Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

في المختبر أسلوب التحكم بتركيزات غازات المهلجنة في استزراع الخلايا الظهارية السنخية

doi: 10.3791/58554 Published: October 23, 2018

Summary

يصف لنا بروتوكولا سهلة مصممة خصيصا للوصول إلى التركيزات الدقيقة والتي تسيطر عليها من سيفوفلوراني أو إيسوفلوراني في المختبر بغية تحسين فهمنا للآليات التي تشارك في إصابة الرئة الظهارية واختبار الرواية العلاج لمتلازمة الضائقة التنفسية الحادة.

Abstract

متلازمة الضائقة التنفسية الحادة (اردز) مرض منتشر الإصابة السنخية مع إزالة السوائل السنخية البصر والتهاب حاد. استخدام وكلاء المهلجنة، مثل سيفوفلوراني أو إيسوفلوراني، لتخدير المرضى في وحدة العناية المركزة (اتحاد المحاكم الإسلامية) يمكن تحسين تبادل الغازات والحد من الوذمة السنخية، وتخفف من التهاب أثناء الضائقة. ومع ذلك، تفتقر إلى البيانات المتعلقة باستخدام العوامل المستنشقة للتخدير المستمر في وحدة العناية المركزة لعلاج أو منع تلف الرئة. لدراسة آثار وكلاء المهلجنة في الخلايا الظهارية السنخية في ظروف "الفسيولوجية"، وصف نظام سهل لخلايا الثقافة في واجهة الهواء السائل ويعرضهم لوكلاء المهلجنة لتوفير الكسور الدقيقة التي تسيطر عليها "الهواء" و "المتوسطة" التركيزات لهذه العوامل. قمنا بتطوير دائرة الغلق مختومة التي يمكن أن تتعرض لوحات مع الخلايا البشرية السنخية الظهارية مخلدة لكسر الدقيقة، التي تسيطر عليها سيفوفلوراني أو إيسوفلوراني باستخدام تدفق غاز مستمرة المقدمة من دائرة آلة مخدر. تعرض الخلايا إلى 4% سيفوفلوراني و 1% من إيسوفلوراني لمدة 24 ساعة. أجرى الغاز الكتلي لتحديد تركيز وكلاء المهلجنة حله في المتوسط. بعد الأول ساعة، وتركيزات سيفوفلوراني وإيسوفلوراني في المتوسط كانت 251 مغ/لتر و 25 مغ/لتر، على التوالي. حل منحنيات تمثل تركيزات سيفوفلوراني وإيسوفلوراني على المديين المتوسط وأظهرت دورات مماثلة على مر الزمن، مع هضبة الذي تم التوصل إليه في ساعة واحدة بعد التعرض.

هذا البروتوكول صمم خصيصا لتصل إلى تركيزات محددة والتي تسيطر عليها من سيفوفلوراني أو إيسوفلوراني في المختبر لتحسين فهمنا للآليات التي تشارك في إصابة الرئة الظهارية خلال الضائقة واختبار علاجات جديدة متلازمة.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

متلازمة الضائقة التنفسية الحادة (اردز) متلازمة سريرية تتميز بإصابة التهاب منتشر وذمة الرئة هيبوكسيميك فشل في الجهاز التنفسي. على الرغم من الضائقة يمثل أكثر من 10% قبول في وحدة الرعاية المركزة (اتحاد المحاكم الإسلامية) وما يقرب من 25 في المائة من مرضى العناية المركزة التي تتطلب التهوية الميكانيكية، إلا أنها لا تزال تشكل تحديا المعترف بها بالنسبة للأطباء، مع معدل وفيات مستشفى من 35-45%1. على الرغم من الأبحاث المكثفة، لم تاريخ تحديد فعالية الضائقة دوائية العلاج أو الوقاية. اثنين من الميزات الرئيسية المساهمة في معدلات الوفيات في الضائقة: ضعف في إزالة السوائل السنخية (كأس آسيا) (أي، غيرت ارتشاف السوائل ذمة السنخية من أجوائها الرئة القاصي) والتهاب حاد2. نظراً للضائقة الوفيات ما زالت مرتفعة، المبادرات الحالية وينبغي أن تشمل أيضا الوقاية الأولية؛ ومع ذلك، تحديا رئيسيا تحديد المرضى المعرضين للخطر في منهم الضائقة من المرجح أن تطوير والذي سيستفيد إذا منعوا الضائقة.

