Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Måle interaksjoner Globular og trådformede proteiner av kjernefysiske magnetisk resonans spektroskopi (NRM) og Mikroskala Thermophoresis (MST)

Published: November 2, 2018 doi: 10.3791/58537
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry, University of Alberta

Summary

Her presenterer vi en protokoll for produksjon og rensing av proteiner som er merket med stabile isotoper og påfølgende karakteristikk av protein-protein interaksjoner ved hjelp av kjernefysiske magnetisk resonans (NRM) spektroskopi og Mikroskala Thermophoresis (MST) eksperimenter.

Abstract

Trådformede proteiner som vimentin gir organisasjonen i celler ved å gi en strukturelle skafottet nettsteder som binder proteiner som inneholder plakin gjentas. Her, er en protokoll for å oppdage og måle slik interaksjon beskrevet ved hjelp av globular plakin gjenta domenet envoplakin og spiralformede spolen av vimentin. Dette gir et grunnlag for å bestemme om et protein som binder vimentin (eller lignende trådformede proteiner) og for måling av slektskap av samhandlingen. Globular protein av interesse er merket med 15N og titreres med vimentin protein i løsningen. En todimensjonal NMR spekter er kjøpt å oppdage interaksjoner ved å observere endringer i topp form eller kjemiske Skift og belyse virkningene av løsning betingelser inkludert salt nivåer, som påvirker vimentin kvartær struktur. Hvis protein rundt binder trådformede ligand kvantifisert binding samspillet ved MST bruker renset proteiner. Tilnærmingen er en grei måte å avgjøre om et protein rundt binder en filament og vurdere hvordan endringer, for eksempel mutasjoner eller løsning forhold, påvirke interaksjonen.

Introduction

Interaksjoner mellom proteiner tillater dannelse av molekylære maskiner som oppretter rekkefølge i celler. Individuelle interaksjoner er ofte svake men vanligvis bidrar til multivalent komplekser som kan være samarbeidsvillig og dynamisk regulert. Følsom analyser som gir atomic oppløsning og kvantitativ informasjon om slike komplekse interaksjoner for å utlede mekanismer og design intervensjoner som narkotika-lignende molekyler. NMR spektroskopi er en effektiv metode for å få informasjon om protein interaksjoner, og også brukes for rask screening for ligander inkludert de som binder svakt1. NMR metodene som brukes kan kategoriseres i de som er protein observere eller ligand observere. Dette manuskriptet bruker tidligere tilnærming der et spekter av en stabil-isotop merket protein som er relativt liten (vanligvis under 20 kDa) er kjøpt og umerkede ligand titreres. Dette tillate merket rester fra samhandlingen kartlegges i fordelaktige tilfeller. Når de komplekse formene, det er endringer i kjemiske miljøer i samspill rester som manifesterer seg som endringer i kjemisk skiftet og form av deres NMR signaler. Omfanget av slike endringer korrelerer med graden av deltakelse av gruppene i samspillet. Kjemisk Skift forstyrrelser (CSP) kan måles ved å sammenligne en rekke NMR spekter av proteinet samlet i fravær og tilstedeværelsen av varierende mengder ligand. For større ligander eller komplekse interaksjoner, kan endringen i topp fasong eller intensiteten måles for å utlede interaksjoner.

Vanligste 2D eksperimentet brukes for å avdekke ligand interaksjoner er 15N-heteronuclear enkelt quantum sammenheng (HSQC) eksperiment2. Dette krever at en protein merkes jevnt med 15N, noe som oppnås vanligvis ved å uttrykke dem som affinitet-merket versjoner i E. coli bakteriekulturer vokst i 15N-beriket media. Bindingen er tydelig når HSQC spectra samlet under Serine aktiveringspunktene, avslørende topp endringer for en undergruppe av rester involvert i komplekse dannelsen. Samspillet kan skje i rask utveksling regimet hvor gratis og ligand-mettet signalene sammenfattes til ett befolkningen gjennomsnitt peak. Alternativt i langsom utveksling mellom statene, er begge signaler observert med integraler som representerer deres relative mengdene. Mens NMR lineshape analyse kan brukes til å beregne bindende slektskap i noen tilfeller metoder som MST har også vist praktisk og gir cross-validering av ekte interaksjoner.

Det oppgitte eksemplet er to proteiner som finnes i desmosomes. De megle veikryss mellom cellen overflater og cytoskeleton og megle multivalent interaksjoner mellom celle vedheft maskiner og intermediære filamenter å opprettholde integriteten til huden og hjertet vev og tåler for skjær krefter. Sykdommer kan gi når desmosomal proteiner som desmoplakin eller vimentin er kompromittert av mutasjoner eller autoantistoffer, fører til destabilization av celle-celle knutepunktene, og dermed deres samspill er av kritisk betydning3. Strukturelle grunnlaget for ligand binding av desmosomal proteiner kan være preget av NMR spektroskopi, mens interaksjoner kan kvantifiseres av MST. Metoder her ble brukt for å karakterisere samspillet mellom plakin gjenta domener (PRDs) som ofte tilstede som tandem sett som tilbyr grunnleggende grooves og vimentin, en intermediære som samhandler gjennom en syrlig overflate som sin spiralformede pakke4. Disse kompleksene dannes på cellemembranen der de ankertekst for intermediære filamenter av cellen cytoskjelett til desmosomes som kobler til tilstøtende celler, og dermed danner et nettverk av selvklebende obligasjoner som utstråler gjennom en vev.

