Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Интенсивности осадков денитрификация с использованием ядер и N2O микросенсоры

Published: December 6, 2018 doi: 10.3791/58553
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Campus UAB, CREAF, 2Center for Advanced Studies of Blanes, (CEAB, CSIC), 3CSIC

Summary

Этот метод оценивает темпы денитрификации в отложениях в осадочных кернах, используя ацетилена ингибирование технику и микропроцессоров измерения накопленной N2O. Протокол описывает процедуры для сбора ядер, калибровка датчиков, выполняя ингибирование ацетилена, измерения накопления N2O и расчета ставки денитрификации.

Abstract

Денитрификация является главным биогеохимических процессом удаления химически активного азота от биосферы. Количественная оценка этого процесса стало особенно актуально для оценки антропогенного изменения глобального круговорота азота и выбросы парниковых газов (т.е., N2O). Для измерения денитрификации доступны несколько методов, но никто из них не являются полностью удовлетворительными. Проблемы с существующими методами включают их недостаточной чувствительности, и необходимость изменять уровни субстрат или изменить физическую конфигурацию с использованием процесса нарушается образцы. Эта работа описывает метод для оценки денитрификации темпы в отложениях, которые объединяет керна, ингибирование ацетилена и микропроцессоров измерения накопленной N2O. Основными преимуществами этого метода являются низкий нарушения в структуре осадков и коллекции непрерывной записи N2O накопления; они позволяют оценки показателей надежных денитрификация с минимальными значениями до 0,4-1 мкмоль N2O m-2 h-1. Способность управлять ключевыми факторами является дополнительным преимуществом для получения экспериментальные исследования. Протокол описывает процедуры для сбора ядер, калибровка датчиков, выполняя ингибирование ацетилена, измерения накопления N2O и расчета ставки денитрификации. Этот метод подходит для оценки показателей денитрификации в любой водной системе с извлеченных осадочных кернах. Если концентрация N2O выше предела обнаружения датчика, ацетилена ингибирование шаг может быть опущен для оценки выбросов N2O вместо денитрификации. Мы покажем, как оценить обоих фактических и потенциальных денитрификации ставки, увеличивая наличие нитратов, а также зависимость от температуры процесса. Мы проиллюстрировать процедуры, с помощью горного озера отложений и обсудить преимущества и недостатки метода по сравнению с другими методами. Этот метод может быть изменен для конкретных целей; Например он может сочетаться с 15N Трейсеры оценить нитрификации и денитрификации или поле в situ измерения денитрификации ставок.

Introduction

Антропогенные изменения круговорота азота является одним из самых сложных проблем для системы земли1. Деятельность человека по крайней мере вдвое уровень реактивного азота для биосфера2. Однако по-прежнему существуют большой неопределенности в отношении как глобального цикла N оценивается. Несколько потоков оценки были количественно с меньш чем ±20% ошибка, и многие неопределенности ±50% и больше3. Эти неопределенности свидетельствуют о необходимости точной оценки темпов денитрификации всей экосистемы и понимание основных механизмов вариации. Денитрификация является микробной активности, через который азотистых оксидов, главным образом нитратов и нитритов, сводятся к диазота газов, N O2и N24. Путь является весьма актуальное значение для биосферы наличия химически активного азота, потому что это основной процесс удаления5. N2O является парниковым газом с потенциал потепления почти 300 раз что CO2 более 100 лет и она является текущей основной причиной истощения стратосферного озона из-за больших количествах, излучаемых6,7.

Ниже мы представляем собой протокол для интенсивности осадков денитрификация с использованием ядер и N2O микросенсоров экспериментально (рис. 1). Денитрификация тарифы рассчитаны с использованием ацетилена ингибирование метод8,9 и измерения накопления N2O в течение определенного периода (рис. 2 и рис. 3). Мы демонстрируем метод, применяя его к Гора озерных отложениях. Это тематическое исследование подчеркивает производительность метода для обнаружения сравнительно низкие ставки с минимальным нарушением физической структуре отложений.

Особенно трудно измерить10денитрификации. Существует несколько альтернативных подходов и методов, каждый из которых преимущества и недостатки. Недостатки, имеющиеся методы включают в себя их использования дорогостоящих ресурсов, недостаточной чувствительности и необходимость изменять уровни субстрат или изменять конфигурацию физического процесса с использованием образцов нарушенной10. Даже более фундаментальный вызов для измерения N2 является его повышенной фоновых уровней в окружающей среде10. Сокращение N2O N2 тормозится ацетилена (C2H2)8,9. Таким образом денитрификация может быть определена количественно измеряя накопленной N2O присутствии C2H2, который возможно из-за низких экологического N2O уровней.

Использование C2H2 для измерения скорости денитрификации в отложениях был разработан около 40 лет назад11и включение N2O датчиков произошло около 10 лет позже12. Наиболее широко применяемый подход, основанный на ацетилен является ядром «статические». Накопленные N2O измеряется во время инкубационный период до 24 ч после добавления headspace запечатанном отложений ядро10C2H2 . Метод, описанный здесь, следующим за этой процедурой с некоторыми нововведениями. Мы добавляем C2H2 , пузырьков газа в водной фазе ядра на несколько минут, и заполняем все headspace образца воды перед началом измерения накопления N2O с микропроцессоров. Мы также включать систему перемешивания, которая предотвращает расслоение воды без resuspending отложений. Процедура дает количественную оценку скорость денитрификации площадь поверхности отложений (например, мкмоль N2O m-2 h-1).

Высокой пространственной и временной вариации денитрификации представляет еще одна трудность в его точную количественную оценку10. Обычно накопления N2O последовательно измеряется газовой хроматографии headspace образцов, которые собираются в ходе инкубации. Метод, описанный обеспечивает улучшение контроля за временной вариации накопления N2O, потому что микропроцессоров обеспечивает непрерывный сигнал. Мультиметр микропроцессоров является микропроцессоров цифровой усилитель (picoammeter), который взаимодействует с датчик (датчики) и компьютера(рисунок 1). Мультиметр позволяет несколько N2O микросенсоров использоваться в то же время. Например до четырех отложений ядер с того же сайта исследования могут быть измерены одновременно счет для пространственной изменчивости.

Основной подход едва мешает структуры осадков, по сравнению с некоторыми другими методами (например, растворы). Если целостность отложений изменяется, это приводит к нереалистичным денитрификации ставки13 , подходят только для относительного сравнения. Более высокие показатели всегда получаются с методами навозной жижи, по сравнению с основными методами14, потому что последний сохраняет ограничения денитрификации диффузии субстрата15. Суспензии меры нельзя считать представителя на месте ставки16; они обеспечивают относительных показателей для сравнения с точно такая же процедура.

Метод, описанный подходит для оценки показателей денитрификации в любой тип осадка, который может быть порошковой. Мы особенно рекомендуем этот метод для выполнения экспериментальных манипуляций некоторых из движущих факторов. Примерами являются эксперименты, которые изменяют наличие нитратов и температуры, необходимые для оценки энергии активации (E) денитрификации17 (рис. 2).

Figure 1
Рисунок 1 : Экспериментальная установка. () Генеральной экспериментальной установки для оценки осадков денитрификации ставки использованием ядер и N2O микросенсоров. Инкубации палата обеспечивает тьмы и контролируемых температурных условий (±0, 3 ° C). Пяти нетронутыми кернах могут обрабатываться одновременно, используя их соответствующие N2O датчики. (b) N2O датчик калибровки камеры. Мы приспособили его с резиновыми пробками и шприцы смешать N2O воды (см. Протокол шаг 3.4.3). Есть термометр для контроля температуры воды. (c) макро отложений базисной выборке с датчиком вставляется в центральное отверстие покрытия ПВХ и суставов, запечатанный клейкой лентой. Мешалка висит в воде, и электромагнитом близка его и крепится к внешней части акриловые трубы. (d) макро N2O микропроцессоров наконечник защищен кусок металла. (e) осадочных кернов, который только что был восстановлен. Он был пробы с лодки в глубокое озеро; до сих пор акриловые трубы с основной крепится к посланник адаптированных тяжести многокамерного19. Смотрите Таблицу материалов для всех элементов, необходимых для выполнения этого метода. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка

Примечание: Начните это в день, прежде чем измерений.

  1. Монтаж установки измерения (рис. 1, смотрите Таблицу материалов).
    Примечание: Чтобы обеспечить постоянное и высокое качество питания, измерения устройство подключено к сцепление через источник бесперебойного питания (UPS), также могут выступать в качестве резервного. В случае сбоя питания длительного автомобильный аккумулятор служить источником дополнительной энергии.
  2. Запуск сенсора программного обеспечения и применять -0,8 V напряжения поляризовать N2O микросенсоров. Сигнал показывает быстрый спуск и последующий рост, то он наконец уменьшается до тех пор, пока это низкая и стабильная.
    Примечание: Производитель микропроцессоров рекомендует поляризации по крайней мере на ночь (или больше) для обеспечения стабильности сигнала датчика. Еще одна рекомендация заключается в держать датчик поляризованных если измерений планируется для нескольких или18дней подряд.
  3. Включите инкубации камеру и Отрегулируйте экспериментальных условий (например, отдельных выключать свет и температуры, будет аналогичен ожидаемый в поле). Поместите контейнер с дейонизированной водой внутри камеры, так что вода доступна позднее при температуре измерения для калибровки датчиков.
    Примечание: Этот шаг может быть сделано в тот же день запланированных измерений, перед отъездом собирать ядра. Для стандартных измерений желательно использовать темных условиях.
  4. Упаковать поле основные материалы коллекции: устройство бура, выборки трубы, резиновые пробки, поливинилхлорид (ПВХ) краны, отвертки, глобального позиционирования (GPS) блок, термометр, портативный Эхолот, вейдерсы и надувная лодка (см. таблицу из Материалы). Используйте контрольный список, чтобы убедиться, все материалы включены.

2. осадка основной коллекции

  1. В зависимости от глубины воды Следуйте 2.1.1 и 2.1.2.
    1. Для глубоких водоемов
      1. Используйте messenger адаптированных тяжести Бур19 из лодки или платформы (eрис. 1).
      2. Исправить трубка отбора проб (акрил, ø 6.35 см, длина ≥ 50 см) для бура с помощью отвертки.
      3. Выберите точку выборки согласно целям расследования. Принять к сведению позицию (например, с помощью GPS координаты) и измерения глубины (например, с помощью ручной эхолот). Если выборка с лодки, используйте якорь (например, сумку с камнями), чтобы избежать дрейфующих во время основной коллекции.
      4. Развертывание системы керна, до тех пор, пока трубка отбора проб является ~ 1 м от отложений. Использование веревки с обычных знаков (например, интервалы 1 м) для контроля глубины расположения оборудования для отбора проб.
      5. Стабилизировать оборудование для отбора проб для 60 s (например, чтобы свести к минимуму движения лодки). Это обеспечит правильную отложений проникновения и восстановления едва нарушается осадочных кернов.
      6. Релиз ~ 1 м больше веревки, так, чтобы трубка отбора проб проникает отложений. Имейте в виду, что если трубка отбора проб проникает слишком много, это может нарушить интерфейс воды/отложений.
      7. При попытке сохранить напряженность в веревки, так что бура остается фиксированной, так и в вертикальном положении, отпустите messenger. Когда посланник влияет бура, небольшая разница может ощущаться в натяжение каната. В то время закройте Бур для создания вакуума, который позволяет для восстановления осадочных кернов.
      8. Восстановите бура, потянув веревку, постоянно и аккуратно.
      9. Как только ядро близко к поверхности, но по-прежнему полностью погруженной (включая резиновые части Бур, который обеспечивает вакуум), место резиновую пробку в нижней части трубки выборки. Осмотрите воды/отложений интерфейс; Это должно быть ясно и не заметно нарушена (eрис. 1). Если это не так, отменить ядро, очистить трубу и повторите шаги 2.1.1.4-9.
      10. Поднять всю систему керна из воды. Освободить трубку выборки из многокамерного и место ПВХ покрытия на верхней части. Запечатать его с клейкой лентой. Избегайте формирования воздушного пространства.
    2. Для прибрежных мест обитания и неглубокие водоемы
      1. Платье в Вадер для отбора проб в очень мелких водах (< 0,6 м).
      2. Использовать с трубкой или подводное снаряжение для глубокого выборки (до 3 м).
      3. Выберите точку выборки согласно целям расследования. Принять к сведению позицию (например, координаты GPS). Вручную, вставьте трубку выборки (например, акрил, ø 6.35 см) в отложениях.
      4. Место резиновую пробку в верхней части трубки выборки для получения вакуума.
      5. Удаление основной из отложений и быстро ввести другой резиновой пробкой в нижней части трубки.
        Примечание: Это необходимо для работы с трубки под водой во все времена; на очень мелководных участках мы рекомендуем сократить трубки до 20 см. Иногда отложений имеет высокое содержание воды и стоков, когда трубка удаляется из отложений кровати. В этом случае необходимо ввести Стопор нижний без поднятия ядро вне отложений. Чтобы сделать это, вручную погружать пробку в отложениях вокруг трубки и поместите его внимательно, чтобы закрыть в нижней части трубки.
      6. Из воды заменить верхний резиновой пробкой с покрытием ПВХ и уплотнение junction с клейкой лентой.
  2. Защитите основной во время ее передачи в лабораторию, минимизации вращений и тряски.

3. Калибровка микросенсоров закиси азота (N2O)

  1. С помощью компьютера (полоса диаграмма, датчик программное обеспечение), проверьте, что сигнал датчика является стабильным и низким (< 20 МВ).
  2. Создайте новый файл (например, с датой и узел выборки (130903_Redon_Lake)) для записи значения калибровки и датчика сигналов.
    Примечание: Датчик сигналов чувствительны к температуре (рис. 4). Используйте же температуры для измерения и калибровки датчика. Датчик реагирует линейно между 0% - 2,5% N2O20. Таким образом две точки калибровки является достаточно18.
  3. Для калибровки значение с нулевым закиси азота, прочитал сигнал датчика, сохраняя сенсорного наконечника submersed в N2O-свободной воды (деионизированная).
  4. Калибровка N2O водой в нужной концентрации.
    Примечание: Подготовьте воду с определенной концентрации2O N, которая слегка превышает ПДК в ходе инкубации. Мы используем ~ 25 мкм N2O калибровки значение. Помните, не превышающий максимальный датчик диапазон концентрации 500 N2O мкм.
    1. Получите N2O-насыщенный водой, восходящей N2O в деионизированной воде на несколько минут.
      Примечание: Значения растворимости в воде2O N зависит от температуры и солености21; Смотрите таблицу в приложении датчик ручного18.
    2. Разбавьте N2O насыщения воды, добавляя некоторое количество насыщенных N2O воды к объему обессоленной воды. Например при 20 ° C, добавление 0,3 мл насыщенного N2O воды, которая имеет концентрацию 28.7 мм N2O, в общей сложности 375 мл воды для получения 22,9 концентрации O N2мкм. Примечание что 375 мл является общий объем калибровки камеры (рис. 1б).
    3. После смешивания аккуратно N2O насыщенных водой с деионизированной воды в сосуде калибровки чтобы разбавить его до требуемой концентрации, читать сигнала датчика когда она постоянна. Это чтение это значение калибровки с X µM N2O водой. При смешивании решение, будьте осторожны, чтобы не создавать пузыри, как это устранит N2O от калибровочный раствор.
      Примечание: Учтите, что N2O в воде будет медленно бежать в воздух; Таким образом подготовленный калибровочный раствор может использоваться только на несколько минут.

4. основной подготовки и ингибирование ацетилена

  1. Изменение покрытия ПВХ расположен в верхней части каждого осадочных кернов другой крышка с отверстием в центре и висит магнитной мешалкой. Повторная печать перекрестка с клейкой лентой.
  2. Уменьшить водной фазы каждого образца приблизительную высоту 12 см (объем ≈ 380 мл). Для этого сначала вставьте трубки силиконовые в центральное отверстие. Затем поставьте осадочных кернов в цилиндре и толкать пробку снизу для создания давления. Пробка и осадка образец идти вверх, и избыток воды проходит через трубку. Сбор воды в сосуде, получателя.
    Примечание: Образцы с грубой зернистости может быть проблематичным во время этого шага. Отложений частиц помещается между пробкой и трубки можно деформировать пробку и открыть отверстие через воздушных пузырей может пройти и нарушить образца. Чтобы избежать этой проблемы, поместите цилиндр в центре нижней пробкой и попробуйте нажать с постоянной силой. Стык между силиконовые трубки используется для эвакуации избыток воды и ПВХ покрытие состоит из твердых части (например, 5 мл наконечник пипетки без его узкого конца) вставлен в силиконовой трубки.
  3. Выполните торможение ацетилена, кипит ацетилена газ в водной фазе ядра для примерно 10 мин. Избегайте resuspending отложений.
    Примечание: Как возможной модификация метода, добавить субстрата (нитрат) через концентрированной жидкой среде перед восходящей ацетилена для потенциальных денитрификации измерений (например, как показано на рисунке 3b, c).

5. денитрификации (N2O накопление мера)

  1. Заполните все воздушное пространство в образце с предыдущих остатки воды. Поместите датчик в осадочных кернов через центральное отверстие мякоти верхней крышки ПВХ. Наконечник датчика должен быть расположен в водной фазе выше мешалкой (рис. 1c).
    Примечание: Все соединения трубы акриловые выборки должны быть закрыты для избежания утечки газов и воды во время измерения (рис. 1, c). В нижней части трубки резиновую пробку достаточно для этого. Уплотнения в мякоти верхней части является более сложным. ПВХ покрытия должны быть настроены. Она должна быть нагрета с факелом; затем когда материал становится гибким, но не выжженной, крышка помещается в трубу таким образом, чтобы ее форму можно формовать. После охлаждения, крышку необходимо больше изменений (за исключением покрытия, используемые для транспортировки образцов в лабораторию в шагах 2.1.1.10 или 2.1.2.6). Центральное отверстие, где датчик вставляется должна быть пробурена. Мешалки могут быть проведены с лески, который в свою очередь соблюдается с клеем на внутренней обложке так что мешалки висит на леску в воде (рис. 1c). Кроме того все суставы (крышка трубки ПВХ и ПВХ покрытие датчика) запечатаны с клейкой лентой. Место упругой Скотч для регулировки диаметра датчика для того, чтобы запечатать контактной поверхности между центральным отверстием крышку ПВХ и датчик (рис. 1c).
  2. Переключитесь на контуре электромагнитного импульса, который является частью системы перемешивания.
    Примечание: Система перемешивания предотвращает стратификации водной фазы без тревожных (resuspending) отложений. Перемешивания система состоит из контура, который переключает вкл/выкл электромагнит, который привлекает/релизы Магнитная мешалка (см. Таблицу материалов для подробного описания).
  3. Переместите электромагнита вокруг внешней частью акриловые трубы мешалки движется непрерывно, а затем исправить его на месте с помощью клейкой ленты (рис. 1c).
  4. Закройте инкубации камеру для обеспечения постоянной температуре (например, вариация ±0. 3 ° C).
  5. Нажмите кнопку записи (датчик программное обеспечение), чтобы начать запись сигнала датчика. Чтения обычно записываются каждые 5 мин.
  6. Нажмите кнопку «Стоп» в конце периода измерения.

6. Заключительные измерения шаги

  1. Подождите по крайней мере ~ 10 мин с сенсорного наконечника, погруженной в воду бесплатно N2O (деионизированная) перед чтением сигнал нулевой N2O калибровка меру.
  2. Выполните калибровку окончательный датчика. Для этого повторите калибровку датчика, после раздела 3, но начиная с шага 3.3.
  3. Сохраните файл (датчик программное обеспечение).

7. денитрификации скорость вычислений

  1. Начните с сдвига выходного файла, порожденных программного обеспечения датчик, который содержит запись сигнала датчика в МВ и мкм N2O и калибровочные данные.
  2. Участок сигнал датчика против времени визуализировать N2O накопление тенденции (например, рис. 2).
  3. Используйте только диапазон времени с линейной накопления, за исключением первоначального адаптационного периода образца и возможные окончательное насыщение из-за ограничения субстрата (например, Рисунок 2b). Создайте модель линейного сигнала датчика (мкм) с течением времени (h).
    Примечание: Склон является скорость денитрификации (мкм N2O сердечника-1 h-1), который, если разделенная на площадь ядра (πr2), превращается в скорость в мкм N2O m-2 h-1и при умножении на Водный объем (πr2h, где h – высота водной фазы и r внутренний радиус акриловые трубы, в данном случае является 0.12 и 0.03175 м, соответственно) превращается в скорость в мкмоль N2O m-2 h-1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В общей сложности 468 денитрификации ставки рассчитывались с использованием протокола выше в отложениях от Пиренейских горных озер за период 2013-2014 гг. Мы показываем некоторые из этих результатов, чтобы проиллюстрировать процедуры (рис. 2 и рис. 3). В целом линейная модель между N2O концентрации и времени имеет хорошие корреляции (R2 ≥ 0.9). Наклон отношений дает оценку темпов денитрификации (шаг 7.3; например, Рисунок 2d). Если действие денитрификации является очень низкой, датчик электронного шума становится более важным и добра подходят уменьшается (например, датчики 4 и 5 в Рисунок 2b и Рисунок 3А). Хотя базовый предел обнаружения N2O ~0.1 мкм в воду22, который является промежуточным значение относительно альтернативных методов23, возможность накопления тысячи непрерывных измерений для фильтрации шума разрешает оценки ценам сравнительно низким денитрификации, до ~ 1 мкмоль N2O m-2 h-1 (рис. 2 и Рисунок 3). Ставки (то есть, ~0.4 мкмоль N2O m-2 h-1) может быть оценена путем сужения водной фазы основной выборки на высоту 8 см (см. Протокол шаг 4.2).

Figure 2
Рисунок 2 : Скорость вычисления денитрификации в эксперименте зависимость температуры. Показаны фактические ( и b) и потенциальные денитрификации измерения (fc–). Когда температура измерения является снижение (c), на первом образце остывает и сигнал датчика, который зависит от температуры, снижается. () A аналогичные событие происходит в начале инкубации в измерении фактических денитрификации; теплее лабораторной среде в отношении условий инкубации производит охлаждение образца, снова сопровождается снижением сигнал датчика. (e) когда температура увеличивается, сначала теплой образцы и сигнал датчика увеличивается экспоненциально вместо линейно. Когда образцы достигают постоянной температуры, датчик сигнала увеличивается линейно, как обычно. Во всех случаях это можно рассчитать показатели денитрификации просто используя период линейного N2O накопления (b, dи f). (b) неактивные образца 3 не отображается. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Примеры денитрификации оценить расчеты. Были оценены фактические () и потенциальные показатели денитрификации (b и c). Мы только использовали диапазон времени с линейной накопления N2O для расчета ставки денитрификации (наклон линейной модели). Однако, в () для образовательных целей, мы показываем все измерения (модели) с более и менее успех; Мы бы отбросить образца 3 из-за высокой нестабильности датчика и пример 2 из-за насыщения в N2O накопление. () образцы, 4 и 5 с коэффициентом 0,5 и 0,7 мкмоль N2O m-2 h-1, соответственно, являются случаи измерений вблизи предела обнаружения метода. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Основными преимуществами описанных метода являются использование минимально нарушенных осадочного керна и непрерывная запись накопления N2O. Они позволяют оценки относительно низкой денитрификации ставок, которые, вероятно, похож на эти происходящие в situ. Тем не менее обсуждаются некоторые аспекты, касающиеся керна, датчик производительности и возможные улучшения.

Видимо простой, но критический шаг метода является хорошим керна. Интерфейс осадков и воды должны удовлетворять трем критериям: (i) никаких изменений в состав химического или составляющих, (ii) никаких изменений в содержание воды или недействительным соотношение и (iii) не структура pertubation24. Меньше волнений, понесенные образец в течение всего протокола, более реалистичные и ближе на месте условия будут измеренных денитрификации скорость быть. Существует несколько устройств/методов для отложения ядро коллекции25, и их выбор зависит от глубины воды. Мы используем посланник адаптированных тяжести многокамерного19 для глубоких образцов (Рисунок 1e), потому что это устройство достаточно легкий вес и может быстро восстановить короткие ядер25 (ядро отстой ≥10 см длины более чем достаточно охватить аэробных и denitrifying слои в отложениях26,27,28). В разделочный жаргоне, «чувствовать» часто называется способность знать расположение бура (будь то до сих пор в толщу воды, или уже в отложениях) и является ли это открыт или закрыт25. Для промежуточных глубин (5-50 м) обычно существует никаких трудностей с чувством. В более глубокие воды происходит потеря чувства (> 50 м) потому что движения толщу воды может скрывать местонахождение Бур25. Чувство, также могут быть потеряны в мелкой воде (< 3 m) из-за боковой снос и волна действий25; Вот почему мы используем другой метод в мелкой воде, либо прямой ручной отбор керна, подводное плавание или одеваться в Вадер. С этой системой лицо, выполняющее выборки можно увидеть отложения и выбрать точное место перед отбором керна; Это позволяет, например, отбор проб осадочных кернов, содержащий макрофитов. После выборки, исследователь должен продолжать работать тщательно минимально нарушить основной выборки осадков во время остальной части протокола, особенно при выполнении ингибирование ацетилена по восходящей.

Некоторые детали необходимо учитывать при использовании N2O микросенсоров. Программное обеспечение датчик обеспечивает непрерывное визуализации (полосы диаграммы) датчик сигнала (фоновой частоте 1000 Гц)29. Эти необработанных данных и индикаторы газа (например, рис. 2) могут быть сохранены. Это необходимо для проверки правильного поведения датчика после его поляризации (например, при возвращении из коллекции полей до шаг 4). В частности, низкий (< 20 МВ) и постоянной базовый сигнал ожидается, когда он погружен в воду N2O-бесплатно. Калибровки датчика вскоре (~ 2 h) после начала его использования; Если он уже используется для несколько дней, интервал может быть продлен (~ 24 h)18. Чтобы свести к минимуму осуществлялся, держать датчик поляризованных если он не используется для нескольких дней18. Со временем изменения в сигнал датчика может возникнуть, до 50% в месяцев, который из-за различных проницаемости его мембраны18. Ниже электронной вмешательства в лаборатории, более постоянной и стабильной будет сигнал датчика. В этом смысле с помощью UPS улучшает качество электрической энергии, которая достигает устройство измерения путем фильтрации колебания напряжения. Интервал выборки, выбранный на вкладке Журнал отличается от частоты фон. Каждый зарегистрированный точка создается из среднее из много измерений. Интервал выборки (до 10 s) указывает частоту, с которой записывается точки данных. Количество измерений на единицу времени, используемые в среднем определяется частота фон29. Например если мы установим частота дискретизации 5 s и фон частотой 500 измерений в секунду, то данные точки записаны каждые 5 s и в среднем 500 образцов в секунду измеряется в ходе предыдущих 5 s. Мы записать сигнал датчика каждые 5 мин (интервал выборки) и задать фон частоту до 1000 измерений в секунду. Исследование системы должны быть известны выбрать правильный интервал без «усреднение» ожидаемые колебания. В весьма активных систем рекомендуется коротких интервалов, в то время как более длительные интервалы позволяют оптимизировать память компьютера29. Некоторые возможные помехи вещества (H2S, нет, и CO2) могут повлиять на N2O датчик сигнала22. Датчик откалиброван с дейонизированной водой, но образцы могут содержать вещества, мешая и изменять Референтный сигнал датчика. Эта ситуация может объяснить, почему отрицательные значения появляются в примерах 2 и 5 в Рисунок 2b и Рисунок 3a, соответственно. Однако когда цель заключается в том, чтобы оценить денитрификации, точный уровень N2O не является ключевым параметром. Что такое ключ является наклон линейной модели (подтверждающие линейной накопления N2O). Наконец необходимо работать с фиксированной температурой, потому что ответ N2O датчик изменения температуры (рис. 4).

Простые изменения или дополнения к протоколу также включить (i) характеристика состояния окружающей среды, контроля цены измеренных денитрификации, (ii) Оценка возможных ставок денитрификации, имитируя ответ на вождение градиент (например, нитрат) и (iii) оценки темпов осаждений N2O выбросов, пропуская ингибирование2 C2Ч в зависимости от цели исследования, можно сделать несколько дополнительных измерений: (i) только после восстановления ядро, на месте условия, например, температуры; (ii) перед измерением, образцы водной фазы, например, [не3–]; и (iii) после измерения, направляющих и кусочки ядра в различных разрешениях (mm-cm)25,30, после процедур объясняется Schwing т. P. et al. 30.

Чтобы оценить потенциальные темпы денитрификации, добавьте нитрата в водной фазе ядра (например, рис. 2 и рис. 3), как описано в C. Palacin-Lizarbe, L. Камареро и J. каталонской17. Если сделать это, добавьте нитрата перед C2H2 ингибирование (шаг 4.3). Кроме того если добавляется нитрат, желательно чтобы также добавить углерода (C; например, ацетат) и фосфор (P), чтобы сохранить пропорции стехиометрическим в situ C, N и P (например, в поверхностных отложений). Это позволит предотвратить ограничение денитрификации, эти элементы31,32и также будет держать соотношение, которое может повлиять на доминирование процесса потребления нитратов (то есть, денитрификация по сравнению с снижение dissimilatory нитрата аммония (DNRA))4. Гипоксия может быть исправлено путем пузырьков N2-CO2 смеси за несколько минут после добавления нитрат, чтобы предотвратить кислородной интерференции с денитрификации; Однако, обратите внимание, что это приводит к блокированию нитрификации. Чтобы вычислить осаждений N2O уровни выбросов, опустите C2H2 ингибирование (шаг 4.3). Однако имейте в виду, что, поскольку в настоящее время он известен в водных экосистемах, N2O выбросы пропорционально низкими по сравнению с N2 выбросов (0% - 4,3%)33, поэтому вполне возможно, что накопленные N2O будет ниже предел обнаружения. Если это так, вариант заключается в добавлении нитратов для увеличения выбросов N2O, расчет потенциальных выбросов N2O.

Главная слабость метода является ингибирования нитрификации C2H210,34. Во время инкубации этот ингибирования нитрификации и неполной ингибирование N2O сокращения могут стать очевидными, поскольку оба очень зависит от времени. К примеру начальной скорости накопления N2O должны выявить уровень реальных денитрификации и постепенно распадаться, как наличие нитратов падает и N2O диффундирует в нитрат свободной зоны, где это снижение35. Таким образом показатель по оценкам денитрификации может считаться действительным только в том случае, если показания Показать линейной накопления N2O10.

Метод, описанный оценкам денитрификации, стоимость области, которая интегрирует весь осадок деятельности. В этом отношении существует некоторая неопределенность о радиус действия ингибирования ацетилена при пузырьков газа в водной фазе образца. Предполагается, что, по крайней мере, ингибирование поверхностных слоя осадка происходит, который является одним с высоким денитрификации ставки26,27.

Возможные улучшения этого метода являются его совместное использование с 15N Трейсеры и изменения, которые могли бы позволить измерения денитрификации в situ. 15 N трассирующими методы могут использоваться для определения доли нитри денитрификацией муфта происходящих в образцы36, и он также может учитывать другие процессы потока N Кроме денитрификации (например, анаэробное окисление аммония и dissimilatory 13,сокращение нитрата аммония (DNRA))37. Однако эти методы имеют недостаток изменения концентрации субстрата10. A. Берендт, D. де пива и Стиф P. 26 использовать метод, объединяющий N2O микросенсоров, ингибирование2 C2H и 15N Трейсеры для анализа вертикальной деятельности распределение сокращения dissimilatory нитрат процессы (денитрификации и DNRA) в отложениях. Они сделали вертикальных профилей в отложениях, проникая в отложениях с датчиками. Основная трудность при измерении денитрификации в situ является способность обрабатывать неконстантными температуры окружающей среды. Это необходимо для записи N2O накопление и температуры одновременно и затем исправить сигнал датчика N2O зависимость температуры во время вычисления скорость денитрификации. Это исправление требует предыдущий анализ температурной зависимости N2O сигнала для каждого датчика. Датчики являются ручной работой, и каждый из них по-разному реагирует на температуру (например, датчик 1 показывает выше зависимость от температуры, чем другие в рисунке 2c, e).

Figure 4
Рисунок 4 : Зависимость температуры реакции N2O микропроцессоров. Разных склонах линейной модели датчика сигнал против температуры на каждом N2O концентрация показывает влияние температуры на сигнал датчика. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Правительство Испании предоставило средства через Ministerio de Educación как лектор стипендий C.P-л (FPU12-00644) и научно-исследовательских грантов Ministerio де Economia y развитию: Lacus (CGL2013-45348-P), NitroPir (CGL2010-19737), передачи () CGL2016-80124-C2-1-P). Проект REPLIM (INRE - программы ИНТЕРРЕГ. EUUN - Европейский союз. EFA056/15) поддержал окончательного составления протокола.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Messenger-adapted gravity corer - - Reference in the manuscript. Made by Glew, J.
Sampling tube - - Acrylic. Dimensions: 100 cm (h) × 6.35 cm (d) × 6.50 cm (D). Sharpen the edge of the sampling tube that penetrates into the sediment to minimize the disturbance in the recovered sediment core sample.
Handheld sounder Plastimo 38074 Echotest II Depth Sounder.
Rubber stopper VWR DENE1012114 With two holes, used to mix the N2O-water in the calibration chamber. Dimensions: 20 mm (h) × 14 mm (d) × 18 mm (D) (3 mm hole (D)).
Rubber stopper VWR 217-0125 To seal the bottom part of the methacrylate tube and to sample in shallow water bodies. Dimensions: 45 mm (h) × 56 mm (d) × 65 mm (D).
Rubber stopper VWR 217-0126 Place the rubber stopper in the top side of the sampling tube to obtain a vacuum for sampling in littoral zones and shallow water bodies. Dimensions: 50 mm (h) x 60 mm (d) x 70 mm (D).
PVC cover - - To seal the top side part of the acrylic tube. Dimensions: 45 mm (h) × 56 mm (d) × 65 mm (D). Dimensions: 65 mm (D).
Adhesive tape - - Waterproof. To ensure all joints (PVC cover sampling tube and PVC cover sensor) and to avoid water leaks.
Thermometer - - Portable and waterproof, to measure the temperature in the water overlying the sediment just after sampling the cores.
GPS - - To save the location of a new sampling site or to arrive at a previous site.
Wader - - For littoral or shallow site samplings.
Boat - - An inflatable boat is the best option for its lightness if the sampling site is not accessible by car.
Rope - - Rope with marks showing its length (e.g., marked with a color code to distinguish each meter).
N2O gas bottle and pressure reducer Abelló Linde 32768-100 Gas bottle reference.
C2H2 gas bottle and pressure reducer Abelló Linde 32468-100 Gas bottle reference.
Tube used to evacuate the excess of water - - Consists of a solid part (e.g., a 5 ml pipette tip without its narrowest end) inserted in a silicone tube.
Nitrous Oxide Minisensor w/ Cap Unisense N2O-R We use 4 sensors at a time.
Microsensor multimeter 4 Ch. 4 pA channels Unisense Multimeter Picoammeter logged to a laptop. The standard device allows for 2 sensor picoammeter connections (e.g., N2O sensor), one pH/mV and a thermometer. We ordered a device with four picoammeter connections, allowing the use of 4 N2O sensors simultaneously.
SensorTrace Basic 3.0 Windows software Unisense Sensor data acquisition software.
Calibration Chamber incl. pump Unisense CAL300 Calibration chamber. We tuned it with rubber stoppers and syringes to mix the N2O-water without making bubbles.
Incubation chamber Ibercex E-600-BV Indispensable equipment for working at a constant temperature (±0.3 °C). It also allows control of the photoperiod.
Electric stirrer - - Part of the stirring system. It hangs in the water, overlying the sediment subject, by a fishing line that is hooked to the PVC cover.
Electromagnet - - Part of the stirring system. It is fixed to the outside of the acrylic tube, approximately at the same level as the stirrer. It is activated episodically (ca. 1 on-off per s) by a circuit, attracting the stirrer when it is on and releasing it when it is off, thereby generating the movement that agitates the water.
Electromagnetic pulse circuit - - Part of the stirring system. It is connected by wires to the electromagnet and sends pulses of current that turn the electromagnet on and off.
Uninterruptible power supply (UPS) - - It improves the quality of the electrical energy that reaches the measurement device, filtering the highs and low of the voltage, thereby ensuring a more constant and stable N2O sensor signal.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rockstrom, J., et al. A safe operating space for humanity. Nature. 461 (7263), 472-475 (2009).
  2. Erisman, J. W., Galloway, J., Seitzinger, S., Bleeker, A., Butterbach-Bahl, K. Reactive nitrogen in the environment and its effect on climate change. Current Opinion in Environmental Sustainability. 3 (5), 281-290 (2011).
  3. Gruber, N., Galloway, J. N. An Earth-system perspective of the global nitrogen cycle. Nature. 451 (7176), 293-296 (2008).
  4. Tiedje, J. M. Ch. 4. Ecology of denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium. Environmental Microbiology of Anaerobes. Vol. 717. Zehnder, A. J. B. , John Wiley and Sons. 179-244 (1988).
  5. Seitzinger, S., et al. Denitrification across landscapes and waterscapes: A synthesis. Ecological Applications. 16 (6), 2064-2090 (2006).
  6. Contribution of Working Group I to the fifth assessment report of the intergovernmental panel on climate change. IPCC. Climate Change 2013: The Physical Science Basis. , Cambridge University Press. (2013).
  7. Ravishankara, A. R., Daniel, J. S., Portmann, R. W. Nitrous Oxide (N2O): The Dominant Ozone-Depleting Substance Emitted in the 21st Century. Science. 326 (5949), 123-125 (2009).
  8. Balderston, W. L., Sherr, B., Payne, W. Blockage by acetylene of nitrous oxide reduction in Pseudomonas perfectomarinus. Applied and Environmental Microbiology. 31 (4), 504-508 (1976).
  9. Yoshinari, T., Knowles, R. Acetylene inhibition of nitrous-oxide reduction by denitrifying bacteria. Biochemical and Biophysical Research Communications. 69 (3), 705-710 (1976).
  10. Groffman, P. M., et al. Methods for measuring denitrification: Diverse approaches to a difficult problem. Ecological Applications. 16 (6), 2091-2122 (2006).
  11. Sorensen, J. Denitrification rates in a marine sediment as measured by the acetylene inhibition technique. Applied and Environmental Microbiology. 36 (1), 139-143 (1978).
  12. Revsbech, N. P., Nielsen, L. P., Christensen, P. B., Sorensen, J. Combined oxygen and nitrous-oxide microsensor for denitrification studies. Applied and Environmental Microbiology. 54 (9), 2245-2249 (1988).
  13. Jorgensen, K. S. Annual pattern of denitrification and nitrate ammonification in estuarine sediment. Applied and Environmental Microbiology. 55 (7), 1841-1847 (1989).
  14. Laverman, A. M., Van Cappellen, P., van Rotterdam-Los, D., Pallud, C., Abell, J. Potential rates and pathways of microbial nitrate reduction in coastal sediments. FEMS Microbiology Ecology. 58 (2), 179-192 (2006).
  15. Ambus, P. Control of denitrification enzyme-activity in a streamside soil. FEMS Microbiology Ecology. 102 (3-4), 225-234 (1993).
  16. Christensen, P. B., Rysgaard, S., Sloth, N. P., Dalsgaard, T., Schwærter, S. Sediment mineralization, nutrient fluxes, denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium in an estuarine fjord with sea cage trout farms. Aquatic Microbial Ecology. 21 (1), 73-84 (2000).
  17. Palacin-Lizarbe, C., Camarero, L., Catalan, J. Denitrification Temperature Dependence in Remote, Cold, and N-Poor Lake Sediments. Water Resources Research. 54 (2), 1161-1173 (2018).
  18. Nitrous Oxide sensor user manual. , UNISENSE A/S. (2011).
  19. Glew, J. Miniature gravity corer for recovering short sediment cores. Journal of Paleolimnology. 5 (3), 285-287 (1991).
  20. Andersen, K., Kjaer, T., Revsbech, N. P. An oxygen insensitive microsensor for nitrous oxide. Sensors and Actuators B-Chemical. 81 (1), 42-48 (2001).
  21. Weiss, R. F., Price, B. A. Nitrous oxide solubility in water and seawater. Marine Chemistry. 8 (4), 347-359 (1980).
  22. Nitrous Oxide Microsensors Specifications. , UNISENSE A/S. (2018).
  23. Koike, I. Ch. 18. Measurement of sediment denitrification using 15-N tracer method. Denitrification in Soil and Sediment 10.1007/978-1-4757-9969-9 F.E.M.S. Symposium Series. Revsbech, N. P., Sørensen, J. , Springer US. 291-300 (1990).
  24. Hvorslev, M. J. Subsurface Exploration and Sampling of Soils for Civil Engineering Purposes. , American Society of Civil Engineers, Waterways Experiment Station, Corps of Engineers, U.S. Army. 521 (1949).
  25. Glew, J. R., Smol, J. P., Last, W. M. Ch. 5. Sediment Core Collection and Extrusion. Tracking Environmental Change Using Lake Sediments: Basin Analysis, Coring, and Chronological Techniques. Last, W. M., Smol, J. P. 1, Springer. Netherlands. 73-105 (2001).
  26. Behrendt, A., de Beer, D., Stief, P. Vertical activity distribution of dissimilatory nitrate reduction in coastal marine sediments. Biogeosciences. 10 (11), 7509-7523 (2013).
  27. Laverman, A. M., Meile, C., Van Cappellen, P., Wieringa, E. B. A. Vertical distribution of denitrification in an estuarine sediment: Integrating sediment flowthrough reactor experiments and microprofiling via reactive transport modeling. Applied and Environmental Microbiology. 73 (1), 40-47 (2007).
  28. Melton, E. D., Stief, P., Behrens, S., Kappler, A., Schmidt, C. High spatial resolution of distribution and interconnections between Fe- and N-redox processes in profundal lake sediments. Environmental Microbiology. 16 (10), 3287-3303 (2014).
  29. SensorTrace BASIC 3.0 user manual. , UNISENSE A/S. (2010).
  30. Schwing, P. T., et al. Sediment Core Extrusion Method at Millimeter Resolution Using a Calibrated, Threaded-rod. Journal of visualized experiments. (114), 54363 (2016).
  31. Bernhardt, E. S. Ecology. Cleaner lakes are dirtier lakes. Science. 342 (6155), 205-206 (2013).
  32. Finlay, J. C., Small, G. E., Sterner, R. W. Human influences on nitrogen removal in lakes. Science. 342 (6155), 247-250 (2013).
  33. Seitzinger, S. P. Denitrification in fresh-water and coastal marine ecosystems- ecological and geochemical significance. Limnology and Oceanography. 33 (4), 702-724 (1988).
  34. Seitzinger, S. P., Nielsen, L. P., Caffrey, J., Christensen, P. B. Denitrification measurements in aquatic sediments - a comparison of 3 methods. Biogeochemistry. 23 (3), 147-167 (1993).
  35. Christensen, P. B., Nielsen, L. P., Revsbech, N. P., Sorensen, J. Microzonation of denitrification activity in stream sediments as studied with a combined oxygen and nitrous-oxide microsensor. Applied and Environmental Microbiology. 55 (5), 1234-1241 (1989).
  36. Peter, N. L. Denitrification in sediment determined from nitrogen isotope pairing. FEMS Microbiology Ecology. 9 (4), 357-361 (1992).
  37. Risgaard-Petersen, N., Nielsen, L. P., Rysgaard, S., Dalsgaard, T., Meyer, R. L. Application of the isotope pairing technique in sediments where anammox and denitrification coexist. Limnology and Oceanography-Methods. 1, 63-73 (2003).

Tags

Экологических наук выпуск 142 биогеохимия лимнология морской химии химии воды азота закиси азота вольтамперометрии ацетилена ингибирование температуры
Интенсивности осадков денитрификация с использованием ядер и N<sub>2</sub>O микросенсоры
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Palacin-Lizarbe, C., Camarero, L.,… More

Palacin-Lizarbe, C., Camarero, L., Catalan, J. Estimating Sediment Denitrification Rates Using Cores and N2O Microsensors. J. Vis. Exp. (142), e58553, doi:10.3791/58553 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter