Schätzung der Sediment Denitrifikation Preise mit Kernen und N₂O Mikrosensoren

Summary

Diese Methode schätzt Sediment Denitrifikation Preise in Sedimentkernen mit Acetylen Hemmung Technik und Reinstraum Messungen des kumulierten N₂O. Das Protokoll beschreibt Verfahren zur Erfassung der Kerne, Kalibrierung der Sensoren, die Acetylen-Hemmung, Durchführung die N₂O Anhäufung Messung und Berechnung der Denitrifikation.

Abstract

Denitrifikation ist der primäre biogeochemische Prozess entfernen von reaktivem Stickstoff aus der Biosphäre. Die quantitative Auswertung dieses Prozesses ist besonders relevant für die Beurteilung der anthropogen veränderte globale Stickstoffkreislauf und die Emission von Treibhausgasen (d. h. N₂O) geworden. Stehen mehrere Methoden zur Messung der Denitrifikation, aber keiner von ihnen sind völlig zufriedenstellend. Probleme mit bestehenden Methoden umfassen ihre unzureichende Sensitivität, und die Notwendigkeit, die Substrat-Ebenen zu ändern oder Ändern der physischen Konfiguration der Prozess verwendet gestört Proben. Diese Arbeit beschreibt eine Methode zur Schätzung der Sediment Denitrifikation raten, die Entkernung kombiniert, Acetylen-Hemmung und Reinstraum Messungen des kumulierten N₂O. Die wichtigsten Vorteile dieser Methode sind eine geringe Störung der Sediment-Struktur und die Sammlung von eine kontinuierliche Aufzeichnung der N₂O Anhäufung; Diese ermöglichen es Schätzungen der zuverlässige Denitrifikation Raten mit minimalen Werten bis zu 0,4-1 µmol N₂O m^-2 h^-1. Die Fähigkeit, Schlüsselfaktoren zu manipulieren ist ein weiterer Vorteil für den Erhalt der experimentellen Erkenntnisse. Das Protokoll beschreibt Verfahren zur Erfassung der Kerne, Kalibrierung der Sensoren, die Acetylen-Hemmung, Durchführung die N₂O Anhäufung Messung und Berechnung der Denitrifikation. Die Methode eignet sich für die Schätzung der Denitrifikation Preise in jedem aquatischen System mit abrufbaren Sedimentkernen. Wenn die N₂O Konzentration oberhalb der Nachweisgrenze des Sensors, kann Acetylen Hemmung Schritt entfallen, N₂O Emission statt Denitrifikation zu schätzen. Wir zeigen, wie Sie sowohl tatsächliche und potenzielle Denitrifikation Preise durch steigende Nitrat Verfügbarkeit sowie die Temperaturabhängigkeit des Prozesses zu schätzen. Wir illustrieren das Verfahren mit Berg-See-Sedimente und erläutern Sie die Vorteile und Schwächen der Technik im Vergleich zu anderen Methoden. Diese Methode kann für bestimmte Zwecke geändert werden; zum Beispiel mit ¹⁵N Tracer zur Nitrifikation und Denitrifikation oder Feld in Situ Messungen der Denitrifikation Preise Bewertung kombinierbar.

Introduction

Anthropogene Veränderung des Stickstoffkreislaufes ist eines der schwierigsten Probleme für die Erde System¹. Menschliche Tätigkeit hat mindestens das Niveau von reaktivem Stickstoff zur Verfügung, um die Biosphäre²verdoppelt. Es bleiben jedoch große Unsicherheiten in Bezug auf wie der globale N-Zyklus ausgewertet wird. Ein paar Flussmittel Schätzungen haben mit weniger als ±20 % Fehler quantifiziert worden, und viele haben Unsicherheiten von ±50 % und größer³. Diese Unsicherheiten zeigen die Notwendigkeit für genaue Schätzungen der Denitrifikation Raten über Ökosysteme und ein Verständnis für die zugrunde liegenden Mechanismen der Variation. Denitrifikation ist eine mikrobielle Aktivität durch die stickstoffhaltigen Oxide, vor allem Nitrat und Nitrit, Distickstoff Gase, N₂O und N₂⁴reduziert werden. Der Weg ist für die Biosphäre Verfügbarkeit von reaktivem Stickstoff von großer Bedeutung, denn das ist der primäre Prozess der Entfernung⁵. N₂O ist ein Treibhausgas mit einem Treibhauspotenzial fast 300-Mal, dass Co₂ in 100 Jahren, und es ist die aktuelle Hauptursache der stratosphärischen Ozonschicht aufgrund der großen Mengen wird emittierten^6,7.

Im folgenden präsentieren wir ein Protokoll für die Schätzung der Sediment Denitrifikation Preise mit Kernen und N₂O Mikrosensoren experimentell (Abbildung 1). Denitrifikation Preise sind anhand der Acetylen Hemmung Methode^8,9 und Messungen der Anhäufung von N₂O in einem definierten Zeitraum (Abbildung 2 und Abbildung 3) geschätzt. Wir zeigen die Methode indem Sie Berg Seesedimenten zuweisen. Diese Fallstudie zeigt die Leistungsfähigkeit der Methode zur Erkennung von relativ niedrigen Raten mit minimaler Störung, die physikalische Struktur der Sedimente.

Denitrifikation ist besonders schwer zu¹⁰messen. Es gibt verschiedene alternative Ansätze und Methoden, jeweils mit vor- und Nachteilen. Nachteile der zur Verfügung stehenden Methoden beinhalten die Verwendung von teuren Ressourcen, nicht genügend Sensibilität und die Notwendigkeit, die Substrat-Ebenen zu ändern oder ändern die physische Konfiguration des Prozesses mit gestörten Proben¹⁰. Eine noch grundlegendere Herausforderung zur Messung von N₂ ist seine erhöhten Hintergrundwerten in der Umwelt-¹⁰. Die Reduktion von N₂O, N₂ ist durch Acetylen (C₂H₂)^8,9gehemmt. So kann Denitrifikation durch Messung der kumulierten N₂O im Beisein von C₂H₂, das ist möglich aufgrund des niedrigen ökologischen N₂O quantifiziert werden.