Protocol

1. rekombinant Protein uttrykk

  1. Uttrykk for Envoplakin PRD (E-PRD) og Vimentin 99-249 (VimRod)
    1. Transformere E. coli BL21(DE3) celler med plasmider som inneholder ønsket genet. Spre cellene i agar plater som inneholder 100 µg/mL ampicillin. Inkuber platene på 37 ° C over natten.
    2. Velg en enkelt koloni og vaksinere 20 mL kjempefint kjøttkraft (TB) som inneholder 100 µg/mL ampicillin velge for plasmider. Vokse kulturen på 37 ° C med skjelvende (180 rpm) over natten.
    3. Overføre hele 20 mL kulturen til 1 L TB med 50 µg/mL ampicillin. Inkuber kulturen på 37 ° C med skjelvende på 180 rpm til OD600 = 0,6 0,8.
    4. Redusere temperaturen til 18 ° C og indusere protein uttrykk ved å legge isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) til en siste konsentrasjon av 1 mM. Fortsette inkubasjon ved 18 ° C med skjelvende på 160 rpm over natten slik at protein uttrykk.
    5. Høste celler av sentrifugering kulturen 8000 x g i 15 min. Decant og kast nedbryting.
    6. Vask høstet cellene av resuspending celle pellet på ca 40 mL fosfat bufret saltvannsoppløsning (PBS: 20 mM fosfatbuffer, pH 7.4, 120 mM NaCl). Overføre rørets til en 50 mL tube. Sentrifuger igjen 8000 x g i 15 min.
    7. Dekanter og kast nedbryting. Enten umiddelbart begynne rensing protokollen eller fryse celle pellets på 20 ° C for fremtidig bruk.
  2. Uttrykket Isotopically merket protein
    1. Transformere E. coli BL21(DE3) celler og forberede en 20 mL startkulturer som 1.1.1-1.1.2.
    2. Overføre hele 20 mL kulturen til 1 L beriket TB inneholder en ekstra 4.0 g tryptone, 5.0 g NaCl og 100 µg/mL ampicillin. Inkuber kulturen på 37 ° C med skjelvende på 160 rpm til OD600 = 1.6-1.9.
    3. Høste 1 L kulturen med sentrifugering 8000 x g i 15 min. Decant og kast nedbryting.
    4. Vask celle pellet av forsiktig resuspending i ca 40 mL PBS og overføre rørets til en 50 mL tube.
    5. Sentrifuge igjen 8000 x g i 15 min. Decant og kast nedbryting.
    6. Resuspend celle pellet i 20 mL av M9 minimal medier (tabell 1) og overføring til resten av den 950 mL av M9 minimal mediet som inneholder 100 µg/mL ampicillin.
    7. Legge til 50 mL av filteret sterilisert næringsstoff blanding (tabeller 2 og 3).
    8. Acclimatize kulturen til 18 ° C i 30 min før du legger IPTG til en siste konsentrasjon av 1 mM.
    9. Ruge over natten ved 18 ° C med skjelvende på 160 rpm.
    10. Høste celler i delen 1.1.4-1.1.6.

2. immobilisert metall affinitet kromatografi (IMAC) rensing av VimRod og E-PRD

  1. Rensing av His6-merket VimRod
    1. Resuspend celle pellet i 5 mL/g av PBS inneholder en protease hemmer cocktail mangler EDTA. Homogenize med 12 slag i en Dounce vev homogenizer å forbedre celle lysis i følgende trinn.
    2. På is, sonicate celle suspensjon på en puls av 1 s på/1 s av, 80% amplituden totalt 1,5 min. Gjenta sonication to flere ganger, virvlende forsiktig på is mellom går å hindre overoppheting.
    3. Sentrifuge prøven på 75 000 x g i 45 min. Decant og filtrere nedbryting bruke filtere sprøyten (0,45 µm).
    4. Equilibrate en 5 mL IMAC kolonne 5 kolonnen volum (CV) av bindende buffer (20 mM HEPES, pH 7.5 500 mM NaCl, 10 mM imidazole) ved en strømningshastighet på 1 mL/min med en rask protein flytende kromatografi (FPLC) system.
    5. Last filtrerte nedbryting på kolonnen på en strømningshastighet på 0,5 mL/min.
    6. Vask kolonnen med 5 CV av vaskebuffer (20 mM HEPES, pH 7.5 500 mM NaCl, 50 mM imidazole) på en strømningshastighet på 1 mL/min.
    7. Elute protein med 3 CV elueringsrør bufferen (20 mM HEPES, pH 7.5 500 mM NaCl, 350 mM imidazole) på en strømningshastighet på 0,5 mL/min. samle 1.5 mL fraksjoner. Velg opp-flow elueringsrør-modus for å øke konsentrasjonen av elut protein.
    8. Identifisere fraksjoner fra FPLC-chromatogram som inneholder proteinet rundt SDS-side og bruker standardmetoder for å måle protein konsentrasjon5.
    9. Samle og konsentrere elueringsrør fraksjoner som inneholder den høyeste mengden protein bruker en sentrifugal ultrafiltrasjon enhet (MWCO 3 kDa, 5 mL) til 2 mL. Sentrifuge 21000 x g å fjerne alle utløse og passerer gjennom et 0.22 μm filter.
    10. Equilibrate en 120 mL størrelse utelukkelse kromatografi (S) kolonne 2 CV av S buffer (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.5 0,5 mM TCEP) ved en strømningshastighet på 1 mL/min ved hjelp av en FPLC.
    11. Injisere konsentrert protein fra 2.1.9 på kolonnen og elute med 1 CV av S buffer på en strømningshastighet på 0,5 mL/min, samle 1 mL fraksjoner.
    12. Identifisere fraksjoner som inneholder proteinet rundt som før.
    13. Basseng fraksjoner som inneholder høyeste mengder protein.
    14. Lagre på 4 ° C for kortvarig bruk eller Legg til glyserol 20% og butikk på-80 ° C i små dele.
  2. Rensing av E-PRD Protein i His6 kode fjernet
    1. Følg trinnene i 2.1.1-2.1.8 å rense His6-merket E-PRD protein. Basseng peak fraksjoner og bestemme protein konsentrasjonen.
    2. Legge til tobakk etse virus (TEV) protease (1 mg/mL) på 2 µL/mg gruppert protein. Overføre til dialyse rør (6 kDa) og dialyze i S buffer overnatting på 4 ° C. Dette trinnet kan spalting av His6 koden og fjerning av imidazole som vil påvirke bindingen til Ni-NTA harpiks i neste trinn.
    3. Equilibrate 5 mL Ni-NTA harpiks i en tyngdekraften kolonne 3 CV av S-bufferen. Avløp overskytende buffer fra harpiks.
    4. Hell cleaved E-PRD protein på harpiks og ruge i 1 time på en rocking plattform å tillate uncleaved His6-merket E-PRD og cleaved His6-koden å binde. Den TEV protease er også His6-merket og vil binde harpiks. Samle flyten gjennom, som inneholder koden-ledig E-PRD. Vask harpiks med 2 CV av S buffer å sikre at alle E-prd gjenvinnes.
    5. Konsentrere E-PRD i flyten gjennom til 2 mL bruker en sentrifugal ultrafiltrasjon enhet (MWCO 3 kDa, 5 mL). Sentrifuge 21 000 x g å fjerne alle utløse og passerer gjennom et 0.22 μm filter.
    6. Equilibrate en 120 mL S kolonne 2 CV av S buffer (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.5 0,5 mM TCEP for MST eller 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7 for NMR) ved en strømningshastighet på 1 mL/min ved hjelp av en FPLC.
    7. Injisere konsentrert E-PRD protein fra 2.2.5 på kolonnen og elute med 1 CV av S buffer på en strømningshastighet på 0,5 mL/min, samle 1 mL fraksjoner.
    8. Identifisere fraksjoner som inneholder proteinet rundt som før.
    9. Basseng fraksjoner som inneholder høyeste mengder protein.
    10. Lagre på 4 ° C for kortvarig bruk eller Legg til glyserol 20% og butikk på-80 ° C i små dele.

3. NMR metoder

  1. NMR eksempel forberedelse
    1. Rense 15N-merket vill-type eller R1914E E-PRD protein som beskrevet tidligere med 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7 som S bufferen for trinn 2.2.6. Protein lager løsninger spenner vanligvis fra 0,3 til 1 mM med mengder ca 1 mL.
      Merk: Protein kan være konsentrert til > 100 µM ved hjelp av en MWCO 3 kDa, 5 mL sentrifugal ultrafiltrasjon enhet for å bringe konsentrasjonen til et egnet område for eksempel forberedelse.
    2. Rense et utvalg umerket VimRod protein med 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7 som S bufferen for trinn 2.1.10.
    3. I et siste volum på 500 µL, legge vill-type eller mutant E-PRD protein til en siste konsentrasjon av 100µM, deuterium oksid (D2O) til en siste konsentrasjon på 10% (v/v), og DSS (4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic acid) til en siste konsentrasjon på 20 µM. Bring eksempel volumet opp til 500 µL med 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7. Et representativt utvalg preparat er beskrevet i Tabell 4.
      Merk: 0 ppm resonans av DSS er brukt til 1H kjemiske Skift som for indirekte henvisning av 15N kjemiske skifter av protein6. D2O brukes for deuterium lås signalet for å holde spectrometer opererer på et konstant netto magnetfelt.
    4. Gjøre opp en andre eksemplar E-prd, D2O og DSS som i forrige trinn, og Legg til VimRod en siste konsentrasjon av 50 µM før bringe volumet opp til 500 µL.
    5. Overføre 500 µL prøvene til en 5 mm bredt NMR rør for eksperimentet.
  2. NMR eksperimentelle oppsett
    1. Slå på luftstrømmen med løs ut-kommandoen "ej"; Dette vil bringe prøven fra magneten. Nå plasserer utvalget innen en spinner på magneten ved åpningen og sett med kommandoen "ij". Vent til eksempel bosetter seg i magneten før du fortsetter.
    2. Opprette en ny datasett ved hjelp av kommandoen "edc" og laste standard 1H-NMR parametere ved å velge eksperiment "ZGPR" (figur 1). Fyll ut feltene navn, EXPNO (eksperiment-nummer) og PROCNO (behandlet mappe tall). Velg løsemiddelet i feltet "Angi løsemiddel" og klikk på "Execute"getprosol"" for å lese standard probehead og løsemiddel avhengige (prosol)-parametere.
    3. Låse prøven til deuterated løsemiddel, dvs. D2O, kommandoen "låse" og vent til den er ferdig feiende og oppnår lås.
    4. Rette resonans frekvensen av magneten ved tuning prøven kommandoen automatisk tuning «atma». Overvåke ustø kurven til automatisk tuning er fullført.
    5. SHIM magnetfelt bruker TOPSHIM (kommandoen "topshim"). Shimming er prosessen med justeringer magnetfelt å oppnå ensartethet rundt prøven. Det er lurt å lagre shim verdier med kommandoen "wsh" og lese dem ved hjelp av "rsh" før topshim, hvis bruker samme eller lignende prøvene.
    6. Justere mottaker gevinst med "rga" kommandere å oppnå maksimal signal til støyforhold.
    7. Plasser midten av spekteret på vann resonans forskyvningen (o1) og angi 90 graders proton pulsen (p1) på høy makt bruker "calibo1p1".
    8. Samle proton spekteret med null gå "zg" kommandoen og prosessen med "efp" som inkluderer eksponentiell multiplikasjon ("em"), gratis induksjon forfall (FID) omfatter linje utvide, "ft" fourier transformasjon av FID og "PN" gjelder fase korreksjon.
    9. Gjelde automatiske fase korreksjon "apk" og automatisk planlagte korreksjon "absn" bruke polynomet uten integrering.
    10. Opprette en ny datasett (som 3.2.2) for SOFAST HMBC eksperimentet ved å velge "SFHMQC3GPPH" i eksperimentet.
    11. Kopier optimalisert P1 og O1 fra proton spektrum og fylle P1 avhengige pulser med kommandoen "getprosol 1H p1 plw1", der p1 er optimalisert P1 verdien og plw1 er strømnivået for P1.
    12. Optimalisere CNST54 konstant for å angi forskyvningen for amid kjemiske Skift og CNST55 å definere båndbredden for omfatte spectral regionene rundt som lar mottakeren gevinst å være optimalisert (figur 2). Å velge parameterne, pakke ut den første FID (gratis induksjon decay) fra todimensjonal spekteret og se etter det observerte signalet å definere dem. I tillegg variere avslapning forsinkelsen (D1), skanner (NS) og dummy skanner (DS) å oppnå akseptabel signal følsomhet kommandoen "GS", som kan gå og skanning til å overvåke datakvaliteten i sanntid.
    13. Registrere spectra med null Go "zg".
  3. NMR databehandling
    1. Angi parametere for behandling til størrelsen på direkte F2 (1H) og indirekte F1 (15N) dimensjoner av spekteret ved hjelp "SI F2 = 2048 F1 = 512" med valgfritt lineær prediksjon i indirekte dimensjon (Figur 3).
    2. Velg "QSINE" som funksjonen vindu og angi en sinus bell Skift (SSB) 2 behandle todimensjonal spekteret.
    3. Skriv inn kommandoen "xfb" for å behandle data i begge retninger med vinduet funksjon og fourier transformasjon.
    4. Bruk kommandoen "apk2d" til å utføre automatiske fase korreksjon i begge retninger. Hvis den automatiske prosessen ikke oppnår tilfredsstillende nivå av fase korreksjon, ekstra FIDs med kommandoen "rser", beregne fase verdier 1D behandling, og bruke dem på 2D-data.
    5. Korrigere den opprinnelige planen med automatisk planlagte korrigering funksjonen "abs2" for 2D-data. Dette gjelder en polynom funksjon mellom ppm verdier definert i parameterne behandling og vil produsere et 2D spektrum for videre analyse.
    6. Hvis planlegging å utføre føljetong behandling for sammenligning av samhandling data med et annet molekyl, lagre parameterne behandling med kommandoen "wpar" og hente dem med "rpar". På denne måten alle datasett behandles med samme parametere og varianter vil ikke bli innført på grunn av behandler forskjeller.
  4. NMR dataanalyse
    1. Skriv inn kommandoen "pp" for å starte prosessen med topp plukking.
    2. Define ppm utvalg og minimum intensitet/maksimum antall topper basert på forventede topper (Figur 4). Klikk på OK og kontrollere resultatene ved by visuell inspeksjon. Hvis nødvendig, Kjør prosessen til resultatet er tilfredsstillende basert på spectra kvalitet.
    3. Generere en peaklist med kommandoen "pp".
      Merk: Denne peaklist inneholder data høyde/topp intensitet informasjon som standard og kan eksporteres til etterfølgende spectrums og kan leses av andre programmer.
    4. Observere endringer i topp intensiteten eller bevegelse i kjemiske endringer i de protein HSQC spectra som angir interaksjon med et annet molekyl. Hvis samspill molekylet er stor, forvent reduksjoner i topp intensiteter sammen med forsvinningen av noen topper.
    5. Importere listen peak til neste data ved å klikke på kategorien "topper" og velge "import" med et Høyreklikk i vinduet topper.
    6. Visualisere topper over spekteret og om nødvendig Skift dem til nye posisjoner. Klikk på "reset intensiteter" for "komplett bord" til å generere en peaklist for spekteret med intensitet (figur 5). Denne topp listen vil bære over posisjonsinformasjon lagrede topp listen.
    7. Eksportere toppen lister fra forskjellige datasets til et regneark eller andre matematisk analyse ved å velge funksjonen "Export".
    8. Beregne endringen i topp intensiteter med funksjonen "peak intensitet i komplekse spektrum/topp intensitet i protein spekteret" for hver topp. Verdier kan konverteres til Prosentvis endring av multiplikasjon av 100. Merk at peak volumer er også nyttig selv om topp intensiteter er enklere å måle for topper som er plassert nær hverandre, som vanligvis er tilfellet for proteiner med en høy tetthet av relativt bred topper.

