Estimando taxas de desnitrificação do sedimento usando núcleos e N₂O Microssensores

Summary

Este método estima taxas de desnitrificação do sedimento em núcleos de sedimentos usando os acetileno inibição técnica e microsensor medições de acumulada N₂O. O protocolo descreve procedimentos para a recolha dos núcleos, calibrando os sensores, realizando a inibição de acetileno, medindo o acúmulo de N₂O e cálculo da taxa de desnitrificação.

Abstract

Desnitrificação é o processo biogeoquímico primário remover nitrogênio reativo da biosfera. A avaliação quantitativa deste processo tornou-se particularmente relevante para avaliar o ciclo do azoto global antropogênico-alterado e a emissão de gases de efeito estufa (ou seja, N₂O). Vários métodos estão disponíveis para medir a desnitrificação, mas nenhum deles é completamente satisfatório. Problemas com os métodos existentes incluem sua sensibilidade insuficiente, e a necessidade de modificar os níveis de substrato ou alterar a configuração física do processo, usando amostras de perturbado. Este trabalho descreve um método para estimar taxas de desnitrificação do sedimento que combina a retirada do dielétrico, inibição de acetileno e medições de microsensor do acumulado de N₂O. As principais vantagens deste método são uma baixa perturbação da estrutura de sedimentos e a coleção de um registro contínuo de acumulação de N₂O; Estes permitem estimativas das taxas de desnitrificação confiável com valores mínimos até 0,4-1 µmol N₂O m^-2 h^-1. A capacidade de manipular os fatores-chave é uma vantagem adicional para a obtenção de conhecimentos experimentais. O protocolo descreve procedimentos para a recolha dos núcleos, calibrando os sensores, realizando a inibição de acetileno, medindo o acúmulo de N₂O e cálculo da taxa de desnitrificação. O método é adequado para estimar taxas de desnitrificação em qualquer sistema aquático com núcleos de sedimentos recuperáveis. Se a concentração de₂O N está acima do limite de detecção do sensor, a etapa de inibição de acetileno pode ser omitida para estimar a emissão de₂O N em vez de desnitrificação. Mostramos como estimar as duas taxas de desnitrificação reais e potenciais, aumentando a disponibilidade de nitrato, bem como a dependência da temperatura do processo. Podemos ilustrar o procedimento usando sedimentos lacustres de montanha e discutir as vantagens e pontos fracos da técnica em comparação com outros métodos. Esse método pode ser modificado para fins particulares; por exemplo, pode ser combinada com ¹⁵N marcadores para avaliar nitrificação e desnitrificação ou campo em situ medições das taxas de desnitrificação.

Introduction

Alterações antropogénicas do ciclo do azoto é um dos problemas mais desafiadores para o sistema de terra¹. Actividade humana pelo menos duplicou os níveis de nitrogênio reativo disponível para a Biosfera². No entanto, persistem grandes incertezas sobre como o ciclo global de N é avaliado. Algumas estimativas de fluxo estar quantificadas com menos de ± 20% de erro, e muitos têm incertezas de ± 50% e maior³. Estas incertezas indicam a necessidade de estimativas precisas das taxas de desnitrificação em ecossistemas e uma compreensão dos mecanismos subjacentes de variação. Desnitrificação é uma atividade microbiana através do qual os óxidos nitrogenados, principalmente nitrato e nitrito, são reduzidos a gases de dinitrogênio, N₂O e N₂⁴. O caminho é altamente relevante para a disponibilidade de Biosfera de nitrogênio reativo porque é o principal processo de remoção⁵. N₂O é um gás com efeito de estufa com um potencial de aquecimento quase 300 vezes que de CO₂ , mais de 100 anos e é a atual das principais causas de depleção do ozônio estratosférico devido as grandes quantidades sendo emitido^6,7.

A seguir, apresentamos um protocolo para estimar taxas desnitrificação sedimentos usando núcleos e N₂O Microssensores experimentalmente (Figura 1). Taxas de desnitrificação são estimadas usando o acetileno inibição método^8,9 e medições da acumulação de N₂O durante um período definido (Figura 2 e Figura 3). Demonstramos o método por aplicá-la aos sedimentos do Lago de montanha. Este estudo de caso destaca o desempenho do método para detectar taxas relativamente baixas, com o mínimo de perturbação para a estrutura física dos sedimentos.

Desnitrificação é particularmente difícil de medir¹⁰. Existem várias abordagens alternativas e métodos, cada um com vantagens e desvantagens. Desvantagens de métodos disponíveis incluem o uso de recursos caros, sensibilidade insuficiente e a necessidade de modificar os níveis de substrato ou alterar a configuração física do processo usando amostras perturbado¹⁰. Um desafio ainda mais fundamental para medir N₂ é seus níveis elevados de plano de fundo do ambiente¹⁰. A redução de N₂O para N₂ é inibida por acetileno (C₂H₂)^8,9. Assim, a desnitrificação pode ser quantificada medindo a acumulada N₂O na presença de C₂H₂, que é viável devido aos baixos níveis de₂O ambientais N.

O uso de C₂H₂ para medir as taxas de desnitrificação em sedimentos foi desenvolvido há 40 anos,¹¹e a incorporação de sensores de N₂O ocorreram cerca de 10 anos mais tarde,¹². A abordagem mais amplamente aplicada baseada em acetileno é o núcleo"estático". O acumulado de N₂O é medido durante um período de incubação de até 24 h após o C₂H₂ é adicionado para o headspace do sedimento selado núcleo¹⁰. O método descrito aqui segue este procedimento com algumas inovações. Nós adicionamos o C₂H₂ por borbulhamento do gás na fase água do núcleo por alguns minutos, e estamos a encher todo o headspace antes de medir a acumulação de N₂O com um microsensor. Incluímos também um sistema de agitação que impede que a estratificação da água sem resuspending do sedimento. O procedimento quantifica a taxa de desnitrificação por área de superfície de sedimentos (por exemplo, µmol N₂O m^-2 h^-1).

A alta variação espacial e temporal de desnitrificação apresenta outra dificuldade na sua quantificação exata¹⁰. Geralmente, acúmulo de N₂O é medido sequencialmente por cromatografia de amostras de headspace que são coletados durante a incubação. O método descrito fornece monitoramento melhorado da Variação temporal da acumulação N₂O, porque o microsensor fornece um sinal contínuo. O microsensor multímetro é um amplificador digital microsensor (picoammeter) que faz interface com os sensores e o computador (Figura 1um). O multímetro permite que vários N₂O Microssensores ser usado ao mesmo tempo. Por exemplo, até sedimentos de quatro núcleos da mesma área de estudo podem ser medidos simultaneamente para dar conta da variabilidade espacial.

A abordagem de núcleo mal perturba a estrutura de sedimentos em comparação com outros métodos (por exemplo, lamas). Se a integridade dos sedimentos é alterada, isso leva a desnitrificação irrealista taxas¹³ que só são adequados para comparações relativas. Taxas mais elevadas são sempre obtidas com métodos de chorume em comparação com métodos de núcleo¹⁴, porque o último preserva a limitação de desnitrificação por substrato difusão¹⁵. Medidas de chorume não podem ser consideradas representativo de em situ taxas¹⁶; Eles fornecem medidas relativas para comparações feitas com o mesmo procedimento exato.

O método descrito é adequado para estimar taxas de desnitrificação em qualquer tipo de sedimento que pode ser retirado o núcleo. Recomendamos especialmente o método para a realização de manipulações experimentais de alguns dos factores de condução. Exemplos são as experiências que modificam a disponibilidade de nitrato e temperatura conforme necessário para estimar a ativação de energia (E_um) de desnitrificação¹⁷ (Figura 2).

Figura 1 : Instalação experimental. (um) geral instalação experimental para estimar taxas de desnitrificação do sedimento usando N₂O Microsensores e núcleos. A câmara de incubação assegura condições de escuridão e de temperatura controlada (± 0,3 ° C). Cinco núcleos de sedimento intacto podem ser processados simultaneamente, usando seus respectivos sensores de₂O N. (b) N₂O câmara de calibração de sensor. Adaptamos com rolhas de borracha e seringas para misturar o N₂O água (ver protocolo passo 3.4.3). Há um termômetro para controlar a temperatura da água. (c) close-up de uma amostra de sedimentos com o sensor inserido no orifício central da tampa do PVC e as articulações seladas com fita adesiva. O agitador está na água, e o eletroímã é muito perto e fixo para a parte externa do tubo de acrílico. (d), close-up da N₂O microsensor ponta protegida por um pedaço de metal. (e) um núcleo de sedimentos que só foi recuperado. Isso foi amostrado de um barco em um lago profundo; o tubo de acrílico com o núcleo ainda é fixo ao mensageiro-adaptado de gravidade corer¹⁹. Consulte a Tabela de materiais para todos os itens necessários para executar este método. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

1. preparação

Nota: Isto começa no dia antes as medições.

1. Montar a instalação de medição (Figura 1um, consulte a Tabela de materiais).
   Nota: Para garantir uma alimentação constante e de alta qualidade, o dispositivo de medição está conectado para o aperto através de uma fonte de alimentação ininterrupta (UPS) que também pode atuar como um backup. No caso de uma falha de energia de longa duração, uma bateria de carro servir como uma fonte de energia extra.
2. Inicie o software do sensor e aplicar um-0.8 V tensão de polarizar o N₂O Microssensores. O sinal mostra uma descida rápida e um subsequente aumento e, em seguida, ela finalmente diminui até baixa e estável.
   Nota: O fabricante microsensor recomenda polarização pelo menos durante a noite (ou mais) para garantir a estabilidade do sinal do sensor. Outra recomendação é manter o sensor polarizado se as medições são planejadas para múltiplas ou dias consecutivos¹⁸.
3. Ligue a câmara de incubação e ajustar as condições experimentais (por exemplo, luz selecionada e temperatura programada para ser semelhante ao esperado no campo). Coloque um recipiente com água desionizada dentro da câmara para que a água está disponível, mais tarde, a temperatura de medição para a calibração dos sensores.
   Nota: Este passo pode ser feito no mesmo dia das medidas planejadas, antes da partida para coletar os núcleos. Para medições padrão, é aconselhável usar condições escuras.
4. Embalar o núcleo campo coleção materiais: dispositivo de corer, tubos, rolhas de borracha, torneiras de cloreto de polivinila (PVC), chave de fenda, unidade de sistema (GPS) posicionamento global, termômetro, sonda portátil, wader e barco inflável de amostragem (ver a tabela de de Materiais). Use uma lista de verificação para garantir que todos os materiais estão incluídos.

2. sedimento Core Collection

1. Dependendo da profundidade da água, siga 2.1.1 ou 2.1.2.
   1. Para corpos de águas profundas
      1. Use uma sonda de gravidade mensageiro-adaptado¹⁹ de um barco ou uma plataforma (Figura 1e).
      2. Fixar o tubo de amostragem (acrílico, ø 6,35 cm, comprimento ≥ 50 cm) para a sonda com uma chave de fenda.
      3. Selecione o ponto de amostragem de acordo com os objectivos de investigação. Tome nota da posição (por exemplo, usando as coordenadas GPS) e profundidade de medição (por exemplo, usando uma sonda portátil). Se a amostragem de um barco, use uma âncora (por exemplo, um saco com pedras) para evitar a deriva durante a coleta de núcleo.
      4. Implante o sistema de retirada do dielétrico até o tubo de amostragem é ~ 1 m do sedimento. Use uma corda com marcas regulares (por exemplo, intervalos de 1 m) para controlar a posição de profundidade do equipamento de amostragem.
      5. Estabilizar o equipamento de amostragem por 60 s (por exemplo, para minimizar o movimento do barco). Isso garantirá a penetração correta de sedimentos e recuperação de um núcleo de sedimento mal perturbado.
      6. Versão m ~ 1 corda mais que o tubo de amostragem penetra o sedimento. Esteja ciente de que, se o tubo de amostragem penetra demais, isso pode perturbar a interface água/sedimento.
      7. Libere o mensageiro enquanto tenta manter a tensão na corda para que a sonda permanece fixa e na posição vertical. Quando o mensageiro impacta a sonda, uma pequena diferença pode ser sentida na tensão da corda. Naquela época, feche a sonda para gerar o vácuo que permite a recuperação do núcleo do sedimento.
      8. Recupere a sonda, puxando a corda constantemente e suavemente.
      9. Uma vez que o núcleo está perto da superfície, mas ainda totalmente submersa (incluindo a parte de borracha da sonda que garante o vácuo), coloque uma rolha de borracha na parte inferior do tubo de amostragem. Inspecionar a interface água/sedimento; deve ser clara e não visivelmente perturbado (Figura 1e). Se isso não for o caso, descarte o núcleo, limpe o tubo e repita etapas 2.1.1.4-9.
      10. Elevar a todo o sistema de retirada do dielétrico da água. Solte o tubo de amostragem da sonda e colocar a cobertura de PVC na parte superior. Selá-lo com fita adesiva. Evite a formação de espaço aéreo.
   2. Para habitats ribeirinhos e corpos d'água rasos
      1. Vestido em um wader para amostragem em águas muito rasas (< 0,6 m).
      2. Use o snorkeling ou mergulho da engrenagem para amostragem mais profunda (até 3 m).
      3. Selecione o ponto de amostragem de acordo com os objectivos de investigação. Tome nota da posição (por exemplo, coordenadas GPS). Manualmente, insira o tubo de amostragem (por exemplo, de acrílico, ø 6,35 cm) para o sedimento.
      4. Coloque uma rolha de borracha no lado superior do tubo de amostragem para obter um vácuo.
      5. Retire o núcleo do sedimento e rapidamente introduzir outra rolha de borracha na parte inferior do tubo.
         Nota: É necessário trabalhar com o tubo debaixo d'água em todos os momentos; em locais muito superficiais, recomendamos encurtar o tubo para baixo a 20 cm. Às vezes, o sedimento tem um alto teor de água e drenos quando o tubo é retirado da cama de sedimentos. Neste caso, é necessário introduzir o bujão inferior sem edificante o núcleo fora do sedimento. Para fazer isso, manualmente, mergulhe a rolha no sedimento ao redor do tubo e colocá-lo cuidadosamente para fechar o fundo do tubo.
      6. Fora da água, substituir a rolha de borracha para a superfície com uma tampa de PVC e selar a junção com fita adesiva.
2. Protege o núcleo durante a sua transferência para o laboratório, minimizando as rotações e a tremer.

3. calibração de Microssensores o óxido nitroso (N₂O)

1. Usando o computador (gráfico de strip-tease, software do sensor), verifique se o sinal do sensor é estável e baixa (< 20 mV).
2. Crie um novo arquivo (por exemplo, com a data e o local de amostragem (130903_Redon_Lake)) para gravar os valores de calibração e sinais do sensor.
   Nota: Os sinais do sensor são sensíveis à temperatura (Figura 4). Use a mesma temperatura para as medições e a calibração do sensor. O sensor responde linearmente entre 0% - 2,5% N₂O²⁰. Portanto, uma calibração de dois pontos é suficiente¹⁸.
3. Para a calibração valor com zero de óxido nitroso, ler o sinal do sensor mantendo a ponta do sensor submersed na N₂O-livre de água (água deionizada).
4. Calibre com N₂O água na concentração desejada.
   Nota: Prepare a água com uma concentração de₂O N definida, que será ligeiramente superior a concentração máxima prevista durante a incubação. Nós usamos ~ 25 µM N₂O como o valor de calibração. Estar ciente de não exceder a concentração de gama sensor máxima de 500 N₂O µM.
   1. Obter N₂O saturados de água borbulhante N₂O em água desionizada por alguns minutos.
      Nota: A solubilidade em água N₂O depende da temperatura e salinidade²¹; consulte a tabela no apêndice do manual sensor¹⁸.
   2. Dilua a N₂O saturado água pela adição de um determinado volume de saturados N₂O água a um volume de água desionizada. Por exemplo, a 20 ° C, adicione 0,3 mL de N₂O água saturada, que tem uma concentração de 28,7 mM N₂O, para um total de 375 mL de água para obter uma concentração de O₂de N 22,9 µM. Nota que 375 mL é o volume total da câmara de calibração (Figura 1b).
   3. Após a mistura delicadamente o N₂O água saturada com água desionizada no vaso calibração para diluí-la para a concentração desejada, ler o sinal do sensor quando é constante. Esta leitura é o valor de calibração com água de₂O X µM N. Ao misturar a solução, tenha cuidado para não gerar bolhas, como isto eliminaria N₂O a partir da solução de calibração.
      Nota: Esteja ciente de que o N₂O na água lentamente vai escapar para o ar; assim, a solução de calibração preparado só pode ser usada por alguns minutos.

4. núcleo de preparação e inibição de acetileno

1. Mudança da tampa de PVC localizada no topo de cada núcleo de sedimentos por outra capa com um buraco no centro e um agitador magnético pendurado. Re-Sele a junção com fita adesiva.
2. Reduzir a fase de cada amostra de água a uma altura aproximada de 12 cm (volume ≈ 380ml). Para isso, primeiro inserir um tubo de silicone no furo central. Em seguida, colocar o núcleo de sedimentos em um cilindro e empurre a tampa inferior para criar pressão. A rolha e a amostra de sedimento subir, e o excesso de água passa através do tubo. Colete a água em um navio recebedor.
   Nota: Amostras com granularidade grossa podem ser problemáticas durante esta etapa. Partículas de sedimento colocadas entre a rolha e o tubo podem deformar a rolha e abra um buraco através do qual ar bolhas podem passar e perturbar a amostra. Para evitar esse problema, coloque o cilindro no centro da rolha a fundo e tentar empurrar com uma força constante. A articulação entre o tubo do silicone usado para evacuar o excesso de água e a tampa de PVC é composto por uma parte sólida (por exemplo, uma ponta de pipeta de 5 mL sem sua extremidade mais estreita) inserida no tubo de silicone.
3. Realizar a inibição de acetileno por borbulhamento com gás acetileno na fase água do núcleo por aproximadamente 10 min. Evite resuspending do sedimento.
   Nota: Como uma possível modificação do método, adicione um substrato (nitrato) através de um meio líquido concentrado antes de borbulhar acetileno para medições de desnitrificação potenciais (por exemplo, como na Figura 3b, c).

5. desnitrificação (medida de acumulação de₂O N)

1. Preencha todo o espaço de ar na amostra com a água de sobra anterior. Coloque o sensor no núcleo do sedimento através do orifício central da tampa de PVC para a superfície. A ponta do sensor deve estar localizada na fase de água acima do agitador (Figura 1c).
   Nota: Todas as junções do tubo acrílico de amostragem devem ser seladas para evitar vazamentos de gás e água durante a medição (Figura 1a, c). Na parte inferior do tubo, a rolha de borracha é suficiente para isso. A parte para a superfície de vedação é mais difícil. A tampa de PVC deve ser sintonizada. Ele deve ser aquecido com uma tocha; em seguida, quando o material se torna flexível, mas não é queimado, a tampa é colocada no tubo para que sua forma pode ser moldada. Após arrefecimento, a cobertura precisa mais modificações (com excepção da capa usada para transportar as amostras para o laboratório em etapas 2.1.1.10 ou 2.1.2.6). O furo central, onde o sensor é inserido deve ser perfurado. O agitador pode ser realizado com uma linha de pesca, que por sua vez é aderida com cola no interior da tampa para que o agitador paira sobre a linha de pesca na água (Figura 1c). Além disso, todas as junções (tubo de tampa de PVC e PVC tampa sensor) são seladas com fita adesiva. Coloque fita adesiva elástica para ajustar o diâmetro do sensor a fim de selar a superfície de contato entre o furo central da tampa de PVC e o sensor (Figura 1c).
2. Interruptor do circuito de pulso eletromagnético que faz parte do sistema de agitação.
   Nota: O sistema de agitação impede a estratificação da fase água sem perturbador (resuspending) o sedimento. O sistema de agitação é composto por um circuito que liga/desliga o eletroímã que atrai/releases agitador magnético (veja a Tabela de materiais para uma descrição detalhada).
3. Mova o eletroímã em torno da parte externa do tubo acrílico até o misturador move-se continuamente e em seguida fixá-lo usando fita adesiva (Figura 1c).
4. Feche a incubadora para garantir uma temperatura constante (por exemplo, variação de ± 0,3 ° C).
5. Pressione o botão de gravação (software de sensor) para iniciar a gravação do sinal do sensor. Leituras normalmente são registradas a cada 5 min.
6. Pressione o botão parar no final do período de medição.

6. etapas de medição final

1. Espere pelo menos ~ 10 min com a ponta do sensor mergulhada na água grátis-N₂O (deionizada) antes de ler o sinal da zero N₂O calibração medida.
2. Realize uma calibração de sensor final. Para isso, repita a calibração do sensor, seção 3 a seguir, mas começando com passo 3.3.
3. Salve o arquivo (software de sensor).

7. desnitrificação cálculos da taxa de

1. Comece com o arquivo de saída tabulada gerado pelo software do sensor que contém o registro do sinal do sensor em mV µM N₂O e os dados de calibração.
2. Traça o sinal do sensor contra o tempo para visualizar a tendência de acumulação de₂O N (por exemplo, a Figura 2a).
3. Use somente o intervalo de tempo com uma acumulação linear, excluindo o período de aclimatação inicial da amostra e uma possível saturação final devido à limitação de substrato (por exemplo, a Figura 2b). Crie um modelo linear do sinal do sensor (µM) ao longo do tempo (h).
   Nota: A inclinação é a taxa de desnitrificação (µM N₂O núcleo^-1 h^-1), que, se dividida pela área do núcleo (πr²), transforma-se a taxa em µM N₂O m^-2 h^-1e quando multiplicado pelo volume (πr²h, onde h é a altura da fase água e r é o raio interno do tubo acrílico, neste caso 0,12 m e 0,03175 m, respectivamente) de água transforma-se a taxa em µmol N₂O m^-2 h^-1.

Representative Results

Um total de 468 taxas de desnitrificação foram estimados usando o protocolo acima em sedimentos de lagos de montanha dos Pirinéus, durante o período de 2013-2014. Mostramos alguns destes resultados para ilustrar o procedimento (Figura 2 e Figura 3). Em geral, o modelo linear entre a concentração de N₂O e tempo tem boa correlação (R² ≥ 0,9). A inclinação da relação fornece uma estimativa da taxa de desnitrificação (passo 7.3; por exemplo, a Figura 2d). Se a atividade de desnitrificação é muito baixa, ruído eletrônico do sensor se torna mais importante e a bondade de ajuste (por exemplo, sensores, 4 e 5 na Figura 2b e Figura 3a) declina. Apesar de ~0.1 µM em água,²², que é um intermediário do limite de detecção de linha de base de N₂O valor relativo a métodos alternativos²³, a possibilidade de acumulados milhares de medições contínuas para filtrar o ruído permite estimativas em taxas de desnitrificação relativamente baixa, até ~ 1 µmol N₂O m^-2 h^-1 (Figura 2 e Figura 3). Taxas mais baixas (ou seja, ~0.4 µmol N₂O m^-2 h^-1) pode ser estimada por estreitamento na fase da amostra a uma altura de 8 cm de água (ver protocolo passo 4.2).

Figura 2 : Cálculos da taxa de desnitrificação em uma experiência de dependência de temperatura. Real (a e b) e potenciais medidas de desnitrificação (c–f) são mostradas. Quando a temperatura da medição é diminuída (c), na primeira amostra esfria e o sinal do sensor, que é dependente de temperatura, declina. (um) A evento semelhante ocorre no início da incubação na medição real desnitrificação; o ambiente de laboratório mais quente em relação às condições de incubação produz um resfriamento da amostra, novamente acompanhada de um declínio no sinal do sensor. (e) quando a temperatura é aumentada, no começo aquecer as amostras e o sinal do sensor aumenta exponencialmente em vez de linearmente. Quando as amostras atingirem uma temperatura constante, o sinal do sensor aumenta linearmente, como de costume. Em todos os casos, é possível calcular as taxas de desnitrificação usando apenas o período de acumulação de₂O N linear (b, de f). (b) inativo amostra 3 não é mostrada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Exemplos de desnitrificação taxa cálculos. Reais (um) e potenciais taxas de desnitrificação (b e c) foram estimadas. Só usamos o intervalo de tempo com um acúmulo de₂O N linear para calcular a taxa de desnitrificação (inclinação do modelo linear). No entanto, em (um), para fins educacionais, mostramos todas as medições (modelos) com sucesso mais e menos; Temos que descartar amostra 3, devido à alta instabilidade do sensor e amostra 2 devido à saturação na acumulação N₂O. (um) amostras de 4 e 5 com taxas de 0,7 e 0,5 µmol N₂O m^-2 h^-1, respectivamente, são os casos das medições perto do limite de detecção do método. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

As principais vantagens do método descrito são o uso de amostras de sedimento minimamente incomodado e a gravação contínua da acumulação N₂O. Estes permitem a estimativa das taxas de desnitrificação relativamente baixo que provavelmente semelhante a esses ocorrem em situ. No entanto, alguns aspectos relativos à retirada do dielétrico, desempenho do sensor e potenciais melhorias são discutidos.

Um passo aparentemente simples, mas fundamental do método é núcleo boa recuperação. A interface sedimento/água deve satisfazer três critérios: (i) nenhuma modificação na sua composição química ou constituinte, (ii) nenhuma alteração no teor de água ou void ratio e (iii) nenhuma estrutura pertubation²⁴. Os distúrbios menos sofridos pela amostra durante o protocolo inteiro, o mais realista e mais perto em situ condições vai ser a taxa de desnitrificação medido. Existem vários dispositivos/técnicas para o núcleo de sedimentos coleção²⁵, e sua seleção depende da profundidade de água. Nós usamos um mensageiro-adaptado de gravidade corer¹⁹ para amostras profundas (Figura 1e) porque é um dispositivo razoavelmente leve e pode rapidamente recuperar núcleos curto²⁵ (um sedimento de núcleo de ≥ 10 cm de comprimento é mais do que suficiente para abranger as camadas oxic e denitrifying em sedimentos^26,,^27,28.) No jargão de dielétrico, "sentir" é muitas vezes referida como a capacidade de saber a localização da sonda (se é que ainda na coluna d'água ou já no sedimento) e se é aberto ou fechado²⁵. Para profundidades de água intermediária (5-50 m), normalmente existem sem dificuldades com sentimento. Uma perda de sensação ocorre em águas mais profundas (> 50 m) porque os movimentos da coluna de água podem mascarar a localização do corer²⁵. Sentimento também pode ser perdido em águas rasas (< 3 m) devido ao desvio lateral e ação de onda²⁵; é por isso que usamos um método diferente em águas rasas, qualquer manual direto dielétrico por mergulho ou vestir-se em um wader. Com este sistema, a pessoa que realize a amostragem pode ver o sedimento e escolher o lugar exato antes de retirada do dielétrico; Isto permite, por exemplo, a amostragem de um núcleo de sedimentos que contém uma macrófitas. Após a amostragem, o pesquisador deve continuar a trabalhar com cuidado para perturbar minimamente o amostra de sedimento durante o resto do protocolo, especialmente ao realizar a inibição de acetileno por borbulhamento.

Alguns detalhes devem ser considerados ao usar N₂O Microssensores. O software do sensor fornece uma visualização contínua (gráfico de faixa) do sensor sinal (frequência de fundo de 1000 Hz)²⁹. Estes dados brutos e o gráfico de faixa (por exemplo, a Figura 2uma) podem ser salvos. É necessário verificar o comportamento correto do sensor após sua polarização (por exemplo, ao retornar de uma coleção de campo antes de etapa 4). Em particular, um baixo (< 20 mV) e sinal de base constante é esperado quando está submersa na água de N₂O-livre. Recalibrar o sensor em breve (~ 2 h) após o início de sua utilização; Se já tem sido utilizado por alguns dias, o intervalo pode ser estendido (~ 24 h)¹⁸. Para minimizar recalibrações, manter o sensor polarizada a menos que ele não é usado por vários dias¹⁸. Ao longo do tempo, uma mudança no sinal do sensor pode ocorrer, até 50% em meses, que é devido a uma diferente permeabilidade da sua membrana¹⁸. Quanto menor a interferência eletrônica no laboratório, o mais constante e estável será o sinal do sensor. Nesse sentido, usar um UPS melhora a qualidade da energia elétrica que atinge o dispositivo de medição filtrando as flutuações de tensão. O intervalo de amostragem, selecionado na guia agente de log, é diferente da frequência de fundo. Cada ponto registrado é gerado a partir da média de muitas medições. O intervalo de amostragem (até 10 s) indica a frequência com que um ponto de dados é gravado. O número de medições por unidade de tempo usada na média é definido pelo fundo frequência²⁹. Por exemplo, se definir uma frequência de amostragem de 5 s e uma frequência de fundo de 500 medições por segundo e, em seguida, os pontos são dados gravaram cada 5 s e a média de 500 amostras por segundo é medido durante o anterior 5 s. Vamos gravar o sinal do sensor cada 5 min (intervalo de amostragem) e definir a frequência de fundo para 1000 medições por segundo. O sistema de estudo deve ser conhecido para selecionar o intervalo de amostragem correta sem "média" flutuações esperadas. Em sistemas altamente ativos, intervalos de amostragem curtos são recomendados, enquanto intervalos maiores permitem a otimização memória^{29 do computador}. Algumas substâncias interferentes possíveis (H₂S, n e CO₂) podem afetar de sinal do sensor N₂O²². O sensor é calibrado com água desionizada, mas as amostras podem conter substâncias interferentes e modificar o sinal de referência do sensor. Esta situação poderia explicar por que valores negativos aparecem nas amostras 2 e 5 na Figura 2b e 3a figura, respectivamente. No entanto, quando o objectivo é estimar a taxa de desnitrificação, o nível exato de N₂O não é o parâmetro key. O que é a chave é a inclinação do modelo linear (evidenciando uma acumulação linear de N₂O). Finalmente, é necessário trabalhar com uma temperatura fixa, porque a resposta do sensor N₂O que muda com a temperatura (Figura 4).

Simples modificações ou adições no protocolo também permitem (i) caracterização das condições ambientais controlando as taxas de desnitrificação medido, (ii) estimativa das taxas de desnitrificação potencial simulando a resposta para uma condução gradiente (por exemplo, nitrato) e (iii) estimativa das taxas de emissão de sedimentos N₂O, saltando a inibição de_{2 2}H C dependendo dos objectivos de estudo, várias medições complementares podem ser feitas: (i) apenas depois de se recuperar o núcleo em situ condições, por exemplo, temperatura; (ii) antes da medição, amostras da água fase, por exemplo, [não há₃^–]; e (iii) após a medição, extrusões e fatias do núcleo às diferentes resoluções (mm-cm)^25,30, seguindo os procedimentos explicaram pelo P. T. Schwing et al ³⁰.

Para medir as potenciais taxas de desnitrificação, adicione nitrato a fase água do núcleo (por exemplo, a Figura 2 e Figura 3), conforme descrito no C. Palacín-Lizarbe, L. Camarero e J. Catalão¹⁷. Se fazer isso, adicione o nitrato antes a inibição de₂ C₂H (passo 4.3). Também, se o nitrato é adicionado, é aconselhável adicionar também o carbono (C; por exemplo, acetato) e fósforo (P) para manter o em situ proporções estequiométricas de C, N e P (por exemplo, no sedimento superficial). Isto impedirá que a limitação de desnitrificação por estes elementos^31,32e manter-se-á também a relação de C/N que pode influenciar o domínio do processo de consumo de nitrato (i.e., desnitrificação contra redução de dissimilatory de nitrato de amónio (DNRA))⁴. Anóxia pode ser corrigida por borbulhamento de uma mistura de₂ N₂-CO por alguns minutos após a adição de nitrato, para evitar a interferência de oxigênio com desnitrificação; no entanto, observe que isto leva a um bloqueio de nitrificação. Para calcular taxas de emissão de sedimentos N₂O, omita a inibição de₂ C₂H (passo 4.3). No entanto, tenha em mente que, tanto quanto é atualmente conhecida nos ecossistemas aquáticos, as emissões de N₂O são proporcionalmente baixas comparado com N₂ emissões (0% - 4,3%)³³, então é possível que o acumulado de N₂O será abaixo limite de detecção. Se este for o caso, uma opção é adicionar nitrato para aumentar o emitido N₂O, cálculo de potenciais emissões de N₂O.

A principal fraqueza do método é a inibição da nitrificação por C₂H₂^10,34. Durante a incubação, esta inibição da nitrificação e a inibição incompleta da redução de N₂O podem tornar-se aparente, como ambos são muito dependentes de tempo. Por exemplo, a taxa de acumulação de₂O N inicial deve revelar a taxa real de desnitrificação e decaem progressivamente conforme a disponibilidade de nitrato cai e N₂O difunde-se em zona livre de nitrato, onde é reduzido de³⁵. Portanto, uma taxa estimada de desnitrificação pode ser considerada válida somente se as leituras mostram uma acumulação linear de N₂O¹⁰.

O método descrito estima uma taxa de desnitrificação por área que integra a atividade de todo sedimento. A este respeito, há alguma incerteza sobre o raio de ação a inibição de acetileno quando borbulhar o gás na fase aquosa da amostra. Presume-se que, pelo menos, inibição da camada colectada dos sedimentos ocorre, que é a única com o mais alto^26,taxas de desnitrificação²⁷.

Melhoramentos possíveis para este método são seu uso combinado com traçadores de ¹⁵N e modificações que podem permitir a medição de desnitrificação em situ. ¹⁵ Métodos de rastreamento de N podem ser usados para determinar a proporção de nitrificação-desnitrificação, ocorrendo em³⁶amostras de acoplamento, e ele pode também conta para outros processos de fluxo de N além de desnitrificação (por exemplo, anammox e dissimilatory redução de nitrato de amónio (DNRA))^13,,³⁷. No entanto, esses métodos têm a desvantagem de alterar a concentração de substrato¹⁰. R. Behrendt, D. de Beer e P. Stief ²⁶ usam um método combinando N₂O Microssensores, C₂H₂ inibição e ¹⁵N marcadores para analisar a distribuição vertical da atividade de redução de nitrato de dissimilatory processos (desnitrificação e DNRA) em sedimentos. Eles fizeram perfis verticais no sedimento de penetrante do sedimento com os sensores. A principal dificuldade em medir desnitrificação em situ é a capacidade de lidar com um ambiente de temperatura não constante. É necessário gravar o acúmulo de N₂O e temperatura simultaneamente e em seguida, corrigir o sinal do sensor N₂O pela dependência de temperatura durante os cálculos de taxa de desnitrificação. Essa correção requer uma análise prévia da dependência do sinal N₂O para cada sensor de temperatura. Os sensores são feitas à mão, e cada um responde de forma diferente a temperatura (por exemplo, sensor 1 mostra uma dependência de temperatura mais elevada do que os outros na Figura 2c, e).

Figura 4 : Dependência da temperatura da resposta microsensor N₂O. Pistas de diferentes do modelo linear do sensor sinal contra a temperatura a cada concentração de O₂N mostra o efeito da temperatura sobre o sinal do sensor. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Messenger-adapted gravity corer	-	-	Reference in the manuscript. Made by Glew, J.
Sampling tube	-	-	Acrylic. Dimensions: 100 cm (h) × 6.35 cm (d) × 6.50 cm (D). Sharpen the edge of the sampling tube that penetrates into the sediment to minimize the disturbance in the recovered sediment core sample.
Handheld sounder	Plastimo	38074	Echotest II Depth Sounder.
Rubber stopper	VWR	DENE1012114	With two holes, used to mix the N2O-water in the calibration chamber. Dimensions: 20 mm (h) × 14 mm (d) × 18 mm (D) (3 mm hole (D)).
Rubber stopper	VWR	217-0125	To seal the bottom part of the methacrylate tube and to sample in shallow water bodies. Dimensions: 45 mm (h) × 56 mm (d) × 65 mm (D).
Rubber stopper	VWR	217-0126	Place the rubber stopper in the top side of the sampling tube to obtain a vacuum for sampling in littoral zones and shallow water bodies. Dimensions: 50 mm (h) x 60 mm (d) x 70 mm (D).
PVC cover	-	-	To seal the top side part of the acrylic tube. Dimensions: 45 mm (h) × 56 mm (d) × 65 mm (D). Dimensions: 65 mm (D).
Adhesive tape	-	-	Waterproof. To ensure all joints (PVC cover sampling tube and PVC cover sensor) and to avoid water leaks.
Thermometer	-	-	Portable and waterproof, to measure the temperature in the water overlying the sediment just after sampling the cores.
GPS	-	-	To save the location of a new sampling site or to arrive at a previous site.
Wader	-	-	For littoral or shallow site samplings.
Boat	-	-	An inflatable boat is the best option for its lightness if the sampling site is not accessible by car.
Rope	-	-	Rope with marks showing its length (e.g., marked with a color code to distinguish each meter).
N2O gas bottle and pressure reducer	Abelló Linde	32768-100	Gas bottle reference.
C2H2 gas bottle and pressure reducer	Abelló Linde	32468-100	Gas bottle reference.
Tube used to evacuate the excess of water	-	-	Consists of a solid part (e.g., a 5 ml pipette tip without its narrowest end) inserted in a silicone tube.
Nitrous Oxide Minisensor w/ Cap	Unisense	N2O-R	We use 4 sensors at a time.
Microsensor multimeter 4 Ch. 4 pA channels	Unisense	Multimeter	Picoammeter logged to a laptop. The standard device allows for 2 sensor picoammeter connections (e.g., N2O sensor), one pH/mV and a thermometer. We ordered a device with four picoammeter connections, allowing the use of 4 N2O sensors simultaneously.
SensorTrace Basic 3.0 Windows software	Unisense		Sensor data acquisition software.
Calibration Chamber incl. pump	Unisense	CAL300	Calibration chamber. We tuned it with rubber stoppers and syringes to mix the N2O-water without making bubbles.
Incubation chamber	Ibercex	E-600-BV	Indispensable equipment for working at a constant temperature (±0.3 °C). It also allows control of the photoperiod.
Electric stirrer	-	-	Part of the stirring system. It hangs in the water, overlying the sediment subject, by a fishing line that is hooked to the PVC cover.
Electromagnet	-	-	Part of the stirring system. It is fixed to the outside of the acrylic tube, approximately at the same level as the stirrer. It is activated episodically (ca. 1 on-off per s) by a circuit, attracting the stirrer when it is on and releasing it when it is off, thereby generating the movement that agitates the water.
Electromagnetic pulse circuit	-	-	Part of the stirring system. It is connected by wires to the electromagnet and sends pulses of current that turn the electromagnet on and off.
Uninterruptible power supply (UPS)	-	-	It improves the quality of the electrical energy that reaches the measurement device, filtering the highs and low of the voltage, thereby ensuring a more constant and stable N2O sensor signal.