المسكنات المهلجنة المتقلبة، مثل سيفوفلوراني وإيسوفلوراني، تستخدم على نطاق واسع لتقديم التخدير العام في غرفة العمليات. في جميع أنحاء العالم، أكثر من 230 مليون من المرضى الذين يخضعون لعمليات جراحية كبرى كل سنة تتطلب التخدير العام والتهوية الميكانيكية3، والمضاعفات الرئوية بعد العملية الجراحية تؤثر سلبا على النتائج السريرية واستخدام الرعاية الصحية4 . استخدام سيفوفلوراني بدلاً من بروبوفول ارتبط بالتهاب الرئة محسنة في المرضى الذين يخضعون لجراحة الصدر وحدوث انخفاض كبير في الأحداث السلبية، مثل الضائقة والمضاعفات الرئوية بعد العمل الجراحي5. وبالمثل، المعالجة المسبقة مع isoflurane آثار واقية على ميكانيكا التنفس والأوكسجين والهليوكبتر في نماذج حيوانية تجريبية من الضائقة6،7. على الرغم من أن هناك ما يبرر إجراء المزيد من الدراسات لمعالجة تأثير العوامل المستنشقة على النتائج في جراحة noncardiac، تخفيض مماثل في المضاعفات الرئوية وقد لوحظ مؤخرا في تحليل تلوي، مما يدل على أن استنشاق مخدر وكلاء – ك وتعارض التخدير عن طريق الحقن الوريدي – ترتبط إلى حد كبير مع انخفاض في معدل الوفيات لجراحة القلب8.

لا تتوفر بيانات مستقبلية محددة حول استخدام العوامل المتقلبة لتخدير المرضى العناية المركزة لمنع أو علاج الضرر الرئة. ومع ذلك، عدة محاكمات الآن دعم فعالية وسلامة سيفوفلوراني المستنشق لتخدير المرضى في وحدة العناية المركزة، وقد أظهرت الدراسات الإكلينيكية أن استنشاق سيفوفلوراني و7،إيسوفلوراني9 تحسين تبادل الغازات، والحد الوذمة السنخية، والتهاب تهذيب في نماذج تجريبية من الضائقة. بالإضافة إلى ذلك، يخفف سيفوفلوراني النوع الثاني الخلايا الظهارية الأضرار10، بينما isoflurane يحافظ على سلامة الحاجز السنخية الشعرية عن طريق التحوير من مفرق ضيق البروتين11. بيد أنه يلزم إجراء المزيد من الدراسات للتحقق من وإلى أي مدى يمكن ترجمة الأدلة التجريبية لحماية الجهاز من استنشاق سيفوفلوراني وإيسوفلوراني للبشر. أول واحدة-مركز التحكم-معشاة (RCT) من مجموعتنا وجدت أن الاستخدام المبكر لاستنشاق سيفوفلوراني في المرضى الذين يعانون من الضائقة ترافق مع تحسن الأوكسجين، انخفاض مستويات بعض علامات برو التحريضية، وانخفاض الرئة طلائي الضرر، حسب تقييم مستويات شكل المستقبلات متقدمة glycation المنتجات النهائية (سراج) قابل للذوبان في السوائل البلازما والسنخيه12.

أخذت معا، الآثار المفيدة سيفوفلوراني وإيسوفلوراني على إصابة الرئة يمكن أن يشير إلى العديد من الممرات البيولوجية أو العمليات الفنية التي تعتمد على المسار الغضب، أي إزالة السوائل السنخية (الاتحاد الآسيوي)، وإصابة الظهارية، إزفاء عامل النووي (NF)-κB، وتفعيل بلعم. وبالإضافة إلى ذلك، قد تؤثر sevoflurane التعبير عن البروتين الغضب نفسها. نظراً للبحوث السابقة التي لدينا فريق البحوث وغيرها يدعم دور محوري للغضب في التهاب السنخية والرئة الظهارية الإصابة/إصلاح خلال الضائقة، قمنا بتصميم نموذج تجريبي لتوفير فهم متعدية لآليات سيفوفلوراني في الرئة الإصابة وإصلاح13،،من1415. تم التحقيق في المختبر آثار سيفوفلوراني وإيسوفلوراني في خط رواية السنخية الظهارية الابتدائية خلية بشرية المصممة خصيصا لدراسة حاجز الدم الهواء في الرئة المحيطية، حلبي (البشرية LentiVirus طلائي السنخية خلد)، مع نوع السنخية-مثل الخصائص بما في ذلك الوصلات ضيق الوظيفية16.