4. Mikroskala Thermophoresis (MST)

  1. Utarbeidelse av Ligand Protein E-PRD
    1. Utveksle ligand til en MST kompatibel buffer av dialyzing opptil 800 μL protein i en 3,5 kDa mini dialyse enhet suspendert i 1 L 20 mm HEPES, pH 7.5 10 mM NaCl, omrøring sakte på 4 ° C over natten.
    2. Konsentrere ligand bruker en sentrifugal ultrafiltrasjon enhet (3 kDa MWCO) av sentrifugering 14 000 x g for 10 min. overføring konsentrert protein til en ren rør.
    3. Sentrifuge ligand 21000 x g i 10 min og nøye overføre nedbryting slik ny fjerne alle utfelt protein. Bestemme konsentrasjonen av ligand bruker absorbansen på 280 nm og ligand utryddelse koeffisient. Legge til 10% Tween-20 å gi en endelig konsentrasjon av 0.015%. Tween-20 legges til analysebuffer å hindre adsorpsjon kapillærene. Den endelige analyse bufferen som brukes for MST eksperimenter er 20 mM HEPES, pH 7.5 10 mM NaCl, 0.015% Tween-20.
  2. Utarbeidelse av Dye-merket målet Protein VimRod
    1. Rekonstituer RED-tris-NTA fargestoff ved å legge til 50 μL av 1 x PBS-T leveres med rød-tris-NTA å gi en konsentrasjon på 5 μM. Dispensere 2 μL dele inn 200 μL rørene og lagre på 20 ° C.
    2. Fortynne målet protein til 0.34 μM med analysebuffer. Legge til 58 μL målet i en 2 μL aliquot RED-tris-NTA fargestoff og ruge i 30 min ved romtemperatur. Siste konsentrasjonen av fargestoff-merket målet er 0,33 μM. Sentrifuge merket målet 21000 x g i 10 min og nøye overføre nedbryting slik ny fjerne alle utløse. RED-tris-NTA fargestoff binder proteiner gjennom His6 koden og har en bindende dissosiasjon konstant (KD) i sub-nanomolar området. Det er effektivt 100% bundet til målet protein så ingen ytterligere rensing kreves.
    3. Slå på apparatet MST og åpne kontroll programvare. Velg røde innstillingen for RED-tris-NTA fargestoff. Slå på temperatur kontrollen 25 ° C.
    4. Velg foregi å validere merkingen av målet og sjekk for aggregasjon eller adsorpsjon til cuvettes. En vurdering av disse parameterne angis automatisk.
    5. Mix 17 μL analysebuffer og 3 μL målet protein og blanding av pipettering. Ut to standard kapillærene dyppe dem i utvannet målet og tegning opp væske i midten av av kapillær. Plasser kapillærene i skuffen og instrumenter. Starte målingen.
    6. Se gjennom resultatene på jakt etter et tilstrekkelig nivå av fluorescens og ingen tegn til adsorpsjon (skjevhet i kapillærlinje form) eller oppsamlingen (skjevheter i MST spor) som vil bli flagget i analysen av programvare. Hvis resultatene er positivt trekk trinn, hvis ikke en annen buffer må prøves ut på ligand eller mengden Tween-20 kan økes til 0,05% eller høyere.
  3. Utarbeidelse av E-PRD Ligand todelt fortynning serien
    1. Forberede en fortynning serie ved merking 16, 200 μL rør fra 1-16.
    2. Legge til 17 μL ligand på 1.17 x større konsentrasjon enn maksimal ligand konsentrasjonen ønsket å Tube1. Dette er dobbelt så mye nødvendig (8,5 μL) som en aliquot overføres deretter til neste røret i serien. Siste bind i analysen er 10 μL så 8,5 μL 1,17 x konsentrasjonen av ligand vil bli utvannet til 1 x av tillegg av 1,5 μL målet protein, VimRod. Denne maksimale konsentrasjonen valgt bør være minst 20 ganger den anslåtte KD verdien.
    3. Legge til 8,5 μL analysebuffer i Tubes2-16 bruker nye pipette tips for hver aliquot. Gjenbruk pipette-spisser kan påvirke nøyaktigheten (for råd om nøyaktig pipettering se produsentens instruksjoner). Overføre 8,5 μL ligand fra Tube1 til Tube2 sakte ut løsningen i analysebuffer uten å generere bobler. Bland ligand og buffer av pipettering opp og ned minst 6 ganger, igjen uten å generere bobler. E-PRD i mest konsentrerte røret var 1,5 mM og merket VimRod var tilstede på en siste konsentrasjon av 50 nM.
    4. Overføre 8,5 μL ligand fra Tube2 til Tube3 og bland med analysen bufferen. Gjenta føljetong fortynning til alle rør har hatt ligand lagt. Kast 8,5 μL fra Tube16 slik at alle rør inneholder 8,5 μL ligand i en rekke todelt fortynninger.
  4. Utarbeidelse av bindende reaksjon og MST eksperimentet
    1. Legg 1,5 μL merket målet protein til hver av rør og bland forsiktig av pipettering opp og ned forsiktige for å unngå bobler. Inkuber i 15 min.
    2. Velg ekspertmodus for bindende analysen og angi i parameterne for en seriell fortynning serie. Kontroller at temperaturkontroll er satt til 25 ° C, eksitasjon makt er satt til 40% og MST kraften til middels. Parameterne må optimaliseres for andre bindende partnere blir studert.
    3. Fylle kapillærene med bindende reaksjonene og plasser i kapillær skuffen. Laste skuffen inn i apparatet, vent til temperaturen å gjenvinne 25 ° C og starte målingen.
  5. Dataanalyse
    1. Åpne filen bindende analysen i affinitet analyseprogramvare. Se gjennom kapillære skanner; Fluorescens nivåer bør ikke varierer mer enn 10% fra gjennomsnittet, ingen aggregasjon eller adsorpsjon skal oppdages som beskrevet i delen 3.6.
    2. Velg MST analysen på det høyre panelet og dra analysen dataene inn til analyse. Hvis det finnes flere serier med samme mål-ligand binding analysen under like kan de flettes ved å slippe i samme sett. Alternativt kan hver kjøre bli fjernet i analyse uavhengig.
    3. Gå til kategorien Dose svar passer lage dataene. Velg KD -modellen hvis en enkelt binding området forventes. Hill modellen er også et alternativ for flere bindende områder med samarbeidende opptreden. Avvikende punkter som ikke bestod kvalitetskontroll kan fjernes fra passer på dette stadiet. Flett sett med flere analyser fargemåleren og feil beregnet som standardavviket.
    4. Åpne kategorien siste og sammenligne resultater mellom alle tomter på et enkelt diagram. Hente passende resultater for hver kurve fra tabellen som genereres. Eksportere data eller montert kurver til annen presentasjon eller analyse programvare hvis ønskelig.