Die Verwendung von C₂H₂ bis Denitrifikation in Sedimenten messen entstand vor etwa 40 Jahren¹¹und die Einbeziehung der N₂O Sensoren aufgetreten ist etwa 10 Jahre später¹². Die am häufigsten angewandte Acetylen-basierten Ansatz ist der "statische Kern". Der kumulierte N₂O ist während einer Inkubationszeit von bis zu 24 h gemessen, nachdem der Kopfraum des versiegelten Sediment Kern¹⁰C₂H₂ hinzugefügt wird. Die hier beschriebene Methode folgt dieses Verfahren mit einigen Neuerungen. Wir fügen die C₂H₂ durch das Gas in der Wasserphase des Kerns für einige Minuten sprudelnd, und wir füllen die Headspace mit Probenwasser vor der Messung der Anhäufung von N₂O mit einem Reinstraum. Wir sind auch ein Rührsystem, die verhindert, die Schichtung des Wassers dass ohne resuspending Sediment. Das Verfahren quantifiziert die Denitrifikation Rate pro Fläche Sediment (z.B., µmol N₂O m^-2 h^-1).

Die hohe räumliche und zeitliche Variation der Denitrifikation stellt eine weitere Schwierigkeit in seine genaue Quantifizierung¹⁰. In der Regel ist N₂O Anhäufung nacheinander durch Gaschromatographie Headspace Proben gemessen, die während der Inkubation gesammelt werden. Die beschriebene Methode bietet verbesserte Überwachung der zeitlichen Variation der N₂O Anhäufung, weil die Reinstraum ein kontinuierliches Signal bietet. Reinstraum-Multimeter ist ein digital Mikrosensor Verstärker (Picoammeter), der Schnittstellen mit den Sensoren und dem Computer (Abbildung 1(ein). Das Multimeter kann mehrere N₂O Mikrosensoren zur gleichen Zeit verwendet werden. Zum Beispiel können bis zu vier Sediment Kerne aus der gleichen Studie Ort gleichzeitig entfallen die räumliche Variabilität gemessen werden.

Die Core-Ansatz stört kaum die Sediment-Struktur im Vergleich zu einigen anderen Methoden (z.B., Schlämme). Wenn die Integrität der Sedimente geändert wird, führt dies zu unrealistisch Denitrifikation Preise¹³ , die nur für relative Vergleiche ausreichend sind. Höhere Raten sind immer mit Gülle-Methoden im Vergleich zu zentralen Methoden¹⁴, abgerufen, da letztere die Begrenzung der Denitrifikation durch Substrat Verbreitung¹⁵bewahrt. Gülle-Maßnahmen können nicht als repräsentativ in Situ Preise¹⁶angesehen werden; Sie bieten relative Maßnahmen für Vergleiche mit dem exakt gleichen Verfahren.

Die beschriebene Methode eignet sich für die Schätzung der Denitrifikation Preise auf jegliche Sediment entkernt werden können. Wir empfehlen besonders die Methode für die Durchführung von experimentellen Manipulationen einiger die treibenden Faktoren. Beispiele sind Experimente, die Nitrat-Verfügbarkeit und Temperatur je nach Bedarf für die Schätzung der Aktivierungs Energie (E_ein) der Denitrifikation¹⁷ (Abbildung 2) zu ändern.

Abbildung 1 : Versuchsaufbau. (ein) General Versuchsaufbau Sediment Denitrifikation Preise mit Kernen und N₂O Mikrosensoren abzuschätzen. Die Inkubation Kammer sorgt Dunkelheit und kontrollierten Temperatur (±0.3 ° C). Fünf intakt Sedimentkerne können gleichzeitig mit ihrer jeweiligen N₂O Sensoren verarbeitet werden. (b) N₂O Kalibrierung Sensorkammer. Wir haben es mit Gummistopfen und Spritzen auf der N₂O Wasser mischen angepasst (siehe Protokoll Schritt 3.4.3). Es ist ein Thermometer, um die Wassertemperatur zu kontrollieren. (c) eingefügt Nahaufnahme von einer Sedimentprobe Kern mit dem Sensor in der Mittelbohrung des PVC-Hülle und die Fugen mit Klebeband versiegelt. Der Rührer im Wasser hängt, und der Elektromagnet ist in der Nähe und der äußere Teil des Acryl Rohr befestigt. (d) Nahaufnahme von N₂O Mikrosensor Tipp von einem Metallstück geschützt. (e) ein Sedimentkern, die gerade wiederhergestellt wurden. Es war ein Boot in einem tiefen See entnommen; das Acryl Rohr mit dem Kern ist immer noch auf die Messenger-angepasst Schwerkraft Corer¹⁹fixiert. Sehen Sie die Tabelle der Materialien für alle Elemente, die erforderlich, um diese Methode durchzuführen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Protocol

1. Vorbereitung

Hinweis: Dies beginnt mit dem Tag bevor die Messungen durchgeführt werden.

