Summary
여기, 안정 동위 원소와 핵 자기 공명 (NMR) 분광학 및 눈금을 사용 하 여 단백질 단백질 상호 작용의 후속 묘사는 생산 및 분류는 단백질의 정화에 대 한 프로토콜 선물이 Thermophoresis (MST) 실험입니다.
Abstract
Filamentous 단백질 vimentin 같은 조직 구조 비 계 사이트 plakin를 포함 하는 단백질을 제공 하 여 세포 내에서 반복을 제공 합니다. 여기, 감지 하 고 이러한 상호 작용을 측정 하는 프로토콜은 envoplakin의 구형 plakin 반복 도메인 vimentin의 헬리컬 코일을 사용 하 여 설명 합니다. 단백질 vimentin (또는 유사한 filamentous 단백질) 바인딩 여부 결정 및 상호 작용의 선호도의 측정 기준을 제공 합니다. 관심의 구형 단백질 15N으로 표시 하 고 솔루션에서 vimentin 단백질으로 적정. 2 차원 NMR 스펙트럼 피크 모양 또는 화학 변화, 변화를 관찰 하 여 상호 작용을 검출 하 고 소금 수준, vimentin 제 사기 구조 영향을 포함 하는 솔루션 조건의 효과 명료 하 게 취득 된다. 관심사의 단백질 filamentous ligand 바인딩, 바인딩 상호 작용 순화 된 단백질을 사용 하 여 MST에 의해 정량입니다. 접근 관심의 단백질 필 라 멘 트, 바인딩 여부 결정 및 변경, 돌연변이 등 솔루션 조건, 상호 작용에 미치는 영향을 평가 하기 위한 간단한 방법입니다.
Introduction
단백질 사이 상호 작용 분자 기계 세포 내에서 순서를 형성을 수 있습니다. 개별 상호 작용은 종종 약한 하지만 일반적으로 협력 하 고 동적으로 규제 될 수 있는 multivalent 복합물에 기여. 민감한 분석 원자 해상도 같은 복잡 한 상호 작용에 대 한 정량적 인 정보를 제공 하는 메커니즘을 추론 하 고 마약 같은 분자 같은 개입 디자인 필요 하다. NMR 분광학 단백질 상호 작용에 대 한 정보를 얻기 위해 효율적인 방법 이며 또한 약하게1을 포함 하는 ligands에 대 한 빠른 검사에 사용 됩니다. NMR 방법은 사용 하는 단백질을 관찰 또는 ligand 관찰로 분류할 수 있습니다. 이 원고는 안정 동위 원소 라는 비교적 작은 (보통 아래 20 kDa) 단백질의 스펙트럼을 획득 하 고 레이블 없는 ligand 적정 전 접근 방식을 사용 합니다. 이 레이블이 잔류물 유리한 경우를 상호 작용에 관련 된 수 있습니다. 일단 복잡 한 형태 변경으로 화학 변화에 자신을 매니 페스트 상호 작용 잔류물의 화학 환경 및 그들의 NMR 신호 모양에 변화가 있다. 이러한 변경의 정도 상호 작용에서이 그룹의 관련의 학위와 상관 한다. 화학 변화 물결 (Csp)는 일련의 부재는 ligand의 변화량의 존재에서 수집 하는 단백질의 NMR 스펙트럼을 비교 하 여 측정할 수 있습니다. 큰 ligands, 복잡 한 상호 작용에 대 한 상호 작용을 추론할 피크 모양 또는 강도에 변화를 측정할 수 있습니다.
Ligand 상호 작용 검출을 위해 사용 하는 가장 일반적인 2D 실험은 15N heteronuclear 단일 양자 상관 (HSQC) 실험2. 15N, 일반적으로 15N-풍부한 미디어에서에서 자란 대장균 세균성 문화에서 선호도 태그 버전으로 그들을 표현 하 여 달성 한 단백질 붙일 균일 하 게 해야 합니다. 바인딩 때 명백한 적정 동안 수집 HSQC 스펙트럼 겹쳐 있다 복잡 한 형성에 관련 된 잔류물의 하위 집합에 대 한 피크 변경 공개. 상호 작용은 자유롭고 ligand 포화 상태 신호 한 인구 평균 피크로 축소 빠른 교류 정권에서 발생할 수 있습니다. 또는, 느린 교류 미국, 경우 두 신호 그들의 상대적인 양을 나타내는 전체와 함께 관찰 된다. NMR lineshape 분석은 어떤 경우에 바인딩 친 화력 예측을 사용할 수 있는, MST 같은 방법 또한 편리한 입증 하 고 진짜 상호 작용의 교차 유효성 검사를 제공 합니다.
제공 되는 예제의 desmosomes에서 발견 하는 두 단백질입니다. 그들은 중재 골격 및 세포 표면 사이의 접합 및 세포 접착 기계와 피부의 무결성을 유지 하기 위해 중간 필 라 멘 트 사이 multivalent 상호 작용을 중재 심장 조직과의 견딜 힘을 전단. 질병은 desmoplakin 등 vimentin desmosomal 단백질 돌연변이 또는 셀 접합의 불안정에 지도 하는 신경에 의해 손상 되 고 그러므로 그들의 상호 작용의 중요3때 발생할 수 있습니다. 동안 상호 작용 MST에 의해 양이 정해질 수 있다 ligand 바인딩 desmosomal 단백질에 의해 구조적으로 NMR 분광학, 특징 될 수 있습니다. 방법은 여기 plakin 반복 (PRDs) 종종 기본 홈을 제공 하는 직렬 식 집합으로 존재 하는 도메인과 vimentin, 그것의 나선형에서 제공 하는 산 성 표면을 통해 서 상호 작용 하는 중간 필 라 멘 트 사이 상호 작용 하 사용 되었다 번들4. 이 단지 그들은 조직을 통하여 발광 하는 접착제의 네트워크 형성, 인접 한 셀에 연결 하는 desmosomes 세포 골격의 중간 필 라 멘 트에 대 한 앵커 세포 막에서 형성 된다.
Protocol
1. 재조합 형 단백질 표정
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Envoplakin PRD (E-PRD)와 Vimentin 99-249 (VimRod)의 표현
- 원하는 유전자를 포함 하는 플라스 미드를 대장균 BL21(DE3) 셀을 변환 합니다. 한 천 배지 100 µ g/mL 암 피 실린을 포함 하는 셀을 확산. 37 ° C에서 접시를 밤새 품 어.
- 단일 식민지를 선택 하 고 포함 하는 플라스 미드에 대 한 선택 하려면 100 µ g/mL 암 피 실린 훌륭한 국물 (TB)의 20 mL를 접종. 37 ° C (180 rpm)를 하룻밤 떨고에서 문화를 성장.
- 50 µ g/mL 암 피 실린 포함 된 결핵의 1 l 전체 20 mL 문화를 전송 합니다. OD600 까지 180 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 문화를 품 어 = 0.6-0.8.