Representative Results

E-PRD domenet (rester 1822-2014 klonet i pProEX-HTC) av menneskelig envoplakin genet og VimRod domenet (rester 99-249 klonet i pET21a) av menneskelig vimentin4 ble uttrykt med His6 koder og renset. Figur 6 og figur 7 viser nivåer av renhet av VimRod (18.8 kDa) og E-PRD (21.8 kDa) innhentet fra denne metoden for renselse er protein. Fjerning av His6 kode fra E-PRD konstruksjon er viktig for MST eksperimenter som VimRod protein er merket med en His6 tag bindende fargestoff og eventuelle E-PRD beholde His6 koden kan konkurrere om binding av fargestoff. Den andre IMAC-kolonnen etter spalting av koden med TEV protease fjerner TEV protease, cleaved koden og noen uncleaved His6-E-PRD som forble. Det siste polering trinnet av rensingen er størrelse utelukkelse kromatografi. Til tross for begge proteiner liknende størrelse, elutes VimRod fra kolonnen på en 51 mL mens E-PRD elueringsrør toppen er sentrert på 72 mL der det forventes et protein monomer av denne størrelsen. Den tilsynelatende økningen i størrelsen på VimRod er sannsynlig grunn de egenskapene som trådformede lang stang formet protein som analytisk ultracentrifuge eksperimenter har vist at VimRod var monomerisk4. Lavere avkastning protein er Hentet fra avlinger vokst i M9 enn de fra rike kjøttkraft på grunn av en lavere mengde celler blir produsert i minimal media. Den opprinnelige veksten av større startkulturer for M9 forberedelser i TB kan forbedring av cellen gir samtidig som omfanget av 15N merking nødvendig for NMR eksperimenter.

15N -1H HSQCs ble kjøpt for wild type og R1914E mutant E-PRD i tilstedeværelse eller fravær av VimRod (figur 8A-8 D). Spekteret av E-PRD i figur 8A viser forventet antall godt løst topper, indikativ av et riktig foldet protein. I nærvær av VimRod (figur 8B) viser spekteret omfattende linje utvide og topp forsvinning, samsvarer med bindingen mellom E-PRD og VimRod. Denne bindingen er bortkommet av mutasjon av R1914E som gjenspeiles i sammenligning av Figur 8 c og 8 D. Liten endring er observert i spekteret ved tillegg av VimRod til R1914E mutant som indikerer manglende binding mellom denne mutant E-PRD og VimRod. E-PRD peak intensiteten i tilstedeværelse/fravær av VimRod forhold og plottet som relativ topp intensiteten i figur 8E, som angir hvilket topp utvide i E-PRD komplekset. R1914E mutant E-prd (vises ikke) beholdt ca 97% av toppene på 20% eller høyere peak intensiteter i nærvær av VimRod sammenlignet med ca 20% for wild type (figur 8E). Dette representerer tap av funksjon punkt mutant, med ekstra mutanter har middels effekter også har vært studert4.

Validere og quantitate binding av VimRod og E-PRD MST analyse ved hjelp av His6-VimRod merket med fluorescerende RED-tris-NTA fargestoff som mål blandet med minkende konsentrasjoner av ligand E-PRD fra 1.28 mM til 39.1 nM ble utført. Tre bindende titrations ble utført og resultatene er gjennomsnitt og vist i figur 9. Dataene ble passer med en standard modell av ett område ligand binding og ga en KD på 25,7 ± 2.1 μM. Evaluering av bindingen mellom VimRod og E-PRD av overflaten plasmon resonans ga lignende KD verdien 19.1 ± 1.3 μM4.

