Summary
Deze methode maakt een schatting van sediment denitrificatie tarieven in sediment kernen met behulp van de acetyleen remming techniek en microsensor metingen van de geaccumuleerde N2O. Het protocol beschrijft procedures voor het verzamelen van de kernen, kalibreren van de sensoren, uitvoeren van de remming van acetyleen, meten de N2O accumulatie en berekening denitrificatie.
Abstract
Denitrificatie is het primaire biogeochemische proces verwijderen van reactieve stikstof uit de biosfeer. De kwantitatieve evaluatie van dit proces is bijzonder relevant voor de beoordeling van de stikstofcyclus antropogene-gewijzigd global en de uitstoot van broeikasgassen (dat wil zeggen, N2O) geworden. Verschillende methoden zijn beschikbaar voor het meten van denitrificatie, maar geen van hen zijn volledig bevredigend. Problemen met bestaande methoden omvatten hun ontoereikende gevoeligheid, en de noodzaak om het substraat niveaus wijzigen of veranderen van de fysieke configuratie van worden gebruikt door het proces verstoord monsters. Dit werk beschrijft een methode voor het schatten van sediment denitrificatie tarieven die combineert ontkernen, acetyleen inhibitie en microsensor metingen van de geaccumuleerde N2O. De belangrijkste voordelen van deze methode zijn een lage verstoring van de structuur van het sediment en de collectie van een permanente record van N2O accumulatie; Deze schattingen van betrouwbare denitrificatie tarieven met minimale waarden tot 0.4-1 in staat stellen µmol N2O m-2 h-1. De mogelijkheid om te manipuleren van de sleutelfactoren is een bijkomend voordeel voor het verkrijgen van experimentele inzichten. Het protocol beschrijft procedures voor het verzamelen van de kernen, kalibreren van de sensoren, uitvoeren van de remming van acetyleen, meten de N2O accumulatie en berekening denitrificatie. De methode is geschikt voor het schatten van denitrificatie tarieven in een aquatisch systeem met opvraagbaar sediment cores. Als de N2O-concentratie hoger dan de detectiegrens van de sensor is, kan de acetyleen remming stap te schatten van de emissie van de2O N in plaats van denitrificatie worden weggelaten. We laten zien hoe beide feitelijke en potentiële denitrificatie tarieven schatten door het verhogen van de beschikbaarheid van nitraat, evenals de temperatuursafhankelijkheid van het proces. We illustreren de procedure met behulp van mountain lake sedimenten en discussiëren over de voordelen en de zwakke punten van de techniek ten opzichte van andere methoden. Deze methode kan worden aangepast voor specifieke doeleinden; het kan bijvoorbeeld worden gecombineerd met 15N traceurs te beoordelen van de nitrificatie en denitrificatie of veld in situ metingen van denitrificatie tarieven.
Introduction
Antropogene wijziging van de stikstofcyclus is een van de meest uitdagende problemen voor de aarde systeem1. Menselijke activiteit heeft op zijn minst verdubbeld de niveaus van reactieve stikstof beschikbaar aan de biosfeer2. Toch blijven er grote onzekerheid over hoe de wereldwijde N-cyclus wordt geëvalueerd. Een paar flux schattingen hebben gekwantificeerd met minder dan ±20% fout, en velen hebben onzekerheden van ±50% en grotere3. Deze onzekerheden geven de behoefte aan nauwkeurige schattingen van de denitrificatie tarieven over ecosystemen en een goed begrip van de onderliggende mechanismen van variatie. Denitrificatie is een microbiële activiteit waardoor stikstofhoudende stikstofoxiden, voornamelijk nitraat en nitriet, zijn gereduceerd tot dinitrogen gassen, N2O en N24. Het traject is zeer relevant voor de beschikbaarheid van de biosfeer van reactieve stikstof want het is het primaire proces van verwijdering5. N2O is een broeikasgas met een GWP-waarde bijna 300 keer dat co2 meer dan 100 jaar, en het is de huidige belangrijke oorzaak van de stratosferische ozonlaag toe te schrijven aan de grote hoeveelheden worden uitgestoten6,7.
In de volgende, presenteren we een protocol voor het schatten van sediment denitrificatie tarieven experimenteel gebruik van kernen en N2O microsensors (Figuur 1). Denitrificatie tarieven worden geschat met behulp van het acetyleen remming methode8,9 en metingen van de accumulatie van N2O tijdens een bepaalde periode (Figuur 2 en Figuur 3). We laten zien van de methode door het toe te passen op de berg lake sedimenten. Deze case studie wijst op de prestaties van de methode voor het opsporen van de relatief lage tarieven met minimale verstoring van de fysieke structuur van de sedimenten.
Denitrificatie is bijzonder moeilijk te meten van10. Er zijn verschillende alternatieve benaderingen en methoden, elk met voor- en nadelen. Nadelen aan beschikbare methoden omvatten het gebruik van dure resources, onvoldoende gevoeligheid en de behoefte aan de substraat-niveaus wijzigen of veranderen van de fysieke configuratie van het proces met behulp van verstoorde monsters10. Een nog meer fundamentele uitdaging voor het meten van N2 is zijn verhoogde achtergrondniveaus in de omgeving-10. De vermindering van N2O tot N2 wordt geremd door acetyleen (C2H2)8,9. Dus, denitrificatie kan worden gekwantificeerd door het meten van de geaccumuleerde N2O in aanwezigheid van C2H2, wat is haalbaar als gevolg van lage milieu N2O niveaus.
Het gebruik van C2H2 te meten denitrificatie tarieven in sedimenten ontstond ongeveer 40 jaar geleden11, en de opneming van N2O sensoren opgetreden ongeveer 10 jaar later12. De meest toegepaste acetyleen gebaseerde benadering is de "statische kern". De geaccumuleerde N2O wordt gemeten tijdens een incubatietijd van maximaal 24 uur nadat de C2H2 is toegevoegd aan de headspace van de verzegelde sediment core10. De hier beschreven methode volgt deze procedure met enkele innovaties. We voegen de C2H2 door het gas borrelt in de waterfase van de kern voor enkele minuten, en we vullen alle de headspace met monster water voor het meten van de accumulatie van N2O met een microsensor. We voegen ook een roersysteem waardoor de gelaagdheid van het water zonder het resuspending van het sediment. De procedure kwantificeert de denitrificatie tarief per oppervlakte van sediment (b.v., µmol N2O m-2 h-1).