- 18 ° C에 온도 감소 하 고 1 m m의 최종 농도에 이소프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)를 추가 하 여 단백질 발현을 유도. 단백질 표정 있도록 하룻밤 160 rpm에서 떨고와 18 ° C에 외피를 계속 합니다.
- 8000 x g 15 분 Decant에서 문화 centrifuging 여 세포를 수확 하 고는 상쾌한 삭제.
- 인산 염의 약 40 mL에 셀 펠 릿을 resuspending 하 여 수확된 셀 버퍼링 생리 식 염 수 세척 (PBS: 20 m m 인산 염 버퍼, pH 7.4, 120 mM NaCl). 50 mL 튜브에는 물의 resuspension 전송. 원심 분리기 다시 8000 x g에서 15 분.
- 가만히 따르다와 삭제는 상쾌한. 하거나 즉시 정화 프로토콜을 시작 하 고 나중에 사용-20 ° C에서 셀 펠 릿을 동결 합니다.
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Isotopically 레이블된 단백질의 표현
- 대장균 BL21(DE3) 셀을 변환 하 고 1.1.1-1.1.2에서 20 mL 스타터 문화를 준비.
- 전체 20 mL 문화 1 L 추가 4.0 g tryptone, 5.0 g NaCl, 100 µ g/mL 암 피 실린 포함 된 풍부한 TB의 전송. OD600 까지 160 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 문화를 품 어 1.6-1.9 =.
- 15 분 Decant 8000 x g에서 원심 분리 하 여 1 L 문화를 수확 하 고는 상쾌한 삭제.
- 부드럽게 약 40 ml PBS의 resuspending에 의해 셀 펠 릿을 세척 하 고 50 mL 튜브에는 물의 resuspension 전송.
- 다시 15 분 Decant 8000 x g에서 원심 및 삭제는 상쾌한.
- M9 최소한의 미디어 (표 1)와 100 µ g/mL 암 피 실린을 포함 된 M9 최소한의 미디어 950 mL의 나머지에 20 mL에 셀 펠 릿을 resuspend.
- 살 균 필터 영양소 혼합 (표 2와 3) 50 mL를 추가 합니다.
- 1 m m의 최종 농도에 IPTG을 추가 하기 전에 30 분 동안 18 ° C에 문화를 익히다.
- 160 rpm에서 떨고와 18 ° C에서 밤새 품 어.
- 1.1.4-1.1.6 섹션에서 셀을 수확.
2. VimRod 및 E-PRD의 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC) 정화를 움직일 수
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VimRod His6 태그의 정화
- 프로 테아 제 억제 물 칵테일 부족 EDTA를 포함 하는 PBS의 5 mL/g에서 셀 펠 릿을 resuspend. 다음 단계에서 세포 세포의 용 해를 개선 하기 위해 Dounce 조직 균질 화기에 12 타와 균질.
- 얼음에 떨어져 1 s/1 s의 펄스에 세포 현 탁 액을 sonicate, 1.5 분의 총 80% 진폭 반복 시간, 과열을 방지 하기 위해 실행 사이의 얼음에 부드럽게 소용돌이 2 추가 쥡니다.
- 45 분 Decant 75000 x g에서 샘플 원심 고 상쾌한 주사기 필터 (0.45 μ m)를 사용 하 여 필터링 합니다.
- 고속 단백질 액체 착 색 인쇄기 (FPLC) 시스템을 사용 하 여 1 mL/min의 유량에 바인딩 버퍼 (20 mM HEPES, pH 7.5, 500 mM NaCl, 이미 10 m m)의 5 열 량 (CV) 5 mL 아이맥 열 equilibrate
- 0.5 mL/min의 유량에 열에 필터링 된 상쾌한 로드.
- 5 이력서의 워시 버퍼 (20 mM HEPES, pH 7.5, 500 m NaCl, m 50 m m 이미) 열 1 mL/min의 유량에 씻는 다.
- 3 단백질을 elute 차입 buffer (20 mM HEPES, pH 7.5, 500 mM NaCl, 이미 350 m m) 0.5 mL/분 수집 1.5 mL 분수의 유량의 이력서. 사용 가능한 경우 eluted 단백질의 농도 증가 최대 흐름 차입 모드를 선택 합니다.
- SDS 페이지 관심사의 단백질을 포함 하 고 표준 메서드를 사용 하 여 측정 단백질 농도5FPLC 크로마에서 분수를 식별 합니다.
- 수영장 그리고 2 mL를 원심 외 장치 (MWCO 3 kDa, 5 mL)을 사용 하 여 단백질의 높은 금액을 포함 하는 차입 분수를 집중. 어떤 침전 제거 0.22 μ m 필터를 통해 전달 하 21000 x g에서 원심.
- 2 이력서의 S 버퍼 (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.5, 0.5 m m TCEP)는 FPLC를 사용 하 여 1 mL/min의 유량에서 120 mL 크기 배제 크로마토그래피 (S) 열 equilibrate
- 2.1.9 열에에서 집중된 단백질을 주입 하 고 1 S 이력서 버퍼 1 mL 분수 수집 0.5 mL/min의 유량에 elute.
- 앞으로 관심사의 단백질을 포함 하는 분수를 식별 합니다.
- 높은 양의 단백질을 포함 하는 분수를 풀.
- 단기 사용을 위한 4 ° C에서 저장 하거나 저장소-80 ° c에서 작은 aliquots 20% 글리세롤을 추가 합니다.
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His6 태그 제거와 함께 E-PRD 단백질의 정화
- 2.1.1-2.1.8 His6 태그 전자-PRD 단백질 정화의 단계를 따릅니다. 피크 분수 풀 고 단백질 농도 결정 합니다.
- 담배를 추가 엣지 풀링된 단백질의 2 µ L/mg에서 바이러스 (TEV) 효소 (1 mg/mL). 투 석 배관 (6 kDa) 전송 및 4 ° c.에 하룻밤 S 버퍼에서 dialyze 이 단계는 His6 태그의 분열 및 다음 단계에서 Ni NTA 수 지 바인딩을 방해는 이미의 제거 수 있습니다.
- 3 이력서의 S 버퍼와 중력 열 수 지 Ni 주권의 5 mL equilibrate 수 지에서 드레인 초과 버퍼입니다.
- 수 지에 쪼개진된 전자-PRD 단백질을 부 어 하 고 1 시간 uncleaved His6 태그 전자 PRD 및 쪼개진된 His6 태그 바인딩할 수 있도록 락 플랫폼에 대 한 품 어. TEV 프로 테아 제 또한 His6 태그와 수 지를 바인딩할 것입니다. 통해 흐름을 수집, 태그 무료 E-PRD 포함. 워시 2 CV의 S 버퍼 수 지 E-PRD의 모든 보장 하기 위해 복구 됩니다.
- E-PRD 원심 외 장치 (MWCO 3 kDa, 5 mL)을 사용 하 여 2 mL를 통해 흐름에 집중 한다. 어떤 침전 제거 0.22 μ m 필터를 통해 전달 하는 21 000 x g에서 원심.