Figure 1
Figur 1: skjermen fange av oppsettet NMR eksperimentet. Vinduet vises brukes til å sette opp en standard eksperiment å samle HSQC dataset. Eksperimentet parametere er lest i tilstøtende eksperimentet. ZGPR forsøket vises velges som et første eksperiment laste standard og løsemiddel avhengige proton parameterne. Vinduet tittel brukes å input eksperimentelle detaljer for journalføring formål. For å samle HSQC spekteret er ZGPR eksperimentet erstattet med SFHMQC3GPPH. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: justere NMR eksperimentelle parametere. Vinduet vises brukes for å angi de grunnleggende parametrene for NMR puls sekvenser for å optimalisere signalet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: NMR databehandling. Parametere som brukes for behandling av hver av de to dimensjonene av NMR spekteret er vist, med piler som angir de som vanligvis er justert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: parametere for NMR Peak plukking. Parameterne som brukes til plukking NMR topper i behandlet NMR spekteret er vist med typiske verdier. Justere ppm utvalg, intensitet og antall topper å optimalisere til spectra. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: representant Peaklist med intensiteter. Hver topp som er plukket i NMR spekter gis et nummer, og dens 1H og 15N kjemiske Skift og signal intensitet vises. Denne peaklist kan deretter brukes til å sammenligne spectra innhentet i tilstedeværelse/fravær av et samspill partner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: rensing av His6-merket VimRod ved IMAC og S. A. Chromatogram for tilsettes IMAC-kolonnen viser en stor topp i VimRod. B. chromatogram for tilsettes S-kolonnen viser en stor topp. C. SDS-PAGE av fraksjoner samlet i løpet av rensing: MW standarder med MW angitt i kDa til venstre av gel (M), celle lysate (1), IMAC gjennomflytsenhet (2), vask (3), gruppert elueringsrør (E1), samlet S elueringsrør (E2). Band synlig på høyere molekylvekt i baner E1 og E2 er oligomers av ren VimRod som bekreftes ved western blot (data ikke vist). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: rensing av E-PRD IMAC og S. A. SDS-siden på IMAC rensing viser molekylvekt standarder med MW angitt i kDa til venstre for gelen (M) og eluate fra den første IMAC kolonnen (E1), den TEV cleavage produkter (+ TEV), og gjennom andre IMAC-kolonnen (FT). B. chromatograph S-kolonnen viser en stor topp. C. SDS-PAGE molekylvekt standarder (M) og fraksjoner fra S topp. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8: HSQC spektra av vill-type og R1914E Mutant E-PRD i tilstedeværelse og fravær av VimRod. Til HSQC spectra Vis vill-type E-PRD (100 µM) i 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, pH 7 i fravær (A) eller tilstedeværelse av 50 µM VimRod (B). Paneler C og D er HSQC spektra av R1914E mutant (100µM) i fravær eller tilstedeværelse av 50 µM VimRod, henholdsvis. I panelet E relative 1H -15N toppen vises intensiteter E-prd med eller uten VimRod binding som en funksjon av hvor toppen, som vilkårlig tildeles og ikke basert på sekvens posisjon. Disse verdiene kan brukes til å definere en betydning cutoff peak intensitet reduksjon på tillegg av en ligand. Hvis det finnes tildelinger, kan betydelig verdiene ofte sees å tilordne til et bindende. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 9
Figur 9: Binding E-prd til VimRod. E-PRD var fortynnet i en rekke todelt fortynninger fra 1.28 mM til 39.1 nM og inkubert med merket VimRod før MST analyse. Data fra tre uavhengige analyser ble kombinert. Dataene ble passer til en KD -modellen gir en K-D på 25,7 μM med KD sikkerhet på ± 2.1 μM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Reagens Antall
Natrium fosfat, dibasic (vannfri) 6.0 g
Kalium fosfat, monobasic (vannfri) 3.0 g
Natriumklorid 0,5 g
H2O Opptil 950 mL

Tabell 1. M9 medier for isotopanrikning merking.

Reagens Antall
15 NH4Cl 1.0 g
Glukose (eller 13C-glukose) 2.0 g
1 M MgSO4 2 mL
50 mM CaCl2 4 mL
20 mg/mL Thiamin 1,0 mL
3 mM FeCl3 400 ΜL
Metall blanding (tabell 3) 500 ΜL
H2O Opptil 50 mL

Tabell 2. Næringsstoff blanding for tilskudd av M9 medier.

Reagens Antall
4 mM ZnSO4 323 mg
1 mM MnSO4 75.5 mg
4.7 mM H3BO3 145 mg
0,7 mM CuSO4 55.9 mg
H2O Opptil 500 mL

Tabell 3. Metall blanding Supplement for berikende MT næringsstoff blanding.

Eksempel 1 mM E-PRD i bufferen A1 (µL) 1mM VimRod buffer A (µL) Bufferen er en (µL) 200 µM DSS i D2O (µL) Buffer B2 (µL) Totalt volum (µL)
E-PRD alene 50 0 50 50 350 500
E-PRD + VimRod 50 50 0 50 350 500
1 Buffer A: 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7
2 Buffer B: 23 mM Tris-HCl, 1.14 mM DTT, pH 7

Tabell 4. NMR eksempel forberedelse.

Discussion

2D 15N-løst NMR eksperiment er en av de mest brukte metodene for å vise hvordan to molekyler samhandle. Det er den mest informasjonsrikt metoden der begge partnere signaler overvåkes kontinuerlig gjennom et titrering eksperiment i løsningen tilstand. Selv om vanligvis kvalitative ved store komplekser, kan metoden også brukes i fordelaktige tilfeller for å måle bindende slektskap der NMR signaler kan spores i høy oppløsning spectra. Der tildelinger kan gjøres enkelt, kan som i mange proteiner under 20 kDa i størrelse, bindende områder også tilordnes. Utfyllende analyser som MST gir kvantitativ informasjon om interaksjoner i løsning og krever mindre protein i umerkede stater. Sammenligning av mutant bindende data er nyttig for å forsikre deg om at interaksjoner dokumentert av NMR linje utvide er ekte og ikke gjenstander av, for eksempel aggregasjon eller viskositet endringer.

