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Estimación de las tasas de desnitrificación sedimento usando corazones y N2O microsensores

Published: December 6, 2018 doi: 10.3791/58553
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Campus UAB, CREAF, 2Center for Advanced Studies of Blanes, (CEAB, CSIC), 3CSIC

Summary

Este método estima tasas de desnitrificación de sedimento en núcleos de sedimentos usando las medidas acetileno inhibición técnica y microsensor de acumulada N2O. El protocolo describe los procedimientos para recoger los corazones, calibración de los sensores, realiza la inhibición de acetileno, la acumulación de N2O de medición y cálculo de la tasa de desnitrificación.

Abstract

Desnitrificación es el proceso biogeoquímico primario eliminación de reactivos del nitrógeno de la Biosfera. La evaluación cuantitativa de este proceso es particularmente relevante para evaluar el ciclo de nitrógeno global antropogénico alterado y la emisión de gases de efecto invernadero (es decir, N2O). Varios métodos están disponibles para la medición de desnitrificación, pero ninguno de ellos es completamente satisfactorio. Problemas con los métodos existentes incluyen su sensibilidad insuficiente, y la necesidad de modificar los niveles de sustrato o alterar la configuración física del proceso utilizando disturbada muestras. Este trabajo describe un método para calcular las tasas de desnitrificación de sedimento que combina perforación, inhibición de acetileno y mediciones de microsensor del acumulado de N2O. Las principales ventajas de este método son una baja perturbación de la estructura del sedimento y la colección de un registro continuo de la acumulación de N2O; Éstos permiten estimaciones de las tasas de desnitrificación confiable con valores mínimos de hasta 0.4 1 μmol N2O m-2 h-1. La habilidad de manipular claves es una ventaja adicional para la obtención de información experimental. El protocolo describe los procedimientos para recoger los corazones, calibración de los sensores, realiza la inhibición de acetileno, la acumulación de N2O de medición y cálculo de la tasa de desnitrificación. El método es apropiado para estimar las tasas de desnitrificación en ningún sistema acuático con núcleos de sedimento recuperable. Si la concentración de N2O es por encima del límite de detección del sensor, se puede omitir el paso de la inhibición de acetileno para estimar las emisiones de N2O en lugar de desnitrificación. Nos enseña a estimar ambas tasas de desnitrificación reales y potenciales mediante el aumento de la disponibilidad de nitrato así como la dependencia de la temperatura del proceso. Ilustramos el procedimiento usando sedimentos de lago de montaña y discutir las ventajas y debilidades de la técnica en comparación con otros métodos. Este método puede ser modificado para fines particulares; por ejemplo, puede combinarse con marcadores de 15N para evaluar la nitrificación y desnitrificación o campo en situ las mediciones de las tasas de desnitrificación.

Introduction

Alteraciones antropogénicas del ciclo del nitrógeno es uno de los problemas más difíciles para el sistema de tierra1. Actividad humana ha duplicado por lo menos los niveles de reactivos del nitrógeno a la Biosfera2. Sin embargo, sigue habiendo grandes incertidumbres con respecto a cómo se evalúa el ciclo de N global. Se han cuantificado unas estimaciones de flujo con menos de error de ± 20%, y muchos tienen incertidumbres de ±50% y mayor de3. Estas incertidumbres indican la necesidad de estimaciones precisas de las tasas de desnitrificación en los ecosistemas y la comprensión de los mecanismos subyacentes de la variación. Desnitrificación es una actividad microbiana a través del cual se reducen óxidos nitrogenados, principalmente nitratos y nitritos, y gases del dinitrogen, N2O N24. La vía es muy importante para la disponibilidad de la Biosfera de nitrógeno reactivo porque es el proceso primario de eliminación5. N2O es un gas de efecto invernadero con un potencial de calentamiento casi 300 veces CO2 más de 100 años y es la principal causa actual de agotamiento del ozono estratosférico debido a las grandes cantidades siendo emitida6,7.

A continuación, presentamos un protocolo para estimar tasas de desnitrificación de sedimento con corazones y N2O microsensores experimental (figura 1). Las tasas de desnitrificación se calculan utilizando el acetileno inhibición método8,9 y mediciones de la acumulación de N2O durante un período definido (figura 2 y figura 3). Demostramos el método aplicando a los sedimentos del lago de montaña. Este estudio de caso destaca el desempeño del método para la detección de tasas relativamente bajas con disturbio mínimo a la estructura física de los sedimentos.

Desnitrificación es particularmente difícil de medir10. Hay varias alternativas y métodos, cada uno con ventajas y desventajas. Desventajas de los métodos disponibles incluyen el uso de recursos costosos, sensibilidad insuficiente y la necesidad de modificar los niveles de sustrato o alterar la configuración física del proceso utilizando muestras disturbadas10. Un desafío aún más fundamental para medir N2 es sus niveles elevados en el medio ambiente10. La reducción del N2O N2 es inhibida por el acetileno (C2H2)8,9. Así, la desnitrificación puede cuantificarse midiendo la acumulada N2O en presencia de C2H2, que es factible debido a los niveles ambientales bajos de N2O.

El uso de C2H2 para medir las tasas de desnitrificación en los sedimentos fue desarrollado hace unos 40 años11y la incorporación de sensores de2O de N se produjeron cerca de 10 años más tarde12. El enfoque más ampliamente aplicado de acetileno es la "estática". El acumulado de N2O se mide durante un período de incubación de 24 h después de la C2H2 se agrega a los espacios vacíos del sedimento sellado base10. El método descrito aquí sigue este procedimiento con algunas innovaciones. Añadimos el C2H2 por burbujeo del gas en la fase del agua de la base durante unos minutos, y llenamos todos los espacios vacíos con agua de la muestra antes de medir la acumulación de N2O con un microsensor. También incluyen un sistema de agitación que impide la estratificación del agua sin resuspender el sedimento. El procedimiento cuantifica la tasa de desnitrificación por área superficial de sedimentos (por ejemplo, μmol N2O m-2 h-1).

La alta variación espacial y temporal de desnitrificación presenta otra dificultad en su exacta cuantificación10. Generalmente, la acumulación de N2O se mide secuencialmente por cromatografía de gases de muestras de espacios vacíos que se recogen durante la incubación. El método descrito proporciona mejor control de la variación temporal de la acumulación de N2O, porque el microsensor proporciona una señal continua. El multímetro de microsensor es un amplificador digital microsensor (picoammeter) que interactúa con los sensores y la computadora (figura 1a). El multímetro permite varios microsensores de2O de N ser utilizado al mismo tiempo. Por ejemplo, hasta sedimentos cuatro núcleos desde el mismo sitio de estudio se pueden medir simultáneamente para tener en cuenta la variabilidad espacial.

El enfoque de base apenas perturba la estructura de sedimentos en comparación con otros métodos (e.g., lodos). Si se altera la integridad de los sedimentos, esto conduce a desnitrificación irreales tasas13 que sólo son adecuados para las comparaciones relativas. Tasas más altas se obtienen siempre con métodos de mezcla frente a los métodos de base14, porque este último conserva la limitación de la desnitrificación por sustrato difusión15. Medidas de la mezcla no pueden considerarse a representante de en situ las tasas16; proporcionan medidas relativas para las comparaciones realizadas con el mismo procedimiento exacto.

El método descrito es apropiado para estimar las tasas de desnitrificación en cualquier tipo de sedimento que puede ser tubular. Particularmente recomendamos el método para realizar las manipulaciones experimentales de algunos de los factores. Los ejemplos son experimentos que modifican la disponibilidad de nitrato y de la temperatura según sea necesario para la estimación de la energía la activación (Ea) desnitrificación17 (figura 2).

Figure 1
Figura 1 : Configuración experimental. (a) General disposición experimental para estimar tasas de desnitrificación de sedimento utilizando núcleos y N2O microsensores. La cámara de incubación asegura condiciones de oscuridad y temperatura controlada (±0. 3 ° C). Cinco núcleos de sedimento intacto pueden procesarse simultáneamente con sus respectivos sensores de2O N. (b) N2O cámara de calibración de sensor. Nos adaptamos con tapones de goma y jeringas para mezclar el N2O agua (ver protocolo paso 3.4.3). Hay un termómetro para controlar la temperatura del agua. (c) primer plano de una muestra de núcleo de sedimento con el sensor insertado en el orificio central de la cubierta de PVC y las juntas selladas con cinta adhesiva. El agitador está colgando en el agua, y el electroimán está cerca de él y fijado a la parte externa del tubo acrílico. (d) cerca de la N2O microsensor punta protegida por una pieza de metal. (e) un núcleo de sedimento que apenas se ha recuperado. Fue muestreado de un barco en un lago profundo; el tubo de acrílico con el núcleo se fija todavía la gravedad adaptados al Mensajero corer19. Vea la Tabla de materiales de todos los elementos necesarios para realizar este método. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Protocol

1. preparación

Nota: Esto comienza el día antes de las mediciones.

  1. Montar la instalación de medición (figura 1a, ver la Tabla de materiales).
    Nota: Para asegurar un suministro de energía constante y de alta calidad, el equipo de medida está conectado a la empuñadura mediante una fuente de alimentación ininterrumpida (UPS) que también puede actuar como una copia de seguridad. En el caso de una falla de energía de larga duración, una batería de coche sirven como una fuente de energía extra.
  2. Iniciar el software del sensor y aplique un -0.8 V Voltaje para polarizar el N2O microsensores. La señal muestra un descenso rápido y un aumento subsecuente y finalmente disminuye hasta que se baja y estable.
    Nota: El fabricante de microsensor recomienda polarización al menos durante la noche (o más) para asegurar la estabilidad de la señal del sensor. Otra recomendación es mantener el sensor polarizado si las medidas están previstas para múltiples o días consecutivos18.
  3. Encienda la cámara de incubación y ajustar las condiciones experimentales (por ejemplo, las luz apagada y la temperatura será similar a la que se espera que en el campo). Coloque un recipiente con agua desionizada dentro de la cámara para que el agua está disponible más tarde en la temperatura de medición para la calibración de los sensores.
    Nota: Este paso puede hacerse el mismo día de las medidas previstas, antes de la salida para recoger los corazones. Para medidas estandar, es aconsejable utilizar condiciones de oscuridad.
  4. Paquete de la base de campo materiales de colección: dispositivo de corer, tubos, tapones de goma, grifos de cloruro de polivinilo (PVC), destornillador, unidad del sistema (GPS) de posicionamiento global, termómetro, sonda de mano, ave zancuda y barco inflable de muestreo (ver el tabla de Materiales). Utilice una lista de verificación para asegurar que todos los materiales están incluidos.

2. sedimento base colección

  1. Dependiendo de la profundidad del agua, siga 2.1.1 2.1.2.
    1. Para cuerpos de agua profunda
      1. Utilice un corer de gravedad adaptados al Mensajero19 de un barco o una plataforma (figura 1e).
      2. Fijar el tubo de muestreo (acrílico, ø 6,35 cm, longitud ≥ 50 cm) para el tubo con un destornillador.
      3. Seleccione el punto de muestreo según los objetivos de la investigación. Tome nota de la posición (por ejemplo, usando coordenadas GPS) y la profundidad de medición (por ejemplo, utilizando una sonda de mano). Si el muestreo desde un bote, utilice un ancla (p. ej., una bolsa con piedras) para evitar la deriva durante la colección núcleo.
      4. Implementar el sistema de perforación hasta que el tubo de muestreo es de ~ 1 m del sedimento. Use una cuerda con marcas regulares (p. ej., intervalos de 1 m) para controlar la posición de la profundidad de los equipos de muestreo.
      5. Estabilizar los equipos de muestreo de 60 s (por ejemplo, para reducir al mínimo el movimiento del barco). Esto asegurará la penetración correcta del sedimento y la recuperación de un núcleo de sedimento apenas perturbado.
      6. Liberar m ~ 1 cuerda más para que el tubo de muestreo penetra en el sedimento. Tenga en cuenta que si penetra demasiado en el tubo de muestreo, puede alterar la interfaz agua/sedimento.
      7. Suelte al messenger al intentar mantener la tensión en la cuerda para que el tubo quede fijo y en posición vertical. Cuando el Mensajero impacta el tubo, se puede sentir una pequeña diferencia en la tensión de la cuerda. En ese momento, cerrar el tubo para generar el vacío que permite la recuperación de la base de sedimento.
      8. Recuperar el tubo tirando de la cuerda suavemente y constantemente.
      9. Una vez que el núcleo está cerca de la superficie pero aún completamente sumergido (incluyendo la parte de goma del tubo que garantiza el vacío), coloque un tapón de caucho en la parte inferior del tubo de muestreo. Inspeccione la interfaz agua/sedimentos; debe ser claro y no visiblemente perturbada (figura 1e). Si este no es el caso, deseche la base, limpie el tubo y repita los pasos 2.1.1.4-9.
      10. Elevar todo el sistema de perforación de agua. Suelte el tubo de muestreo desde el tubo y colocar una capa de PVC en la parte superior. Sellar con cinta adhesiva. Evitar la formación del espacio aéreo.
    2. Hábitats litorales y cuerpos de agua superficial
      1. Vestido en un ave zancuda para muestreo en aguas muy someras (< 0,6 m).
      2. Uso de snorkel o scuba gear para muestreo profundo (hasta 3 m).
      3. Seleccione el punto de muestreo según los objetivos de la investigación. Tome nota de la posición (por ejemplo, coordenadas GPS). Manualmente, inserte el tubo de muestreo (por ejemplo, acrílico, ø 6,35 cm) en el sedimento.
      4. Coloque un tapón de caucho en la parte superior del tubo de muestreo para obtener un vacío.
      5. Retire la base del sedimento y rápidamente introducir otro tapón de goma en la parte inferior del tubo.
        Nota: Es necesario trabajar con el tubo bajo el agua en todo momento; en sitios de muy poca profundidad, se recomienda acortar el tubo de hasta 20 cm. A veces el sedimento tiene un alto contenido de agua y desagües cuando el tubo se saca de la cama de sedimentos. En este caso, es necesario introducir el tapón de abajo sin elevar el núcleo fuera el sedimento. Para ello, manualmente sumerja el tapón en el sedimento alrededor del tubo y colóquelo cuidadosamente para cerrar la parte inferior del tubo.
      6. Fuera del agua, sustituir el tapón de goma superior con una capa de PVC y sellar a la Unión con cinta adhesiva.
  2. Proteger el núcleo durante su traslado al laboratorio reduciendo al mínimo las rotaciones y agitándolo.

3. calibración de los microsensores de óxido nitroso (N2O)

  1. Usando la computadora (tabla de la tira, software del sensor), compruebe que la señal del sensor es estable y baja (< 20 mV).
  2. Crear un nuevo archivo (por ejemplo, con la fecha y el sitio de muestreo (130903_Redon_Lake)) para registrar los valores de calibración y señales de los sensores.
    Nota: Las señales de los sensores son sensibles a la temperatura (figura 4). Utilice la misma temperatura para la medición y la calibración del sensor. El sensor responde linealmente entre 0% - 2.5% N2O20. Por lo tanto, una calibración de dos puntos es suficiente18.
  3. Para la calibración el valor con cero óxido nitroso, leer la señal del sensor mantiene la punta del sensor sumergido en N2libre O agua (desionizada).
  4. Calibrar con N2O agua a la concentración deseada.
    Nota: Prepara agua con una definida concentración de N2O, que superará ligeramente la concentración máxima esperada durante la incubación. Utilizamos ~ 25 μm N2O como el valor de calibración. Tenga en cuenta de no sobrepasar la concentración de gama sensor máximo de 500 μm de2O N.
    1. Obtener N2O saturado de agua por burbujas de N2O en agua desionizada durante unos minutos.
      Nota: La solubilidad de agua de N2O depende de la temperatura y la salinidad21; Consulte la tabla en el apéndice del manual sensor18.
    2. Diluir el N2O saturado de agua mediante la adición de un volumen determinado de agua saturada de2O N hasta un volumen de agua desionizada. Por ejemplo, a 20 ° C, agregar 0.3 mL de agua de2O saturada N, que tiene una concentración de 28,7 mM N2O, para un total de 375 mL de agua para obtener un 22,9 μm N2O concentración. Nota que 375 mL es el volumen total de la cámara de calibración (figura 1b).
    3. Después de mezclar suavemente el N2O agua saturada con agua desionizada en el recipiente de calibración para diluirla a la concentración deseada, leer la señal del sensor cuando es constante. Esta lectura es el valor de calibración con agua de X µM N2O. Al mezclar la solución, tenga cuidado de no generar burbujas, como esto eliminaría N2O de la solución de calibración.
      Nota: Tenga en cuenta que el N2O en el agua se escapará lentamente en el aire; por lo tanto, la solución de calibración preparada puede utilizarse sólo durante unos minutos.

4. base de preparación y la inhibición de acetileno

  1. Cambio la cubierta de PVC ubicada en la parte superior de cada núcleo de sedimento por otra tapa con un agujero en el centro y un agitador magnético colgante. Vuelva a sellar a la Unión con cinta adhesiva.
  2. Reducir la fase de agua de cada muestra a una altura aproximada de 12 cm (volumen ≈ 380 mL). Para ello, primero se debe introducir un tubo de silicona en el orificio central. Después, el núcleo de sedimento en un cilindro y empuje el tapón de la parte inferior para crear presión. Suben el tapón y la muestra de sedimento, y el exceso de agua pasa a través del tubo. Recoger el agua en un recipiente receptor.
    Nota: Las muestras con granularidad gruesa pueden ser problemáticas durante este paso. Partículas de sedimento colocadas entre el tapón y el tubo pueden deformar el tapón y abrir un agujero a través del cual el aire burbujas pueden pasar y molestar a la muestra. Para evitar este problema, coloque el cilindro en el centro del tapón inferior y tratar de empujar con una fuerza constante. La unión entre el tubo de silicona se utiliza para evacuar el exceso de agua y la cubierta de PVC consta de una parte sólida (por ejemplo, una pipeta de 5 mL sin su extremo más estrecho) insertada en el tubo de silicona.
  3. Llevar a cabo la inhibición de acetileno burbujear con gas de acetileno en la fase de agua de la base de aproximadamente 10 minutos. Evitar Resuspender el sedimento.
    Nota: Como una posible modificación del método, añadir un sustrato (nitrato) a través de un medio líquido concentrado antes de burbujear el acetileno para posibles medidas de desnitrificación (p. ej., como en la figura 3b, c).

5. desnitrificación (medida de acumulación de N2O)

  1. Llenar todo el espacio de aire en la muestra con el agua sobrante anterior. Coloque el sensor en la base del sedimento a través del orificio central de la parte superior cubierta de PVC. La punta del sensor debe estar ubicada en la fase de agua encima del agitador (figura 1c).
    Nota: Todas las juntas del acrílico del tubo de muestreo deben ser selladas para evitar fugas de agua y gas durante la medición (figura 1a, c). En la parte inferior del tubo, el tapón de goma es suficiente para esto. Sellado de la parte superior es más difícil. Debe ajustarse la cubierta de PVC. Debe ser calentado con una antorcha; Luego, cuando el material se vuelve flexible, pero no es quemado, la tapa se coloca en el tubo para que su forma puede ser moldeada. Después de enfriar, la cubierta necesita más modificaciones (a excepción de la cubierta utilizada para transportar las muestras al laboratorio en pasos 2.1.1.10 o 2.1.2.6). El agujero central donde se inserta el sensor debe ser perforado. El agitador puede ser sostenido con una línea de pesca, que a su vez se adhiere con el pegamento en el interior de la cubierta para que el agitador se cuelga en la línea de pesca en el agua (figura 1c). Además, todas las juntas (cubierta tubo de PVC y PVC cubierta sensor) se sellan con cinta adhesiva. Coloque cinta adhesiva elástica para ajustar el diámetro del sensor con el fin de sellar la superficie de contacto entre el agujero central de la cubierta de PVC y el sensor (figura 1c).
  2. Interruptor en el circuito de pulso electromagnético que es parte del sistema de agitación.
    Nota: El sistema de agitación impide la estratificación de la fase de agua sin inquietante (resuspender) el sedimento. El sistema de agitación consta de un circuito de interruptores de encendido/apagado el electroimán que atrae/comunicados el agitador magnético (véase la Tabla de materiales para una descripción detallada).
  3. Mover el electroimán en la parte externa del tubo acrílico hasta que el agitador se mueve continuamente y luego fijarlo con cinta adhesiva (figura 1c).
  4. Cerca de la cámara de incubación para asegurar una temperatura constante (por ejemplo, variación de ±0. 3 ° C).
  5. Presione el botón de grabación (software del sensor) para iniciar la grabación de la señal del sensor. Las lecturas se registran típicamente cada 5 min.
  6. Presione el botón stop al final del período de medición.

6. final medición pasos

  1. Espere por lo menos ~ 10 min con la punta del sensor sumergido en agua libre de N2O (desionizada) antes de leer la señal de la medida de calibración cero2O de N.
  2. Realizar una calibración del sensor final. Para ello, repita la calibración del sensor, siguiente sección 3, pero a partir de paso 3.3.
  3. Guarde el archivo (software del sensor).

7. cálculos de tasa de desnitrificación

  1. Comience con el archivo de tabulados de salida generado por el software del sensor que contiene el registro de la señal del sensor en mV y μm N2O y los datos de calibración.
  2. Trama de la señal del sensor contra el tiempo para visualizar la tendencia de acumulación de2O N (por ejemplo, figura 2a).
  3. Utilice sólo el intervalo de tiempo con una acumulación lineal, excluyendo el período de aclimatación inicial de la muestra y una posible saturación final debido a la limitación de sustrato (por ejemplo, figura 2b). Crear un modelo lineal de la señal del sensor (μm) en el tiempo (h).
    Nota: La pendiente es la tasa de desnitrificación (μm N2O de la base-1 h-1), que, si se divide por el área de la base (πr2), transforma la tasa en μm N2O m-2 h-1y al multiplicar por el volumen (πr2h, donde h es la altura de la fase de agua y r es el radio interior del tubo acrílico, en este caso 0,12 m y 0,03175 m, respectivamente) el agua transforma la tasa en μmol N2O m-2 h-1.

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Representative Results

Un total de 468 tasas de desnitrificación se estimaron usando el protocolo anteriormente en sedimentos de lagos de montaña pirenaicos durante el período 2013-2014. Mostramos algunos de estos resultados para ilustrar el procedimiento (figura 2 y figura 3). En general, el modelo lineal entre la concentración de N2O y tiene buena correlación (R2 ≥ 0.9). La pendiente de la relación proporciona una estimación de la tasa de desnitrificación (paso 7.3; por ejemplo, figura 2d). Si la actividad de la desnitrificación es muy baja, ruido electrónico del sensor se vuelve más importante y la bondad de ajuste disminuye (p. ej., sensores de 4 y 5 en la figura 2b y figura 3a). Aunque el límite de detección instantánea de N2O es ~0.1 μm en agua22, que es un intermediario valor sobre métodos alternativos23, la posibilidad de acumuladas miles de mediciones continuas para filtrar el ruido permite estimaciones a tasas relativamente bajas de desnitrificación, hasta ~ 1 μmol N2O m-2 h-1 (figura 2 y figura 3). Tasas más bajas (es decir, ~0.4 μmol N2O m-2 h-1) puede estimarse por estrechamiento de la fase de agua de la muestra de base hasta una altura de 8 cm (ver protocolo paso 4.2).

Figure 2
Figura 2 : Cálculos de la tasa de desnitrificación en un experimento de dependencia de la temperatura. Real (a y b) y medidas potenciales de desnitrificación (c–f) se muestran. Cuando la temperatura de la medida está disminuida (c), en el primero se enfría la muestra y la señal del sensor, que es dependiente de la temperatura, disminuye. (a) A un evento similar ocurre en el inicio de la incubación en la medición real de la desnitrificación; el cálido ambiente de laboratorio con respecto a las condiciones de incubación produce un enfriamiento de la muestra, otra vez acompañada por una disminución en la señal del sensor. (e) cuando la temperatura se incrementa, al principio las muestras calientes y la señal del sensor aumenta exponencialmente en vez de linealmente. Cuando las muestras a una temperatura constante, la señal del sensor aumenta linealmente como de costumbre. En todos los casos, es posible calcular las tasas de desnitrificación sólo mediante el uso del período de acumulación lineal de2O de N (b, dy f). (b) inactivo muestra 3 no se muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Ejemplos de desnitrificación tasa cálculos. Se estimaron real (un) y posibles tasas de desnitrificación (b y c). Sólo utilizamos el rango de tiempo con una acumulación lineal de2O de N para calcular la tasa de desnitrificación (pendiente del modelo lineal). Sin embargo, en (un), para fines educativos, muestran todas las medidas (modelos) con más y menos éxito; descartamos muestra 3 debido a la alta inestabilidad del sensor y muestra 2 debido a la saturación en la acumulación de N2O. (a) muestras 4 y 5 con tasas de 0.5 y 0.7 μmol N2O m-2 h-1, respectivamente, son casos de mediciones cerca del límite de detección del método. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Las principales ventajas del método descrito son el uso de muestras del núcleo de sedimento mínimamente perturbados y el registro continuo de la acumulación de N2O. Estos permiten estimación de las tasas de desnitrificación relativamente baja que probablemente similares a ésos que ocurren en situ. Sin embargo, se discuten algunos aspectos relativos a la perforación, rendimiento del sensor y mejoras potenciales.

Un paso aparentemente sencillo pero fundamental del método es la recuperación de buena base. La interface sedimento/agua debe satisfacer tres criterios: (i) ninguna modificación en su composición química o constitutiva, (ii) ninguna alteración en el contenido de agua o relación de vacíos y (iii) ninguna estructura pertubation24. Los disturbios menos sufridos por la muestra durante el conjunto del Protocolo, más realista y más cerca en situ condiciones voluntad ser la tasa de desnitrificación medido. Hay varios dispositivos y técnicas para el sedimento base colección25, y su selección depende de la profundidad del agua. Utilizamos un corer de gravedad adaptados al Mensajero19 para muestras profundas (figura 1e) porque es un dispositivo bastante ligero y puede recuperarse rápidamente corta corazones25 (un sedimento base de ≥ 10 cm de longitud es más que suficiente para abarcar las oxic y desnitrificar capas en los sedimentos26,27,28). En jerga de base, "sentir" se refiere a menudo como la capacidad de conocer la ubicación del tubo (ya sea en la columna de agua o ya en el sedimento) y si es abierta o cerrada25. Para profundidades de agua intermedia (5-50 m), generalmente no hay dificultades con la sensación. Se produce una pérdida de sensación en aguas más profundas (> 50 m) debido a los movimientos de la columna de agua pueden ocultar la ubicación del corer de la25. Sensación también puede ser perdida en aguas poco profundas (< 3 m) debido a la deriva lateral y la onda acción25; por esta razón utilizamos un método diferente en aguas poco profundas, ya sea manual directo de base por buceo o vestir de un ave zancuda. Con este sistema, la persona que realiza el muestreo puede ver el sedimento y elegir el lugar exacto antes de perforación; Esto permite, por ejemplo, el muestreo de un núcleo de sedimento que contiene un macrófitos. Después del muestreo, el investigador debe seguir trabajando cuidadosamente para perturbar mínimamente la muestra de núcleo de sedimento durante el resto del Protocolo, especialmente cuando se realiza la inhibición de acetileno por burbujeo.

Algunos detalles deben considerarse cuando se usa el N2O microsensores. El software del sensor proporciona una visualización continua (carta de tira) del sensor de la señal (frecuencia de fondo de 1000 Hz)29. Pueden guardar estos datos y la tabla de la tira (por ejemplo, figura 2a). Es necesario verificar el comportamiento correcto del sensor después de su polarización (por ejemplo, al volver de la colección de campo antes de paso 4). En particular, una baja (< 20 mV) y señal de base constante se espera cuando está sumergido en agua de N2O libre. Vuelva a calibrar el sensor de poco tiempo (2 h) después de comenzar su uso; Si ya ha sido utilizado por algunos días, el intervalo puede ampliarse (~ 24 h)18. Para minimizar el recalibraciones, mantenga el sensor polarizado a menos que no se utiliza para varios días18. Con el tiempo, un cambio en la señal del sensor puede ocurrir, hasta un 50% en meses, que es debido a una diferente permeabilidad de su membrana18. Menor será la interferencia electrónica en el laboratorio, el más constante y estable será la señal del sensor. En ese sentido, usando un UPS mejora la calidad de la energía eléctrica que llega hasta el dispositivo de medición por filtrado de las fluctuaciones del voltaje. El intervalo de muestreo seleccionado en la ficha de registro, es diferente de la frecuencia de fondo. Cada punto registrado se genera del promedio de muchas medidas. El intervalo de muestreo (10 s) indica la frecuencia con la que se registra un punto de datos. El número de mediciones por unidad de tiempo usada en el medio se define por la frecuencia de fondo29. Por ejemplo, si establece una frecuencia de muestreo de 5 s y una frecuencia de fondo de 500 mediciones por segundo, entonces los datos son registrados cada 5 s y el promedio de las 500 muestras por segundo se mide durante el anterior 5 s. Grabar la señal del sensor cada 5 min (intervalo de muestreo) y ajustar la frecuencia de fondo para 1000 mediciones por segundo. El sistema de estudio debe ser conocido para seleccionar el intervalo de muestreo correcto sin "promedio" de las fluctuaciones esperadas. En sistemas altamente activos, se recomiendan intervalos de muestreo corto, mientras que los intervalos más largos permiten optimizar memoria29 la computadora. Algunos posibles sustancias interferentes (H2S, n, y CO2) pueden afectar el N2O sensor señal22. El sensor está calibrado con agua desionizada, pero las muestras pueden contener sustancias que interfieren y modificar la señal de referencia del sensor. Esta situación podría explicar por qué valores negativos aparecen en las muestras 2 y 5 en la figura 2b y 3a Figura, respectivamente. Sin embargo, cuando el objetivo es estimar la tasa de desnitrificación, el nivel exacto de N2O no es el parámetro clave. Lo clave es la pendiente del modelo lineal (evidenciando una acumulación lineal de N2O). Finalmente, es necesario trabajar con una temperatura fija, porque la respuesta del sensor2O N cambia con la temperatura (figura 4).

Simples modificaciones o adiciones en el protocolo también permiten (i) caracterización de las condiciones ambientales, control de las tasas de desnitrificación medido, (ii) estimación de las tasas de desnitrificación potencial mediante la simulación de la respuesta a la conducción de un gradiente (p. ej., nitrato) y (iii) estimación de las tasas de emisión de sedimentos N2O por saltarse la C2H2 inhibición dependiendo de los objetivos del estudio, se pueden hacer varias mediciones complementarias: (i) después de recuperar la en situ las condiciones, por ejemplo, la temperatura; (ii) antes de la medición, las muestras de la fase de agua, por ejemplo, [NO3–]; y (iii) después de la medición, extrusiones y rebanadas del núcleo a distintas resoluciones (mm cm)25,30, siguiendo los procedimientos explicaron por P. T. Schwing et al. 30.

Para medir las posibles tasas de desnitrificación, añadir nitrato a la fase de agua de la base (p. ej., figura 2 y figura 3) como se describe en C. Palacin-Lizarbe, Camarero L. y J. Catalán17. Si al hacerlo, agregar el nitrato antes de la inhibición de C2H2 (paso 4.3). Además, si se agrega nitrato, es aconsejable también añadir carbono (C; por ejemplo, acetato) y fósforo (P) para mantener las proporciones estequiométricas en situ de C, N y P (por ejemplo, en el sedimento superficial). Esto evitará que la limitación de la desnitrificación por estos elementos31,32y también mantendrá la relación C/N que puede influir en el predominio del proceso de consumo de nitrato (es decir, desnitrificación versus reducción silfito nitrato de amonio (DRNA))4. La anoxia puede ser fijada por una mezcla de N2-CO2 que burbujea durante unos pocos minutos después de la adición de nitrato, para prevenir la interferencia del oxígeno con desnitrificación; sin embargo, tenga en cuenta que esto lleva a una obstrucción de nitrificación. Para calcular la tasa de emisión de sedimentos N2O, omitir el C2H2 la inhibición (paso 4.3). Sin embargo, tenga en cuenta que, como se conoce actualmente en los ecosistemas acuáticos, las emisiones de N2O son proporcionalmente bajas comparado con N2 emisiones (0% - 4,3%)33, por lo que es posible que la acumulada de N2O sea por debajo de el límite de detección. Si este es el caso, una opción es añadir nitrato para aumentar emitida N2O, cálculo de potenciales emisiones de N2O.

La principal debilidad del método es la inhibición de la nitrificación por C2H210,34. Durante la incubación, esta inhibición de la nitrificación y la inhibición incompleta de la reducción de N2O pueden llegan a ser evidentes, ya que ambos son muy tiempo dependiente. Por ejemplo, la tasa de acumulación a partir de N2O debe revelar la tasa de desnitrificación real y progresivamente del decaimiento como la disponibilidad de nitrato cae y N2O se difunde en la zona libre de nitrato, que es menor de35. Por lo tanto, una tasa de desnitrificación estimada puede ser considerada válida sólo si las lecturas muestran una acumulación lineal de N2O10.

El método descrito estima una tasa de desnitrificación por área que integra la actividad de todo sedimento. En este sentido, hay cierta incertidumbre sobre el radio de acción de la inhibición de acetileno al burbujear el gas en la fase acuosa de la muestra. Se supone que, al menos, inhibición de la capa superficial del sedimento se produce, que es uno con la más alta desnitrificación tarifas26,27.

Posibles mejoras a este método son su uso combinado con marcadores de 15N y modificaciones que permitan la medición de la desnitrificación en situ. 15 Métodos del trazalíneas de N pueden utilizarse para determinar la proporción de acoplamiento que se produce en las muestras36nitrificación-desnitrificación, y también puede explicar otros procesos de flujo de N además de desnitrificación (p. ej., anammox y silfito reducción del nitrato a amonio (DRNA))13,37. Sin embargo, estos métodos tienen el inconveniente de cambiar la concentración de sustrato10. A. Behrendt, D. de Beer y Stief P. 26 utilizan un método de combinación de microsensores de N2O, C2H2 inhibición y trazadores de 15N para analizar la distribución vertical de la actividad de reducción de nitrato silfito procesos (desnitrificación y DRNA) en los sedimentos. Hicieron perfiles verticales en el sedimento por penetrar el sedimento con los sensores. La principal dificultad en la medición de desnitrificación en situ es la capacidad para manejar un ambiente de temperatura no constante. Es necesario registrar la temperatura y acumulación de N2O al mismo tiempo y luego corregir la señal del sensor de2O de N por la dependencia de la temperatura durante los cálculos de la tasa de desnitrificación. Esta corrección requiere un análisis previo de la dependencia de la temperatura de la señal de2O de N para cada sensor. Los sensores son hechos a mano, y cada uno responde diferentemente a la temperatura (p. ej., sensor 1 muestra una mayor dependencia de la temperatura que los otros en la figura 2c, e).

Figure 4
Figura 4 : Dependencia de la temperatura de la respuesta de microsensor de N2O. Las diferentes pistas del modelo lineal de la sensor señal versus la temperatura en la concentración de O2de cada N muestra el efecto de la temperatura sobre la señal del sensor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

El gobierno español proporciona fondos a través del Ministerio de Educación como una beca predoctoral a C.P-L. (FPU12-00644) y becas de investigación del Ministerio de Economia y Competitividad: NitroPir (CGL2010-19737), Lacus (CGL2013-45348-P), transferencia () CGL2016-80124-C2-1-P). El proyecto REPLIM (INRE - programa INTERREG. EUUN - Unión Europea. EFA056/15) apoyó la redacción final del protocolo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Messenger-adapted gravity corer - - Reference in the manuscript. Made by Glew, J.
Sampling tube - - Acrylic. Dimensions: 100 cm (h) × 6.35 cm (d) × 6.50 cm (D). Sharpen the edge of the sampling tube that penetrates into the sediment to minimize the disturbance in the recovered sediment core sample.
Handheld sounder Plastimo 38074 Echotest II Depth Sounder.
Rubber stopper VWR DENE1012114 With two holes, used to mix the N2O-water in the calibration chamber. Dimensions: 20 mm (h) × 14 mm (d) × 18 mm (D) (3 mm hole (D)).
Rubber stopper VWR 217-0125 To seal the bottom part of the methacrylate tube and to sample in shallow water bodies. Dimensions: 45 mm (h) × 56 mm (d) × 65 mm (D).
Rubber stopper VWR 217-0126 Place the rubber stopper in the top side of the sampling tube to obtain a vacuum for sampling in littoral zones and shallow water bodies. Dimensions: 50 mm (h) x 60 mm (d) x 70 mm (D).
PVC cover - - To seal the top side part of the acrylic tube. Dimensions: 45 mm (h) × 56 mm (d) × 65 mm (D). Dimensions: 65 mm (D).
Adhesive tape - - Waterproof. To ensure all joints (PVC cover sampling tube and PVC cover sensor) and to avoid water leaks.
Thermometer - - Portable and waterproof, to measure the temperature in the water overlying the sediment just after sampling the cores.
GPS - - To save the location of a new sampling site or to arrive at a previous site.
Wader - - For littoral or shallow site samplings.
Boat - - An inflatable boat is the best option for its lightness if the sampling site is not accessible by car.
Rope - - Rope with marks showing its length (e.g., marked with a color code to distinguish each meter).
N2O gas bottle and pressure reducer Abelló Linde 32768-100 Gas bottle reference.
C2H2 gas bottle and pressure reducer Abelló Linde 32468-100 Gas bottle reference.
Tube used to evacuate the excess of water - - Consists of a solid part (e.g., a 5 ml pipette tip without its narrowest end) inserted in a silicone tube.
Nitrous Oxide Minisensor w/ Cap Unisense N2O-R We use 4 sensors at a time.
Microsensor multimeter 4 Ch. 4 pA channels Unisense Multimeter Picoammeter logged to a laptop. The standard device allows for 2 sensor picoammeter connections (e.g., N2O sensor), one pH/mV and a thermometer. We ordered a device with four picoammeter connections, allowing the use of 4 N2O sensors simultaneously.
SensorTrace Basic 3.0 Windows software Unisense Sensor data acquisition software.
Calibration Chamber incl. pump Unisense CAL300 Calibration chamber. We tuned it with rubber stoppers and syringes to mix the N2O-water without making bubbles.
Incubation chamber Ibercex E-600-BV Indispensable equipment for working at a constant temperature (±0.3 °C). It also allows control of the photoperiod.
Electric stirrer - - Part of the stirring system. It hangs in the water, overlying the sediment subject, by a fishing line that is hooked to the PVC cover.
Electromagnet - - Part of the stirring system. It is fixed to the outside of the acrylic tube, approximately at the same level as the stirrer. It is activated episodically (ca. 1 on-off per s) by a circuit, attracting the stirrer when it is on and releasing it when it is off, thereby generating the movement that agitates the water.
Electromagnetic pulse circuit - - Part of the stirring system. It is connected by wires to the electromagnet and sends pulses of current that turn the electromagnet on and off.
Uninterruptible power supply (UPS) - - It improves the quality of the electrical energy that reaches the measurement device, filtering the highs and low of the voltage, thereby ensuring a more constant and stable N2O sensor signal.

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Palacin-Lizarbe, C., Camarero, L., Catalan, J. Estimating Sediment Denitrification Rates Using Cores and N2O Microsensors. J. Vis. Exp. (142), e58553, doi:10.3791/58553 (2018).

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