- 2 이력서의 S buffer (20 mM HEPES, 150 m m NaCl, pH 7.5, 0.5 m m MST 또는 20 mM Tris HCl, 1mm DTT, pH 7 NMR TCEP)는 FPLC를 사용 하 여 1 mL/min의 유량 120 mL S 열 equilibrate
- 2.2.5 열에에서 집중된 E-PRD 단백질을 주입 하 고 1 S 이력서 버퍼 1 mL 분수 수집 0.5 mL/min의 유량에 elute.
- 앞으로 관심사의 단백질을 포함 하는 분수를 식별 합니다.
- 높은 양의 단백질을 포함 하는 분수를 풀.
- 단기 사용을 위한 4 ° C에서 저장 하거나 저장소-80 ° c에서 작은 aliquots 20% 글리세롤을 추가 합니다.
3. NMR 방법
- NMR 시료 준비
- 15N 표시 된 야생-타입 또는 20 mM Tris HCl, 1mm DTT, pH 7 단계 2.2.6 S 버퍼를 사용 하 여 앞에서 설명한 대로 R1914E E-PRD 단백질 정화. 일반적으로 단백질 재고 솔루션 볼륨 약 1 mL의 1 m m 0.3에서 범위.
참고: 단백질을 집중 수 > 샘플 준비에 대 한 적합 한 범위에 농도가지고 MWCO 3 kDa, 5 mL 원심 한 장치를 사용 하 여 100 µ M. - 샘플 20 m m Tris HCl, 1mm DTT, pH 7 단계 2.1.10 S 버퍼를 사용 하 여 레이블이 없는 VimRod 단백질의 정화.
- 500 µ L의 최종 볼륨을 100µM, 중수소 산화물 (D2O) 최종 농도 20 µ M.에 10% (v/v), 및 DSS (4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic 산)의 최종 농도의 최종 농도에 야생-타입 또는 돌연변이 전자-PRD 단백질 추가 지참 500 µ L 최대 샘플 볼륨 20 mM Tris HCl, 1mm DTT, pH 7 사용 하 여. 샘플 준비는 표 4에 설명 되어 있습니다.
참고: 0 ppm DSS의 공명 1H 화학 변화를 보정 하는 데 사용으로 15N 화학의 간접 참조에 대 한 단백질6의 교대. D2O는 중수소 잠금 신호에 대 한 일정 net 자기장에서 분석기를 유지 하는 데 사용 됩니다. - 이전 단계에서와 같이 E-PRD, D2의 두 번째 예제를 O와 DSS 확인 하 고 500 µ L까지 볼륨을 가져오기 전에 50 µ M의 최종 농도에 VimRod를 추가.
- 실험에 대 한 5 mm 넓은 NMR 튜브에 500 µ L 샘플을 전송.
- 15N 표시 된 야생-타입 또는 20 mM Tris HCl, 1mm DTT, pH 7 단계 2.2.6 S 버퍼를 사용 하 여 앞에서 설명한 대로 R1914E E-PRD 단백질 정화. 일반적으로 단백질 재고 솔루션 볼륨 약 1 mL의 1 m m 0.3에서 범위.
- NMR 실험 설치
- 추출 명령 "ej";와 공기 흐름 설정 이 자석에서 샘플을 가져올 것 이다. 이제, 회전자는 자석 위에 내 샘플 개방 놓고 명령 "ij"와 함께 삽입 합니다. 샘플 진행 하기 전에 자석 내부 침전 될 때까지 기다립니다.
- "Edc" 명령을 사용 하 여 새 데이터 집합을 만들고 "ZGPR" (그림 1) 실험을 선택 하 여 표준 1H NMR 매개 변수를 로드 합니다. 이름, EXPNO (실험 번호) 및 PROCNO (처리 된 데이터 폴더 번호) 필드에 입력. "용 매 설정" 필드에 있는 용 매를 선택 하 고 "Execute 'getprosol'" 표준 probehead 및 용 매 종속 (prosol) 매개 변수를 클릭 합니다.
- 자물쇠는 deuterated 용 매, 즉, D2O 샘플, "잠금" 명령을 사용 하 고 그것이 완료 될 때까지 기다립니다 공중 소탕 하 고 자물쇠를 달성 한다.
- 자석의 공 진 주파수 자동 튜닝 명령 "atma"를 사용 하 여 샘플을 조정 하 여 수정 합니다. 자동 튜닝 완료 될 때까지 동요 곡선을 모니터링 합니다.
- TOPSHIM (명령 "topshim")를 사용 하 여 자기장 심 메우는 자기장 균일 샘플 주위를 달성 하기 위해 조정의 과정 이다. 그것은 명령 "wsh"와 심 값을 저장 하 고 그들을 읽는 것이 좋습니다 경우에 동일 하거나 유사한 샘플을 사용 하 여 topshim, 전에 "rsh"를 사용 하 여.
- 최대 신호 대 잡음 비를 달성 하기 위해 "rga" 명령 사용 하 여 수신기 이득을 조정 합니다.
- 물 공명 오프셋 (o1)에 스펙트럼의 센터를 놓고 "calibo1p1"를 사용 하 여 높은 전력에서 90도 양성자 펄스 (p1)를 설정 합니다.
- 제로 사용 하 여 양성자 스펙트럼 "zg" 명령과 "efp" 지 수 곱셈 ("em"), 자유 유도 감쇠 (FID) 라인 확대 통합, "피트"와 프로세스를 이동 하는 수집 단계 적용 FID "pk"의 푸리에 변환 정정 합니다.
- 자동 위상 보정 "apk" 및 "absn" 통합 옵션 없이 다항식을 사용 하 여 자동 기준 수정 적용 됩니다.
- 실험에서 "SFHMQC3GPPH"를 선택 하 여 SOFAST HMBC 실험 (3.2.2)에서 새 데이터 집합을 만듭니다.
- 복사는 양성자 스펙트럼에서 p 1과 o 1을 최적화 및 P1 종속 펄스 명령 "getprosol 1 H p 1 plw1", p 1은 최적화 된 P1 값과 plw1는 p 1에 대 한 전력 레벨을 사용 하 여 채웁니다.
- 아 미드 화학 변화에 대 한 오프셋을 설정 하려면 CNST54 상수를 최적화 하 고 대역폭 수신기 이득이 될 수 있는 관심의 괴기 한 지구를 포함 하기 위하여 정의 하는 CNST55 최적화 (그림 2). 이러한 매개 변수를 선택 하려면 첫 번째 FID (무료 유도 붕괴) 2 차원 스펙트럼에서 추출 하 고 그들을 정의 하는 관찰 된 신호에 대 한 보고. 또한, 휴식 지연 (D1), 검사 (NS), 및 더미 검사 (DS) 명령 "gs"와 허용 신호 감도 얻을 수 있습니다가 고 실시간으로 데이터 품질 모니터링을 스캔의 숫자 다.
- 0가 "zg"를 사용 하 여 스펙트럼을 기록 합니다.
- NMR 데이터 처리
- 처리 매개 변수 직접 F2의 크기를 설정 (1H) 및 간접 F1 (15N) 크기 사용 하 여 스펙트럼의 "시 F2 2048, F1 = 512 =" 선택적 선형 예측과 간접 차원 (그림 3).
- 창 기능으로 "QSINE"를 선택 하 고 2 차원 스펙트럼을 처리 하는 데의 사인 벨 shift (SSB)를 입력 합니다.
- 창 함수를 푸리에 변환으로 양방향에서 데이터 처리 명령 "xfb"를 입력 합니다.
- "Apk2d" 명령을 사용 하 여 양방향에서 자동 위상 보정을 수행. 경우 자동 프로세스 단계 교정의 만족 수준을 달성 하지 않는다, "rser" 명령을 사용 하 여 Fid를 추출, 1 일 처리에서 단계 값을 계산 하 고 2D 데이터에 적용할.
- 자동 초기 보정 기능 "abs2" 2D 데이터에 대 한 초기 계획을 수정 합니다. 이 처리 매개 변수에서 정의 된 ppm 값 사이의 다항식 함수를 적용 하 고 추가 분석을 위해 2 차원 스펙트럼을 생산할 예정 이다.
- 다른 분자와 상호 작용 데이터의 비교에 대 한 직렬 처리를 수행 하려는, 명령 "wpar"와 처리 매개 변수를 저장 하 고 "rpar"로 그들을 기억 합니다. 이 방법으로 모든 데이터 집합을 동일한 매개 변수 및 유사 처리 됩니다 하지 소개 합니다 처리 차이 때문.
- NMR 데이터 분석
- 피크 피킹 프로세스를 시작 하려면 명령 "pp"를 입력 합니다.
- 예상된 봉우리 (그림 4)에 따라 봉우리의 ppm 범위와 최소 강도/최대 수를 정의 합니다. 확인을 클릭 하 고 검사 하 여 결과 확인. 필요한 경우, 다시 결과 만족 될 때까지 프로세스 스펙트럼 품질에 따라 실행 합니다.
- "Pp" 명령 사용 하 여 peaklist를 생성 합니다.
참고:이 peaklist 정보가 데이터 높이/피크 강도 기본적으로 후속 스펙트럼을 내보낼 수 있습니다 및 다른 프로그램에서 읽을 수 있습니다. - 피크 농도에 변화 또는 다른 분자와 상호 작용을 나타내는 단백질 HSQC 스펙트럼의 화학 변화에 움직임을 관찰 합니다. 상호 작용 분자 큰 경우 일부 봉우리의 실종 함께 피크 농도에서 감축을 기대 합니다.
- 봉우리 창에서 오른쪽 클릭으로 "봉우리" 탭을 클릭 하 고 "가져오기"를 선택 하 여 다음 데이터 세트에 피크 목록을 가져옵니다.
- 스펙트럼을 통해 첨단 시각화를 새 위치로 이동 하는 데 필요한 경우. "" "전체 테이블"에 대 한 농도 재설정 클릭 농도 (그림 5)와 스펙트럼에 대 한 peaklist 생성 하. 이 피크 목록 저장된 피크 목록에서 위치 정보를 통해 수행 한다.
- "내보내기" 기능을 선택 하 여 스프레드시트 또는 분석에 대 한 다른 수학 프로그램에 서로 다른 데이터 집합에서 피크 목록을 내보냅니다.
- 기능 "각 피크에 대 한" 단백질 스펙트럼에서 복잡 한 스펙트럼/피크 강도에 강도 피크 피크 농도에 변화를 계산 합니다. 값은 100의 곱셈에 의해 비율 변화에 변환할 수 있습니다. 참고 최대 볼륨은 유용 피크 농도 일반적으로 경우 처럼 높은 밀도와 단백질에 대 한 상대적으로 넓은 봉우리의 봉우리는 서로 가까운 위치에 대 한 측정을 쉽게 합니다.
4. 미 Thermophoresis (MST)
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Ligand 단백질 E-PRD의 준비
- 20 mm HEPES, pH 7.5, 10 mM NaCl, 하룻밤 4 ° C에서 천천히 교 반 1 L에 3.5 kDa 미니 투 석 단위에서 단백질의 800 μ까지 dialyzing에 의해 MST 호환 버퍼에 있는 ligand를 교환 합니다.
- 10 분 전송 집중된 단백질 깨끗 한 관을 위한 14 000 x g에서 centrifuging 의해 원심 한 단위 (3 kDa MWCO)를 사용 하 여 리간드를 집중.
- 10 분에 대 한 21000 x g에서 ligand 원심 하 고 신중 하 게 어떤 침전 된 단백질을 제거 하는 새로운 관에는 상쾌한 전송. 흡수도 사용 하 여 280에 ligand의 농도 결정 및 리간드 소멸 계수. 10% 추가 0.015%의 최종 농도 게 트윈-20. 트윈-20 모세 혈관에 흡착을 방지 하기 위해 분석 결과 버퍼에 추가 됩니다. 최종 분석 결과 MST 실험에 사용 되는 버퍼가 20 mM HEPES, pH 7.5, 10 mM NaCl, 0.015% 트윈-20.
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염료-표시 대상 단백질 VimRod의 준비
- 1 x PBS-T 5 μ M의 농도 주고 레드 트리 NTA와 함께 제공 된의 50 μ를 추가 하 여 레드-트리 스-NTA 염료를 다시 구성. 200 μ 튜브 2 μ aliquots를 분배 하 고-20 ° c.에 저장
- 분석 결과 버퍼 0.34 μ M 대상 단백질을 희석. 대상의 58 μ 레드-트리 스-NTA 염료의 2 μ 약 수를 추가 하 고 실 온에서 30 분 동안 품 어. 염료-표시 대상의 최종 농도 0.33 μ M 이다. 10 분에 대 한 21000 x g에서 레이블이 대상 원심 하 고 신중 하 게 어떤 침전 제거 하려면 새로운 튜브에는 상쾌한 전송. 레드-트리 스-NTA 염료 His6 태그를 통해 단백질을 있으며 바인딩 분리 상수 (KD) 하위 nanomolar 범위에 있습니다. 그것은 효과적으로 100% 아니 더 정화가 필요 하므로 대상 단백질에 바인딩됩니다.
- MST 악기를 켜고 제어 소프트웨어를 엽니다. 레드-트리 스-NTA 염료에 대 한 빨간 설정을 선택 합니다. 25 ° c 온도 제어를 설정
- 대상의 라벨을 확인 하기 위해 예비 시험을 선택 하 고 집계 또는 흡착은 큐 벳에 대 한 확인. 이러한 매개 변수에 대 한 평가 자동으로 제공 됩니다.
- 분석 결과 버퍼 및 대상 단백질 및 pipetting으로 혼합 3 μ의 믹스 17 μ. 2 개의 표준 모 세관 희석된 대상에 그들을 찍기 및 액체는 모 세관의 센터에 의해 작성. 트레이 악기에 모세 혈관을 배치 합니다. 측정을 시작 합니다.
- 형광의 충분 한 수준과 흡착 (모 세관 선 형태로 왜곡)의 흔적을 찾고 결과 검토 또는 집계 (MST 추적에 왜곡) 소프트웨어 분석에 표시 됩니다. 결과 긍정적인 이동 하는 경우는 ligand에 단계를 하지 않을 경우 다른 버퍼 합니다 시도 또는 0.05% 이상의 트윈-20의 금액을 증가 수 있습니다.
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E-PRD Ligand 2 배 희석 시리즈의 준비
- 16, 라벨 희석 시리즈 준비 1-16에서 200 μ 튜브.
- 17 μ는 ligand의 Tube1를 원하는 최대 ligand 농도 보다 큰 농도 x 1.17에 추가 합니다. 이 볼륨 두 번 금액입니다 필요 (8.5 μ)는 약 수 다음 시리즈에서 다음 튜브에 전송 됩니다. 분석 결과의 최종 볼륨 10 μ 이므로 ligand의 1.17 배 농도의 8.5 μ 1 x 대상 단백질, VimRod의 1.5 μ의 추가 의해 희석 될 것입니다. 선택이 최대 농도 20 배 이상 예상된 KD 값 이어야 합니다.
- Tubes2-16 새로운 피 펫 팁을 사용 하 여 각 약 수에 대 한 분석 결과 버퍼의 8.5 μ를 추가 합니다. 피 펫 팁을 다시 사용 (정확한 pipetting 참조 제조 업체의 지침에 대 한 조언)에 대 한 정확도 영향을 수 있습니다. 서서히 거품을 생성 하지 않고 분석 결과 버퍼 솔루션을 발표 Tube2 Tube1에서 ligand의 8.5 μ를 전송 합니다. 믹스 ligand와 버퍼 pipetting 위아래로 최소 6 번, 다시 거품을 생성 하지 않고 여. E-PRD 가장 집중된 관에서 1.5 m m 이었고 레이블된 VimRod 50의 최종 농도에 출석 했다 nM.
- Tube2에서 Tube3 ligand의 8.5 μ를 전송 하 고 분석 결과 버퍼와 혼합. 직렬 희석을 반복 하 여 모든 튜브 ligand 추가 했다. 모든 튜브 포함 8.5 μ 2 배 희석의 일련에 ligand의 Tube16에서 8.5 μ를 삭제 합니다.
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바인딩 반응과 MST 실험의 준비
- 튜브의 각 레이블이 대상 단백질의 1.5 μ를 추가 하 고 거품을 피하기 위해 주의 되 고 위아래로 pipetting으로 부드럽게 혼합. 15 분 동안 품 어.
- 바인딩 분석 결과 대 한 전문가 모드를 선택 하 고 직렬 희석 시리즈에 대 한 매개 변수에 입력. 온도 제어 설정 되어 있는지 확인 25 ° C에는 전원을 40%, 그리고 보통 MST 전원 설정 되어. 이 매개 변수는 공부 되 고 다른 바인딩 파트너에 대 한 낙관 되어야 한다.
- 바인딩 반응 모세를 모 세관 트레이 있습니다. 용지함에 로드, 온도 25 ° C를 회복 하 고 측정을 시작 하기를 기다립니다.
-
데이터 분석
- 선호도 분석 소프트웨어에서 바인딩 분석 결과 파일을 엽니다. 검토 하는 모 세관 검사; 형광 수준에서 평균 10% 이상 달라 지지 한다, 3.6 절에 설명 된 대로 집계 또는 흡착을 감지 해야 합니다.
- 오른쪽 패널에 MST 분석을 선택 하 고 분석 결과 데이터 분석 집합으로 끕니다. 동일한 조건에서 동일한 대상 ligand 바인딩 분석 결과의 여러 번 실행 하는 경우 동일한 집합에 떨어지고 병합할 수 있습니다. 또는, 각 실행 삭제할 수 있습니다 하지 분석에 독립적으로.
- 데이터를 그래프 복용량 응답 맞는 탭으로 이동 합니다. 단일 바인딩 사이트 KD 모델을 선택 합니다. 힐 모델도 협력적인 행동으로 여러 바인딩 사이트에 대 한 옵션입니다. 이 단계에 맞는에서 품질 관리를 통과 하지 않은 국외 자 포인트를 제거할 수 있습니다. 여러 분석 병합 집합 평균 될 것 이다 하 고 오류 표준 편차로 계산.
- 마지막 탭을 열고 하나의 그래프에 모든 음모 사이 결과 비교 합니다. 생성 되는 테이블에서 각 곡선에 대 한 피팅 결과 검색 합니다. 원하는 경우 다른 프레 젠 테이 션 또는 분석 소프트웨어 데이터 또는 장착 되어 커브를 내보냅니다.
Representative Results
E-PRD 도메인 (pProEX-HTC로 복제 하는 잔류물 1822-2014) 인간 envoplakin 유전자와 VimRod 도메인 (99-249 pET21a로 복제 잔류물)의 인간의 vimentin의4 His6 태그로 표현 되었고 정화. 그림 6 과 그림 7 VimRod의 순수성의 수준을 보여주는 (18.8 kDa) 및 E-PRD (21.8 kDa) 단백질 정화의이 방법에서 얻은. His6 E-PRD 구문에서 태그는 필수적 MST 실험에 대 한 VimRod 단백질 His6 태그 바인딩 염료를 사용 하 여 표시 됩니다 및 모든 E-PRD의 His6 태그를 유지 수 있습니다 염료의 바인딩에 대 한 경쟁의 제거. TEV protease와 태그의 분열 후 두 번째 아이맥 열 TEV protease, 쪼개진된 태그 및 어떤 uncleaved His6-E-PRD 남아 제거 합니다. 정화의 최종 연마 단계는 크기 배제 크로마토그래피 이다. 불구 하 고 두 단백질 비슷한 크기의,는 VimRod E-PRD 차입 피크 가운데 72 mL이이 크기의 단백질 단위체 것 이라고 예상 하는 어디에 하는 동안 51 mL에 열에서 elutes. VimRod의 크기에서 명백한 증가 때문에 가능성이 높습니다는 filamentous 긴 막대와 그것의 특성 모양의 단백질으로 분석 ultracentrifuge 실험 시연 VimRod 단위체4했다. 단백질의 낮은 수율 M9 보다 최소한의 미디어에서 생산 되는 셀의 낮은 금액으로 인해 풍부한 국물에서 성장 하는 문화에서 얻을 수 있습니다. TB에 M9 준비에 대 한 더 큰 시 동기 문화의 초기 성장 15N NMR 실험에 필요한 라벨의 범위를 유지 하면서 셀 수율의 개선 수 있습니다.
15N-1H HSQCs VimRod (그림 8A-8 D)의 유무에서 야생 유형 및 E-PRD의 R1914E 돌연변이 대 한 인수 했다. 그림 8A 에 E-PRD의 스펙트럼 잘 해결된 봉우리, 제대로 접힌된 단백질의 지표의 예상된 번호를 보여 줍니다. VimRod (그림 8B)의 존재는 스펙트럼 광범위 한 라인 확장 하 고 해당 E-PRD와 VimRod 간의 바인딩을 하 피크 실종 보여줍니다. 이 바인딩은 그림 8C 8d와비교 하 여 입증 R1914E의 돌연변이 의해 손실 됩니다. 작은 변화는이 돌연변이 전자-PRD와 VimRod 간의 바인딩의 부족을 나타내는 R1914E 돌연변이 VimRod의 추가 따라 스펙트럼에서 관찰 됩니다. VimRod의 존재/부재에 E-PRD 피크 농도 비교 되었고 그림 8E, 피크 E-PRD 복잡 한 확대의 범위를 나타냅니다에 상대적인 피크 농도로 꾸몄다. E-PRD (표시 되지 않음)의 R1914E 돌연변이 야생 타입 (그림 8E)에 대 한 약 20%에 비해 VimRod의 존재에 20% 또는 더 높은 피크 농도에서 봉우리의 약 97%를 유지. 손실 함수 점 돌연변이, 중간 효과 또한 데 추가 돌연변이와이 대표는 공부4되었습니다 데.
확인 하 고 VimRod 및 E-PRD MST 분석 대상으로 형광 레드-트리 스-NTA 염료와 함께 표시 하는 His6-VimRod를 사용 하 여 바인딩을 quantitate 39.1에 1.28 m m에서 E-PRD ligand의 농도 감소와 혼합 nM 수행 했다. 세 가지 바인딩 titrations 실행 되었다 그리고 결과 평균 하 고 그림 9에 나와 있습니다. 데이터 1-사이트 ligand 바인딩의 표준 모델에 맞게 됐다 고 25.7 ± 2.1 μ M의 KD 를 주었다. 표면 플라스몬 공명에 의해 VimRod와 E-PRD 간의 바인딩 평가 19.1 ± 1.3 μ M4의 비슷한 KD 값을 했다.
그림 1: NMR 실험의 설정의 화면 캡처. 표시 창 HSQC 데이터 집합을 수집 하는 표준 실험을 설정 하는 데 사용 됩니다. 실험 매개 변수는 읽습니다 실험에 인접 한. 표시 하는 ZGPR 실험 표준 및 솔벤트 종속 양성자 매개 변수를 로드 하는 초기 실험으로 선택 됩니다. 제목 창 기록 유지 목적에 대 한 실험 정보를 입력 하는 데 사용 됩니다. HSQC 스펙트럼 수집 ZGPR 실험 SFHMQC3GPPH로 대체 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: NMR 실험 매개 변수 조정. 표시 창 NMR 펄스 시퀀스에 대 한 기본 매개 변수를 입력 하기 위한 신호를 최적화 하기 위해 사용 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: NMR 데이터 처리. 2 차원 NMR 스펙트럼의 각 처리에 사용 하는 매개 변수는 일반적으로 조정 하는 그를 나타내는 화살표와 함께 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: NMR 피크 따기에 대 한 매개 변수. 처리 NMR 스펙트럼에서 NMR 봉우리를 따기 위해 사용 되는 매개 변수는 일반적인 값으로 표시 됩니다. Ppm 범위, 강도 및 스펙트럼을 최적화 하는 봉우리의 수를 조정 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 농도와 대표 Peaklist. 숫자, 그리고 그것의 1H NMR 스펙트럼에서 선택은 각 피크 주어진 15N 화학 교대와 신호 강도 표시 됩니다. 이 peaklist 다음 파트너를 상호 작용의 존재/부재에서 얻은 스펙트럼 비교를 사용할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: IMAC와 S. A. VimRod His6 태그의 정화 아이맥 열에서 차입에 대 한 크로마 VimRod의 한 주요 피크를 보여준다. B. 크로마 S 열에서 차입에 대 한 하나의 주요 피크를 보여준다. C. SDS 페이지 분수의 정화의 과정을 통해 수집:는 MW MW 기준 kDa는 젤 (M), 세포 lysate (1), 아이맥 흐름 (2), 세척 (3), 풀링된 차입 (E1)의 왼쪽에 풀링된 S 차입 (E2)에 표시 된. 밴드 레인 E1 및 e 2에 더 높은 분자 무게에서 보이는 서쪽 오 점 (데이터 표시 되지 않음)에 의해 확인으로 순수한 VimRod의 올리고 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: IMAC와 S. A. E-PRD의 정화 SDS-PAGE는 MW와 분자량 표준 보여주는 아이맥 정화의 첫 번째 아이맥 열 (E1)는 TEV 분열 제품 (+ TEV)에서 왼쪽 젤 (M)과 eluate의 kDa에 표시 및 두 번째 아이맥 열 (피트)에서 통해 흐름. B. 크로마 토 그래프 S 열에서 하나의 주요 피크를 보여준다. C. 분자량 표준 (M) 및 S 피크에서 분수의 SDS 페이지입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8: 야생-타입 및 존재에 E-PRD의 R1914E 돌연변이 VimRod의 부재의 HSQC 스펙트럼. HSQC 스펙트럼 표시 야생-타입 E-PRD (100 µ M) 20 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 부재 (A) 또는 50 µ M의 존재에서 pH 7에서에서 VimRod (B). 패널 C와 D는 R1914E 돌연변이 (100µM)의 HSQC 스펙트럼 50 µ M의 존재 또는 부재에 VimRod, 각각. 패널 E 상대 1H-15N 피크 농도 또는 VimRod 바인딩 없이 E-PRD의 최대 수는 임의로 할당 되며 순서 위치를 기반으로 하지의 기능으로 표시 됩니다. 이러한 값 의미 컷오프는 ligand의 추가 따라 피크 강도 감소에 대 한 정의를 사용할 수 있습니다. 할당을 사용할 수 중요 한 값은 바인딩 영역에 매핑할 종종 볼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 9: E-VimRod에 PRD의 바인딩. E-PRD 39.1에 1.28 m m에서 두 배 희석의 일련에 희석은 nM MST 분석을 수행 하기 전에 레이블된 VimRod와 인 큐베이 팅 하 고. 3 개의 독립적인 분석에서 데이터를 결합 했다. 데이터는 주는 ± 2.1 μ M의 KD 자신감과 25.7 μ M의 KD KD 모델에 적합 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 시 약 | 수량 |
| 염기 인산 나트륨 (무수) | 6.0 g |
| 이수소 칼륨 인산 염 (무수) | 3.0 g |
| 염화 나트륨 | 0.5 g |
| H2O | 최대 950 mL |
표 1입니다. M9 동위 원소 라벨에 대 한 미디어입니다.
| 시 약 | 수량 |
| 15 NH4Cl | 1.0 g |
| 포도 당 (또는 13C-포도 당) | 2.0 g |
| 1 M MgSO4 | 2 mL |
| 50mm CaCl2 | 4 mL |
| 20 mg/mL 티 아민 | 1.0 mL |
| 3mm FeCl3 | 400 Μ L |
| 금속 혼합 (표 3) | 500 Μ L |
| H2O | 최대 50 mL |
표 2입니다. 영양 보충의 M9 미디어 믹스입니다.
| 시 약 | 수량 |
| 4mm ZnSO4 | 323 mg |
| 1mm MnSO4 | 75.5 mg |
| 4.7 m m H3보3 | 145 mg |
| 0.7 m m CuSO4 | 55.9 mg |
| H2O | 최대 500 mL |
표 3입니다. 금속 혼합 농축 산 영양 혼합에 대 한 보충.
| 샘플 | 1mm E-PRD 버퍼 A1 (µ L) | 버퍼 A (µ L)에서 1 m m VimRod | 버퍼 (µ L) | 200 µ M DSS D2O (µ L) | 버퍼 B2 (µ L) | 총 볼륨 (µ L) |
| E-PRD 혼자 | 50 | 0 | 50 | 50 | 350 | 500 |
| E-PRD + VimRod | 50 | 50 | 0 | 50 | 350 | 500 |
| 1 버퍼 a: 20 mM Tris HCl, 1mm DTT, pH 7 | ||||||
| 2 버퍼 b: 23 mM Tris HCl, 1.14 m m DTT, pH 7 | ||||||
표 4입니다. NMR 샘플 준비입니다.
Discussion
2D 15N 해결 NMR 실험 중 가장 널리 사용 되는 상호 작용 하는 두 분자를 표시 하는 방법. 그것은 두 파트너의 신호 솔루션 상태에서 적정 실험을 통해 지속적으로 모니터링할 수 있는 가장 풍부한 정보 방법 이다. 비록 큰 단지의 경우 일반적으로 질적, 메서드 또한 사용할 수 있습니다 유리한 경우에 바인딩 선호도 측정 하기 위해 고해상도 스펙트럼에 NMR 신호를 추적할 수 있는. 할당을 편리 하 게 만들 수 있는 같은 크기, 20 kDa 아래 많은 단백질의 경우 바인딩 사이트도 매핑할 수 있습니다. MST 등 보완 분석 솔루션, 상호 작용에 대 한 정량적 인 정보를 제공 하 고 레이블이 없는 상태에서 더 적은 단백질을 필요로. 돌연변이 바인딩 데이터의 비교는 상호 작용 NMR 라인 확대에 의해 입증 정품 되도록 컨트롤 하지 유물, 예를 들어 집계 또는 점도 변화를 제공 하는 데 유용.
단백질 표정
식 프로세스를 능률화 노동 집약적인 단백질 생산의 양을 줄일 수 있습니다. 이 최적화 프로세스의 일부 단백질의 재조합 표현에 대 한 대장균 의 적절 한 긴장의 식별을 포함 한다. 스트레인 설정 사용에서 벡터의 성격을 포함 한 요소에 따라 달라 집니다 그리고, 좀 더 구체적으로, 재조합 단백질의 궁극적인 안정성 표현7. 위험 내 인 성 대장균 에 의해 분리 단백질의 저하의 프로 테아 제 효소의 사용에 의해 감소 될 수 있다 부족 대장균 BL21 긴장 등. 드문 codons를 포함 하는 유전자, BL21-CodonPlus (DE3) RIPL 같은 스트레인 선호 수 있습니다. 이 긴장은 아르기닌, 이소류신, 프롤린, 및 신에 대 한 드문 codon tRNAs의 추가 생 복사본 BL21 스트레인의 효소 결핍 자연을 결합 한 제품. 또는, 드문 codons overexpression를 손상 시킬 수 있는 상업적인 소스에서 하는 코 돈 최적화 구조를 주문 하 여 피할 수 있습니다. 많은 변종 대장균 의 재조합 유전자 발현에 대 한 사용할 수 있습니다, 그리고 각 식7동안 특정 한 문제를의 우회에 대 한 최적화 합니다. 이 연구의 경우 표준 효소 결핍 스트레인 BL21(DE3) 후속 정화 및 분석에 대 한 수용 성 단백질의 충분 한 수량을 생산.
단백질 정화
주어진된 단백질에 대 한 정화 프로토콜은 종종 각 단백질 안정과 녹는 온도, 소금 농도, pH 등 다른 조건 하에서 유지 하는 의미에서 고유 합니다. 친화성 크로마토그래피를 통해 정화의 전반적인 효과 또한 정화 과정에서 다양 한 단계에서 이미 종 방출의 농도에 민감합니다. 이 작품에서 아이맥에 대 한 중요 한 버퍼 조건-PRD, 전자에 대 한 pH와 이미 농도 VimRod에 대 한 했다. 7.5의 pH 초기 차입 아이맥 열에서 다음 E-PRD의 강수량을 피하기 위해 필요 했다. VimRod의 아이맥 정화 열 세척 단계에서 이미 30에서 50 m m의 농도 증가 최종 차입 분수의 순수성에 있는 상당한 개선을 발견 됐다. 차입 단계에 이미 250에서 350 m m의 농도 증가 또한 발견 됐다 최종 차입의 수율을 향상 시킵니다. 초기 시도 이미 250 m m를 사용 하 여 단백질을 elute 이끌어 냈다 VimRod의 불완전 한 차입 열 (데이터 표시 되지 않음)의 최종 1 M 이미 스트립에 의해 밝혀. 350 m m는 차입에 대 한 이미 농도 증가 모든 단백질은 열에 바인딩된 복구 하기에 충분 했다. 버퍼 exchange를 동시에 수행 하는 동안 단백질 정화에 대 한 연마 단계 역할을 하므로 S 이중 목적을 검색할 수 있습니다. 버퍼 교환 His6 태그 단백질을 elute 데 이미 제거 이후 후속 바인딩 분석을 위한 중요 한 단계입니다. 그것은 또한 소금 농도 등 특정 다운스트림 기술 또는 분석 실험의 효능에 영향을 미칠 수 있는 pH 조건을 변경할 수 있는 기회 역할을 합니다. 단백질 열 변화 (점) 요구에 대 한 안정적인 단백질 그들을 위해 특히 다운스트림 분석 실험에 대 한 최적의 버퍼를 식별 하는 데 수 시간 실내 온도8,9에서 장기간.
바인딩 분석
갓 준비 단백질은 냉동된 단백질 결과 비교으로 사용할 수 있습니다 또한 비록 정확한 바인딩 분석 실험, 중요 합니다. Filamentous 단백질 vimentin multimerize 소금 및 pH 의존 패션, 같은 따라서 솔루션 최적화 될 필요가 및 초10,11, 동적 빛 비 산 같은 방법으로 추정 oligomeric 상태 조건 12 또는 분석 ultracentrifugation13,,1415. NMR 분광학은 리간드 원자 해상도 작은 단백질의 상호 작용을 측정 하기 위한 적합 합니다. 그러나, 큰 분자와 상호 작용 하는 단백질, 느린 연속 ensues, 그리고 비록 그것이 반드시 바인딩을 확인할 수 신호의 손실 발생 때 허용 요구 하는 것 또한 할당의 적어도 사이트 바인딩의 백본 공명입니다. 이 시나리오에서는 NMR 실험 상호 작용 사이트의 식별을 허용 하지 않습니다. 따라서 사이트 감독 mutagenesis 바인딩에 대 한 필요한 중요 한 잔류물을 식별 하기 위해 적용 됩니다. 따라서 이러한 돌연변이 신호 손실을 전시 하지 않습니다. 이 프로토콜에서 위치 1914에서 대체 된 돌연변이 형태 VimRod의 존재에 피크 농도 유지 하 고 따라서 전자-PRD 및 VimRod의 상호 작용의 확인 합니다. 백본 및 sidechain 공명의 할당 것 추가할 값이 방법 특히 무료 전자-PRD의 구조 엑스레이 결정학4에 의해 해결 되었습니다. NMR의 미래 응용 프로그램 더 큰 분자 사이 복잡 한 상호 작용의 묘사 포함 그리고 매우 높은 분야 자석 및 13등 다른 관찰 그룹의 사용을 누릴 것입니다 C 표시와 기자로 trifluoro 메 틸 그룹.
MST는 바인딩 상호 작용16공부에 대 한 이점이 있다. 바인딩 파트너는 솔루션에서 자유롭고 하지 고정입니다. 샘플의 품질의 분석 소프트웨어 품질 관리 집계의 보고, 모 세관 또는 부족 한 형광 라벨 부착 대상 분자의 흡착에 내장 되어있습니다. 대상의 작은 금액은 일반적으로 사용 하는, 레이블이 지정 된 대상의 농도 일반적으로 10-20 μ 볼륨/반응에 20-50 nM 사이. 이 프로토콜 특징을 약한 바인딩 상호 작용을 허용 하는 titrations에서 달성 될 수 있다 ligand의 농도 극대화 하기 위해 매우 작은 반응 볼륨 (10 μ)을 사용 합니다. 이 정확한 pipetting 및 아직도 철저 하 게 혼합 하는 동안 거품을 도입 방지로 이동 되 고 치료를 필요로 합니다. 적절 한 혼합 하는 것이 직렬 희석의 설정에 따라 정확 하 고 일관 된 형광 측정에 대 한 중요 합니다. MST 실험에서 트윈 20 양의 표준 거품을 만들고 혼합 향상의 경향이 낮은 0.05% ~ 0.015%에서에서 감소 되었다.
레드-트리 스-NTA 염료는 그의 어떤 단백질을 붙일, 쉽고 빠르고 편리한 방법을 제공 합니다 태그. 라벨은 효과적으로 30 분만에 완전 한 이며 매우 빡 빡 아무 염료 제거 절차는 필요. 아니 수정 ligand 바인딩 속성을 변경할 수 있는 단백질에 있는 아미노산 잔류물에 만들어집니다. 경고를 붙일만 단백질 His6 태그에 있어야 한다 이다. 이 ligand 단백질, E-PRD, 그리고 태그와 uncleaved E-두 번째 아이맥 열 단계 PRD의 제거에서 태그의 분열을 필요합니다. Ligand 단백질은 그의의 사용 하지 않고 준비 하는 한다 만약에 가능 하다 면, 태그. 또는 단백질 covalently 아민 리 진 잔류물 또는 thiol 시스테인 잔류물에 커플링 커플링을 통해 fluorophore로 표시 될 수 있습니다. 그러나, 해야 합니다 주의 정전기 또는 극 지 바인딩 상호 작용 lysine 또는 시스테인 잔류물에 영향을 미칠 수는 fluorophore의 공유 첨부 파일부터 이러한 시스템을 사용 하는 경우. VimRod 및 E-PRD MST에 의해 사이 친 화력 바인딩 정량화 소금 농도에 유난히 민감한 했다. 이 문제는 처음 분석 결과 버퍼의 동일한 배치에 대상 및 리간드를 dialyzing에 의해 완화 되었다. 그럼에도 불구 하 고, VimRod의 복잡 한 동작으로 인해 150 m m NaCl의 MST 분석을 수행할 때 채도 MST 바인딩 곡선의 달성 하지 수 없습니다. 안정적이 고 완전 한 데이터 얻은 일단 NaCl의 농도 KD의 정확한 계산을 허용 하는 10mm 낮아졌다. 따라서, 주의 최적화 솔루션 조건 및 보완 분석 실험과의 비교는 강력한 결과 얻을 수 것이 좋습니다. 또한, MST 주어진된 상호 작용에 대 한 소금 의존도 계량, 효소 반응 속도 론17에 단백질 상호 작용, 모니터 단백질 폴딩, 및 검색의 화학 량 론 속성을 계량을 사용할 수 있습니다.
Disclosures
저자는 충돌의 관심을 공개.
Acknowledgments
이 프로젝트는 NSERC RGPIN-2018-04994, 캠퍼스 앨버타 혁신 프로그램 (RCP-12-002 C) 및 앨버타 프리온 연구소에 의해 지원 되었습니다 앨버타 혁신적인 바이오 솔루션 (201600018), 미주리 및 게놈 캐나다와 캐나다 재단 수 여 / 혁신 부여 대사체학 혁신 센터 (TMIC)와 NANUC에 게 수 여 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Monolith NT.115, includes control and analysis software | NanoTemper Technologies | MO-G008 | Instrument for microscal thermophoresis |
| His-Tag Labeling Kit RED-Tris-NTA | NanoTemper Technologies | MO-L008 | RED-tris-NTA dye for MST |
| Standard capillaries | NanoTemper Technologies | MO-K022 | capillaries for MST |
| HisTrap HP, 5 mL | GE Healthcare | 17524801 | IMAC column |
| HisPur Ni-NTA resin, 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 88222 | IMAC resin |
| HiLoad 16/600 Superdex 75 pg | GE Healthcare | 28989333 | SEC column |
| TEV protease | Sigma Aldrich | T4455 | cleavage of his tag from E-PRD |
| BL21(DE3) Competent E. coli | New England Biolabs | C2527H | cells for protein expression |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets EDTA-Free | Sigma Aldrich | 11873580001 | protease inhibitors for protein purification by IMAC |
| TCEP, Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706 | reducing agent for protein purification |
| Reagents (HEPES, NaCl, etc) | Sigma Aldrich | various | Preparation of media and buffers |
| Ammonium chloride (15N, 99%) | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-467 | isotope labelling for NMR |
| D2O, Deuterium Oxide (D, 99.8%) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-2259 | NMR sample preparation |
| DSS, Sodium 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-D6 (D,98%) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-8206 | reference for NMR |
| Precision 5 mm NMR Tubes, 7” long | SJM/Deuterotubes | BOROECO-5-7 | NMR tubes |
| NMR spectrometer (14.1 Tesla) | Bruker | acquisition of NMR data | |
| TCI 5mm z-PFG cryogenic probe | Bruker | acquisition of NMR data | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Bruker TopSpin 4.0.1 | Bruker | processing of NMR data | |
| MO.Control | NanoTemper Technologies | included with Monlith NT.115 | |
| MO.Affinity Analysis | NanoTemper Technologies | included with Monlith NT.115 |
References
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