1. Montieren Sie den Messaufbau (Abbildung 1ein, siehe die Tabelle der Materialien).
   Hinweis: Um eine konstante und qualitativ hochwertige Stromversorgung zu gewährleisten, das Messgerät ist verbunden, der Griff über eine unterbrechungsfreie Stromversorgung (USV), die auch als Backup dienen kann. Im Falle eines Stromausfalls von langer Dauer eine Autobatterie dienen als zusätzliche Energiequelle.
2. Die Sensor-Software zu starten und anwenden einer -0,8 V Spannung N₂O Mikrosensorenpolarisieren. Das Signal zeigt eine rasante Abfahrt und eine anschließende Aufstieg, dann es schließlich sinkt, bis es niedrig und stabil ist.
   Hinweis: Der Reinstraum Hersteller empfiehlt Polarisation mindestens über Nacht (oder mehr) zur Gewährleistung der Stabilität des Sensorsignals. Eine weitere Empfehlung ist es, halten den Sensor polarisiert, wenn mehrere Messungen vorgesehen sind oder aufeinander folgenden Tagen¹⁸.
3. Schalten Sie die Inkubation Kammer und passen Sie die experimentellen Bedingungen (z.B., ausgewählte Licht ausschalten und Temperatur eingestellt, um ähnlich wie erwartet auf dem Gebiet). Stellen Sie einen Behälter mit entionisiertem Wasser im Inneren der Kammer, so dass Wasser später bei der Messtemperatur für die Kalibrierung der Sensoren zur Verfügung steht.
   Hinweis: Dieser Schritt erfolgt am selben Tag der geplanten Messungen vor dem Abflug, die Kerne zu sammeln. Für Standardmessungen ist es ratsam, dunklen Bedingungen zu verwenden.
4. Packen der Feld-Kern Sammlung Materialien: Corer Gerät, Probenahme, Rohre, Gummistopper, Polyvinylchlorid (PVC) Hähne, Schraubendreher, global positioning (GPS) Systemeinheit, Thermometer, Handheld-Echolot, Wader und Schlauchboot (siehe Tabelle der Materialien). Verwenden Sie eine Checkliste, um sicherzustellen, dass alle Materialien enthalten sind.

(2) Sediment Core-Kollektion

1. Abhängig von der Wassertiefe folgen Sie 2.1.1 oder 2.1.2.
   1. Für tiefe Gewässer
      1. Verwenden Sie ein Bote angepasst Schwerelot¹⁹ aus ein Boot oder eine Plattform (Abbildung 1e).
      2. Der Messgasleitung zu beheben (Acryl, Ø 6,35 cm, Länge ≥ 50 cm), die Corer mit einem Schraubendreher.
      3. Wählen Sie die Entnahmestelle entsprechend den Zielen der Untersuchung. Achten Sie auf die Position (z. B.mithilfe von GPS-Koordinaten) und Messtiefe (z.B.mit einem handheld Sirene). Wenn von einem Boot Probenahme, verwenden Sie einen Anker (z.B. einen Beutel mit Steinen) zu vermeiden, driften bei Core-Kollektion.
      4. Erst der Messgasleitung ~ 1 m aus dem Sediment ist bereitstellen Sie das erbohrte System. Verwenden Sie ein Seil mit regelmäßigen Marken (z.B. Abstand von 1 m) um die Tiefenposition der Probenahmegeräte steuern.
      5. Stabilisierung der Probenahmegeräte für 60 s (z. B., um die Bewegung des Bootes zu minimieren). Dadurch wird die korrekte Sediment eindringen und Wiederherstellung der kaum gestört Sedimentkern sichergestellt.
      6. Geben Sie ~ 1 m mehr Seil, so dass der Messgasleitung dringt in das Sediment. Beachten Sie, dass wenn der Messgasleitung zuviel eindringt, kann es die Wasser/Sediment-Schnittstelle stören.
      7. Lassen Sie den Messenger bei dem Versuch, die Spannung im Seil zu halten, so dass die Corer fixiert bleibt und in einer vertikalen Position. Wenn der Bote der Corer auswirkt, kann ein kleiner Unterschied in der Spannung des Seils zu spüren. Schließen Sie zu diesem Zeitpunkt die Corer um das Vakuum zu erzeugen, das für die Verwertung von Sedimentkern ermöglicht.
      8. Die Corer durch ziehen das Seil ständig und sanft zu erholen.
      9. Sobald der Kern in der Nähe der Oberfläche liegt jedoch noch ganz untergetaucht (einschließlich das Gummiteil Corer, die das Vakuum garantiert), legen Sie einen Gummistopfen am unteren Rand der Messgasleitung. Inspizieren Sie die Wasser/Sediment-Schnittstelle; Es sollte klar sein und nicht sichtlich gestört (Abbildung 1e). Wenn dies nicht der Fall ist, entsorgen Sie den Kern, reinigen Sie das Rohr zu, und wiederholen Sie die Schritte 2.1.1.4-9.
      10. Das erbohrte Gesamtsystem aus dem Wasser zu erheben. Lösen Sie der Messgasleitung aus der Corer und legen Sie eine PVC-Abdeckung auf der Oberseite. Mit Klebeband abdichten. Vermeiden Sie die Bildung des Luftraums.
   2. Für küstennahe Lebensräume und flachen Gewässer
      1. Kleid in eine Wathose für die Probenahme in sehr flachen Gewässern (< 0,6 m).
      2. Verwenden Sie Schnorcheln oder Tauchen Ausrüstung für tiefere Probenahme (bis zu 3 m).
      3. Wählen Sie die Entnahmestelle entsprechend den Zielen der Untersuchung. Achten Sie auf die Position (z.B. GPS-Koordinaten). Manuell, Einfügen der Messgasleitung (z.B.Acryl, Ø 6,35 cm) ins Sediment.
      4. Legen Sie einen Gummistopfen in die Oberseite der Messgasleitung, ein Vakuum zu erhalten.
      5. Entfernen Sie den Kern aus dem Sediment und führen Sie schnell eine andere Gummistopfen am unteren Rohr ein.
         Hinweis: Es ist notwendig, mit dem Schlauch unter Wasser zu allen Zeiten zu arbeiten; an seichten Stellen empfehlen wir das Rohr bis auf 20 cm kürzen. Manchmal das Sediment hat einen hohen Wasseranteil und Kanalisation, wenn das Rohr aus dem Sediment Bett entfernt wird. In diesem Fall ist es notwendig, den unteren Anschlag einzuführen ohne Kern außerhalb der Sediment erhebend. Um dies zu tun, manuell Tauchen Sie den Stopfen im Sediment um das Rohr und legen Sie sie sorgfältig durch, um den Boden des Röhrchens zu schließen.
      6. Ersetzen Sie aus dem Wasser die Oberseite Gummistopfen mit einer PVC-Hülle und verschließen Sie die Kreuzung mit Klebeband.
2. Schützen Sie den Kern während ihrer Übertragung an das Labor von Drehungen zu minimieren und schütteln.

3. Kalibrierung von Lachgas (N₂O) Mikrosensoren

1. Mit dem Computer (Strip Chart, Sensor-Software), überprüfen Sie, ob der Sensor Signal stabil und niedrig ist (< 20 mV).
2. Erstellen Sie eine neue Datei (z.B.mit dem Datum und der Probenahme-Website (130903_Redon_Lake)), um die Kalibrierwerte und die Sensor-Signale aufzuzeichnen.
   Hinweis: Die Sensor-Signale reagieren empfindlich auf Temperatur (Abbildung 4). Verwenden Sie die gleiche Temperatur für die Messungen und die Sensorkalibrierung. Der Sensor reagiert linear zwischen 0 % - 2,5 % N₂O²⁰. Daher ist eine zwei-Punkt-Kalibrierung ausreichend¹⁸.
3. Für die Kalibrierung Wert mit Null Lachgas, gelesen, dass das Sensorsignal halten die Sensorspitze in N₂O-freies Wasser (entionisiertem) eingetaucht.
4. Kalibrieren Sie mit N₂O Wasser auf die gewünschte Konzentration.
   Hinweis: Bereiten Sie Wasser mit einer definierten N₂O Konzentration, die die maximale Konzentration während der Inkubation erwartet leicht übertreffen. Wir verwenden ~ 25 µM N₂O als den Kalibrierwert. Beachten Sie die maximale Sensor Bereich Konzentration von 500 N₂O µM nicht zu überschreiten.
   1. Erhalten Sie N₂O-gesättigten Wasser sprudelnden N₂O in entionisiertem Wasser für ein paar Minuten.
      Hinweis: Die N₂O Wasserlöslichkeit hängt von Temperatur und Salzgehalt²¹; Siehe die Tabelle im Anhang der Sensor manuelle¹⁸.
   2. Verdünnen Sie N₂O gesättigte Wasser durch Zugabe von einem bestimmten Volumen von gesättigten N₂O Wasser auf ein Volumen von entionisiertem Wasser. Fügen Sie z. B. bei 20 ° C 0,3 mL gesättigte N₂O Wasser, das eine Konzentration von 28,7 mM N₂O, insgesamt 375 mL Wasser, einer 22.9 µM N₂O Konzentration zu erhalten. Beachten Sie, dass 375 mL ist das Gesamtvolumen der Kalibrierung Kammer (Abbildung 1b).
   3. Nach dem Mischen sanft N₂O lesen gesättigte Wasser mit entionisiertem Wasser im Behälter, um die gewünschte Konzentration zu verdünnen Kalibrierung das Sensorsignal wenn es konstant ist. Diese Lesung ist der Kalibrierwert mit X µM N₂O Wasser. Beim Mischen der Lösung achten Sie nicht erzeugen Bläschen, da dies N₂O aus der Kalibrierlösung beseitigen würde.
      Hinweis: Beachten Sie, dass der N₂O im Wasser langsam in die Luft entweicht. Somit kann die vorbereitete Kalibrierlösung nur für ein paar Minuten verwendet werden.

4. Kern Sie-Vorbereitung und Acetylen Hemmung

1. Änderung der PVC-Hülle befindet sich am oberen Rand jeder Sedimentkern durch ein weiteres Cover mit einem Loch in der Mitte und einem hängenden Magnetrührer. Wieder zur Kreuzung mit Klebeband zu verschließen.
2. Reduzieren Sie die Wasserphase jeder Probe auf eine ungefähre Höhe von 12 cm (Volumen ≈ 380 mL). Hierzu zunächst einfügen Sie ein Silikonschlauch in das zentrale Loch. Dann den Sedimentkern in einem Zylinder und schieben Sie den unteren Anschlag Druck erstellen. Die Stopper und Sedimentprobe hinauf, und das überschüssige Wasser fließt durch das Rohr. Sammeln Sie das Wasser in einem Empfänger Behälter.
   Hinweis: Proben mit grobe Granularität können während dieses Schritts problematisch sein. Trubstoffe platziert zwischen den Stopfen und das Rohr können den Stopper verformen und öffnen ein Loch durch die Luft können Luftblasen vorbei und stören die Probe. Um dieses Problem zu vermeiden, setzen Sie den Zylinder in der Mitte des unteren Anschlags und versuchen Sie, mit einer konstanten Kraft schieben. Die Fuge zwischen den Silikonschlauch verwendet, um das überschüssige Wasser zu evakuieren und die PVC-Abdeckung besteht aus einem festen Teil (z.B. eine 5 mL-Pipettenspitze ohne seinen schmalsten Ende) in den Silikonschlauch eingefügt.
3. Durchführen Sie die Acetylen-Hemmung durch sprudelnden mit Acetylen-Gas in der Wasserphase des Kerns für ca. 10 min. Vermeiden Sie resuspending Sediment.
   Hinweis: Als eine mögliche Änderung der Methode hinzufügen ein Substrat (Nitrat) durch eine konzentrierte flüssige Medium vor Blasenbildung Acetylen für potenzielle Denitrifikation Messungen (z. B., wie in Abbildung 3b, c).

(5) Denitrifikation (N₂O Anhäufung Maßnahme)