De hoge ruimtelijke en temporele variatie van denitrificatie presenteert een andere moeilijkheid in haar nauwkeurige kwantificering10. Meestal wordt N2O accumulatie sequentieel gemeten met behulp van gaschromatografie van headspace monsters die zijn verzameld tijdens de incubatie. De beschreven methode biedt verbeterde controle van de temporele variatie van de N2O accumulatie, omdat de microsensor een continu signaal biedt. De microsensor-multimeter is een versterker met digitale microsensor (picoammeter) die met de sensor(en) en de computer (Figuur 1een interfacet). De multimeter kunt verschillende N2O microsensors moet worden gebruikt op hetzelfde moment. Bijvoorbeeld maximaal vier sediment kunnen kernen van de zelfde studieplaats worden gemeten gelijktijdig aan account voor de ruimtelijke variabiliteit.
De aanpak van de kern stoort nauwelijks de structuur van de sedimenten in vergelijking met sommige andere methodes (bv, slurries). Als de integriteit van de sedimenten is gewijzigd, leidt dit tot onrealistisch denitrificatie tarieven13 die alleen geschikt zijn voor relatieve vergelijkingen. Hogere tarieven zijn altijd verkregen met drijfmest methoden vergeleken met kern methoden14, omdat de laatste de beperking van denitrificatie door substraat diffusie15 behoudt. Drijfmest maatregelen niet beschouwd als vertegenwoordiger van in situ tarieven16; zij voorzien in relatieve maatregelen voor vergelijkingen gemaakt met exact dezelfde procedure.
De beschreven methode is geschikt voor het schatten van denitrificatie tarieven in elk type sediment die kan worden gevulde. Wij raden met name de methode voor het uitvoeren van experimentele manipulaties van enkele van de drijvende factoren. Voorbeelden zijn experimenten die wijzigen nitraat beschikbaarheid en temperatuur zo nodig voor het inschatten van de energie activering (Eeen) denitrificatie17 (Figuur 2).
Figuur 1 : Experimentele opzet. (een) algemene experimentele opstelling te schatten van sediment denitrificatie tarieven met behulp van kernen en N2O microsensors. De incubatie zaal zorgt voor duisternis en geregelde temperatuur (±0.3 ° C) voorwaarden. Vijf intact sediment kernen kunnen verwerkt worden gelijktijdig met behulp van hun respectieve N2O sensoren. (b) N2O sensor kalibratie kamer. We aangepast met rubber stoppen en spuiten te mengen de N2O water (zie protocol stap 3.4.3). Er is een thermometer om de temperatuur van het water. (c) in Close-up van een sediment core monster met de sensor die in het gat in het midden van de cover van het PVC en de gewrichten verzegeld met plakband wordt ingevoegd. De roerder is opknoping in het water, en de elektromagneet ligt dicht bij het en bevestigd aan het buitenste gedeelte van de acryl buis. (d) Close-up van het microsensor van de2O N tip beschermd door een metalen stuk. (e) een sediment kern die net zijn hersteld. Het werd bemonsterd vanaf een boot in een diep meer; de acryl buis met de kern is nog steeds op de messenger-aangepast zwaartekracht corer19bevestigd. Zie de Tabel van de materialen van alle items die nodig zijn om deze methode uit te voeren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereiding
Opmerking: Begint dit op de dag voordat de metingen zijn verricht.
- Monteren van de meting setup (Figuur 1een, zie de Tabel van de materialen).
Opmerking: Om te zorgen voor een constante en hoogwaardige voeding, de meting-apparaat is aangesloten op de greep via een uninterruptible power supply (UPS) die ook als een back-up fungeren kan. In het geval van een langdurige stroomstoring, een auto-accu dienen als een extra energiebron. - Start van de sensor software en toepassen van een -0,8 V spanning om te polariseren de N2O microsensors. Het signaal toont een snelle afdaling en een verdere stijging, dan het verlaagt tot slot totdat het is laag en stabiel.
Opmerking: De microsensor-fabrikant raadt polarisatie ten minste 's nachts (of meer) om de stabiliteit van het signaal van de sensor. Een andere aanbeveling is om te houden van de sensor gepolariseerde als metingen zijn gepland voor meerdere of opeenvolgende dagen18. - Zet de incubatie kamer en aanpassen van de experimentele omstandigheden (bijvoorbeeld, geselecteerde licht af en temperatuur ingesteld zijn vergelijkbaar met die in het veld verwacht). Plaats een container met gedeïoniseerd water in de kamer zodat water later beschikbaar op de temperatuur van de metingen voor de kalibratie van de sensoren is.
Opmerking: Deze stap kan dezelfde dag van de geplande metingen, vóór het vertrek te verzamelen van de kernen. Voor standaardmaten is het raadzaam om het gebruik van donkere omstandigheden. - Pak de kern veld collectie materialen: corer apparaat, bemonstering van buizen, rubber stoppen, polyvinylchloride (PVC) kranen, schroevendraaier, global positioning system (GPS) eenheid, thermometer, handheld sounder, steltloper en opblaasbare boot (Zie de tabel van van Materialen). Gebruik een checklist om ervoor te zorgen dat alle materialen inbegrepen zijn.
2. sedimenten kerncollectie
- Afhankelijk van de waterdiepte, volg 2.1.1 of 2.1.2.
-
Voor diepe waterlichamen
- Gebruik een messenger-aangepast zwaartekracht corer19 vanaf een boot of een platform (Figuur 1e).
- Vaststellen van de bemonstering buis (acryl, ø 6,35 cm, lengte ≥ 50 cm) om de corer met een schroevendraaier.
- Selecteer het monsterpunt volgens de doelstellingen van het onderzoek. Let op de positie (bijvoorbeeldmet behulp van GPS coördinaten) en de meting diepte (bijvoorbeeldmet behulp van een handheld sounder). Als bemonstering vanaf een boot, gebruikt u een anker (bijvoorbeeld, een zak met stenen) om te voorkomen dat tijdens de kerncollectie drijven.
- Implementatie van het grondonderzoek systeem totdat de bemonstering buis ~ 1 m uit het sediment is. Met een touw en regelmatige merken (bijv., intervallen van 1 m) bepalen de positie van de diepte van de bemonstering-apparatuur.
- Stabiliseren van de bemonstering apparatuur voor 60 s (bijvoorbeeldom te minimaliseren van het verkeer van de boot). Dit zorgt voor de juiste sediment penetratie en het herstel van een nauwelijks gestoord sediment core.
- Vrijgeven ~ 1 m meer touw zodat de bemonstering buis het sediment doordringt. Wees ervan bewust dat als de bemonstering buis teveel doordringt, het kan het verstoren van de water/sediment-interface.
- Laat de boodschapper terwijl het proberen om de spanning in het touw te houden, zodat de corer vastgesteld blijft en in een verticale positie. Wanneer de boodschapper de corer beïnvloedt, kan een klein verschil worden gevoeld in de spanning van het touw. Op dat moment sluit de corer voor het genereren van het vacuüm dat voor herstel van de kern van het sediment zorgt.
- De corer herstellen door het touw trekken voortdurend en zachtjes.
- Zodra de kern dicht onder de oppervlakte is, maar nog steeds volledig ondergedompeld (met inbegrip van het deel van de rubber van de corer die zorgt voor het vacuüm) plaats een rubberstop aan de onderkant van de buis van de bemonstering. Inspecteren van de water/sediment interface; het moet duidelijk zijn en niet zichtbaar verstoord (Figuur 1e). Als dit niet het geval is negeren de kern, de buis schoon en herhaal stappen 2.1.1.4-9.
- Verheffen het gehele grondonderzoek systeem uit het water. Vrijgeven van de buis van de bemonstering van de corer en een PVC-cover plaats op de top. Zegel met plakband. Voorkom de vorming van het luchtruim.
-
Voor en habitats en ondiepe wateren
- Jurk in een wader voor bemonstering in zeer ondiepe wateren (< 0,6 m).
- Snorkelen of scuba gear gebruiken voor diepere bemonstering (tot 3 m).
- Selecteer het monsterpunt volgens de doelstellingen van het onderzoek. Let op de positie (bv, GPS-coördinaten). Handmatig invoegen de bemonstering buis (bijvoorbeeldacryl, ø 6,35 cm) in het sediment.
- Plaats een rubberstop in de bovenzijde van de monstername buis te verkrijgen van een vacuüm.
- Verwijder de kern uit het sediment en snel invoeren van een andere rubberstop aan de onderkant van de buis.
Opmerking: Het is nodig om te werken met de buis onderwater te allen tijde; op zeer ondiepe sites, is het raadzaam de verkorting van de buis tot 20 cm. Soms is het sediment heeft een hoog watergehalte en watert wanneer de buis is verwijderd uit het sediment bed. In dit geval is het nodig om de bodem stop zonder de verheffing van de kern buiten het sediment. Om dit te doen, handmatig de stop in het sediment rond de buis onderdompelen en plaats deze zorgvuldig om te sluiten van de onderkant van de buis. - Uit het water, vervangen de bovenzijde rubberstop met een PVC-omslag en verzegel de kruising met plakband.
-
Voor diepe waterlichamen
- Beveiligt de kern bij de overdracht naar het laboratorium minimaliseren van rotaties en schudden.
3. kalibratie van de Microsensors Nitrous Oxide (N2van O)
- Met behulp van de computer (strip grafiek, sensor-software), Controleer dat van de sensor signaal stabiel en lage (< 20 mV).
- Maak een nieuw bestand (b.v.met de datum en de plaats van bemonstering (130903_Redon_Lake)) om de waarden van de kalibratie en de sensor signalen te registreren.
Opmerking: De sensor signalen zijn gevoelig voor temperatuur (Figuur 4). Gebruik de zelfde temperatuur voor de metingen en de sensor kalibratie. De sensor reageert lineair tussen 0 tot 2,5% N2O20. Daarom is een twee-punts kalibratie voldoende18. - Voor de kalibratie waarde met nul distikstofoxide (lachgas), gelezen het signaal van de sensor houden de sensor tip onderdompelen in N2O-gratis water (gedeïoniseerd).
- Kalibreren met N2O water op de gewenste concentratie.
Opmerking: Bereiden water met een gedefinieerde N2O concentratie, die iets hoger zal zijn dan de maximale concentratie tijdens de incubatie wordt verwacht. We gebruiken ~ 25 µM N2O als de waarde van de kalibratie. Zich bewust zijn van niet meer dan de maximale sensor bereik concentratie van 500 N2O µM.- Verkrijgen van N2O-verzadigd water door borrelende N2O in gedeïoniseerd water voor een paar minuten.
Opmerking: De oplosbaarheid in water2O N is afhankelijk van temperatuur en saliniteit21; Zie de tabel in de bijlage van de sensor handmatige18. - Verdun het N2O verzadigd water door een bepaalde hoeveelheid verzadigde N2O water tot een volume van gedeïoniseerd water toe te voegen. Bijvoorbeeld bij 20 ° C, toevoegen 0.3 mL verzadigde N2O water, met een concentratie van 28.7 mM N2O, tot een totaal van 375 mL water tot een 22.9 µM N2O concentratie aan. Opmerking dat 375 mL is het totale volume van de kalibratie kamer (Figuur 1b).
- Na het mengen zachtjes de N2O lees verzadigde water met gedeïoniseerd water in de kalibratie-schip te Verdun het tot de gewenste concentratie, de sensor signaal wanneer het is constant. Deze lezing is de waarde van de kalibratie met X µM N2O water. Bij het mengen van de oplossing, oppassen niet te genereren van bubbels, zoals dit N2O van de kalibratie-oplossing elimineren zou.
Opmerking: Let erop dat de N2O in het water langzaam in de lucht ontsnappen zal; Dus, de bereid kalibreervloeistof kan alleen worden gebruikt voor een paar minuten.
- Verkrijgen van N2O-verzadigd water door borrelende N2O in gedeïoniseerd water voor een paar minuten.
4. kern voorbereiding en acetyleen inhibitie
- Verandering de PVC-cover gelegen op de top van elk boormonster sediment door een andere cover met een gat in het midden en een hangende magneetroerder. Opnieuw verzegelen het kruispunt met plakband.
- Verminderen van de waterfase van elk monster tot een geschatte hoogte van 12 cm (volume ≈ 380 mL). Hiervoor voegt u eerst een Siliconen slang in het centrale gat. Vervolgens zet de kern van het sediment in een cilinder en duw de bodem stop druk maken. De stop en sediment monster stijgen en het overtollige water loopt door de buis. Het water in een ontvangende vaartuig te verzamelen.
Opmerking: Monsters met grove granulatie kunnen problematisch worden tijdens deze stap. Sediment deeltjes geplaatst tussen de stop en de buis kunnen vervormen de stop en open een gat door welke lucht bubbels kunnen doorgeven en verstoren van het monster. U kunt dit probleem omzeilen, zet de cilinder in het midden van de bodem stop en proberen te duwen met een constante kracht. De pakking tussen de Siliconen slang gebruikt om het overtollige water te evacueren en de PVC-cover bestaat uit een effen gedeelte (bijvoorbeeld, een 5 mL-pipet tip zonder het smalste uiteinde) ingevoegd in de silicone buis. - De acetyleen remming door borrelen met acetyleengas in de waterfase van de kern voor ongeveer 10 min uitvoeren. Vermijd resuspending van het sediment.
Opmerking: Als een eventuele wijziging van de methode, voeg een substraat (nitraat) door middel van een geconcentreerde vloeistof vóór borrelen acetyleen voor potentiële denitrificatie metingen (bijvoorbeeld, zoals in Figuur 3b, c).
5. denitrificatie (N2O accumulatie maatregel)
- Vul alle het luchtruim in het monster met de vorige overgebleven water. Plaats de sensor in de kern van sediment door het gat in het midden van de bovenzijde PVC-dekking. Het uiteinde van de sensor moet zich bevinden in de waterfase boven de roerder (Figuur 1c).
Opmerking: Alle de gewrichten van de buis acryl bemonstering moeten worden gesloten om te voorkomen dat gas en water lekken tijdens de meting (Figuur 1a, c). In het onderste gedeelte van de buis volstaat de rubberstop hiervoor. Afdichten van de bovenzijde deel is moeilijker. De cover van PVC moet worden afgestemd. Het moet worden verwarmd met een zaklamp; Wanneer het materiaal flexibel wordt maar is niet verschroeid, is de cover geplaatst in de buis zodat de vorm kan worden gegoten. Na afkoeling moet de cover meer wijzigingen (met uitzondering van de dekking die wordt gebruikt voor het vervoer van de monsters naar het laboratorium in stappen 2.1.1.10 of 2.1.2.6). Het centrale gat waar de sensor wordt ingevoegd moet worden geboord. De roerder kan worden gehouden met een vislijn, die op zijn beurt wordt nageleefd met lijm aan de binnenkant van de klep zodat de roerder hangt af van de visserij-lijn in het water (Figuur 1c). Ook worden alle de gewrichten (cover PVC-buis en PVC cover sensor) afgedicht met kleefband. Plaats elastische plakband om aan te passen van de diameter van de sensor om het zegel van het contactoppervlak tussen het centrale gat van het deksel van de PVC- en de sensor (Figuur 1c). - Overschakelen op het circuit van elektromagnetische puls die deel uitmaakt van het roersysteem.
Opmerking: De roersysteem voorkomt de gelaagdheid van de waterfase zonder storende (resuspending) het sediment. Het roeren systeem bestaat uit een circuit dat schakelt in/uit de elektromagneet die trekt/releases de magneetroerder (Zie de Tabel van materialen voor een gedetailleerde beschrijving). - Verplaats de elektromagneet rond het buitenste gedeelte van de acryl buis totdat de roerder beweegt zich voortdurend, en vervolgens repareren in plaats met behulp van plakband (Figuur 1c).
- Sluit de incubatie zaal om te zorgen voor een constante temperatuur (b.v., variatie van ±0.3 ° C).
- Druk op de opnameknop (sensor software) te beginnen met opnemen van het signaal van de sensor. Lezingen worden meestal geregistreerd voor elke 5 min.
- Druk op de stopknop aan het einde van de periode van de meting.
6. laatste meting stappen
- Wacht minstens ~ 10 min met de sensor van tip ondergedompeld in water van de vrije-N2O (gedeïoniseerd) voor het lezen van het signaal van de nul N2O kalibratie maatregel.
- Een laatste sensor kalibratieuit te voeren. Herhaal hiervoor de sensor kalibratie, na deel 3 maar beginnen met stap 3.3.
- Sla het bestand (de software van de sensor).
7. denitrificatie tarief berekeningen
- Begin met het getabelleerde uitvoerbestand gegenereerd door de sensor-software die de record van de sensor signaal in mV µM N2O en de kalibratiegegevens bevat.
- Het uitzetten van het signaal van de sensor tegen de klok om te visualiseren de tendens van de accumulatie van N-2, O, (b.v., Figuur 2een).
- Gebruik alleen het tijdsbereik met een lineaire accumulatie, met uitzondering van de periode van de eerste acclimatisering van het monster en een mogelijke definitieve verzadiging door substraat beperking (b.v., Figuur 2b). Maak een lineair model van het signaal van de sensor (µM) na verloop van tijd (h).
Opmerking: De helling is het tarief denitrificatie (µM N2O core-1 h-1), die als gedeeld door de oppervlakte van de kern (πr2), transformeert in het tarief in µM N2O m-2 h-1, en wanneer vermenigvuldigd met de water volume (πr2h, waarbij h is de hoogte van de waterfase en r de binnenstraal van de acryl buis, in dit geval 0,12 m en 0.03175 m, respectievelijk) transformeert in het tarief in µmol N2O m-2 h-1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een totaal van 468 denitrificatie tarieven werden geschat aan de hand van het protocol boven in sedimenten uit Pyrenese bergmeren in de periode 2013-2014. We tonen enkele van deze resultaten om te illustreren de procedure (Figuur 2 en Figuur 3). In het algemeen, heeft het lineaire model tussen de N2O-concentratie en de tijd goede correlatie (R2 ≥ 0.9). De helling van de relatie geeft een schatting van het denitrificatie tarief (stap 7.3; bijvoorbeeld, Figuur 2d). Als de denitrificatie activiteit erg laag is, de motorgeluiden van de sensor wordt steeds belangrijker en de goedheid van fit weigert (bijvoorbeeldsensoren 4 en 5 in Figuur 2b en Figuur 3a). Hoewel de detectiegrens van de basislijn van N2O ~0.1 µM in water22, dat een intermediair is waarde betreffende alternatieve methoden23, de mogelijkheid van accumulatie duizenden continumetingen voor het filteren van het lawaai vergunningen ramingen tegen relatief lage denitrificatie tarieven, tot ~ 1 µmol N2O m-2 h-1 (Figuur 2 en figuur 3). Lagere tarieven (dat wil zeggen, ~0.4 µmol N2O m-2 h-1) kan worden geschat door vernauwing van de waterfase van de kern monster, tot op een hoogte van 8 cm (zie protocol stap 4.2).
Figuur 2 : Denitrificatie tarief berekeningen in een temperatuur afhankelijkheid experiment. Werkelijke (a en b) en potentiële denitrificatie metingen (c--f) worden weergegeven. Wanneer de temperatuur van de meting is verminderde (c), op eerste het monster koelt en het signaal van de sensor, die temperatuur afhankelijk is, daalt. (een) A soortgelijke gebeurtenis bij het begin van de incubatie in de meting van de werkelijke denitrificatie; de warmere labo-omgeving met betrekking tot de incubatieomstandigheden produceert een afkoeling van het monster, weer gepaard met een daling in de sensor signaal. (e) wanneer de temperatuur wordt verhoogd, in eerste instantie de monsters warm en het signaal van de sensor in plaats van lineair exponentieel toeneemt. Wanneer de monsters bij een constante temperatuur, verhoogt de sensor signaal lineair zoals gewoonlijk. In alle gevallen is het mogelijk voor de berekening van de tarieven denitrificatie gewoon met behulp van de periode van lineaire N2O accumulatie (b, den f). (b) inactief monster 3 wordt niet weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Voorbeelden van denitrificatie stem berekeningen. (Een) werkelijke en potentiële (b en c) denitrificatie tarieven werden geraamd. We alleen het tijdsbereik met een lineaire N2O accumulatie gebruikt voor het berekenen van het tarief denitrificatie (helling van het lineaire model). Echter, in (een), voor educatieve doeleinden, we laten zien van alle metingen (modellen) met meer en minder succes; Wij zouden negeren monster 3 als gevolg van de hoge instabiliteit van de sensor en de monster 2 als gevolg van de verzadiging in de accumulatie van de2O N. (een) monsters 4 en 5 met tarieven van 0,5 en 0,7 µmol N2O m-2 h-1, respectievelijk, zijn gevallen van metingen in de buurt van de detectiegrens van de methode. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De belangrijkste voordelen van de beschreven methode zijn het gebruik van minimaal gestoord sedimentmonsters kern en de continue opname van de accumulatie van de2O N. Deze toestaan schatting van de relatief lage denitrificatie tarieven die waarschijnlijk vergelijkbaar met die voorkomen in situ. Toch, sommige aspecten met betrekking tot de ontkernen sensor prestaties en mogelijke verbeteringen worden besproken.
Een ogenschijnlijk eenvoudige maar kritische stap van de methode is goede core herstel. De interface van het sediment/water moet aan drie criteria voldoen: (i) geen wijziging in de samenstelling van chemische of samenstellende, (ii) geen wijziging van het watergehalte of ongeldig verhouding, en (iii) geen structuur pertubation24. De minder verstoringen leed door het monster gedurende het gehele protocol, de meer realistische en dichter bij in situ voorwaarden zal de gemeten denitrificatie bedraagt. Er zijn verschillende apparaten/technieken voor het sediment core collectie25, en hun keuze hangt af van de waterdiepte. We gebruiken een messenger-aangepast zwaartekracht corer19 voor diepe monsters (Figuur 1e) omdat het een redelijk lichtgewicht apparaat en snel korte kernen25 herstellen kan (een sediment core van ≥10 cm lengte is ruim voldoende om te omvatten de IME en denitrificerende lagen in de sedimenten26,27,28). In het ontkernen jargon, "feel" wordt vaak aangeduid als de mogelijkheid om te weten wat de locatie van de corer (of het is nog steeds in de waterkolom of al in het sediment) en of het open of gesloten van25. Voor tussenliggende waterdieptes (5-50 m) zijn meestal er geen problemen met gevoel. Een verlies van gevoel optreedt in dieper water (> 50 m) omdat de bewegingen van de waterkolom de locatie van de corer25 maskeren kunnen. Gevoel kan ook worden verloren in ondiep water (< 3 m) te wijten aan laterale drift en Golf actie25; Dit is waarom we gebruik maken van een andere methode in ondiep water, ofwel direct handleiding ontkernen door duiken of dressing in een steltloper. Met dit systeem, kunt de persoon die de steekproeven uitvoert zien van het sediment en kies de exacte plaats voor het ontkernen; Hierdoor, bijvoorbeeld, de bemonstering van de kern van een sediment die een macrophyte bevat. Na de monsterneming, moet de onderzoeker blijven werken zorgvuldig minimaal verstoren van het sediment core monster gedurende de rest van het protocol, met name bij het uitvoeren van acetyleen remming door borrelen.
Sommige details moeten worden overwogen bij het gebruik van N2O microsensors. De sensor-software biedt een continue visualisatie (strip grafiek) van de sensor signaal (achtergrond frequentie van 1000 Hz)29. Deze ruwe gegevens en de grafiek van de strip (b.v., Figuur 2een) kunnen worden opgeslagen. Het is noodzakelijk om het juiste gedrag van de sensor controleren na haar polarisatie (b.v.bij terugkeer uit veld collectie vóór stap 4). In het bijzonder, een lage (< 20 mV) en constante basis signaal wordt verwacht wanneer het is ondergedompeld in N2O-gratis water. Kalibreren van de sensor kort (~ 2 h) na het starten van het gebruik ervan; het is al gebruikt voor enkele dagen, kan het interval worden verlengd (~ 24 h)18. Gepolariseerde tenzij het niet voor verschillende dagen18 gebruikt wordtte minimaliseren van de herkalibraties, de sensor te houden. Na verloop van tijd kan een verandering in de sensor signaal optreden, tot 50% in maanden, die is te wijten aan een verschillende permeabiliteit van zijn membraan-18. Hoe lager de elektronische storing in het laboratorium, de meer constante en stabiele zullen de sensor signaal. In die zin verbetert met behulp van een UPS de kwaliteit van de elektrische energie die de meting apparaat door het filteren van de schommelingen van de spanning bereikt. Het voorbeeldinterval, geselecteerd op het tabblad Logger, verschilt van die van de frequentie van de achtergrond. Elke geregistreerde punt is gegenereerd op basis van het gemiddelde van veel metingen. Het voorbeeldinterval (maximaal 10 s) geeft de frequentie waarmee een gegevenspunt wordt geregistreerd. Het aantal metingen per eenheid die wordt gebruikt in het gemiddelde wordt bepaald door de achtergrond frequentie29. Bijvoorbeeld, als we een sampling-frequentie van 5 s en een achtergrond frequentie van 500 metingen per seconde, en vervolgens de gegevens punten zijn opgenomen elke 5 s en het gemiddelde van de 500 samples per seconde wordt gemeten tijdens de vorige 5 s. Wij registreren de sensor signaal elke 5 min (voorbeeldinterval) en de frequentie van de achtergrond ingesteld op 1000 metingen per seconde. De studie-systeem moet bekend zijn met het selecteren van de juiste voorbeeldinterval zonder "gemiddeld" verwachte schommelingen. In zeer actieve systemen, worden korte bemonstering intervallen aanbevolen, terwijl langere intervallen kunnen optimaliseren van de computer geheugen29. Sommige mogelijke storende stoffen (H2van S, Nee, en CO2) kunnen invloed hebben op de N2O sensor signaal22. De sensor is gekalibreerd met gedeïoniseerd water, maar de monsters kunnen storende stoffen bevatten en wijzigen van de sensor referentie signaal. Deze situatie zou kunnen verklaren waarom negatieve waarden worden weergegeven in monsters 2 en 5 in Figuur 2b en Figuur 3a, respectievelijk. Wanneer het doel is naar schatting van de mate van denitrificatie, is het precieze niveau van N2O echter niet de belangrijkste parameter. Wat is sleutel is de helling van het lineaire model (waaruit blijkt dat een lineaire accumulatie van N2O). Tot slot, is het nodig om te werken met een vaste temperatuur omdat de reactie van de sensor van de2O N met de temperatuur (Figuur 4 verandert).
Eenvoudige aanpassingen of toevoegingen aan het protocol ook inschakelen (i) karakterisering van de milieuomstandigheden beheersing van de gemeten denitrificatie tarieven, (ii) de schatting van de potentiële denitrificatie tarieven door simulatie van de reactie op een rij verloop (bijvoorbeeld, nitraat), en (iii) schatting van de emissieniveaus van sediment N2O taalkeuzemenu de C2H2 remming afhankelijk van de doelstellingen van de studie, verschillende aanvullende metingen kunnen worden gemaakt: (i) net na het herstellen van de kern, in situ voorwaarden, bijvoorbeeld, temperatuur; (ii) voor de meting, monsters van de waterfase, bv, [3-]; en (iii) na de meting, extrusie en segmenten van de kern bij verschillende resoluties (mm-cm)25,30, volgens de procedures uitgelegd door P. T. Schwing et al. 30.
Toevoegen om te meten de potentiële denitrificatie tarieven, nitraat op naar de water-fase van de kern (bijvoorbeeld Figuur 2 en figuur 3), zoals beschreven in C. Palacin-Lizarbe, L. Camarero en J. Catalaanse17. Als doen, voegt u de nitraat voordat de C2H2 remming (stap 4.3). Ook als nitraat wordt toegevoegd, is het raadzaam om ook het toevoegen van koolstof (C; bijvoorbeeld, acetaat) en fosfor (P) om de in situ stoichiometrische verhoudingen van C, N en P (b.v.in de surface sediment) te behouden. Dit zal de beperking van denitrificatie voorkomen door deze elementen31,32, en blijft ook de C/N-verhouding die invloed op de dominantie van het nitraat consumptie proces (dat wil zeggen, denitrificatie hebben kan versus fonologische nitraat te beperken tot ammonium (DNRA))4. Anoxia kan worden opgelost door het doorgeven van een mengsel van N2-CO2 voor een paar minuten na de toevoeging van nitraat, ter voorkoming van storing door zuurstof met denitrificatie; Nochtans, merken op dat dit tot een stagnatie van de nitrificatie leidt. Weglaten als u wilt berekenen sediment N2O emissieniveaus, de C2H2 remming (stap 4.3). Houd echter in gedachten dat, voor zover bekend is momenteel in aquatische ecosystemen, N2O-emissies proportioneel laag in vergelijking tot en met N2 uitstoot (0% - 4,3%)33 zijn, dus het is mogelijk dat de geaccumuleerde N2O hieronder zullen de detectiegrens. Als dit het geval is, is een optie om toe te voegen van nitraat te verhogen van de uitgestoten N2O, berekening van potentiële N2O-emissies.
De belangrijkste zwakte van de methode is de remming van de nitrificatie door C2H210,34. Tijdens de incubatie, kunnen deze remming van de nitrificatie en de onvolledige inhibitie van N2O vermindering blijken, zoals beide zeer tijd afhankelijk zijn. Bijvoorbeeld, moet de startende N2O accumulatie tarief onthullen de echte denitrificatie tarief en geleidelijk verval zoals de beschikbaarheid van nitraat druppels en N2O in de nitraat vrije zone diffundeert, waar er verminderde35. Daarom kan een geschatte denitrificatie tarief slechts geldig indien de lezingen Toon een lineaire accumulatie van N2O10worden beschouwd.
De beschreven methode maakt een schatting van een denitrificatie tarief per oppervlakte dat de hele sediment activiteit integreert. In dit opzicht is er enige onzekerheid over de actieradius van de remming van acetyleen wanneer het gas borrelt in de waterige fase van het monster. Er wordt verondersteld dat, op zijn minst, remming van de oppervlakkige laag van het sediment optreedt, dat is degene met de hoogste denitrificatie tarieven26,27.
Mogelijke verbeteringen van deze methode zijn het gecombineerde gebruik ervan met 15N traceurs en wijzigingen waardoor de meting van denitrificatie in situ. 15 N tracer methoden kunnen worden gebruikt om te bepalen van het aandeel van de nitrificatie-denitrificatie koppelen die zich in de monsters36, en het kan ook goed zijn voor andere processen flux N naast denitrificatie (b.v., anammox en fonologische de reductie van nitraat tot ammonium (DNRA))13,37. Deze methoden hebben echter het nadeel van het wijzigen van het substraat concentratie10. A. Behrendt, D. de Beer en P. Stief 26 een methode combineren N2O microsensors, C2H2 inhibitie en 15N traceurs gebruiken voor het analyseren van de distributie verticale activiteit van vermindering van de fonologische nitraat processen (denitrificatie en DNRA) in sedimenten. Ze maakten verticale profielen in het sediment door penetreren het sediment met de sensoren. Het grootste probleem bij de waardering van denitrificatie in situ is de mogelijkheid om een nonconstant temperatuurmilieu. Het is noodzakelijk om te registreren de N2O accumulatie en temperatuur tegelijkertijd en corrigeer vervolgens de N2O sensor signaal door de temperatuursafhankelijkheid tijdens de denitrificatie tarief berekeningen. Deze correctie vereist een voorafgaande analyse van de temperatuursafhankelijkheid van het signaal van de2O N voor elke sensor. De sensoren zijn handgemaakt en iedereen reageert anders op temperatuur (bijvoorbeeldsensor 1 toont de temperatuursafhankelijkheid van een hogere dan de anderen in Figuur 2c, e).
Figuur 4 : Temperatuursafhankelijkheid van de reactie van N2O microsensor. De hellingen van het lineaire model van de sensor signaal versus de temperatuur bij elke N2O-concentratie toont het effect van temperatuur op signaal van de sensor. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De Spaanse regering verstrekte middelen via de Ministerio de Educación als een predoctoraal fellowship C.P-L. (FPU12-00644) en onderzoekssubsidies van de Ministerio de Economia y Competitividad: NitroPir (CGL2010-19737), Lacus (CGL2013-45348-P), Transfer () CGL2016-80124-C2-1-P). Het REPLIM-project (INRE - INTERREG-programma. EUUN - Europese Unie. EFA056/15) ondersteund het uiteindelijke schrijven van het protocol.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Messenger-adapted gravity corer | - | - | Reference in the manuscript. Made by Glew, J. |
| Sampling tube | - | - | Acrylic. Dimensions: 100 cm (h) × 6.35 cm (d) × 6.50 cm (D). Sharpen the edge of the sampling tube that penetrates into the sediment to minimize the disturbance in the recovered sediment core sample. |
| Handheld sounder | Plastimo | 38074 | Echotest II Depth Sounder. |
| Rubber stopper | VWR | DENE1012114 | With two holes, used to mix the N2O-water in the calibration chamber. Dimensions: 20 mm (h) × 14 mm (d) × 18 mm (D) (3 mm hole (D)). |
| Rubber stopper | VWR | 217-0125 | To seal the bottom part of the methacrylate tube and to sample in shallow water bodies. Dimensions: 45 mm (h) × 56 mm (d) × 65 mm (D). |
| Rubber stopper | VWR | 217-0126 | Place the rubber stopper in the top side of the sampling tube to obtain a vacuum for sampling in littoral zones and shallow water bodies. Dimensions: 50 mm (h) x 60 mm (d) x 70 mm (D). |
| PVC cover | - | - | To seal the top side part of the acrylic tube. Dimensions: 45 mm (h) × 56 mm (d) × 65 mm (D). Dimensions: 65 mm (D). |
| Adhesive tape | - | - | Waterproof. To ensure all joints (PVC cover sampling tube and PVC cover sensor) and to avoid water leaks. |
| Thermometer | - | - | Portable and waterproof, to measure the temperature in the water overlying the sediment just after sampling the cores. |
| GPS | - | - | To save the location of a new sampling site or to arrive at a previous site. |
| Wader | - | - | For littoral or shallow site samplings. |
| Boat | - | - | An inflatable boat is the best option for its lightness if the sampling site is not accessible by car. |
| Rope | - | - | Rope with marks showing its length (e.g., marked with a color code to distinguish each meter). |
| N2O gas bottle and pressure reducer | Abelló Linde | 32768-100 | Gas bottle reference. |
| C2H2 gas bottle and pressure reducer | Abelló Linde | 32468-100 | Gas bottle reference. |
| Tube used to evacuate the excess of water | - | - | Consists of a solid part (e.g., a 5 ml pipette tip without its narrowest end) inserted in a silicone tube. |
| Nitrous Oxide Minisensor w/ Cap | Unisense | N2O-R | We use 4 sensors at a time. |
| Microsensor multimeter 4 Ch. 4 pA channels | Unisense | Multimeter | Picoammeter logged to a laptop. The standard device allows for 2 sensor picoammeter connections (e.g., N2O sensor), one pH/mV and a thermometer. We ordered a device with four picoammeter connections, allowing the use of 4 N2O sensors simultaneously. |
| SensorTrace Basic 3.0 Windows software | Unisense | Sensor data acquisition software. | |
| Calibration Chamber incl. pump | Unisense | CAL300 | Calibration chamber. We tuned it with rubber stoppers and syringes to mix the N2O-water without making bubbles. |
| Incubation chamber | Ibercex | E-600-BV | Indispensable equipment for working at a constant temperature (±0.3 °C). It also allows control of the photoperiod. |
| Electric stirrer | - | - | Part of the stirring system. It hangs in the water, overlying the sediment subject, by a fishing line that is hooked to the PVC cover. |
| Electromagnet | - | - | Part of the stirring system. It is fixed to the outside of the acrylic tube, approximately at the same level as the stirrer. It is activated episodically (ca. 1 on-off per s) by a circuit, attracting the stirrer when it is on and releasing it when it is off, thereby generating the movement that agitates the water. |
| Electromagnetic pulse circuit | - | - | Part of the stirring system. It is connected by wires to the electromagnet and sends pulses of current that turn the electromagnet on and off. |
| Uninterruptible power supply (UPS) | - | - | It improves the quality of the electrical energy that reaches the measurement device, filtering the highs and low of the voltage, thereby ensuring a more constant and stable N2O sensor signal. |
References
- Rockstrom, J., et al. A safe operating space for humanity. Nature. 461 (7263), 472-475 (2009).
- Erisman, J. W., Galloway, J., Seitzinger, S., Bleeker, A., Butterbach-Bahl, K. Reactive nitrogen in the environment and its effect on climate change. Current Opinion in Environmental Sustainability. 3 (5), 281-290 (2011).
- Gruber, N., Galloway, J. N. An Earth-system perspective of the global nitrogen cycle. Nature. 451 (7176), 293-296 (2008).
- Tiedje, J. M. Ch. 4. Ecology of denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium. Environmental Microbiology of Anaerobes. Vol. 717. Zehnder, A. J. B. , John Wiley and Sons. 179-244 (1988).
- Seitzinger, S., et al. Denitrification across landscapes and waterscapes: A synthesis. Ecological Applications. 16 (6), 2064-2090 (2006).
- Contribution of Working Group I to the fifth assessment report of the intergovernmental panel on climate change. IPCC. Climate Change 2013: The Physical Science Basis. , Cambridge University Press. (2013).
- Ravishankara, A. R., Daniel, J. S., Portmann, R. W. Nitrous Oxide (N2O): The Dominant Ozone-Depleting Substance Emitted in the 21st Century. Science. 326 (5949), 123-125 (2009).
- Balderston, W. L., Sherr, B., Payne, W. Blockage by acetylene of nitrous oxide reduction in Pseudomonas perfectomarinus. Applied and Environmental Microbiology. 31 (4), 504-508 (1976).
- Yoshinari, T., Knowles, R. Acetylene inhibition of nitrous-oxide reduction by denitrifying bacteria. Biochemical and Biophysical Research Communications. 69 (3), 705-710 (1976).
- Groffman, P. M., et al. Methods for measuring denitrification: Diverse approaches to a difficult problem. Ecological Applications. 16 (6), 2091-2122 (2006).
- Sorensen, J. Denitrification rates in a marine sediment as measured by the acetylene inhibition technique. Applied and Environmental Microbiology. 36 (1), 139-143 (1978).
- Revsbech, N. P., Nielsen, L. P., Christensen, P. B., Sorensen, J. Combined oxygen and nitrous-oxide microsensor for denitrification studies. Applied and Environmental Microbiology. 54 (9), 2245-2249 (1988).
- Jorgensen, K. S. Annual pattern of denitrification and nitrate ammonification in estuarine sediment. Applied and Environmental Microbiology. 55 (7), 1841-1847 (1989).
- Laverman, A. M., Van Cappellen, P., van Rotterdam-Los, D., Pallud, C., Abell, J. Potential rates and pathways of microbial nitrate reduction in coastal sediments. FEMS Microbiology Ecology. 58 (2), 179-192 (2006).
- Ambus, P. Control of denitrification enzyme-activity in a streamside soil. FEMS Microbiology Ecology. 102 (3-4), 225-234 (1993).
- Christensen, P. B., Rysgaard, S., Sloth, N. P., Dalsgaard, T., Schwærter, S. Sediment mineralization, nutrient fluxes, denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium in an estuarine fjord with sea cage trout farms. Aquatic Microbial Ecology. 21 (1), 73-84 (2000).
- Palacin-Lizarbe, C., Camarero, L., Catalan, J. Denitrification Temperature Dependence in Remote, Cold, and N-Poor Lake Sediments. Water Resources Research. 54 (2), 1161-1173 (2018).
- Nitrous Oxide sensor user manual. , UNISENSE A/S. (2011).
- Glew, J. Miniature gravity corer for recovering short sediment cores. Journal of Paleolimnology. 5 (3), 285-287 (1991).
- Andersen, K., Kjaer, T., Revsbech, N. P. An oxygen insensitive microsensor for nitrous oxide. Sensors and Actuators B-Chemical. 81 (1), 42-48 (2001).
- Weiss, R. F., Price, B. A. Nitrous oxide solubility in water and seawater. Marine Chemistry. 8 (4), 347-359 (1980).
- Nitrous Oxide Microsensors Specifications. , UNISENSE A/S. (2018).
- Koike, I. Ch. 18. Measurement of sediment denitrification using 15-N tracer method. Denitrification in Soil and Sediment 10.1007/978-1-4757-9969-9 F.E.M.S. Symposium Series. Revsbech, N. P., Sørensen, J. , Springer US. 291-300 (1990).
- Hvorslev, M. J. Subsurface Exploration and Sampling of Soils for Civil Engineering Purposes. , American Society of Civil Engineers, Waterways Experiment Station, Corps of Engineers, U.S. Army. 521 (1949).
- Glew, J. R., Smol, J. P., Last, W. M. Ch. 5. Sediment Core Collection and Extrusion. Tracking Environmental Change Using Lake Sediments: Basin Analysis, Coring, and Chronological Techniques. Last, W. M., Smol, J. P. 1, Springer. Netherlands. 73-105 (2001).
- Behrendt, A., de Beer, D., Stief, P. Vertical activity distribution of dissimilatory nitrate reduction in coastal marine sediments. Biogeosciences. 10 (11), 7509-7523 (2013).
- Laverman, A. M., Meile, C., Van Cappellen, P., Wieringa, E. B. A. Vertical distribution of denitrification in an estuarine sediment: Integrating sediment flowthrough reactor experiments and microprofiling via reactive transport modeling. Applied and Environmental Microbiology. 73 (1), 40-47 (2007).
- Melton, E. D., Stief, P., Behrens, S., Kappler, A., Schmidt, C. High spatial resolution of distribution and interconnections between Fe- and N-redox processes in profundal lake sediments. Environmental Microbiology. 16 (10), 3287-3303 (2014).
- SensorTrace BASIC 3.0 user manual. , UNISENSE A/S. (2010).
- Schwing, P. T., et al. Sediment Core Extrusion Method at Millimeter Resolution Using a Calibrated, Threaded-rod. Journal of visualized experiments. (114), 54363 (2016).
- Bernhardt, E. S. Ecology. Cleaner lakes are dirtier lakes. Science. 342 (6155), 205-206 (2013).
- Finlay, J. C., Small, G. E., Sterner, R. W. Human influences on nitrogen removal in lakes. Science. 342 (6155), 247-250 (2013).
- Seitzinger, S. P. Denitrification in fresh-water and coastal marine ecosystems- ecological and geochemical significance. Limnology and Oceanography. 33 (4), 702-724 (1988).
- Seitzinger, S. P., Nielsen, L. P., Caffrey, J., Christensen, P. B. Denitrification measurements in aquatic sediments - a comparison of 3 methods. Biogeochemistry. 23 (3), 147-167 (1993).
- Christensen, P. B., Nielsen, L. P., Revsbech, N. P., Sorensen, J. Microzonation of denitrification activity in stream sediments as studied with a combined oxygen and nitrous-oxide microsensor. Applied and Environmental Microbiology. 55 (5), 1234-1241 (1989).
- Peter, N. L. Denitrification in sediment determined from nitrogen isotope pairing. FEMS Microbiology Ecology. 9 (4), 357-361 (1992).
- Risgaard-Petersen, N., Nielsen, L. P., Rysgaard, S., Dalsgaard, T., Meyer, R. L. Application of the isotope pairing technique in sediments where anammox and denitrification coexist. Limnology and Oceanography-Methods. 1, 63-73 (2003).