Protein uttrykk

Strømlinjeforme uttrykk prosessen reduserer arbeidskraft intensiv protein produksjon. En del av denne optimaliseringsprosessen innebærer identifisering av en passende stamme av E. coli for rekombinant uttrykket protein. Belastning preferanse avhenger inkludert natur vektoren i bruk og, mer spesifikt, ultimate stabiliteten av rekombinante proteiner blir uttrykt7. Risikoen for degradering av heterologous protein av endogene E. coli proteaser reduseres ved bruk av protease mangelfull E. coli som BL21 belastningen. For gener som inneholder sjeldne kodon, kan en stamme som BL21-CodonPlus (DE3) RIPL bli foretrukket. Denne belastningen kombinerer protease mangelfull natur BL21 belastningen med flere endogene kopier av sjeldne codon tRNAs for arginin, isoleucin, proline og leucine. Alternativt, sjeldne kodon som kan kompromiss overuttrykte kan unngås ved å bestille en codon-optimalisert konstruere fra en kommersiell kilde. Mange stammer av E. coli er tilgjengelig for rekombinant genuttrykk, hver optimalisert for omgåelse av et bestemt problem under uttrykk7. I denne studien produsert standard protease mangelfull belastningen BL21(DE3) tilstrekkelig mengder av løselig protein for påfølgende rensing og analyse.

Protein rensing

Rensing protokollen for et gitt protein er ofte unik i den forstand at hver protein forblir stabil og løselig under ulike forhold som temperatur, saltkonsentrasjon eller pH. Effektiviteten gjennom affinitet kromatografi er også følsom for konsentrasjonen av eluting arter som imidazole på trinnene under en renselsesprosess. I dette arbeidet var kritisk buffer forholdene for IMAC pH for E-PRD og imidazole konsentrasjon for VimRod. En pH på 7,5 var nødvendig å unngå nedbør E-prd etter første elueringsrør fra kolonnen IMAC. For IMAC rensing av VimRod, ble øker konsentrasjonen av imidazole fra 30 til 50 mM under kolonnen wash trinn funnet for å ha en betydelig forbedring i renheten på de endelige elueringsrør fraksjonene. For elueringsrør trinn, ble øker konsentrasjonen av imidazole fra 250 til 350 mM også funnet for å forbedre avkastningen av siste tilsettes. Første forsøk på å elute protein med 250 mM imidazole førte til ufullstendig elueringsrør av VimRod som med en siste 1 M imidazole stripe av kolonnen (data ikke vist). Øker imidazole konsentrasjonen til 350 mM for tilsettes var tilstrekkelig til å gjenopprette alle protein bundet til kolonnen. S kan tjene to formål fordi det fungerer som et polering skritt for protein rensing og samtidig utføre buffer exchange. Bufferen er et kritisk punkt for påfølgende binding analyse ettersom det fjerner imidazole til elute His6-merket protein. Det fungerer også som en mulighet til å endre vilkårene som saltkonsentrasjon eller pH, som kan påvirke effekten av visse nedstrøms teknikker eller analyser. Protein termisk Skift (PTS) kan brukes til å identifisere optimal bufferne for nedstrøms analyser, spesielt for de som krever stabile protein for lengre perioder romtemperatur8,9.

Bindende analyse

Protein som nylaget er avgjørende for nøyaktig bindende analyser, selv om frosne protein kan også brukes så lenge resultatene sammenlignes. Trådformede proteiner som vimentin multimerize i en salt og pH avhengige mote, og dermed løsningen betingelse må optimaliseres og oligomeric staten anslått av en metode som sek10,11, dynamisk lys spredning 12 eller analytisk ultracentrifugation13,14,15. NMR spektroskopi er godt egnet for måling ligand interaksjoner av små proteiner atomic oppløsning. Men når et protein samhandler med større molekylet, tregere tumbling følger, og dette resulterer i tap av signaler som kan bekrefte bindende selv om det gjør ikke nødvendigvis tillater tilordning av bindende områder som vil også kreve tildeling av minst ryggraden resonanser. I dette scenariet tillater ikke NMR eksperimenter identifikasjon av webområdet interaksjon. Derfor regissert området mutagenese brukes for å identifisere kritiske rester nødvendig for bindingen. Slike mutanter derfor vise ikke signaltap. I denne protokollen, en mutert form med en substitusjon på posisjon 1914 beholder peak intensiteten i nærvær av VimRod og derfor bekrefter forstyrrelse av samspillet av E-PRD og VimRod. Tilordning av ryggrad og sidechain resonanser ville legge verdien til denne tilnærmingen, spesielt i strukturen for den gratis E-PRD har blitt løst ved Røntgenkrystallografi4. Fremtidige anvendelser av NMR inkluderer karakteristikk av komplekse interaksjoner mellom større molekyler og nytte ultra høy feltet magneter og bruk av andre observerbare grupper som 13C-merket og trifluoro metylgrupper som journalister.

MST har en rekke fordeler for å studere bindende interaksjoner16. Bindende partnerne er gratis i løsning og ikke immobilisert. Analyse av kvaliteten på prøvene er innebygd i programvaren med kvalitetskontroll rapportering av aggregering, adsorpsjon kapillærene eller utilstrekkelig fluorescerende merking av mål molekylet. Små mengder målet brukes vanligvis, konsentrasjonen av merket målet er vanligvis mellom 20-50 nM i en 10-20 μL volum/reaksjon. Denne protokollen bruker svært liten reaksjon volumer (10 μL) å maksimere konsentrasjonen av ligand som kan oppnås i titrations tillater svak bindende interaksjoner å være preget. Dette nødvendiggjør nøyaktig pipettering og omsorg blir tatt for å unngå å innføre bobler mens fortsatt grundig. Tilstrekkelig miksing er avgjørende for nøyaktig, konsekvent fluorescens målinger langs settet med føljetong fortynninger. Mengden Tween-20 i MST eksperimentene ble redusert fra en standard 0,05 0.015% til lavere tendens til å opprette bobler og forbedre miksing.

RED-Tris-NTA fargestoff gir en rask, enkel og praktisk måte å fluorescently merke noen protein som har en hans tag. Merkingen er effektivt fullført på bare 30 minutter og er veldig stramt slik at ingen fargestoff fjerningen er nødvendig. Ingen endringer er gjort til aminosyre rester i protein som kan endre egenskapene ligand binding. En påminnelse er at bare protein merkes bør ha en His6 kode. Dette krevde cleavage i koden ligand protein, E-PRD og fjerning av tag og uncleaved E-PRD med andre IMAC kolonnen trinnet. Hvis mulig, ligand protein bør være forberedt uten bruk av en hans tag. Alternativt kan proteiner covalently merkes med en fluorophore gjennom Amin kopling lysin rester eller thiol koble til cystein rester. Imidlertid må utvises ved bruk av slike systemer siden kovalente feste en fluorophore kan påvirke elektrostatisk eller polar binding interaksjoner stole på lysin- eller cystein rester. Kvantifisering av bindende affinitet mellom VimRod og E-PRD av MST var usedvanlig følsomt for salt konsentrasjon. Dette problemet ble motvirket av opprinnelig dialyzing både målet og ligand til den samme gruppen av analysebuffer. Metning av MST bindende kurven kan likevel ikke oppnås når MST analysen i nærvær av 150 mM NaCl på grunn av komplekse opptreden av VimRod. Pålitelig og fullstendig data ble oppnådd når konsentrasjonen av NaCl ble senket til 10 mM tillater nøyaktig beregning av KD. Derfor anbefales forsiktig optimalisering av løsning forhold og sammenligning med komplementære analyser til robust resultat. Videre kan MST brukes å kvantifisere den salt avhengigheten for en gitt interaksjon, kvantifisere stoichiometric egenskaper av protein interaksjoner, skjermen proteinfolding og sonde inn enzym kinetics17.

Disclosures

Forfatterne avsløre noen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette prosjektet har blitt støttet av NSERC RGPIN-2018-04994, Campus Alberta innovasjon Program (RCP-12-002 C) og Alberta Prion Research Institute / Alberta fornyer Bio løsninger (201600018), tildeles Mo og Genome Canada og Canada grunnlaget for Innovasjon stipend tildelt The Metabolomics Innovation Centre (TMIC) og NANUC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Monolith NT.115, includes control and analysis software NanoTemper Technologies MO-G008 Instrument for microscal thermophoresis
His-Tag Labeling Kit RED-Tris-NTA NanoTemper Technologies MO-L008 RED-tris-NTA dye for MST
Standard capillaries NanoTemper Technologies MO-K022 capillaries for MST
HisTrap HP, 5 mL GE Healthcare 17524801 IMAC column
HisPur Ni-NTA resin, 100 mL Thermo Fisher Scientific 88222 IMAC resin
HiLoad 16/600 Superdex 75 pg GE Healthcare 28989333 SEC column
TEV protease Sigma Aldrich T4455 cleavage of his tag from E-PRD
BL21(DE3) Competent E. coli New England Biolabs C2527H cells for protein expression
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets EDTA-Free Sigma Aldrich 11873580001 protease inhibitors for protein purification by IMAC
TCEP, Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Sigma Aldrich C4706 reducing agent for protein purification
Reagents (HEPES, NaCl, etc) Sigma Aldrich various Preparation of media and buffers
Ammonium chloride (15N, 99%) Cambridge Isotope Laboratories NLM-467 isotope labelling for NMR
D2O, Deuterium Oxide (D, 99.8%) Cambridge Isotope Laboratories DLM-2259 NMR sample preparation
DSS, Sodium 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-D6 (D,98%) Cambridge Isotope Laboratories DLM-8206 reference for NMR
Precision 5 mm NMR Tubes, 7” long SJM/Deuterotubes BOROECO-5-7 NMR tubes
NMR spectrometer (14.1 Tesla) Bruker acquisition of NMR data
TCI 5mm z-PFG cryogenic probe Bruker acquisition of NMR data
Name Company Catalog Number Comments
Software
Bruker TopSpin 4.0.1 Bruker processing of NMR data
MO.Control NanoTemper Technologies included with Monlith NT.115
MO.Affinity Analysis NanoTemper Technologies included with Monlith NT.115

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vinogradova, O., Qin, J. NMR as a unique tool in assessment and complex determination of weak protein-protein interactions. Topics in Current Chemistry. 326, 35-45 (2012).
  2. McKercher, M. A., Wuttke, D. S. NMR Chemical Shift Mapping of SH2 Peptide Interactions. Methods in Molecular Biology. 1555, Clifton, N.J. 269-290 (2017).
  3. Al-Jassar, C., Bikker, H., Overduin, M., Chidgey, M. Mechanistic Basis of Desmosome-Targeted Diseases. Journal of Molecular Biology. 425 (21), 4006-4022 (2013).
  4. Fogl, C., et al. Mechanism of intermediate filament recognition by plakin repeat domains revealed by envoplakin targeting of vimentin. Nature Communications. 7, (2016).
  5. The Protein Protocols Handbook. Walker, J. M. , 2nd ed, Humana Press. (2002).
  6. Wishart, D. S., et al. 1H, 13C and 15N chemical shift referencing in biomolecular NMR. J. Biomol. NMR. 6, 135-140 (1995).
  7. Casali, N. Escherichia coli Host Strains. E. coli Plasmid Vectors. , Humana Press. 27-48 (2003).
  8. Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., DeTitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).
  9. Kozak, S., et al. Optimization of protein samples for NMR using thermal shift assays. Journal of Biomolecular Nmr. 64, 281-289 (2016).
  10. Burgess, R. R. A brief practical review of size exclusion chromatography: Rules of thumb, limitations, and troubleshooting. Protein Expression and Purification. , In Press (2018).
  11. Kunji, E. R. S., Harding, M., Butler, P. J. G., Akamine, P. Determination of the molecular mass and dimensions of membrane proteins by size exclusion chromatography. Methods. 46 (2), 62-72 (2008).
  12. Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences. Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).
  13. Patel, T. R., Winzor, D. J., Scott, D. J. Analytical ultracentrifugation: A versatile tool for the characterisation of macromolecular complexes in solution. Methods. 95, 55-61 (2016).
  14. Pearson, J. Z., et al. Chapter One - Next-Generation AUC Adds a Spectral Dimension: Development of Multiwavelength Detectors for the Analytical Ultracentrifuge. Methods in Enzymology. Cole, J. L. 562, Academic Press. 1-26 (2015).
  15. Gorbet, G. E., Pearson, J. Z., Demeler, A. K., Cölfen, H., Demeler, B. Chapter Two - Next-Generation AUC: Analysis of Multiwavelength Analytical Ultracentrifugation Data. Methods in Enzymology. Cole, J. L. 562, Academic Press. 27-47 (2015).
  16. Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nature Communications. 1, 100 (2010).
  17. Jerabek-Willemsen, M., et al. MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond. Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).

Tags

Biokjemi problemet 141 celle adhesiondesmosome desmoplakin trådformede protein derfor Mikroskala thermophoresis kjernefysiske magnetisk resonans spektroskopi protein samhandling vimentin
Måle interaksjoner Globular og trådformede proteiner av kjernefysiske magnetisk resonans spektroskopi (NRM) og Mikroskala Thermophoresis (MST)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Winkelaar, G., Trieber, C., Kumar,… More

Winkelaar, G., Trieber, C., Kumar, J., Overduin, M. Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST). J. Vis. Exp. (141), e58537, doi:10.3791/58537 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter