. Homogenisera med 12 drag i en Dounce vävnad Homogenisatorer att förbättra cell Lys i följande steg.
    2. På isen, Sonikera cellsuspension på en puls av 1 s/1 s off, 80% amplitud för sammanlagt 1,5 min. Upprepa ultraljudsbehandling två ytterligare tider, snurra försiktigt på is mellan körningar att förhindra överhettning.
    3. Centrifugera provet vid 75 000 x g i 45 min. Dekantera och filtrera supernatanten med hjälp av en spruta filter (0.45 µm).
    4. Temperera en 5 mL IMAC kolumn med 5 kolumn volymer (CV) av bindande buffert (20 mM HEPES, pH 7.5, 500 mM NaCl, 10 mM Imidazol) med en flödeshastighet av 1 mL/min med ett snabbt protein vätskekromatografi (FPLC) system.
    5. Ladda filtrerade supernatanten på kolonnen med en flödeshastighet av 0,5 mL/min.
    6. Tvätta kolonnen med 5 CV av tvätta buffert (20 mM HEPES, pH 7.5, 500 mM NaCl, 50 mM Imidazol) med en flödeshastighet av 1 mL/min.
    7. Eluera proteinet med 3 CV eluering buffert (20 mM HEPES, pH 7.5, 500 mM NaCl, 350 mM Imidazol) med en flödeshastighet av 0,5 mL/min. samla 1,5 mL fraktioner. Om tillgängligt, väljer du upp-flow eluering läge att öka koncentrationen av eluerade protein.
    8. Identifiera de fraktioner från FPLC kromatogrammet som innehåller proteinet av intresse av SDS-PAGE och använda standardmetoder för att mäta koncentration protein5.
    9. Pool och koncentrera eluering fraktioner som innehåller de högsta beloppen för protein med en centrifugal ultrafiltrering enhet (MWCO 3 kDa, 5 mL) till 2 mL. Centrifugera vid 21 000 x g ta bort eventuell fällning och passerar genom ett 0,22 μm filter.
    10. Temperera en 120 mL utslagning kromatografi (S) i kolumnen storlek med 2 CV för S buffert (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.5, 0,5 mM TCEP) med en flödeshastighet av 1 mL/min med en FPLC.
    11. Injicera det koncentrerat proteinet från 2.1.9 på kolumnen och eluera med 1 CV för S buffert med en flödeshastighet på 0,5 mL/min, samla 1 mL fraktioner.
    12. Identifiera de fraktioner som innehåller proteinet av intresse som innan.
    13. Poolen fraktioner som innehåller de högsta mängder proteinet.
    14. Förvaras vid 4 ° C för kort sikt användning eller Lägg till glycerol 20% och förvaras vid-80 ° C i små portioner.
  2. Rening av E-PRD Protein med His6 etiketten tas bort
    1. Följ stegen i 2.1.1-2.1.8 att rena His6-taggade E-PRD protein. Pool peak fraktioner och bestämma proteinkoncentration.
    2. Lägg till tobak etch virus (TEV) proteas (1 mg/mL) 2 µL/mg av poolade protein. Överföra till dialys slangar (6 kDa) och dialyze i S buffert över natten vid 4 ° C. Detta steg kan klyvning av taggen His6 och borttagning av den Imidazol som kommer att störa bindningen till Ni-NTA harts i nästa steg.
    3. Temperera 5 mL av Ni-NTA harts i en gravitation kolumn med 3 CV för S-buffert. Dränera överflödig buffert från kådan.
    4. Häll klyvs E-PRD proteinet på kådan och inkubera i 1 timme på en gungande plattform att tillåta uncleaved His6-taggade E-PRD och klyvs His6-taggen att binda. Den TEV proteasen är också His6-märkta och kommer för att binda kådan. Samla in flödet genom, som innehåller taggen-gratis E-PRD. Tvätta kådan med 2 CV för S buffert att se till att alla E-PRD återvinns.
    5. Koncentrera sig E-PRD i flödet genom att 2 mL med en centrifugal ultrafiltrering enhet (MWCO 3 kDa, 5 mL). Centrifugera vid 21 000 x g ta bort eventuell fällning och passerar genom ett 0,22 μm filter.
    6. Temperera en 120 mL S kolumn med 2 CV för S buffert (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.5, 0,5 mM TCEP för MST eller 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7 för NMR) med en flödeshastighet av 1 mL/min med en FPLC.
    7. Injicera koncentrerad E-PRD proteinet från 2.2.5 på kolumnen och eluera med 1 CV för S buffert med en flödeshastighet på 0,5 mL/min, samla 1 mL fraktioner.
    8. Identifiera de fraktioner som innehåller proteinet av intresse som innan.
    9. Poolen fraktioner som innehåller de högsta mängder proteinet.
    10. Förvaras vid 4 ° C för kort sikt användning eller Lägg till glycerol 20% och förvaras vid-80 ° C i små portioner.

3. NMR metoder

  1. NMR provberedning
    1. Rena 15N-märkt vildtyp eller R1914E E-PRD protein som tidigare beskrivits med 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7 som S bufferten för steg 2.2.6. Protein stamlösningar sträcker sig vanligtvis från 0,3 till 1 mM med volymer med ca 1 mL.
      Obs: Protein kan vara koncentrerad till > 100 µM med hjälp av en MWCO 3 kDa, 5 mL centrifugal ultrafiltrering enhet till att koncentrationen till ett lämpligt område för provberedning.
    2. Rena ett prov av omärkta VimRod protein med 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7 som S bufferten för steg 2.1.10.
    3. I en slutlig volym av 500 µL, lägga till vildtyp eller muterade E-PRD protein till en slutlig koncentration på 100µM, deuteriumoxid (D2O) till en slutlig koncentration på 10% (v/v) och DSS (4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic syra) till en slutkoncentration av 20 µM. Bring provvolymen upp till 500 µL med 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7. Ett representativt prov förberedelse beskrivs i tabell 4.
      Obs: 0 ppm resonans av DSS används för att kalibrera de kemiska förskjutningarna för 1H samt för indirekta hänvisningar 15N kemiska förskjutningar av protein6. D2O används för deuterium lås signalen för att hålla spektrometern på ett konstant netto magnetfält.
    4. Göra upp ett andra prov med E-PRD, D2O och DSS som i föregående steg och lägga till VimRod till en slutkoncentration av 50 µM innan volymen upp till 500 µL.
    5. Överföra de 500 µL proverna till en 5 mm breda NMR rören för experimentet.
  2. NMR experiment
    1. Slå på luftflödet med den eject kommandot ”ej”; Detta kommer att ta provet upp från magneten. Nu placera provet i en spinnare ovanpå magneten genom öppningen och infoga med kommandot ”ij”. Vänta tills provet kvittar släpper magneten innan du fortsätter.
    2. Skapa en ny datamängd med kommandot ”edc” och Ladda standard 1H NMR parametrar genom att välja experiment ”ZGPR” (figur 1). Fyll i namn, EXPNO (experiment nummer) och PROCNO (bearbetade data Mappnummer) fält. Välj lösningsmedlet i fältet ”ange lösningsmedel” och klicka på ”kör 'getprosol'” för att läsa standard probehead och lösningsmedel beroende (prosol) parametrar.
    3. Låsa den deutererade lösningsmedel, dvs D2O provet, kommandot ”lock” och vänta tills den är klar svepande och uppnår lås.
    4. Korrigera resonansfrekvens magneten genom att trimma provet med kommandot Automatisk tuning ”atma”. Övervaka vingla kurvan tills den automatisk inställning är klar.
    5. Shimsa magnetiska fältet TOPSHIM (kommandot ”topshim”). Mellanlägg innebär justeringar av magnetfält att uppnå enhetlighet runt provet. Det är god praxis att lagra shim värden med det befalla ”wsh” och läsa dem med ”rsh” innan topshim, om du använder samma eller liknande proverna.
    6. Justera mottagaren förstärkning med ”rga” kommando för att uppnå maximal signal-brus-förhållande.
    7. Placera mitten av skalan på vatten resonans offset (o1) och Ställ in 90 graders proton pulsen (p1) vid hög effekt med hjälp av ”calibo1p1”.
    8. Samla proton spektrumet med noll gå ”zg” kommandot och processen med ”efp” som inkluderar exponentiell multiplikation (”em”), gratis induktion decay (FID) införliva linje breddning, ”ft” fourier omformningen av FID och ”pk” tillämpa fas korrigering.
    9. Applicera automatiska fas korrigering ”apk” och den automatisk baslinjekorrektion ”absn” med hjälp av polynom utan integration alternativ.
    10. Skapa en ny datauppsättning (som i 3.2.2) för SOFAST HMBC experimentet genom att välja ”SFHMQC3GPPH” i experiment.
    11. Kopia optimerad P1 och O1 från proton spektrum och fylla P1 beroende av pulser med kommandot ”getprosol 1H p1 plw1”, där p1 är optimerad P1 värdet och plw1 är batterinivån för P1.
    12. Optimera konstanten CNST54 om du vill ange förskjutningen för amide Kemisk förskjutning och CNST55 att definiera bandbredd för att omfatta de spektrala regionerna av intresse som tillåter mottagaren vinsten vara optimerad (figur 2). Välj dessa parametrar, extrahera den första FID (gratis induktion decay) från tvådimensionell spektrumet och leta efter observerade signalen att definiera dem. Dessutom variera avkoppling förseningen (D1), antal skanningar (NS) och overksam skanningar (DS) för att få acceptabelt signal känslighet med kommandot ”gs”, som kan gå och skanna för att övervaka datakvalitet i realtid.
    13. Spela in spektra med noll Go ”zg”.
  3. NMR databehandling
    1. Ange parametrarna bearbetning till storleken på den direkta F2 (1H) och indirekta F1 (15N) dimensioner av spektrum med ”SI F2 = 2048, F1 = 512” med valfritt linjär förutsägelse i indirekta dimension (figur 3).
    2. Välj ”QSINE” som funktionen fönster och ange en Sine bell Skift (SSB) 2 att bearbeta tvådimensionell spektrumet.
    3. Ange den kommandot ”xfb” för att bearbeta data i båda riktningarna med fönster funktion och fourier omvandling.
    4. Använd kommandot ”apk2d” att utföra automatisk fas korrigering i båda riktningarna. Om den automatiska processen inte uppnår en tillfredsställande nivå av fas korrigering, extrahera FIDs med kommandot ”rser” beräkna fas värden från 1D bearbetning och tillämpa dem på 2D data.
    5. Korrigera baslinjen med automatisk baslinjen korrigeringsfunktionen ”abs2” för 2D data. Detta gäller ett polynom funktion mellan de ppm-värden som definieras i parametrarna för bearbetning och kommer att producera ett 2D spektrum för vidare analys.
    6. Om du planerar att utföra seriell bearbetning för jämförelse av interaktionsdata med en annan molekyl, lagra processparametrar med det befalla ”wpar” och minns dem med ”rpar”. På detta sätt alla datamängder kommer att behandlas med samma parametrar och variationer kommer inte att införas på grund av bearbetning skillnader.
  4. NMR dataanalys
    1. Ange kommandot ”pp” för att påbörja processen för peak plockning.
    2. Definiera ppm utbud och minsta intensitet och högsta antalet toppar baserat på förväntade toppar (figur 4). Klicka på OK och kontrollera resultaten av okulärbesiktning. Om det behövs kör igen processen tills resultaten är tillfredsställande baserat på spectra kvalitet.
    3. Generera en peaklist med kommandot ”pp”.
      Obs: Denna peaklist innehåller data höjd/peak intensitet information som standard och kan exporteras till efterföljande spectrums och kan läsas av andra program.
    4. Observera ändringar i de högsta stödnivåerna eller rörelse i kemiska förskjutningarna i protein HSQC spektra som indikerar interaktion med en annan molekyl. Om samverkande molekylen är stor, räkna minskningar i peak stödnivåer tillsammans med försvinnandet av några toppar.
    5. Importera listan topp till nästa data genom att klicka på fliken ”toppar” och välja ”Importera” med ett högerklick i fönstret toppar.
    6. Visualisera toppar över spektrum och vid behov flytta dem till nya positioner. Klicka på ”Återställ stödnivåer” för ”komplett tabell” att generera en peaklist för spectrum med stödnivåer (figur 5). Denna topp lista kommer att föra över positionsinformation från lagrade topp lista.
    7. Exportera listorna peak från olika datamängder till ett kalkylblad eller andra matematiska program för analys genom att välja funktionen ”Exportera”.
    8. Beräkna förändringen i peak stödnivåer med funktionen ”peak intensitet i komplex spektrum/peak intensitet i protein spektrum” för varje topp. Värden kan konverteras till procentuell förändring av multiplikation av 100. Observera att peak volymer är också användbara även om peak stödnivåer är lättare att mäta för toppar som är placerade nära varandra, som oftast är fallet för proteiner med hög täthet av förhållandevis breda toppar.

4. hur provtagningsutrustningen skall Thermophoresis (MST)

  1. Beredning av liganden Protein E-PRD
    1. Växla in liganden till en MST kompatibel buffert av dialyzing upp till 800 μL av protein i en 3,5 kDa mini dialys enhet upphängd i 1 L 20 mm HEPES, pH 7.5, 10 mM NaCl, omrörning långsamt vid 4 ° C över natten.
    2. Koncentrera sig liganden använda en centrifugal ultrafiltrering enhet (3 kDa MWCO) genom centrifugering vid 14 000 x g i 10 min. överföring det koncentrerat proteinet till en ren röret.
    3. Centrifugera liganden vid 21 000 x g i 10 min och noggrant överför supernatanten till en ny tub att ta bort alla utfällda proteinet. Bestämma koncentrationen av liganden med absorbansen vid 280 nm och den ligand extinktionskoefficient. Lägga till 10% Tween-20 att ge en slutlig koncentration på 0,015%. Tween-20 läggs till den analysbuffert att förhindra adsorption till kapillärerna. Den slutliga analysbuffert som används för MST experiment är 20 mM HEPES, pH 7.5, 10 mM NaCl, 0,015% Tween-20.
  2. Beredning av Dye-märkt mål Protein VimRod
    1. Bered röd-tris-NTA färgen genom att tillsätta 50 μL 1 x PBS-T levereras med röd-tris-NTA ge en koncentration av 5 μM. Fördela 2 μL alikvoter i 200 μL rör och förvaras vid-20 ° C.
    2. Späd målproteinet till 0,34 μM med Analysbuffert. Lägga till 58 μL av mål i en 2 μl alikvot av röd-tris-NTA färgämne och inkubera i 30 min i rumstemperatur. Den slutliga koncentrationen av färgämne-märkt mål är 0,33 μM. Centrifugera märkt målet vid 21 000 x g i 10 min och noggrant överför supernatanten till en ny tub att ta bort eventuell fällning. RÖD-tris-NTA färgämnet binder till proteiner genom His6 etiketten och har en bindande dissociationskonstant (KD) i intervallet sub-nanomolar. Det är faktiskt 100% bundet till målproteinet så ingen ytterligare rening krävs.
    3. Slå på instrumentet MST och öppna programvaran kontroll. Välj inställningen röd för röd-tris-NTA färgämnet. Aktivera temperaturkontrollen till 25 ° C.
    4. Välj den testar att validera märkning av målet och kolla för aggregering eller adsorption till kyvetter. En bedömning av dessa parametrar anges automatiskt.
    5. Blanda 17 μl analysbuffert och 3 μL målproteinet och blanda genom pipettering. Fyll två standard kapillärer genom att doppa dem i det utspädda mål och utarbetar vätska in i centrera av kapillären. Placera kapillärer i facket och i instrumenten. Starta mätningen.
    6. Granska resultaten och söker en tillräcklig nivå av fluorescens och inga tecken på adsorption (distorsion i formen kapillär linje) eller aggregering (snedvridningar i MST spårningen) som kommer att flaggas i programvara analys. Om resultaten är positiva flytta vidare till liganden steg, om inte en annan buffert måste prövas eller mängden Tween-20 kan ökas till 0,05% eller högre.
  3. Beredning av E-PRD Ligand två-faldig utspädning serien
    1. Förbereda en spädningsserien genom märkning 16, 200 μL rör från 1-16.
    2. Tillsätt 17 μL av liganden på 1,17 x större koncentration än maximalt ligand koncentrationen önskas till Tube1. Denna volym är dubbelt så mycket som behövs (8,5 μL) som en alikvot kommer sedan att överföras till nästa röret i serien. Den avslutande volymen i analysen är 10 μL så 8,5 μl av 1,17 x koncentration av liganden kommer att spädas till 1 x genom tillsats av 1,5 μL av målproteinet, VimRod. Denna högsta koncentration som valt bör vara minst 20 gånger det uppskattade KD -värdet.
    3. Lägga till den 8,5 μl analysbuffert i Tubes2-16 med en ny pipettspetsen för varje delprov. Återanvända pipettspetsar kan påverka noggrannheten (för råd om korrekt pipettering Se tillverkarens anvisningar). Överför 8,5 μl av ligand från Tube1 till Tube2 långsamt släppa lösningen i analysbuffert utan att generera bubblor. Blanda ligand och buffert av pipettering upp och ner minst 6 gånger, igen utan att generera bubblor. E-PRD i mest koncentrerade röret var 1,5 mM och de märkta VimRod var närvarande vid en slutlig koncentration på 50 nM.
    4. Överföra 8,5 μl av ligand från Tube2 till Tube3 och blanda med Analysbuffert. Upprepa den seriella utspädningen tills alla rör har haft ligand lagt till. Kassera 8,5 μl från Tube16 så att alla rör innehåller 8,5 μL av liganden i en serie dubbla utspädningar.
  4. Utarbetandet av bindande reaktion och MST experimentet
    1. Tillsätt 1,5 μL av märkt målproteinet till vart och ett av rören och blanda försiktigt genom pipettering upp och ner är noga med att undvika bubblor. Inkubera i 15 min.
    2. Välj expertläge för bindande analysen och ange i parametrarna för en seriell spädningsserien. Kontrollera temperaturkontroll är inställd till 25 ° C, excitation kraften är inställd på 40% och MST makt till medium. Dessa parametrar måste vara optimerad för andra bindande partner som studeras.
    3. Fyll kapillärerna med bindande reaktionerna och placera i kapillär facket. Fyll på facket i instrumentet, vänta tills temperaturen att återfå 25 ° C och starta mätningen.
  5. Analys av data
    1. Öppna filen bindande assay i affinitet analys programvara. Granska kapillär skanningar; Fluorescens nivåer får inte variera mer än 10% från medelvärdet, ingen aggregering eller adsorption ska identifieras som beskrivs i avsnitt 3.6.
    2. Välj MST analysen på den högra panelen och dra assay data till analys-set. Om det finns flera körningar av samma målligand bindande analysen under identiska förhållanden kan de sammanfogas genom att släppa i samma uppsättning. Alternativt kan varje körning släppas in analys självständigt.
    3. Gå till fliken dos svar passar till den Diagramdata. Välj KD modellen om en enda bindningsställe förväntas. Den Hill-modellen är också ett alternativ för flera bindningsställen med kooperativa beteende. Avvikare punkter som inte klarade kvalitetskontroll kan avlägsnas från passformen i detta skede. Sammanfoga uppsättningar med flera analyser kommer att vara i genomsnitt och fel beräknas som standardavvikelsen.
    4. Öppna den sista fliken och jämföra resultat mellan alla tomter på ett enda diagram. Hämta passande resultat för varje kurva som genereras från tabellen. Exportera data eller monterade kurvor till annan presentation eller analys programvara om så önskas.

Representative Results

E-PRD domänen (rester 1822-2014 klonade in pProEX-HTC) av den mänskliga envoplakin gen och domänen VimRod (rester 99-249 klonade in pET21a) av mänskliga vimentin4 var uttryckt med His6 Taggar och renas. Figur 6 och figur 7 visar nivåerna av renhet av VimRod (18,8 kDa) och E-PRD (21,8 kDa) framställs med denna metod av protein rening. Avlägsnande av den His6 tagg från den E-PRD konstruktion är avgörande för MST experiment som proteinet VimRod är märkt med ett His6 tagg bindande färgämne och eventuella E-PRD behålla dess His6-tag kan konkurrera om bindning av färgämnet. Den andra IMAC kolumnen efter klyvning av taggen med TEV proteas avlägsnar den TEV proteasen, taggen klyvs och någon uncleaved His6-E-PRD som återstod. Det sista polering steget i reningen är storlek utslagning kromatografi. Trots både proteiner att av liknande storlek, eluerar VimRod från kolumnen på en 51 mL medan E-PRD eluering peak är centrerad på 72 mL där en protein monomer av denna storlek skulle förväntas. Den synbara ökningen i storlek av VimRod är sannolikt på grund av dess kännetecken som en trådformiga lång stav formad protein som analytiskt ultracentrifugen experiment visade att VimRod var monomer4. Lägre avkastning av protein erhålls från kulturer odlas i M9 än de från rika buljong på grund av en lägre mängd celler som produceras i minimal media. Inledande tillväxten av större starter kulturer för M9 preparat i TB kan förbättring av cell avkastning bibehållen omfattningen av 15N märkning nödvändigt för NMR experiment.

15N -1H HSQCs förvärvades för vildtyp och R1914E mutant i E-PRD i närvaro eller frånvaro av VimRod (figur 8A-8 D). Spectrumen av E-PRD i figur 8A visar det förväntade antalet väl löst toppar, vägledande av ett ordentligt vikta protein. I närvaro av VimRod (figur 8B) visar spektrumet omfattande sortiment breddas och peak försvinnande, motsvarande bindning mellan E-PRD och VimRod. Denna bindning är förlorade genom mutation av R1914E som jämförelse framgår av figur 8 c och 8 D. Lite förändring observeras i spektrum vid tillägg av VimRod till R1914E mutant som anger brist på bindande mellan detta muterade E-PRD och VimRod. E-PRD peak stödnivåerna i närvaro/frånvaro av VimRod var jämfört och ritade som de relativa maximala stödnivåerna i figur 8E, som visar utbudet av toppbreddning i E-PRD komplex. R1914E mutant i E-PRD (visas inte) behöll ca 97% av topparna på 20% eller högre peak stödnivåer i närvaro av VimRod jämfört med ca 20% för den vilda typen (figur 8E). Detta representerar en förlust av funktion punkt mutant, med ytterligare mutanter med mellanliggande effekter även efter att ha varit studerade4.

Att validera och kvantifiera bindningen av VimRod och E-PRD MST analys med His6-VimRod märkt med fluorescerande röd-tris-NTA färgämne som mål blandat med minskande koncentrationer av liganden E-PRD från 1,28 mM till 39,1 nM utfördes. Tre bindande titreringar genomfördes och resultaten är i genomsnitt och visas i figur 9. Data var passar med en standard modell av en-plats ligand bindande och gav en KD 25,7 ± 2,1 μm. Utvärdering av bindningen mellan VimRod och E-PRD av ytan plasmon resonans gav liknande KD värdet 19,1 ± 1,3 μM4.

Figure 1
Figur 1: skärmdump av installationen av NMR Experiment. Fönstret visas används för att ställa in ett standard experiment att samla en HSQC datamängd. Experimentet parametrar läses i anslutning till Experiment. ZGPR experimentet visas väljs som ett första experiment att ladda standard och lösningsmedel beroende proton parametrarna. Fönstret titel används för att mata in experimentella Detaljer för registerföring ändamål. För att samla in det HSQC spektrumet ersätts ZGPR experimentet med SFHMQC3GPPH. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: justering av NMR experimentella parametrar. Fönstret visas används för att ange de grundläggande parametrarna för NMR puls sekvensen för att optimera signalen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: NMR databehandling. Parametrar som används för bearbetning av var och en av de två dimensionerna av NMR spectrumen visas med pilar som visar dem som justeras normalt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: parametrar för NMR Peak plockning. De parametrar som används för att plocka NMR toppar i bearbetade NMR spectrumen visas med typiska värden. Justera ppm utbud, intensitet och antalet toppar att optimera spektra. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: representant Peaklist med intensiteter. Varje topp som plockas i NMR spectrumen ges ett nummer, och dess 1H och 15N kemiska skiftar och signalintensitet visas. Denna peaklist kan sedan användas för att jämföra spectra som erhållits i närvaro/frånvaro av en samverkande partner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: rening av His6-taggade VimRod av IMAC och S. A. Kromatogrammet för elueringen från kolumnen IMAC visar en större topp av VimRod. B. kromatogrammet för elueringen från kolumnen S visar en stor topp. C. SDS-PAGE av fraktioner som samlats in under loppet av rening: MW standarder med MW anges i kDa till vänster om den gel (M), cell lysate (1), IMAC genomströmning (2), tvätta (3), poolade eluering (E1), poolade S eluering (E2). Band som är synlig vid högre molekylvikt Lanes E1 och E2 är oligomerer av ren VimRod som bekräftats av western blot (inga data anges). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: rening av E-PRD av IMAC och S. A. SDS-PAGE IMAC rening visar molekylvikt normerna med MW anges i kDa till vänster om gelen (M) och eluatet från den första IMAC kolumnen (E1), TEV klyvning produkter (+ TEV), och flödet genom från kolumnen andra IMAC (FT). B. kolonnen från kolumnen S visar en stor topp. C. SDS-PAGE molekylvikt normerna (M) och fraktioner från S peak. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8: HSQC Spectra av vildtyp och R1914E Mutant i E-PRD i närvaro och frånvaro av VimRod. HSQC spektra visar vildtyp E-PRD (100 µM) i 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, pH 7 i frånvaron (A) eller närvaron av 50 µM VimRod (B). Paneler C och D är HSQC spektra av R1914E mutant (100µM) i frånvaron eller närvaron av 50 µM VimRod, respektive. I panelen E relativa 1H -15N peak visas stödnivåer i E-PRD med eller utan VimRod bindande som en funktion av antalet peak, som är godtyckligt tilldelas och inte baserat på sekvens position. Dessa värden kan användas för att definiera en betydelse cutoff för maximal intensitet minskning vid tillägg av en ligand. Om uppgifter finns tillgängliga, kan de signifikanta värdena ofta ses att mappa till ett bindande område. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 9
Figur 9: bindande av E-PRD till VimRod. E-PRD var utspädd i en serie dubbla utspädningar från 1,28 mM till 39,1 nM och inkuberas med märkta VimRod innan du utför MST analys. Data från tre oberoende analyser kombinerades. Informationen var plats till en K-D -modell ger en KD 25,7 μm med en KD förtroende ± 2,1 μM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Reagens Kvantitet
Natriumfosfat, dibasiskt (vattenfri) 6,0 g
Kaliumfosfat, monobasiskt (vattenfri) 3,0 g
Natriumklorid 0,5 g
H2O Upp till 950 mL

Tabell 1. M9 media för isotopiska märkning.

Reagens Kvantitet
15 NH4Cl 1,0 g
Glukos (eller 13C-glukos) 2,0 g
1 M MgSO4 2 mL
50 mM CaCl2 4 mL
20 mg/mL tiamin 1,0 mL
3 mM FeCl3 400 ΜL
Metall Mix (tabell 3) 500 ΜL
H2O Upp till 50 mL

Tabell 2. Näringsämne blandning för tillskott av M9 media.

Reagens Kvantitet
4 mM ZnSO4 323 mg
1 mM MnSO4 75,5 mg
4.7 mM H3BO3 145 mg
0,7 mM CuSO4 55,9 mg
H2O Upp till 500 mL

Tabell 3. Metall Mix tillägg för berikande MT näringsämnen mixen.

Prov 1 mM E-PRD i buffert A1 (µL) 1mM VimRod i buffert A (µL) Buffert en (µL) 200 µM DSS i D2O (µL) Buffert B2 (µL) Total volym (µL)
E-PRD ensam 50 0 50 50 350 500
E-PRD + VimRod 50 50 0 50 350 500
1 Buffert A: 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7
2 Buffert B: 23 mM Tris-HCl, 1.14 mM DTT, pH 7

Tabell 4. NMR provberedning.

Discussion

I 2D 15N-löst NMR experiment är en av de mest använda metoder för att visa hur två molekyler interagerar. Det är den mest informationsrika metoden som låter båda parter signaler till övervakas kontinuerligt under hela en titrering experiment i lösning tillstånd. Även om typiskt kvalitativa när det gäller stora komplex, kan metoden också användas i gynnsamma fall för att mäta bindande samhörighet där NMR signaler kan spåras i högupplösta spektra. Om uppdrag kan göras bekvämt, kan såsom när det gäller många proteiner under 20 kDa i storlek, bindningsställen också mappas. Kompletterande analyser såsom MST ger kvantitativ information om interaktioner i lösning, och kräver mindre protein i omärkta staterna. Jämförelse av muterade bindande data är användbart för att ge kontroller för att säkerställa att interaktioner framgår av NMR linje bredda är äkta och inte artefakter av, till exempel aggregering eller viskositet förändringar.

Proteinuttryck

Effektivisera det uttryck processen minskar mängden labor intensiv proteinproduktion. En del av detta optimeringsprocessen innebär identifiering av ett lämpligt stam av E. coli av rekombinant uttryck för protein. Stam inställningar beror på element inklusive arten av vektorn som används och, mer specifikt, den ultimata stabiliteten av rekombinant protein uttryckt7. Risken för nedbrytning av proteinet heterologa av endogena E. coli proteaser kan minskas genom användning av proteashämmare bristfällig E. coli såsom BL21 stammen. För gener som innehåller sällsynta kodon, kan en stam såsom BL21-CodonPlus (DE3) RIPL vara att föredra. Denna stam kombinerar proteas bristfälliga beskaffenhet BL21 stammen med ytterligare endogena kopior av sällsynta kodon tRNAs leucin, prolin, arginin och isoleucin. Alternativt, sällsynta kodon som kan äventyra överuttryck kan undvikas genom att beställa en kodon-optimerad konstruktion från en kommersiell källa. Många stammar av E. coli är tillgängliga för rekombinant genuttryck, var optimerad för kringgående av ett särskilt problem under uttryck7. När det gäller denna studie producerat standard proteas bristfällig stammen BL21(DE3) tillräckliga mängder av lösligt protein för efterföljande rening och analys.

Protein rening

Rening protokollet för ett visst protein är ofta unikt i den meningen att varje protein förblir stabil och lösliga under olika förhållanden som temperatur, salthalt och pH. Rening genom affinitetskromatografi övergripande effektivitet är också känslig för koncentrationen av eluerande arter såsom Imidazol vid olika steg under reningsprocessen. I detta arbete var kritisk buffert villkorar för IMAC pH för E-PRD och Imidazol koncentration för VimRod. Ett pH på 7,5 var skyldig att undvika utfällning av E-PRD efter inledande eluering från kolumnen IMAC. För IMAC rening av VimRod befanns öka koncentrationen av Imidazol från 30 till 50 mM under kolumnen tvättningen ha en väsentlig förbättring i renhet av de slutliga eluering fraktionerna. För eluering steg konstaterades öka koncentrationen av Imidazol från 250 till 350 mM även för att förbättra avkastningen av den slutliga elueringen. Inledande försök att eluera protein med 250 mM Imidazol ledde till ofullständig eluering av VimRod som avslöjades av en slutlig 1 M Imidazol remsa av kolumnen (inga data anges). Öka Imidazol koncentrationen till 350 mM för elueringen räckte för att återställa alla proteinet bunden till kolumnen. S kan tjäna ett dubbelt syfte eftersom den fungerar som en polering steg för protein rening medan du samtidigt utför buffert exchange. Buffert exchange är ett kritiskt steg för efterföljande bindande analys eftersom det tar bort den Imidazol som används för att eluera His6-taggade protein. Den tjänar också som en möjlighet att ändra villkor såsom salt koncentration eller pH, vilket kan påverka effekten av vissa nedströms tekniker eller analyser. Protein som termisk Skift (PTS) kan användas för att identifiera optimala buffertar för nedströms analyser, särskilt för dem som kräver stabilt protein för längre perioder vid rumstemperatur8,9.

Bindande analys

Protein som nylagad är avgörande för korrekt bindning analyser, även frysta protein kan också användas så länge resultaten jämförs. Trådformiga proteiner såsom vimentin multimerize i en salt och pH beroende mode, och därför lösningen skick behöver optimeras och Oligomera staten beräknas med en metod såsom SEK10,11, dynamisk ljus spridning 12 eller analytisk ultracentrifugering13,14,15. NMR spektroskopin är väl lämpad för att mäta ligand interaktioner av små proteiner på atomär upplösning. Men när ett protein interagerar med större molekyl, långsammare tumlande inträder, och detta resulterar i förlust av signaler, som kan bekräfta bindande även om det inte nödvändigtvis låta kartläggning av bindande platser, vilket också kräver tilldelning av minst ryggraden resonanser. I det här fallet tillåter NMR experiment inte identifiering av webbplatsen interaktion. Därav riktad webbplats mutagenes används för att identifiera de kritiska restsubstanser som behövs för bindningen. Sådan mutanter därför uppvisar inte signalförlust. I detta protokoll, en muterad form med en substitution vid position 1914 behåller de maximala stödnivåerna i närvaro av VimRod och bekräftar därför störningar i samspelet mellan E-PRD och VimRod. Tilldelning av ryggraden och sidechain resonanser skulle tillföra värde till detta tillvägagångssätt, särskilt som strukturen för gratis E-PRD har lösts genom röntgenkristallografi4. Framtida tillämpningar av NMR inkluderar karaktärisering av komplexa interaktioner mellan större molekyler och kommer att dra nytta av ultra hög fältet magneter och användning av andra observerbara grupper såsom 13C-märkta och trifluoro metylgrupper som reportrar.

MST har ett antal fördelar för att studera bindande interaktioner16. De bindande partnerna är fria i lösningen och inte immobiliserade. Analys av proverna kvalitet är inbyggd i programvaran med kvalitetskontroll rapportering av aggregation, adsorption till kapillärer eller otillräcklig fluorescerande märkning av målmolekylen. Små mängder av målet används vanligtvis, koncentrationen av märkt målet är oftast mellan 20-50 nM i en 10-20 μL volym/reaktion. Detta protokoll använder mycket liten reaktion volymer (10 μL) att maximera koncentrationen av liganden som kan uppnås i de titreringar som ger svag bindning interaktioner att karakteriseras. Detta kräver noggrann pipettering och omsorg vidtas för att undvika att införa bubblor samtidigt fortfarande grundligt blandning. Lämplig blandning är avgörande för korrekt, konsekvent fluorescens mätningar längs uppsättningen seriespädningar. Tween-20 var i MST experimenten minskas från en standard 0,05% till 0,015% lägre tendensen att skapa bubblor och förbättra blandning.

RÖD-Tris-NTA färgen ger ett snabbt, enkelt och bekvämt sätt att fluorescently märka något protein som har en sin tagg. Märkningen är effektivt klar på bara 30 minuter och är mycket snäv så att ingen färgämne Borttagningsproceduren är nödvändigt. Inga ändringar för aminosyra rester i det protein som kan påverka ligand bindande egenskaper. En varning är att endast proteinet att märkas bör ha en His6-tagg. Detta krävde klyvning av taggen från proteinet ligand, E-PRD och avlägsnande av den etiketten och uncleaved E-PRD med ett andra IMAC kolumn steg. Om möjligt, ligand proteinet bör vara beredd utan användning av ett hans tagg. Alternativt kan proteiner märkas kovalent med en fluorophore genom amine koppling till lysin rester eller thiol koppling till cystein resthalter. Man måste dock vara försiktig när genom att använda sådana system sedan covalent tillbehöret av en fluorophore kan påverka elektrostatiska eller polär bindning interaktioner förlitar sig på lysin eller cystein resthalter. Kvantifiering av bindande samhörighet mellan VimRod och E-PRD av MST var ovanligt känsliga för salt koncentration. Problemet var mildras av initialt dialyzing både målet och liganden i samma batch av analysbuffert. Dock är det inte säkert att mättnad av MST bindande kurvan kunde uppnås när du utför MST analysen i närvaro av 150 mM NaCl på grund av VimRod komplexa beteende. Tillförlitlig, komplett data erhölls när koncentrationen av NaCl sänktes till 10 mM möjliggör en korrekt beräkning av KD. Därför rekommenderas noggrann optimering av lösning villkor och jämförelse med kompletterande analyser att uppnå robusta resultat. MST kan dessutom användas för att kvantifiera det salt beroendet för en viss interaktion, kvantifiera stökiometriska boenden proteininteraktioner, monitor proteinveckning och sond in i enzymet kinetik17.

Disclosures

Författarna avslöja inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Detta projekt har fått stöd av NSERC RGPIN-2018-04994, Campus Alberta Innovation Program (RCP-12-002 C) och Alberta Prion Research Institute / Alberta utvecklar Bio lösningar (201600018), tilldelas M.O och Genome Canada och Kanada Stiftelsen för Innovation bidrag tilldelas The metabolomik Innovation Centre (TMIC) och NANUC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Monolith NT.115, includes control and analysis software NanoTemper Technologies MO-G008 Instrument for microscal thermophoresis
His-Tag Labeling Kit RED-Tris-NTA NanoTemper Technologies MO-L008 RED-tris-NTA dye for MST
Standard capillaries NanoTemper Technologies MO-K022 capillaries for MST
HisTrap HP, 5 mL GE Healthcare 17524801 IMAC column
HisPur Ni-NTA resin, 100 mL Thermo Fisher Scientific 88222 IMAC resin
HiLoad 16/600 Superdex 75 pg GE Healthcare 28989333 SEC column
TEV protease Sigma Aldrich T4455 cleavage of his tag from E-PRD
BL21(DE3) Competent E. coli New England Biolabs C2527H cells for protein expression
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets EDTA-Free Sigma Aldrich 11873580001 protease inhibitors for protein purification by IMAC
TCEP, Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Sigma Aldrich C4706 reducing agent for protein purification
Reagents (HEPES, NaCl, etc) Sigma Aldrich various Preparation of media and buffers
Ammonium chloride (15N, 99%) Cambridge Isotope Laboratories NLM-467 isotope labelling for NMR
D2O, Deuterium Oxide (D, 99.8%) Cambridge Isotope Laboratories DLM-2259 NMR sample preparation
DSS, Sodium 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-D6 (D,98%) Cambridge Isotope Laboratories DLM-8206 reference for NMR
Precision 5 mm NMR Tubes, 7” long SJM/Deuterotubes BOROECO-5-7 NMR tubes
NMR spectrometer (14.1 Tesla) Bruker acquisition of NMR data
TCI 5mm z-PFG cryogenic probe Bruker acquisition of NMR data
Name Company Catalog Number Comments
Software
Bruker TopSpin 4.0.1 Bruker processing of NMR data
MO.Control NanoTemper Technologies included with Monlith NT.115
MO.Affinity Analysis NanoTemper Technologies included with Monlith NT.115

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vinogradova, O., Qin, J. NMR as a unique tool in assessment and complex determination of weak protein-protein interactions. Topics in Current Chemistry. 326, 35-45 (2012).
  2. McKercher, M. A., Wuttke, D. S. NMR Chemical Shift Mapping of SH2 Peptide Interactions. Methods in Molecular Biology. 1555, Clifton, N.J. 269-290 (2017).
  3. Al-Jassar, C., Bikker, H., Overduin, M., Chidgey, M. Mechanistic Basis of Desmosome-Targeted Diseases. Journal of Molecular Biology. 425 (21), 4006-4022 (2013).
  4. Fogl, C., et al. Mechanism of intermediate filament recognition by plakin repeat domains revealed by envoplakin targeting of vimentin. Nature Communications. 7, (2016).
  5. The Protein Protocols Handbook. Walker, J. M. , 2nd ed, Humana Press. (2002).
  6. Wishart, D. S., et al. 1H, 13C and 15N chemical shift referencing in biomolecular NMR. J. Biomol. NMR. 6, 135-140 (1995).
  7. Casali, N. Escherichia coli Host Strains. E. coli Plasmid Vectors. , Humana Press. 27-48 (2003).
  8. Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., DeTitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).
  9. Kozak, S., et al. Optimization of protein samples for NMR using thermal shift assays. Journal of Biomolecular Nmr. 64, 281-289 (2016).
  10. Burgess, R. R. A brief practical review of size exclusion chromatography: Rules of thumb, limitations, and troubleshooting. Protein Expression and Purification. , In Press (2018).
  11. Kunji, E. R. S., Harding, M., Butler, P. J. G., Akamine, P. Determination of the molecular mass and dimensions of membrane proteins by size exclusion chromatography. Methods. 46 (2), 62-72 (2008).
  12. Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences. Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).
  13. Patel, T. R., Winzor, D. J., Scott, D. J. Analytical ultracentrifugation: A versatile tool for the characterisation of macromolecular complexes in solution. Methods. 95, 55-61 (2016).
  14. Pearson, J. Z., et al. Chapter One - Next-Generation AUC Adds a Spectral Dimension: Development of Multiwavelength Detectors for the Analytical Ultracentrifuge. Methods in Enzymology. Cole, J. L. 562, Academic Press. 1-26 (2015).
  15. Gorbet, G. E., Pearson, J. Z., Demeler, A. K., Cölfen, H., Demeler, B. Chapter Two - Next-Generation AUC: Analysis of Multiwavelength Analytical Ultracentrifugation Data. Methods in Enzymology. Cole, J. L. 562, Academic Press. 27-47 (2015).
  16. Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nature Communications. 1, 100 (2010).
  17. Jerabek-Willemsen, M., et al. MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond. Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).

Tags

Biokemi fråga 141 cell adhesiondesmosome desmoplakin fintrådiga protein mellanliggande glödtråden hur provtagningsutrustningen skall thermophoresis kärnmagnetisk resonans protein interaktion vimentin
Mäta interaktion av klotformig och fintrådiga proteiner av kärnmagnetisk resonansspektroskopi (NMR) och hur provtagningsutrustningen skall Thermophoresis (MST)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Winkelaar, G., Trieber, C., Kumar,… More

Winkelaar, G., Trieber, C., Kumar, J., Overduin, M. Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST). J. Vis. Exp. (141), e58537, doi:10.3791/58537 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter