Uppskatta Sediment denitrifikation priser med kärnor och N₂O mikrosensorer

Summary

Denna metod bedömer sedimenten denitrifikation priser i sedimentkärnor som använder acetylen hämning teknik och mikrogivare mätningar av den ackumulerade N₂O. Protokollet beskrivs förfaranden för insamling av kärnar ur, kalibrera den sensorer, utför acetylen hämning, mäta N₂O ansamling och beräkning denitrifikation.

Abstract

Denitrifikation är primära biogeokemiska processen att ta bort reaktivt kväve från biosfären. Den kvantitativa utvärderingen av denna process har blivit särskilt relevant för bedömningen av antropogena-förändrad global Kvävets kretslopp och utsläpp av växthusgaser (dvs N₂O). Det finns flera metoder för att mäta denitrifikation, men ingen av dem är helt tillfredsställande. Problem med befintliga metoder inkluderar deras otillräcklig känslighet, och behovet av att ändra nivåerna som substrat eller förändra den fysiska konfigurationen av processen med störda prover. Detta arbete beskriver en metod för att uppskatta sediment denitrifikation priser som kombinerar coring, acetylen hämning och mikrogivare mätningar av den ackumulerade N₂O. De främsta fördelarna med denna metod är en låg störning av sediment struktur och insamling av en kontinuerlig registrering av N₂O ackumulering; Dessa möjliggör uppskattningar av tillförlitliga denitrifikation priser med lägsta värden upp till 0.4-1 µmol N₂O m^-2 h^-1. Förmågan att manipulera nyckelfaktorer är en ytterligare fördel för att erhålla experimentella insikter. Protokollet beskrivs förfaranden för insamling av kärnar ur, kalibrera den sensorer, utför acetylen hämning, mäta N₂O ansamling och beräkning denitrifikation. Metoden är lämplig för att uppskatta denitrifikation priser i alla akvatiska system med hämtas sedimentkärnor. Om N₂O koncentrationen ligger över detektionsgränsen för sensorn, kan steget acetylen hämning utelämnas att uppskatta N₂O utsläpp istället för denitrifikation. Vi visar hur för uppskattning av både faktiska och potentiella denitrifikation genom att öka nitrat tillgänglighet samt temperaturberoendet av processen. Vi illustrerar förfarandet enligt mountain lake sediment och diskutera fördelar och svagheter av tekniken jämfört med andra metoder. Denna metod kan ändras för särskilda ändamål. Det kan till exempel kombineras med ¹⁵N spårämnen att bedöma nitrifikation och denitrifikation eller fält i situ mätningar av denitrifikation priser.

Introduction

Antropogena förändringar av Kvävets kretslopp är en av de mest utmanande problem för Earth system¹. Mänsklig aktivitet har minst fördubblats nivåerna av reaktiva kväve tillgängligt till biosfär². Finns dock fortfarande stor osäkerhet om hur den globala N cykeln utvärderas. Några flux uppskattningar har kvantifierats med mindre än ±20% fel, och många har osäkerheten i ±50% och större³. Dessa osäkerheter indikerar behov av noggranna uppskattningar av denitrifikation priser hela ekosystem och en förståelse för de bakomliggande mekanismerna av variation. Denitrifikation är en mikrobiell aktivitet genom vilken kväveinnehållande oxider, främst nitrat och nitrit, reduceras till Kvävetetroxid gaser, N₂O och N₂⁴. Vägen är mycket relevanta för biosfären tillgängligheten av reaktiva kväve eftersom det är den primära bearbetningsprocessen borttagning⁵. N₂O är en växthusgas med uppvärmningspotential nästan 300 gånger att co₂ över 100 år, och det är den nuvarande största orsaken till stratosfäriska ozonskiktet stora kvantiteter vara utsända^6,7.

I följande presenterar vi ett protokoll för att uppskatta sediment denitrifikation priser använda kärnor och N₂O mikrosensorer försöksvis (figur 1). Denitrifikation priser beräknas med hjälp av acetylen hämning metod^8,9 och mätningar av ansamling av N₂O under en definierad period (figur 2 och figur 3). Vi visar metoden genom att tillämpa det till mountain lake sediment. Denna fallstudie visar utförandet av metoden för att påvisa relativt låga priser med minimal störning för den fysiska strukturen i sedimenten.

Denitrifikation är särskilt svårt att mäta¹⁰. Det finns flera alternativa metoder och metoder, med fördelar och nackdelar. Nackdelar med tillgängliga metoder inkluderar deras användning av dyra resurser, otillräcklig känslighet och behovet av att ändra nivåerna som substrat eller förändra den fysiska konfigurationen av processen med störda prover¹⁰. En ännu mer grundläggande utmaning att mäta N₂ är dess förhöjda bakgrundsnivåerna i miljön¹⁰. Minskning av N₂O till N₂ hämmas av acetylen (C₂H₂)^8,9. Således, denitrifikation kan kvantifieras genom att mäta den ackumulerade N₂O i närvaro av C₂H₂, vilket är möjligt på grund av låga miljömässiga N₂O nivåer.

Användning av C₂H₂ att mäta denitrifikation priser i sediment utvecklades ungefär 40 år sedan¹¹och införlivandet av N₂O sensorer inträffade ungefär 10 år senare¹². Det mest tillämpad acetylen-baserat tillvägagångssättet är den ”statiska kärna”. Den ackumulerade N₂O mäts under en inkubationstid på upp till 24 h efter C₂H₂ läggs till headspace förseglade sediment core¹⁰. Den metod som beskrivs här följer proceduren med några innovationer. Vi lägger C₂H₂ av bubblande gasen i vatten fas kärnan i några minuter, och vi fyller alla headspace med prov vatten innan du mäter ansamling av N₂O med en mikrogivare. Vi har även en omrörningsanordning system som förebygger skiktningen av vattnet utan omblandning av sediment. Förfarandet kvantifierar denitrifikation frekvensen per sediment yta (t.ex., µmol N₂O m^-2 h^-1).

Hög rumsliga och tidsmässiga variationen av denitrifikation presenterar en annan svårighet i dess exakt kvantifiering¹⁰. Vanligtvis mäts N₂O ackumulering sekventiellt genom gaskromatografi av headspace prover som samlats in under ruvningen. Den beskrivna metoden ger förbättrad övervakning av temporala variationen av N₂O ansamling, eftersom mikrogivare ger en kontinuerlig signal. Mikrogivare multimeterns är en digital mikrogivare förstärkare (picoammeter) som gränssnitt med givare och datorn (figur 1en). Multimeterns tillåter flera N₂O mikrosensorer användas samtidigt. Till exempel, upp till fyra sediment kan kärnor från samma studie plats mätas samtidigt till kontot för den rumsliga variationen.

Metoden med core störer knappt sediment struktur jämfört med vissa andra metoder (t.ex., slam). Om integritet av sedimentsna ändras, leder detta till orealistiska denitrifikation priser¹³ som är endast lämpliga för relativa jämförelser. Högre priser erhålls alltid med flytgödsel metoder jämfört med core metoder¹⁴, eftersom den senare bevarar begränsning av denitrifikation av substrat diffusion¹⁵. Flytgödsel åtgärder inte kan anses vara representativ i situ priser¹⁶; de ger relativa åtgärder för jämförelser med exakt samma procedur.

Den metod som beskrivs är lämpligt för att uppskatta denitrifikation priser i någon typ av sediment som kan vara kärnhus. Vi rekommenderar särskilt metoden för att utföra experimentella manipulationer av några av de drivande faktorerna. Exempel är experiment som ändra nitrat tillgänglighet och temperatur som behövs för att uppskatta energi aktivering (E_en) av denitrifikation¹⁷ (figur 2).

Figur 1 : Experimentell setup. (en) allmänna experiment att uppskatta sediment denitrifikation priser med kärnor och N₂O mikrosensorer. Inkubation kammaren säkerställer mörker och temperaturreglerad (±0.3 ° C) förhållanden. Fem intakta sedimentkärnor kan bearbetas samtidigt med deras respektive N₂O sensorer. (b), N₂O sensor kalibrering kammare. Vi anpassade det med gummiproppar och sprutor att blanda den N₂O vatten (se protokollet steg 3.4.3). I området i närheten finns det en termometer för att kontrollera vattentemperaturen. (c) Närbild av ett sediment core urval med sensorn in i hål i mitten av locket PVC och fogarna tätas med tejp. Omröraren hängande i vattnet, och elektromagneten ligger nära det och fixade till den yttre delen av akryl röret. (d), närbild av de N₂O mikrogivare tips skyddas av en metallbit. (e) en sediment-kärna som bara har återvunnits. Det samplades från en båt i en djup sjö; akryl röret med kärnan är fortfarande fast till messenger-anpassad gravitation corer¹⁹. Se Tabell för material för alla objekt som behövs för att utföra denna metod. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Protocol

1. beredning

Obs: Börja detta dagen innan i mätningarna.

1. Montera den mätning setup (figur 1en, se Tabell för material).
   Obs: För att säkerställa en konstant och hög kvalitet strömförsörjning, mätning enheten är ansluten till den grepp via en avbrottsfri elkälla (UPS) som också kan fungera som en säkerhetskopia. Vid långvariga strömavbrott tjäna ett bilbatteri som en extra strömkälla.
2. Börja sensorns programvara och applicera en -0,8 V spänning att polarisera den N₂O mikrosensorer. Signalen visar en snabb nedstigning och en efterföljande uppgång, då det slutligen minskar tills det är låg och stabil.
   Obs: Mikrogivare tillverkaren rekommenderar polarisation minst över natten (eller längre) för att säkerställa stabiliteten i sensorns signal. En annan rekommendation är att hålla sensorn polariserade om mätningar planeras för flera eller på varandra följande dagar¹⁸.
3. Slå på inkubation kammare och Justera de experimentella förhållandena (t.ex., av valda lampa och temperatur att bli liknande som förväntas i fältet). Placera en behållare med avjoniserat vatten inne i kammaren så att vatten finns senare vid mätning temperatur för kalibrering av sensorerna.
   Obs: Detta steg kan göras samma dag som de planerade mätningarna, före avresan att samla kärnor. För standardmått är det tillrådligt att använda mörka förhållanden.
4. Packa fält kärnan samling material: kennyljung enhet, provtagning rör, gummiproppar, polyvinylklorid (PVC) kranar, skruvmejsel, global positioning system (GPS) enheten, termometer, handhållen ekolodet, vadare och gummibåt (se tabell för Material). Använda en checklista för att säkerställa att allt material ingår.

2. sediment Core Collection

1. Beroende på vattendjupet, följ 2.1.1 och 2.1.2.
   1. För djupa vattenförekomster
      1. Använd en messenger-anpassad gravitation corer¹⁹ från en båt eller en plattform (figur 1e).
      2. Fixa provtagning röret (akryl, ø 6,35 cm, längd ≥ 50 cm) till PIK med en skruvmejsel.
      3. Välj provtagningspunkten enligt undersökningen målen. Ta del av position (t.ex., med hjälp av GPS-koordinater) och mätning djup (t.ex., använder en handhållen ekolodet). Om provtagning från båt, Använd ett ankare (t.ex., en påse med stenar) att undvika drifting under core collection.
      4. Distribuera coring systemet tills provtagning röret är ~ 1 m från sedimenten. Använd ett rep med regelbundna märken (t.ex., med 1 m mellanrum) för att styra djup placering av provtagningsutrustning.
      5. Stabilisera provtagningsutrustning för 60 s (t.ex., att minimera förflyttning av båten). Detta kommer att säkerställa den rätta sediment penetration och återställningen av en knappt störd sediment kärna.
      6. Släppa ~ 1 m mer rep så att provtagning tuben penetrerar sediment. Tänk på att om provtagning röret tränger igenom alltför mycket, kan det störa gränssnittet vatten/sediment.
      7. Släppa messenger samtidigt försöka hålla spänningen i linan så att corer förblir fast och i vertikal position. När budbäraren påverkar PIK, kan en liten skillnad kännas i spänningen av repet. Stäng corer för att generera det vakuum som möjliggör återvinning av sediment kärnan på den tiden.
      8. Återställa corer genom att dra i repet hela tiden och försiktigt.
      9. När kärnan är nära ytan, men fortfarande helt nedsänkt (inklusive gummidelen av den PIK som säkerställer vakuum), placera en gummipropp i botten av provtagning röret. Inspektera gränssnittet vatten/sediment; Det bör vara tydliga och inte synbart störs (figur 1e). Om detta inte är fallet, ta bort kärnan, rengöra röret och upprepa steg 2.1.1.4-9.
      10. Lyfta upp hela coring systemet från vattnet. Släppa provtagning röret från Pik och placera en PVC-cover på toppen. Försegla det med tejp. Undvik bildning av luftar utrymme.
   2. Littoral livsmiljöer och grunt vatten organ
      1. Klänning i en vadare för provtagning i mycket grunda vatten (< 0.6 m).
      2. Använda snorkling eller dykning redskap för djupare provtagning (upp till 3 m).
      3. Välj provtagningspunkten enligt undersökningen målen. Ta del av position (t.ex., GPS-koordinater). In manuellt, provtagning röret (t.ex., akryl, ø 6,35 cm) in i sedimenten.
      4. Placera en gummipropp i ovansidan av provtagning röret att erhålla ett vakuum.
      5. Ta bort kärnan från sedimenten och snabbt introducera en annan propp längst ned röret.
         Obs: Det är nödvändigt att arbeta med röret under vattnet hela tiden; på mycket grunt platser rekommenderar vi förkorta röret ner till 20 cm. Ibland sedimenten har en hög vattenhalt och avrinningar när röret är bort från sediment sängen. I det här fallet är det nödvändigt att införa botten proppen utan upplyftande kärnan utanför sediment. Detta gör manuellt fördjupa proppen i sedimenten runt röret och placera den försiktigt för att stänga botten av röret.
      6. Ur vattnet, ersätta ovansida gummiproppen med en PVC-cover och försegla korsningen med tejp.
2. Skydda kärnan under dess överföring till laboratoriet genom att minimera rotationer och skakar.

3. kalibrering av lustgas (N₂O) mikrosensorer

1. Med hjälp av datorn (strip chart, sensor programvara), kontrollera att sensorns signal är låg och stabil (< 20 mV).
2. Skapa en ny fil (t.ex., med datum och webbplatsen provtagning (130903_Redon_Lake)) för att registrera kalibreringsvärden och sensorsignaler.
   Obs: Sensorsignaler är känsliga för temperatur (figur 4). Använd samma temperatur för mätningarna och sensorkalibrering. Sensorn reagerar linjärt mellan 0-2,5% N₂O²⁰. En två-punkt kalibrering är därför tillräcklig¹⁸.
3. För kalibrering Läs värde med noll lustgas, signalen från sensorn att sensorn spetsen dränka i N₂O-fri vatten (avjoniserat).
4. Kalibrera med N₂O vatten på önskad koncentration.
   Obs: Förbereda vatten med en definierad N₂O koncentration, som något överstiger den högsta koncentration som förväntat under inkubation. Vi använder ~ 25 µM N₂O som kalibreringsvärdet. Tänk på att inte överskrida den maximala sensor utbud koncentrationen av 500 N₂O µM.
   1. Få N₂O-mättade vatten av bubblande N₂O avjoniserat vatten i några minuter.
      Obs: N₂O vattenlöslighet beror på temperatur och salthalt²¹; Se tabellen i tillägg av sensorn manuell¹⁸.
   2. Späd N₂O mättade vattnet genom att tillsätta en viss mängd mättade N₂O vatten till en volym avjoniserat vatten. Exempelvis vid 20 ° C, tillsätt 0,3 mL mättad N₂O vatten, som har en koncentration av 28.7 mM N₂O, till sammanlagt 375 mL vatten för att få en 22,9 µM N₂O koncentration. Observera att 375 mL är den totala volymen av kalibrering kammare (figur 1b).
   3. Efter försiktigt blandning N₂O läsa mättad vatten med avjoniserat vatten i kalibrering fartyget att späda ut det till önskad koncentration, signalen från sensorn när den är konstant. Denna behandling är kalibreringsvärdet med X µM N₂O vatten. När blanda lösningen, vara noga med att inte generera bubblor, eftersom detta skulle eliminera N₂O från kalibreringslösningen.
      Obs: Tänk på att de N₂O i vattnet långsamt kommer att fly till luften. förberedda kalibreringslösningen kan således endast användas för några minuter.

4. kärna förberedelse och acetylen hämning

1. Förändring PVC locket ligger högst upp på varje sediment kärna av ett annat lock med ett hål i mitten och en hängande magnetomrörare. Åter försegla korsningen med tejp.
2. Minska den vattenfasen av varje prov till en ungefärlig höjd 12 cm (volym ≈ 380 mL). För detta, först infoga en silikon tub i hål i mitten. Sedan sätta sediment kärnan i en cylinder och driva de nedre flikarna för att skapa tryck. Den proppen och sediment prov gå upp, och överflödigt vatten passerar genom röret. Samla in vattnet i en mottagande fartyget.
   Obs: Prover med grov granularitet kan vara problematiskt under detta steg. Sediment partiklar placeras mellan proppen och röret kan deformera proppen och öppna ett hål genom vilka luft bubblor kan passera och stör provet. För att undvika detta problem, sätt cylindern i mitten av botten proppen och prova att skjuta med en konstant kraft. Skarven mellan silikon röret används för att evakuera överflödigt vatten och PVC locket består av en fast del (t.ex., en 5 mL pipettspetsen utan dess smalaste ände) infogas i silikon röret.
3. Utföra acetylen hämning av bubblande med acetylengas i vatten fas kärnan i ca 10 min. Undvika omblandning av sediment.
   Obs: Som en möjlig ändring av metoden, lägga till ett substrat (nitrat) genom ett koncentrerat flytande medium innan bubblande acetylen för potentiella denitrifikation mätningar (t.ex., som i figur 3b, c).

5. denitrifikation (N₂O ackumulering åtgärd)

1. Fyll alla luftrummet i provet med det tidigare överblivna vattnet. Placera sensorn i sediment kärnan genom hål i mitten av ovansidan PVC omslaget. Spetsen på sensorn bör finnas i vattenfasen ovan omröraren (figur 1c).
   Obs: Alla lederna i akryl provtagning röret måste tätas för att undvika gas och vatten läckor under mätningen (figur 1a, c). I den nedre delen av röret är gummiproppen tillräckligt för detta. Försegla den ovansida delen är svårare. PVC omslaget måste stämmas. Den skall värmas med en fackla; sedan, när materialet blir flexibel men är inte brända, locket placeras i röret så att dess form kan formas. Efter kylning måste locket mer ändringar (med undantag av luckan används för att transportera proverna till laboratoriet i steg 2.1.1.10 eller 2.1.2.6). Hål i mitten där sensorn sätts måste borras. Omröraren kan hållas med en fiskelina, som i sin tur följs med lim på insidan av omslaget så att omröraren hänger på linan i vattnet (figur 1c). Också, alla lederna (PVC täcka röret och PVC täcker sensorn) tätas med tejp. Placera elastisk tejp för att justera diametern på sensorn för att försegla kontaktytan mellan hål i mitten av PVC omslaget och sensorn (figur 1c).
2. Växla på elektromagnetisk puls krets som ingår i systemets omrörning.
   Obs: Omrörning systemet förhindrar skiktningen av vattenfasen utan störande (omblandning) sediment. Omrörning systemet består av en krets som slår på/av elektromagneten som lockar/releaser magnetomröraren (se Tabell av material för en detaljerad beskrivning).
3. Flytta elektromagneten runt yttre delen av akryl röret tills omröraren flyttar kontinuerligt, och sedan fixa det på plats med tejp (figur 1c).
4. Stäng inkubation kammaren för att säkerställa en konstant temperatur (t.ex., variant av ±0.3 ° C).
5. Tryck på inspelningsknappen (sensor programvara) att börja spela in signalen från sensorn. Avläsningar registreras vanligtvis varje 5 min.
6. Tryck på stoppknappen i slutet av mätperioden.

6. slutliga mätningen steg

1. Vänta minst ~ 10 min med sensorns spets nedsänkt i gratis-N₂O vatten (avjoniserat) innan du läser signalen noll N₂O kalibrering åtgärden.
2. Utför en slutlig kalibrering. För detta, upprepa sensorkalibrering, efter avsnitt 3 men börjar med steg 3.3.
3. Spara filen (sensor software).

7. denitrifikation beräkningar

1. Börja med tabellerade utdatafilen genereras av sensorn programvaran som innehåller posten för sensorns signal i mV och µM N₂O och kalibreringsdata.
2. Rita signalen från sensorn mot tiden att visualisera N₂O ackumulering trenden (t.ex., figur 2en).
3. Använd endast tidsintervall med en linjär ackumulering, exklusive perioden inledande acklimatisering av provet och ett möjligt slutliga mättnad på grund av substrat begränsning (t.ex., figur 2b). Skapa en linjär modell av signalen från sensorn (µM) över tid (h).
   Obs: Lutningen är andelen denitrifikation (µM N₂O core^-1 h^-1), som dividerat med området i kärnan (πr²), förvandlas till hastigheten i µM N₂O m^-2 h^-1, och när multiplicerat med den vattenvolym (πr²h, där h är höjden av vattenfasen och r är den inre radien av akryl röret, i detta fall 0,12 m 0.03175 m, respektive) förvandlas till hastigheten i µmol N₂O m^-2 h^-1.

Representative Results

Totalt 468 denitrifikation priser uppskattades med hjälp av protokollet ovan i sediment från pyreneiska mountain lakes under perioden 2013-2014. Vi visar några av dessa resultat att illustrera förfarandet (figur 2 och figur 3). Den linjära modellen mellan N₂O koncentration och tid har generellt god korrelation (R² ≥ 0.9). Lutningen på förhållandet ger en uppskattning av andelen denitrifikation (steg 7,3; t.ex., figur 2d). Om aktiviteten denitrifikation är mycket låg, sensorns elektroniskt brus blir viktigare och godhet passform minskar (t.ex., sensorer 4 och 5 i figur 2b och räkna 3a). Även om baslinjen detektionsgränsen för N₂O är ~0.1 µM i vatten²², som är en intermediär värde om alternativa metoder²³, möjligheten att samla tusentals kontinuerliga mätningar att filtrera bruset medger uppskattningar på relativt låga denitrifikation priser, upp till ~ 1 µmol N₂O m^-2 h^-1 (figur 2 och figur 3). Lägre priser (dvs. ~0.4 µmol N₂O m^-2 h^-1) kan uppskattas genom att minska den vattenfasen av core provet med en höjd på 8 cm (se protokollet steg 4.2).

Figur 2 : Denitrifikation beräkningar i en temperatur beroende experiment. Faktisk (a och b) och potentiella denitrifikation mätningar (c–f) visas. När temperaturen i mätningen är minskad (c), på första provet kyls och signalen från sensorn, som är temperaturberoende, minskar. (en) A liknande händelse inträffar i början av inkubering i faktiska denitrifikation mätning; varmare laboratoriemiljö med avseende på inkubationsförhållanden producerar en kylning av provet igen åtföljd av en nedgång i signalen från sensorn. (e) när temperaturen ökar, vid första proverna varma och signalen från sensorn ökar exponentiellt i stället för linjärt. När proverna når en konstant temperatur, ökar signalen från sensorn linjärt som vanligt. I alla fall är det möjligt att beräkna de denitrifikation priserna bara genom att använda perioden av linjär N₂O ackumulering (b, doch f). (b), inaktiv prov 3 visas inte. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3 : Exempel på denitrifikation beräkningarna. Faktisk (en) och potentiella (b och c) denitrifikation priser uppskattades. Vi använde endast tidsintervall med en linjär N₂O ackumulering för att beräkna denitrifikation (lutningen på den linjära modellen). Men i (en), för utbildningsändamål, visar vi alla mätningar (modeller) med mer och mindre framgång. Vi skulle kassera prov 3 på grund av den höga instabiliteten av sensorn och prov 2 på grund av mättnad i N₂O ansamling. (en) prover 4 och 5 med andelen 0,5 och 0,7 µmol N₂O m^-2 h^-1, respektive, är fall av mätningar nära detektionsgränsen för metoden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

De främsta fördelarna med den beskrivna metoden är användning av minimalt störd sediment borrkärnor och kontinuerlig inspelning av N₂O ansamling. Dessa tillåter skattning av relativt låga denitrifikation priser som sannolikt liknar de förekommande i situ. Dock diskuteras vissa aspekter rörande coring, sensor prestanda och potentiella förbättringar.

En tydligen enkla men kritiska steg i metoden är bra core återhämtning. Sediment och vatten gränssnittet måste uppfylla tre kriterier: (i) ändringar i dess kemiska eller konstituerande sammansättning, (ii) ingen ändring i halten eller ogiltiga relationen, och (iii) ingen struktur pertubation²⁴. Färre störningar som provet lidit under hela protokollet, mer realistiska och närmare i situ villkor kommer den uppmätta denitrifikation vara. Det finns flera enheter/tekniker för sediment core collection²⁵, och deras val beror på vattendjupet. Vi använder en messenger-anpassad gravitation corer¹⁹ för djupa prover (figur 1e) eftersom det är en någorlunda ljus-vikt enhet och kan snabbt återställa kort kärnor²⁵ (en kärna sediment av ≥10 cm längd är mer än tillräckligt för att omfatta genotoxisk och denitrifierande lagren i sediment^26,27,28). I coring jargong, ”känna” benämns ofta som förmågan att veta var PIK (oavsett om det är fortfarande i vattenmassan eller redan i sedimentet) och om det är öppna eller stängda²⁵. För mellanliggande vattendjup (5-50 m) är vanligtvis det inga svårigheter med känsla. En förlust av känsla uppstår i djupare vatten (> 50 m) eftersom rörelserna av vattenmassan kan maskera platsen de corer²⁵. Känslan kan också gå förlorat i grunt vatten (< 3 m) på grund av laterala avdrift och wave åtgärd²⁵; Det är därför vi använder en annan metod i grunt vatten, antingen direkt manuell coring av dykning eller klä sig i en vadarfågel. Med detta system, kan den person som utför provtagningen se sediment och välja den exakta platsen innan coring; Detta gör, t.ex., provtagning av en sediment-kärna som innehåller en makrofyter. Efter provtagningen, måste forskaren fortsätta att arbeta noggrant för att störa minimalt sediment core provet under resten av protokollet, särskilt när du utför acetylen hämning av bubblande.

Vissa detaljer måste beaktas när du använder N₂O mikrosensorer. Det ger en kontinuerlig visualisering (remsa diagram) av sensor signal (bakgrunden frekvens 1000 Hz)²⁹sensor programvara. Dessa rådata och strip diagram (t.ex., figur 2en) kan sparas. Det är nödvändigt att kontrollera den rätta beteenden av sensorn efter dess polarization (t.ex., när de återvänder från fältuppsättningen innan steg 4). I synnerhet, en låg (< 20 mV) och konstant bas signalen förväntas när det är nedsänkt i N₂O-gratis vatten. Kalibrera sensorn inom kort (~ 2 h) efter dess användning; om det redan har använts i några dagar, kan intervallet förlängas (~ 24 h)¹⁸. Minimera om, hålla sensorn polariserade såvida det inte används för flera dagar¹⁸. Över tiden, kan en förändring i signalen från sensorn förekomma, upp till 50% i månader, vilket beror på en olika genomsläpplighet av dess membran¹⁸. Ju lägre den elektroniska störningen i laboratoriet, mer konstant och stabil blir signalen från sensorn. I det avseendet förbättrar använder en UPS kvaliteten på den elektriska energi som når enhetens mätning av filtrering av spänningsvariationer. Provtagning intervallet, markerade på fliken Logger, skiljer sig från bakgrunden frekvensen. Varje registrerad punkt genereras från medelvärdet av många mätningar. Provtagningsintervall (upp till 10 s) anger frekvensen med vilken en datapunkt registreras. Antalet mätningar per enhet av tiden används i genomsnitt definieras av bakgrunden frekvens²⁹. Till exempel, om vi sätter en samplingsfrekvens på 5 s och en bakgrund frekvens av 500 mätningar per sekund, då data punkter är registreras varje 5 s och genomsnittet av de 500 proverna per sekund mäts under de föregående 5 s. Vi spela in signalen från sensorn varje 5 min (provtagningsintervall) och ställa in bakgrunden frekvens till 1000 mätningar per sekund. Studien systemet måste vara känt att välja rätt provtagningsintervall utan ”genomsnitt” förväntade variationer. I mycket aktiva system rekommenderas kort sampling intervaller, medan längre intervall kan optimera datorns minne²⁹. Vissa möjliga störande ämnen (H₂S, nr, och CO₂) kan påverka N₂O sensorns signal²². Givaren är kalibrerad med avjoniserat vatten, men proverna kan innehålla störande ämnen och ändra sensorns referenssignal. Denna situation skulle kunna förklara varför negativa värden visas i prover 2 och 5 i figur 2b och figur 3a, respektive. Men, när målet är att uppskatta den denitrifikation, den exakta nivån av N₂O är inte den viktigaste parametern. Vad är nyckel är lutningen på den linjära modellen (som styrker en linjär ackumulering av N₂O). Slutligen är det nödvändigt att arbeta med en fast temperatur eftersom svaret från N₂O sensorn förändras med temperaturen (figur 4).

Enkla ändringar eller tillägg till protokollet möjliggör också (i) karakterisering av de miljömässiga förhållanden som styr de uppmätta denitrifikation satser, (ii) uppskattning av de potentiella denitrifikation priserna genom att simulera att bemöta en drivande övertoning (t.ex., nitrat), och (iii) uppskattning av sediment N₂O utsläpp genom att hoppa över C₂H₂ hämning beroende på syftet studie, flera kompletterande mätningar kan utföras: (i) strax efter att återställa den kärnan i situ villkor, t.ex., temperatur; (ii) före mätning, prover av vattenfasen, t.ex., [nr₃^–]; och (iii) efter mätningen, profiler och skivor av kärnan vid olika upplösningar (mm-cm)^25,30, enligt förfaranden som förklaras av P. T. Schwing o.a. ³⁰.

För att mäta de potentiella denitrifikation priserna, lägga till nitrat till vatten-fasen av kärnan (t.ex., figur 2 och figur 3) som beskrivs i C. Palacin-Lizarbe, L. Camarero och J. katalanska¹⁷. Om därvid lägga till nitrat innan C₂H₂ hämning (steg 4,3). Dessutom om nitrat läggs, är det lämpligt att också lägga kol (C; t.ex., acetat) och fosfor (P) att behålla den i situ stökiometriska proportioner C, N och P (t.ex., i ytsediment). Detta kommer att förhindra begränsning av denitrifikation av dessa element^31,32, och kommer också att hålla C/N kvoten som kan påverka processen för nitrat-konsumtion (dvs denitrifikation dominans kontra dissimilatory nitrat minskning till ammonium (DNRA))⁴. Syrebrist kan fastställas av bubblande en N₂-CO₂ blandningen ett par minuter efter nitrat tillägg, att förhindra syreinterferensen med denitrifikation; Observera dock att detta leder till en blockering av nitrifikation. För att beräkna sediment N₂O utsläpp priser, utelämna C₂H₂ hämning (steg 4,3). Men, kom ihåg att, såvitt för närvarande är det känt i akvatiska ekosystem, N₂O utsläpp är proportionellt låga jämfört med N₂ utsläpp (0% - 4,3%)³³, så det är möjligt att den ackumulerade N₂O kommer att understiga detektionsgränsen. Om så är fallet, är ett alternativ att lägga till nitrat för att öka den utsända N₂O, beräkning av potentiella N₂O utsläpp.

Den huvudsakliga svagheten i metoden är hämning av nitrifikation av C₂H₂^10,34. Under inkubationstiden, kan denna hämning av nitrifiering och ofullständig hämning av N₂O minskning bli uppenbart, som både är mycket tid beroende. Till exempel måste start N₂O ackumulering avslöja den verkliga denitrifikation hastigheten och gradvis förfalla som nitrat tillgången sjunker och N₂O diffunderar in i nitrat frizon, där det är minskad³⁵. Årstakt Beräknad denitrifikation kan därför anses giltiga endast om avläsningarna visar en linjär ackumulering av N₂O¹⁰.

Den beskrivna metoden uppskattar denitrifikation hastighet per område som integrerar aktiviteten hela sediment. I detta avseende finns det viss osäkerhet om radien av handlingen av acetylen hämning när bubblande gasen i vattenfasen av provet. Det antas att, åtminstone, hämning av det surficial lagret av sediment sker, som är en med den högsta denitrifikation priser^26,27.

Möjliga förbättringar till denna metod är dess kombinerad användning med ¹⁵N spårämnen och ändringar som möjliggör mätning av denitrifikation i situ. ¹⁵ N tracer metoder kan användas för att bestämma andelen nitrifiering-denitrifikation koppling som förekommer i de prover³⁶, och det kan också redovisa andra N flux processer förutom denitrifikation (t.ex., anammox och dissimilatory nitrat minskning till ammonium (DNRA))^13,37. Dessa metoder har dock nackdelen att ändra de substrat koncentration¹⁰. A. Behrendt, D. de Beer och s. Stief ²⁶ använda en metod som kombinerar N₂O mikrosensorer, C₂H₂ hämning och ¹⁵N spårämnen för att analysera vertikala aktivitet distribution av dissimilatory nitrat minskning processer (denitrifikation och DNRA) i sediment. De gjorda vertikala profiler i sedimenten av genomträngande sediment med sensorer. Den största svårigheten i att mäta denitrifikation i situ är förmågan att hantera en nonconstant temperatur miljö. Det är nödvändigt att registrera N₂O ackumulering och temperaturen samtidigt och sedan korrigera N₂O sensorns signal genom temperaturberoendet under beräkningarna av denitrifikation. Denna korrigering kräver en tidigare analys av temperaturberoendet av N₂O signalen för varje sensor. Sensorerna är handgjorda, och var och en svarar olika på temperatur (t.ex., sensor 1 visar en högre temperaturberoende än de andra i figur 2c, e).

Figur 4 : Temperaturberoendet av N₂O mikrogivare svar. De olika sluttningarna av den linjära modellen av den sensor signal kontra temperaturen vid varje N₂O koncentration visar temperatur effekten på sensorns signal. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Messenger-adapted gravity corer	-	-	Reference in the manuscript. Made by Glew, J.
Sampling tube	-	-	Acrylic. Dimensions: 100 cm (h) × 6.35 cm (d) × 6.50 cm (D). Sharpen the edge of the sampling tube that penetrates into the sediment to minimize the disturbance in the recovered sediment core sample.
Handheld sounder	Plastimo	38074	Echotest II Depth Sounder.
Rubber stopper	VWR	DENE1012114	With two holes, used to mix the N2O-water in the calibration chamber. Dimensions: 20 mm (h) × 14 mm (d) × 18 mm (D) (3 mm hole (D)).
Rubber stopper	VWR	217-0125	To seal the bottom part of the methacrylate tube and to sample in shallow water bodies. Dimensions: 45 mm (h) × 56 mm (d) × 65 mm (D).
Rubber stopper	VWR	217-0126	Place the rubber stopper in the top side of the sampling tube to obtain a vacuum for sampling in littoral zones and shallow water bodies. Dimensions: 50 mm (h) x 60 mm (d) x 70 mm (D).
PVC cover	-	-	To seal the top side part of the acrylic tube. Dimensions: 45 mm (h) × 56 mm (d) × 65 mm (D). Dimensions: 65 mm (D).
Adhesive tape	-	-	Waterproof. To ensure all joints (PVC cover sampling tube and PVC cover sensor) and to avoid water leaks.
Thermometer	-	-	Portable and waterproof, to measure the temperature in the water overlying the sediment just after sampling the cores.
GPS	-	-	To save the location of a new sampling site or to arrive at a previous site.
Wader	-	-	For littoral or shallow site samplings.
Boat	-	-	An inflatable boat is the best option for its lightness if the sampling site is not accessible by car.
Rope	-	-	Rope with marks showing its length (e.g., marked with a color code to distinguish each meter).
N2O gas bottle and pressure reducer	Abelló Linde	32768-100	Gas bottle reference.
C2H2 gas bottle and pressure reducer	Abelló Linde	32468-100	Gas bottle reference.
Tube used to evacuate the excess of water	-	-	Consists of a solid part (e.g., a 5 ml pipette tip without its narrowest end) inserted in a silicone tube.
Nitrous Oxide Minisensor w/ Cap	Unisense	N2O-R	We use 4 sensors at a time.
Microsensor multimeter 4 Ch. 4 pA channels	Unisense	Multimeter	Picoammeter logged to a laptop. The standard device allows for 2 sensor picoammeter connections (e.g., N2O sensor), one pH/mV and a thermometer. We ordered a device with four picoammeter connections, allowing the use of 4 N2O sensors simultaneously.
SensorTrace Basic 3.0 Windows software	Unisense		Sensor data acquisition software.
Calibration Chamber incl. pump	Unisense	CAL300	Calibration chamber. We tuned it with rubber stoppers and syringes to mix the N2O-water without making bubbles.
Incubation chamber	Ibercex	E-600-BV	Indispensable equipment for working at a constant temperature (±0.3 °C). It also allows control of the photoperiod.
Electric stirrer	-	-	Part of the stirring system. It hangs in the water, overlying the sediment subject, by a fishing line that is hooked to the PVC cover.
Electromagnet	-	-	Part of the stirring system. It is fixed to the outside of the acrylic tube, approximately at the same level as the stirrer. It is activated episodically (ca. 1 on-off per s) by a circuit, attracting the stirrer when it is on and releasing it when it is off, thereby generating the movement that agitates the water.
Electromagnetic pulse circuit	-	-	Part of the stirring system. It is connected by wires to the electromagnet and sends pulses of current that turn the electromagnet on and off.
Uninterruptible power supply (UPS)	-	-	It improves the quality of the electrical energy that reaches the measurement device, filtering the highs and low of the voltage, thereby ensuring a more constant and stable N2O sensor signal.