1. Füllen Sie der Luftraum in der Probe mit der vorherigen übrig gebliebene Wasser. Stellen Sie den Sensor in das Sedimentkern durch das zentrale Loch an der Oberseite PVC-Hülle. Die Spitze des Sensors sollte in der Wasserphase über die Rührer (Abbildung 1c) befinden.
   Hinweis: Alle Gelenke des Acryl Messgasleitung müssen abgedichtet werden, um Gas und Wasser Undichtigkeiten während der Messung (Abb. 1a, c) zu vermeiden. Im Unterteil des Rohres reicht der Gummistopfen dafür. Abdichtung den Oberseite Teil ist schwieriger. Die PVC-Abdeckung muss abgestimmt werden. Es muss mit einem Brenner erhitzt werden; dann, wenn das Material flexibel wird aber nicht verbrannt, ist die Abdeckung in der Röhre gelegt, so dass seine Form geformt werden kann. Nach dem Abkühlen braucht das Cover mehr Änderungen (mit Ausnahme der Deckel für den transport der Proben an das Labor in den Schritten 2.1.1.10 oder 2.1.2.6). Das zentrale Loch, wo der Sensor sitzt, muss gebohrt werden. Der Rührer kann mit einer Angelschnur, wiederum mit Kleber auf der Innenseite des Deckels eingehalten wird, so dass der Rührer an der Angelschnur im Wasser (Abbildung 1c hängt) stattfinden. Auch sind alle Gelenke (PVC Abdeckung Rohr und PVC Abdeckung Sensor) mit Klebeband verschlossen. Platzieren Sie elastische Klebeband um den Durchmesser des Sensors einstellen, um die Kontaktfläche zwischen der Mittelbohrung des PVC-Hülle und dem Sensor (Abbildung 1c) versiegeln.
2. Schalten Sie die elektromagnetische Puls-Schaltung, die das Rührsystem gehört.
   Hinweis: Das Rührsystem verhindert die Schichtung der Wasserphase ohne störende (resuspending) das Sediment. Das Rührsystem besteht aus einem Stromkreis, der Schalter ein-/Ausschalten der Elektromagnet, der zieht den Magnetrührer Veröffentlichungen (siehe die Tabelle der Materialien für eine ausführliche Beschreibung).
3. Verschieben Sie die Elektromagneten um den äußeren Teil des Acryl Rohr zu, bis die Rührer kontinuierlich bewegt, und dann fixieren sie mit Klebeband (Abbildung 1c).
4. Schließen Sie die Inkubation Kammer um eine konstante Temperatur (z.B. Variation von ±0.3 ° C) zu gewährleisten.
5. Drücken Sie die Record-Taste (Sensor-Software) zum Starten der Aufnahme des Sensorsignals. Messwerte werden in der Regel alle 5 Minuten aufgezeichnet.
6. Drücken Sie die Stop-Taste am Ende der Messperiode.

6. abschließende Messung Schritte

1. Warten Sie mindestens ~ 10 min mit der Sensorspitze in frei N₂O Wasser (entionisiertem) vor dem Lesen des Signals der Null N₂O Kalibrierung Maßnahme getaucht.
2. Durchführen Sie eine letzte Sensorkalibrierung. Hierzu wiederholt die Sensorkalibrierung, nach Abschnitt 3, aber beginnend mit Schritt 3.3.
3. Speichern Sie die Datei (Sensor-Software).

(7) Denitrifikation Berechnung

1. Beginnen Sie mit den tabellierten Ausgabedatei erzeugt durch die Sensor-Software mit dem Datensatz des Sensorsignals in mV und µM N₂O und die Kalibrierdaten.
2. Zeichnen Sie das Sensorsignal gegen die Zeit, die N₂O Anhäufung Trend (z.B. Abbildung 2eine) zu visualisieren.
3. Verwenden Sie nur den Zeitbereich mit eine lineare Akkumulation, ausgenommen der erste Akklimatisierung Zeitraum der Probe und eine möglich endgültigen Sättigung durch Substrat Einschränkung (z.B. Abbildung 2b). Erstellen Sie ein lineares Modell des Sensorsignals (µM) im Laufe der Zeit (h).
   Hinweis: Die Steigung ist die Denitrifikation (µM N₂O core^-1 h^-1), die, wenn geteilt durch die Fläche des Kerns (πr²), verwandelt sich die Rate in µM N₂O m^-2 h^-1, und wenn multipliziert mit der Wasservolumen (πr²h, wo h ist die Höhe der Wasserphase und r ist der innere Radius des Rohres Acryl, in diesem Fall 0,12 m und 0,03175 m, beziehungsweise) verwandelt sich die Rate in µmol N₂O m^-2 h^-1.

Representative Results

Insgesamt 468 Denitrifikation Preise wurden anhand des Protokolls über in den Sedimenten aus Pyrenäen Bergseen im Zeitraum 2013-2014 geschätzt. Wir zeigen einige dieser Ergebnisse beschreiben die Verfahren (Abbildung 2 und Abbildung 3). Im Allgemeinen hat das lineare Modell zwischen der N₂O Konzentration und Zeit gute Korrelation (R² ≥ 0,9). Die Neigung der Beziehung stellt eine Schätzung der Denitrifikation (Schritt 7.3; z. B. Abbildung 2d). Wenn die Denitrifikation Aktivität sehr gering ist, elektronische Sensorrauschen wird immer wichtiger und die Anpassungsgüte sinkt (z.B.Sensoren, 4 und 5 in Abbildung 2 b und Abbildung 3a). Obwohl die Grundlinie Nachweisgrenze von N₂O ~0.1 µM im Wasser²², ist das Zwischenprodukt ist Wert über Alternativmethoden²³, die Möglichkeit Anhäufung Tausender von kontinuierlichen Messungen um den Lärm zu filtern erlaubt Schätzungen bei relativ niedrigen Denitrifikation Raten bis zu ~ 1 µmol N₂O m^-2 h^-1 (Abbildung 2 und Abbildung 3). Niedrigere Preise (d. h. ~0.4 µmol N₂O m^-2 h^-1) durch die Verengung der Wasserphase von der Bohrkern bis zu einer Höhe von 8 cm geschätzt werden kann (siehe Protokoll Schritt 4.2).

Abbildung 2 : Denitrifikation Berechnungen in einem Temperatur-Abhängigkeit-Experiment. Actual (a und b) und potenzielle Denitrifikation Messungen (c–f) werden angezeigt. Wenn die Temperatur der Messung ist verminderte (c), auf den ersten, die die Probe kühlt und das Sensorsignal, das temperaturabhängig ist, lehnt ab. (ein) A ähnliches Ereignis tritt zu Beginn der Inkubation bei der Messung der tatsächlichen Denitrifikation. die wärmere Laborumgebung in Bezug auf den Inkubationsbedingungen produziert eine Kühlung der Probe, wieder begleitet von einem Rückgang des Sensorsignals. (e) wenn die Temperatur erhöht, auf den ersten Proben warm und das Sensorsignal exponentiell statt linear steigt. Wenn die Proben eine konstante Temperatur erreichen, erhöht das Sensorsignal linear wie üblich. In allen Fällen ist es möglich, die Denitrifikation Preise zu berechnen, nur durch die Verwendung der Periode der linearen N₂O Akkumulation (b, dund f). (b) inaktiv-Probe 3 wird nicht angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3 : Beispiele der Denitrifikation bewerten Berechnungen. Actual (ein) und potenzielle (b und c) Denitrifikation Preise wurden geschätzt. Wir haben nur den Zeitraum mit einer linearen N₂O Anhäufung der Denitrifikation (Steigung des linearen Modells) zu berechnen. Jedoch ineinemfür pädagogische Zwecke, wir zeigen alle Messungen (Modelle) mit mehr und weniger Erfolg; Wir würden Probe 3 aufgrund der hohen Instabilität des Sensors und der Probe 2 aufgrund der Sättigung in der N₂O Anhäufung verwerfen. (ein) Proben 4 und 5 mit Raten von 0,5 und 0,7 µmol N₂O m^-2 h^-1, bzw. sind Fälle von Messungen in der Nähe der Nachweisgrenze der Methode. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Die wichtigsten Vorteile des beschriebenen Verfahrens sind die Verwendung von minimal gestört Sedimentproben Kern und die kontinuierliche Aufzeichnung der N₂O Anhäufung. Diese erlauben Schätzung der relativ niedrigen Denitrifikation raten, die wahrscheinlich sind ähnlich wie die auftretenden in Situ. Dennoch werden einige Aspekte in Bezug auf die Entkernung, Sensor-Performance und Verbesserungsmöglichkeiten diskutiert.

Ein scheinbar einfacher, aber wichtiger Schritt des Verfahrens ist die Wiederherstellung der guten Kern. Das Sediment/Wasser-Grenzfläche muss drei Kriterien erfüllen: (i) keine Änderung in seiner konstituierenden oder chemische Zusammensetzung, (Ii) keine Veränderung in der Wassergehalt oder Hohlraumanteil und (Iii) keine Struktur Pertubation²⁴. Weniger Störungen, die von der Probe während das gesamte Protokoll, die realistischer und genauer in Situ Bedingungen Willen erlitten die gemessenen Denitrifikation sein. Es gibt verschiedene Geräte/Techniken für das Sediment Kern Kollektion²⁵, und ihre Auswahl hängt von der Wassertiefe. Wir verwenden ein Bote angepasst Schwerkraft Corer¹⁹ für tiefe Proben (Abbildung 1e), weil es ein relativ leichtes Gerät ist und schnell, kurze Kerne^{25 wiederherstellen kann} (ein Kern Sediment ≥10 cm Länge ist mehr als genug zu umfassen die oxischen und denitrifizierenden Schichten der Sedimente^26,27,28). In Kernbohrungen Jargon, "fühlen" werden oft als die Fähigkeit, den Speicherort der die Corer kennen (ob es immer noch in der Wassersäule oder bereits im Sediment) und ob es offen oder geschlossen²⁵. Für mittlere Wassertiefen (5-50 m) gibt in der Regel es keine Schwierigkeiten mit Gefühl. Ein Verlust des Gefühls tritt in tieferes Wasser (> 50 m) weil die Bewegungen der Wassersäule die Lage der Corer²⁵verdecken können. Gefühl kann auch im seichten Wasser verloren (< 3 m) durch seitliche Drift und Welle Aktion²⁵; Deshalb verwenden wir eine andere Methode im flachen Wasser, entweder direkte manuelle Kernbohrungen durch Tauchen oder dressing in einen Watvogel. Mit diesem System kann die Person, die die Probenahme das Sediment zu sehen und wählen Sie den genauen Ort vor der Entkernung; Dies ermöglicht z.B.die Entnahme von einem Sedimentkern, die eine Wasserpflanzen enthält. Nach der Probenahme, muss die Forscher weiterhin sorgfältig zu arbeiten, um minimal Kern Sedimentprobe stören den weiteren Verlauf des Protokolls, insbesondere bei Acetylen-Hemmung durch Blasenbildung.

Einige Details müssen bei N₂O Mikrosensoren mit berücksichtigt werden. Die Sensor-Software bietet eine kontinuierliche Visualisierung (Strip Chart) der Sensor Signal (Hintergrund Frequenz von 1000 Hz)²⁹. Diese Rohdaten und die Streifen-Diagramm (z.B. Abbildung 2eine) können gespeichert werden. Es ist notwendig, das richtige Verhalten des Sensors nach seine Polarisation (z. B.bei der Rückkehr von Feldauflistung vor Schritt 4) zu überprüfen. Insbesondere eine niedrige (< 20 mV) und konstante Basis-Signal wird erwartet, wenn es in N₂O-freie Wasser untergetaucht ist. Kalibrieren Sie den Sensor kurz (~ 2 h) nach dem Start seiner Verwendung; Wenn sie bereits für einige Tage verwendet wurde, kann das Intervall (~ 24 h)¹⁸erweitert werden. Zur Minimierung von Rekalibrierungen halten Sie den Sensor polarisiert, wenn es nicht für mehrere Tage¹⁸verwendet wird. Im Laufe der Zeit auftreten eine Änderung in das Sensorsignal, bis zu 50 % in Monaten, die durch eine unterschiedliche Durchlässigkeit der Membran¹⁸. Je niedriger die elektronische Störungen im Labor, die weitere konstante und stabil wird das Sensorsignal. In diesem Sinne verbessert Einsatz einer USV die Qualität der elektrischen Energie, die das Messgerät durch Spannungsschwankungen Filtern erreicht. Das Abtastintervall, ausgewählt in der Registerkarte "Logger" unterscheidet sich von der Hintergrund-Frequenz. Jeder registrierte Punkt vom Mittelwert aus vielen Messungen erzeugt. Das Abtastintervall (bis zu 10 s) gibt die Häufigkeit, mit der ein Datenpunkt aufgenommen. Die Anzahl der Messungen pro Maßeinheit der Zeit im Durchschnitt verwendet wird durch die Hintergrund-Frequenz-²⁹definiert. Zum Beispiel, wenn man eine Abtastfrequenz von 5 s und einer Hintergrund-Frequenz von 500 Messungen pro Sekunde, dann die Punkte sind Daten erfasst alle 5 s und dem Durchschnitt von 500 Samples pro Sekunde wird gemessen, während der vorherige 5 s. Wir erfassen das Sensorsignal alle 5 min. (Samplingintervall) und stellen Sie die Hintergrund-Frequenz zu 1000 Messungen pro Sekunde. Das Studiensystem muss bekannt sein, um die richtige Samplingintervall auszuwählen, ohne "durchschnittlich" erwarteten Schwankungen. In hochaktive Systeme sind kurze Probenahme Abständen empfohlen, während längere Intervallen ermöglichen Optimierung des Computers Speicher²⁹. Einige möglichen Störsubstanzen (H₂S, NO und CO₂) können der N₂O Sensor Signal²²beeinflussen. Der Sensor ist mit entionisiertem Wasser kalibriert, aber die Proben können störende Substanzen enthalten und ändern des Sensors Referenzsignal. Diese Situation könnte erklären, warum negative Werte in Proben 2 und 5 in Abbildung 2 b und Abbildung 3a, bzw. angezeigt werden. Wenn das Ziel ist es, die Schätzung der Denitrifikation, ist jedoch die genaue Höhe der N₂O nicht der entscheidende Parameter. Entscheidend ist die Steigung des linearen Modells (über eine lineare Ansammlung von N₂O). Schließlich ist es notwendig, mit einer fest eingestellten Temperatur zu arbeiten, weil die Reaktion des Sensors N₂O ändert sich mit der Temperatur (Abbildung 4).

Einfache Änderungen oder Ergänzungen des Protokolls ermöglichen auch (i) Charakterisierung der Umweltbedingungen steuern die gemessenen Denitrifikation Preise, (Ii) Abschätzung der potenziellen Denitrifikation Raten durch die Simulation der Reaktion auf eine treibende Steigung (z.B. Nitrat), und (Iii) Schätzung der Sediment N₂O Emissionsraten durch das Auslassen der C₂H₂ Hemmung abhängig von der Studie zielt darauf ab, mehrere ergänzende Messungen vorgenommen werden können: (i) nur nach der Wiederherstellung der Kern, in Situ -Bedingungen, z.B., Temperatur; (Ii) vor der Messung, Proben der Wasserphase, z. B.[Nr.₃^–]; und (Iii) nach der Messung, Extrusionen und Scheiben des Kerns in verschiedenen Auflösungen (mm-cm)^25,30, der wie folgt erklärt durch P. T. Schwing Et Al. ³⁰.

Um die potenziellen Denitrifikation messen, Nitrat hinzufügen der Wasserphase des Kerns (z. B. Abbildung 2 und Abbildung 3) wie in C. Palacin-Lizarbe, L. Camarero und J. Katalanisch¹⁷beschrieben. Wenn dies tun, fügen Sie das Nitrat vor der C-₂H-₂ -Hemmung (Schritt 4.3). Auch, wenn Nitrat hinzugefügt wird, ist es ratsam, auch hinzufügen, Kohlenstoff (C; z.B. Acetat) und Phosphor (P), die in Situ stöchiometrische Anteile von C, N und P (z. B.in der Oberfläche Sediment) beizubehalten. Dadurch wird verhindert, dass die Begrenzung der Denitrifikation durch diese Elemente^31,32, und halten auch das C/N-Verhältnis, das die Dominanz des Nitrat-Verbrauch-Prozesses (d. h. Denitrifikation beeinflussen können im Vergleich zu dissimilatory Nitratreduktion zu Ammonium (DNRA))⁴. Sauerstoffmangel kann durch sprudelt eine N₂-CO₂ Mischung für ein paar Minuten nach der Zugabe von Nitrat, Sauerstoff mit Denitrifikation Störungen behoben werden; Beachten Sie jedoch, dass dies zu einer Verstopfung der Nitrifikation führt. Um Sediment N₂O Emissionsraten berechnen, lassen Sie die C₂H₂ Hemmung (Schritt 4.3). Denken Sie jedoch daran, dass, soweit es in aquatischen Ökosystemen derzeit bekannt ist, N₂O-Emissionen proportional gering im Vergleich zu N₂ Emissionen (0-4,3 %)^{33 sind}, so ist es möglich, dass der kumulierte N₂O unten werden die Nachweisgrenze. Wenn dies der Fall ist, ist das eine Option hinzufügen Nitrat um die emittierten N₂O, Berechnung der potenziellen N₂O Emissionen zu erhöhen.

Die größte Schwäche der Methode ist die Hemmung der Nitrifikation von C₂H₂^10,34. Während der Inkubation können diese Hemmung der Nitrifikation und die unvollständige Hemmung der N₂O Reduzierung ersichtlich, werden da beide sehr zeitabhängig sind. Zum Beispiel muss N₂O Anhäufung Ausgangspreis offenbaren die wahre Denitrifikation Rate und schrittweise zerfallen wie die Nitrat-Verfügbarkeit sinkt und N₂O in die Nitrat-freie-Zone diffundiert, wo es reduzierte³⁵ist. Daher kann eine geschätzte Denitrifikation Rate nur gültig, wenn die Messwerte eine lineare Ansammlung von N₂O^{10 zeigen}angesehen werden.

Die beschriebene Methode schätzt eine Denitrifikation Rate pro Fläche, die die gesamte Sediment Aktivität integriert. In dieser Hinsicht gibt es gewisse Unsicherheit über den Aktionsradius der Acetylen-Hemmung, wenn das Gas in der wässrigen Phase der Probe sprudeln. Es wird angenommen, dass zumindest Hemmung der surficial Schicht des Sediments die derjenige mit der höchsten Denitrifikation Preise^{26,27 tritt}.

Mögliche Verbesserungen für diese Methode sind die kombinierten Einsatz mit ¹⁵N Tracer und Änderungen, die die Messung der Denitrifikation in Situermöglichen könnte. ¹⁵ N-Tracer-Methoden können verwendet werden, zu bestimmen, den Anteil der Nitrifikation-Denitrifikation Kopplung auftreten in den Proben³⁶, und es kann auch andere N Flussmittel Prozesse neben der Denitrifikation entfallen (z.B., Anammox und dissimilatory Nitratreduktion zu Ammonium (DNRA))^13,37. Diese Methoden haben jedoch den Nachteil der Substrat-Konzentration-¹⁰zu ändern. A. Behrendt, D. de Beer und s. Stief ²⁶ verwenden eine Kombination von N₂O Mikrosensoren, C-₂H-₂ -Hemmung und ¹⁵N Tracer Methode um die vertikale Aktivitätsverteilung der dissimilatory Nitratreduktion zu analysieren Prozesse (Denitrifikation und DNRA) in Sedimenten. Sie machten Vertikalprofile im Sediment dringt das Sediment mit den Sensoren. Die größte Schwierigkeit bei der Denitrifikation in Situ Messung ist die Fähigkeit, eine Ansteigen der Temperatur Umgebung zu behandeln. Es ist notwendig, der N₂O Anhäufung und Temperatur gleichzeitig aufnehmen und dann die N₂O Sensorsignal korrigieren, indem die Temperaturabhängigkeit während der Denitrifikation Berechnung. Diese Korrektur erfordert eine vorherige Analyse der Temperaturabhängigkeit des Signals N₂O für jeden Sensor. Die Sensoren sind handgefertigt, und jeder reagiert anders auf Temperatur (z. B.Sensor 1 zeigt eine höhere Temperatur-Abhängigkeit als die anderen in Abbildung 2c, e).

Abbildung 4 : Temperaturabhängigkeit der N₂O Mikrosensor Antwort. Die unterschiedlichen Steigungen des linearen Modells von dem Sensor Signal im Vergleich zeigt die Temperatur bei jeder N₂O Konzentration der Temperatureinfluss auf die Sensor-Signal. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Messenger-adapted gravity corer	-	-	Reference in the manuscript. Made by Glew, J.
Sampling tube	-	-	Acrylic. Dimensions: 100 cm (h) × 6.35 cm (d) × 6.50 cm (D). Sharpen the edge of the sampling tube that penetrates into the sediment to minimize the disturbance in the recovered sediment core sample.
Handheld sounder	Plastimo	38074	Echotest II Depth Sounder.
Rubber stopper	VWR	DENE1012114	With two holes, used to mix the N2O-water in the calibration chamber. Dimensions: 20 mm (h) × 14 mm (d) × 18 mm (D) (3 mm hole (D)).
Rubber stopper	VWR	217-0125	To seal the bottom part of the methacrylate tube and to sample in shallow water bodies. Dimensions: 45 mm (h) × 56 mm (d) × 65 mm (D).
Rubber stopper	VWR	217-0126	Place the rubber stopper in the top side of the sampling tube to obtain a vacuum for sampling in littoral zones and shallow water bodies. Dimensions: 50 mm (h) x 60 mm (d) x 70 mm (D).
PVC cover	-	-	To seal the top side part of the acrylic tube. Dimensions: 45 mm (h) × 56 mm (d) × 65 mm (D). Dimensions: 65 mm (D).
Adhesive tape	-	-	Waterproof. To ensure all joints (PVC cover sampling tube and PVC cover sensor) and to avoid water leaks.
Thermometer	-	-	Portable and waterproof, to measure the temperature in the water overlying the sediment just after sampling the cores.
GPS	-	-	To save the location of a new sampling site or to arrive at a previous site.
Wader	-	-	For littoral or shallow site samplings.
Boat	-	-	An inflatable boat is the best option for its lightness if the sampling site is not accessible by car.
Rope	-	-	Rope with marks showing its length (e.g., marked with a color code to distinguish each meter).
N2O gas bottle and pressure reducer	Abelló Linde	32768-100	Gas bottle reference.
C2H2 gas bottle and pressure reducer	Abelló Linde	32468-100	Gas bottle reference.
Tube used to evacuate the excess of water	-	-	Consists of a solid part (e.g., a 5 ml pipette tip without its narrowest end) inserted in a silicone tube.
Nitrous Oxide Minisensor w/ Cap	Unisense	N2O-R	We use 4 sensors at a time.
Microsensor multimeter 4 Ch. 4 pA channels	Unisense	Multimeter	Picoammeter logged to a laptop. The standard device allows for 2 sensor picoammeter connections (e.g., N2O sensor), one pH/mV and a thermometer. We ordered a device with four picoammeter connections, allowing the use of 4 N2O sensors simultaneously.
SensorTrace Basic 3.0 Windows software	Unisense		Sensor data acquisition software.
Calibration Chamber incl. pump	Unisense	CAL300	Calibration chamber. We tuned it with rubber stoppers and syringes to mix the N2O-water without making bubbles.
Incubation chamber	Ibercex	E-600-BV	Indispensable equipment for working at a constant temperature (±0.3 °C). It also allows control of the photoperiod.
Electric stirrer	-	-	Part of the stirring system. It hangs in the water, overlying the sediment subject, by a fishing line that is hooked to the PVC cover.
Electromagnet	-	-	Part of the stirring system. It is fixed to the outside of the acrylic tube, approximately at the same level as the stirrer. It is activated episodically (ca. 1 on-off per s) by a circuit, attracting the stirrer when it is on and releasing it when it is off, thereby generating the movement that agitates the water.
Electromagnetic pulse circuit	-	-	Part of the stirring system. It is connected by wires to the electromagnet and sends pulses of current that turn the electromagnet on and off.
Uninterruptible power supply (UPS)	-	-	It improves the quality of the electrical energy that reaches the measurement device, filtering the highs and low of the voltage, thereby ensuring a more constant and stable N2O sensor signal.