أثناء إعداد تصميم تحقيقاتنا في المختبر (مثلاً من الثقافات من الخلايا الظهارية السنخية في واجهة الهواء السائل مع التعرض إلى "استنشاق" سيفوفلوراني أو إيسوفلوراني، أدركنا من نشر قبل الدراسات التي وقد قسمت فقط كسور سيفوفلوراني في "الهواء" واجهة17،،من1819 استخدام الشاشات القياسية (مماثلة لتلك المستخدمة في إعداد سريرية). عامل المهلجنة تركيزات اختيرت عادة وفقا لقيم الحد الأدنى من تركيز السنخية (ماك) (مثلاً، في البشر، سيفوفلوراني، 0.5 و 1.1 والمجلد 2.2 في المائة، تمثل 0.25 و 0.5 و 1 ماك، إيسوفلوراني، 0.6، 0.8، على التوالي؛ و 20من المجلد 1.3% يمثلون 0.25 و 0.5 و 1 ماك، على التوالي). وفي الواقع، حققت تركيزات سيفوفلوراني وإيسوفلوراني ابدأ في المتوسط الثقافة نفسها، مما يحد من صلاحية الصكوك النماذج التجريبية السابقة. وعلاوة على ذلك، يستخدم معظم التجارب جرة اللاهوائية التي أغلقت بعد قد تم مسح سيفوفلوراني تحتوي على مزيج الهواء الداخل. كما أن هدفنا دراسة الخلايا الظهارية السنخية في ظروف "الفسيولوجية"، اعتقدنا أن دولة اللاهوائية قد لا يكون الحل الأمثل، ولن يكون متوافقاً مع فترات طويلة التجريبية. ولذلك، علينا تطوير نظامنا لخلايا الثقافة في واجهة الهواء السائل وتعرضها لوكلاء المهلجنة (سيفوفلوراني وإيسوفلوراني) بهدف توفير دقة الكسور التي تسيطر عليها "الهواء" وتركيزات "المتوسط" لهذه العوامل. وفي رأينا، هذه الخطوة التجريبية، التي لم تبلغ حتى الآن في الأدب، إلزامية قبل أي زيادة في المختبر التحقيقات سيفوفلوراني وإيسوفلوراني.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1-ثقافة "الخلايا الظهارية السنخية" (حلبي)

  1. ذوبان الجليد
    1. "الماصة؛" 4 مل من زراعة جاهزة للاستخدام البشري السنخية الظهارية (هوايك) المتوسطة في أنبوب بلاستيك 15 مل وسرعة ذوبان الجليد القنينة في حمام مائي مسخن (37 درجة مئوية).
    2. نقل تعليق خلية المذابة إلى أنبوب بلاستيك 15 مل يحتوي على 4 مل المتوسط قبل سينتريفوجينج الأنبوبة في 200 غ س لمدة 5 دقائق.
    3. نضح المادة طافية وبيليه الخلية مع 5 مل المتوسط زراعة ريسوسبيند. ثم قم بنقل الخلايا إلى قارورة T25.
    4. زراعة الخلايا تحت الظروف القياسية (5% CO2, 95% هوميديفيد الجوية, 37 درجة مئوية)
  2. تقسيم
    1. التحقق من حالة الخلايا مجهريا. عندما تكون الخلايا روافد 80-90 ٪، تقسيم الخلايا، اتباع الخطوات 1.2.2 من خلال 1.2.10.
    2. نضح وسائط زراعة الخلايا مع ماصة معقمة.
    3. تغسل الخلايا مرة واحدة مع 4 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (دببس دولبيكو) ونضح دببس.
    4. أضف 1 مل من محلول التربسين/يدتا (TE) إلى الخلايا قبل تفرخ في 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق حتى تبدأ الخلايا لفصل؛ تحقق من وجود مفرزة تحت مجهر.
    5. ريسوسبيند الخلايا مع 2 مل المتوسط الثقافة والطرد المركزي الخلايا في 200 غ س لمدة 5 دقائق. ثم نضح المادة طافية وبيليه الخلية مرة أخرى مع 3 مل المتوسط زراعة ريسوسبيند.
    6. استخدام مقايسة الاستبعاد صبغة زرقاء تريبان لتحديد صلاحية الخلايا. تأخذ 30 ميليلتر من تعليق خلية وإضافة 30 ميليلتر لحل تريبان الأزرق في أنبوب 0.4 في المائة. وبعد ذلك، فعالية مزيج الحل باستخدام 3-5 مرات ماصة 100 ميليلتر. تأخذ 10 ميليلتر من الحل ووضعها تحت ساترة هيموسيتوميتير.
    7. عد العدد الإجمالي لخلايا قابلة للحياة وعدد الخلايا الميتة (الأزرق) في المناطق هيموسيتوميتير. ثم، حساب الخلية صلاحية [%] باستخدام المعادلة: خلية بقاء = 100 – (100/إجمالي عدد الخلايا x عدد الخلايا الميتة)
    8. نقل قاسمة مع بيليه حراكه الخلية قارورة T25 ثقافة خلية جديدة أو صفيحة بئر 6. إضافة وسيلة زراعة الخلايا لتحقيق ما مجموعة 5 مل من زراعة المتوسطة في قارورة T25، أو 1 مل لكل بئر من آبار 6-اللوحة.
    9. زراعة الخلايا في حاضنة تحت الظروف القياسية (5% CO2, 95% هوميديفيد الجوية, 37 درجة مئوية)
    10. عندما تكون الخلايا المتلاقية تماما، أنهم مستعدون للتجربة.

2-إعداد دائرة الغلق

ملاحظة: خطة البناء للدائرة الغلق هو مبين في الشكل 1.

  1. استخدم مربع البوليبروبيلين المحكم بقدرة 6.5 ل. الطول والعرض والارتفاع هي 30 × 20 × 15.5 سم، على التوالي. يرجى الملاحظة بأن حجم المربع أقل من حجم النظرية بسبب تدوير الزوايا.
  2. حفر حفرة قطرها 2.5 سم على الجانب السفلي من الجدار الجانبي.
  3. إدراج أنبوب مموج مع علامة خضراء، والتي سوف تكون بمثابة أنبوب الإدخال خليط الغازات-الهواء، وختم ذلك بالسيليكون.
  4. حفر حفرة قطرها 2.5 سم ثانية على الجانب العلوي من الجدار الجانبي المعاكس.
  5. إدراج آخر الأنبوب المموج مع علامة حمراء وتوصيله مع عامل تصفية فحم، الذي سيكون بمثابة أنبوب إخراج خليط الغازات-الهواء، وختم ذلك بالسيليكون.
  6. حفر حفرة قطرها ضيق 4 ملم في وسط الجدار يعني مربع.
  7. إدراج أنابيب ضخ قصيرة متصل في مشعب مع الدورية ذكور اللوير لوك، الذي سوف يكون موصول محلل غاز، وختم ذلك بالسيليكون.
  8. مكان حرارة/رطوبة رقمية داخل قاعة الغلق.

3-الكشف عن الخلايا الظهارية السنخية لوكلاء المهلجنة (سيفوفلوراني وإيسوفلوراني)

ملاحظة: تخطيطي الرسم للجهاز هو مبين في الشكل 2.

تنبيه: على الرغم من أن الدراسات الحيوانية قد كشفت عن أية أدلة على ضرر الجنين أو ضعف الخصوبة، ودراسة صغيرة جداً أثناء القيصرية لم تظهر أي تأثيرات غير مرغوبة على الأم أو الجنين، سلامة استخدام المهلجنة وكلاء (مثلاً، سيفوفلوراني أو إيسوفلوراني) أثناء المخاض والولادة لم تظهر حتى الآن. وعلاوة على ذلك، تم جمعها لا البيانات الخاضعة للرقابة أثناء الحمل البشري. لذلك، إجراء تجارب باستخدام سيفوفلوراني أو إيسوفلوراني أثناء الحمل ينبغي أن تثبط بقوة.

  1. تعمل تحت غطاء النازع مختبر.
  2. تخصيص دارة آلة مخدر تبديل خط غاز أكسيد النيتروز بثاني أكسيد الكربون (CO2).
  3. قم بتوصيل الدائرة الغلق مع أنبوب علامة خضراء، الكرتون المموج الدارة المخصصة آلة مخدر. إدراج مرطب ساخنة (مثل تلك المستخدمة في أجهزة التهوية اتحاد المحاكم الإسلامية) في أنبوب الاتصال بين الجهاز مخدر وقاعة الغلق لتسخين المخلوط تدفق الغاز إلى حوالي 37 درجة مئوية
  4. تثبيت الدائرة الغلق على لوحة الساخن، توفير تدفئة لوحة درجة الحرارة 37 درجة مئوية.
  5. وضع جيد-لوحة 6 تتضمن الخلايا حلبي في الهواء الضيق الدائرة وختم الغطاء.
  6. تنظيم معدلات تدفق الغاز (أي الخليط من الهواء، وأول أكسيد الكربون2) الحصول على الشروط القياسية، ويعرف 5% من أول أكسيد الكربون2 و 95% من الهواء هوميديفيد بسرعة.
  7. فتح مبخر عامل المهلجنة واختر النسبة المئوية المطلوب (في هذه الدراسة، تم اختبارها من سيفوفلوراني وإيسوفلوراني كانت التركيزات 4% و 1%، على التوالي).
  8. ملاحظة تكوين تركيز الغاز المخلوط وسيفوفلوراني أو إيسوفلوراني كما يقاس بمحلل غاز خارجية وعرضها على الشاشة.
  9. بمجرد تحقيق القيم المستهدفة، خفض معدل تدفق غاز جديدة إلى 1 لتر في الدقيقة.
  10. يمكن الحفاظ على قاعة الغلق مع معدل تدفق الغاز هذا طالما كان ذلك ضروريا للتجربة.

4-قياس سيفوفلوراني أو إيسوفلوراني بالفصل اللوني

  1. إعداد العينات
    1. في نقاط زمنية مختلفة، بإيجاز شديد فتح قاعة لأخذ العينات التي شملتها الدراسة (في هذه الدراسة، كنا جيدا 6-لوحة) وأغلق الغطاء. الاحتفاظ عينات أخرى في المربع. ثم نضح 1 مل المتوسط الوارد في كل عينة مع ميكروبيبيتي قابل لتعديل وحدات تخزين متعددة.
    2. وضع المتوسط 10 مل headspace اللوني القنينات، الذي ينبغي أن يكون مشدود مغلقة بأحكام مشددة مع قبعة مختومة تفلون. تجميد قارورة اللوني في-20 درجة مئوية إذا كنت لا تستخدم لهم فورا.
    3. إعداد حل أسهم من سيفوفلوراني وحل مخزون آخر من إيسوفلوراني، على حد سواء في 50 غرام/لتر في الميثانول. في الوقت نفسه، تعد حلاً أسهم من كلوروفورم (المعايير الداخلية، هو) في 2 غرام/لتر في الميثانول. تخزين كافة الحلول القياسية عند-20 درجة مئوية.
    4. إعداد الحلول العامل سيفوفلوراني وإيسوفلوراني على 50 و 500 و 5000 مغ/لتر في المياه عالي النقاوة/ثنائي ميثيل سولفوكسيدي (50/50؛ v/v). لتوحيد المقاييس الداخلية، ثابتاً عند 100 مغ/لتر في الميثانول الحل العامل.
  2. تحليل العينات الخلوية
    ملاحظة: يستند هذا الإجراء استخراج المصادق عليها سابقا طريقة الفصل اللوني للغاز والطيف الكتلي من بوردو et al. 1 ويستخدم نفس المعلمات لحساسية وخصوصية. واستخدمت سيفوفلوراني وكلوروفورم (ق. أ) في هذا البروتوكول، و isoflurane ارتبط بأسلوب تحليلي مولتيباراميتريك. بإيجاز، لاقتناء الكتلي، وضعت الطريقة بعد حقن نقية الحل. بعد ذلك، تم تأكيد m/z مع المعايير المرجعية، وبيانات الأدب. واختير ثلاثة m/z لكل أكثر (ما عدا IS): m/z واحدة للقياس الكمي (الأكثر وفرة وأعلى)، التي تم حسابها وفرة بإدماج المنطقة تحت المنحنى للقياس الكمي، وهما m/z للتأكيد. باستخدام ثلاث m/z، تحليلها يمكن تحديداً لأن جميع m/z في نفس الوقت الاحتفاظ، فضلا عن أن جميع المبالغ m/z (قريب من تأكيد أيون مقابل الكمي) هي نفسها في معيار خالصة وفي جميع العينات. مع هذا الوضع اقتناء، يمكن التعرف على تحليلها وكمياً مع خصوصية جيدة.
    1. بناء منحنيات 8 نقطة معايرة مع نطاقات تركيز 0.5-400 مغ/لتر، ونوعية متعددة تعليمات (0.5 و 1، 5، 10، 20، 75، 200 و 400 مغ/لتر).
      ملاحظة: للتحقق من صحة كل المعايرة، أربعة ضوابط الجودة واستخدمت: الحد الأدنى للقياس الكمي (C1 = 0.5 مغ/لتر)، اثنين من المستويات المتوسطة (C2 = 20 مغ/لتر و C3 = 75 مغ/لتر)، والمستوى النهائي (C4 في 400 مغ/لتر؛ المستوى العلوي للقياس الكمي). تم تحليل جميع المعايير والضوابط في مصفوفات الخلايا المزروعة لتجنب تأثير مصفوفة. وقد تم تحليل مصفوفة فارغة كل منحنى المعايرة، للتحقق من صحة أن كان هناك لا تدخل مع المعايير الداخلية الخلوية ومثقف.
    2. إعداد حل أسهم من سيفوفلوراني وحل مخزون آخر من إيسوفلوراني، على حد سواء في 50 غرام/لتر في الميثانول. في الوقت نفسه، تعد حلاً أسهم من كلوروفورم (المعايير الداخلية، هو) في 2 غرام/لتر في الميثانول. تخزين كافة الحلول القياسية عند-20 درجة مئوية. ثم، إعداد الحلول العامل من مختلطة سيفوفلوراني/إيسوفلوراني على 50 و 500 و 5000 مغ/لتر في الماء عالي النقاوة/ثنائي ميثيل سولفوكسيدي (50/50؛ v/v). لهو، هو تمييع الحل العامل عند 100 مغ/لتر في الميثانول.
    3. منحنيات المعايرة والضوابط، إعداد العينات من التشويك ميليلتر 50 من هو (100 مغ/لتر) إلى 1 مل من العينة الخلوية المصفوفات.
    4. إعداد عينة حلول مع 200 ميليلتر من كلوريد الصوديوم المشبعة المياه الحل في أنبوب headspace 10 مل، مشدود مغلقة بأحكام مشددة مع قبعة مختومة تفلون.
  3. الفصل اللوني للغاز والطيف الكتلي
    1. لتحليل العينات، استخدام الحقن headspace في الفصل لوني للغاز، مقترنة بطريقة الكشف الشامل.
    2. حمل أنابيب headspace لمدة 10 دقائق عند 80 درجة مئوية مع شاكر سخان. ثم سحب وضخ 1.5 مل العينة الغاز في كروماتوجرافيا الغاز. تعيين المعلمة محقن عند 260 درجة مئوية مع تدفق انقسام في 100 مل/دقيقة لمدة 2 دقيقة في بداية تشغيل اللوني.
    3. استخدام حاقن سبليت/سبليتلس مع ضغط المبرمجة في وضع الناقل. أولاً، الحفاظ على ضغط الغاز في الجيش الشعبي الكوري 40 دقيقة 0.15. ثم، زيادة الضغط البرنامج المعدل إلى 150 من الجيش الشعبي الكوري في الجيش الشعبي الكوري 125/دقيقة قبل تعيين نسبة من الجيش الشعبي الكوري بالدقيقة 16 إلى 300 ضغط الجيش الشعبي الكوري لمدة 5 دقائق.
    4. بدء المتزامن للحقن، مع درجة حرارة فرن 60 درجة مئوية 1 دقيقة وزيادة حتى يتم التوصل إلى درجة حرارة 140 درجة مئوية بمعدل 20 درجة مئوية/دقيقة. ثم، بزيادة درجة الحرارة مرة أخرى حتى يتم تحقيق 250 درجة مئوية. إجمالي وقت التشغيل 7 دقيقة.
    5. القيام بالفصل اللوني باستخدام عمود شعري تنصهر السيليكا (30 م × 1.4 ميكرومتر، معرف 0.25 مم). القيام بتجارب جماعية مع أيون واحد رصد حالة (SIM)، ورصد m/z أيون الكمي m/z 181، وأيون المؤهلات m/z 151 و 51 في وقت واحد في وقت احتفاظ (RT) من 2.30 دقيقة سيفوفلوراني، m/z 149 (أيون الكمي)، 115 و 87 (أيون المؤهلات) إيسوفلوراني في RT 2.8 دقيقة، و m/z 83 (أيون الكمي) كلوروفورم في دقيقة RT 3.70.
    6. تحديد تركيزات سيفوفلوراني وإيسوفلوراني في ثقافة الخلية بنسب المجال لذلك هو استخدام تناسب وزن التربيعية. الحد الأدنى للقياس الكمي (لوك) سيفوفلوراني وإيسوفلوراني في 0.5 ملغ/لتر وكان الحد الأعلى للقياس الكمي (الوك) 400 مغ/لتر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

التركيزات من سيفوفلوراني وإيسوفلوراني، التي حلت في الأجل المتوسط على مر الزمن، ترد في الجدول 1 و الجدول 2، على التوالي.

الدورات الدراسية لتركيزات سيفوفلوراني وإيسوفلوراني في الأجل المتوسط كانت متشابهة مع مرور الوقت. فورا بعد أن تم تعيين تركيز مطلوب عامل المهلجنة، ارتفعت تركيزات خلال الساعة الأولى. ثم التوصل إلى هضبة، التي استمرت حتى تم إيقاف إدارة عامل المهلجنة. وبعد انقطاع الإدارة، انخفضت تركيزات خلال ساعة واحدة (الشكل 3).

بعد الأول ساعة، ومتوسط تركيزات سيفوفلوراني وإيسوفلوراني في المتوسط كانت 251 مغ/لتر و 25 مغ/لتر، على التوالي. تم العثور على لا يوجد فرق كبير بين التجارب المختلفة.

Figure 1
رقم 1: خطة بناء قاعة الغلق الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: الرسم للجهاز التخطيطي الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: تركيز sevoflurane (n = 5) وإيسوفلوراني (n = 5) مع مرور الوقت. A) تركيز عامل المهلجنة على مر الزمن. يتم التعبير عن القيم في مغ/لتر. يتم التعبير عن القيم في الوسط و sem. ب) تركيز عامل المهلجنة على مر الزمن لكل تجربة. يتم التعبير عن القيمة في مغ/لتر. ج) جزء عامل المهلجنة على مر الزمن في قاعة الغلق تقاس محلل الغاز. يتم التعبير عن القيم بالنسب المئوية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الوقت تركيز سيفوفلوراني في الأجل المتوسط جزء سيفوفلوراني
(مغ/لتر) في قاعة الغلق
الوسيط IC (%)
5 دقيقة 27 [19-31] 4.6
30 دقيقة 152 142-[152] 4.1
ح 1 251 [243-332] 4.1
ح 4 259 256-[271] 4.2
ح 8 265 [237-280] 4.2
ح 24 (إيقاف) 218 [196-247] 4.3
إيقاف + 5 دقيقة 237 [214-241] 0
إيقاف + 30 دقيقة 92 91-[104] 0
إيقاف + ح 1 57 [42-58] 0

الجدول 1: تركيزات sevoflurane حله في المتوسط مع مرور الزمن. يتم التعبير عن البيانات العددية كقيمة وسيط باستخدام نطاق المجال للتركيز والنسبة المئوية للكسر. IQR (لنطاق المجال)

الوقت تركيز إيسوفلوراني في الأجل المتوسط جزء إيسوفلوراني
(مغ/لتر) في قاعة الغلق
الوسيط IC (%)
5 دقيقة 2 [2-2.5] 0.8
30 دقيقة 16 [4-18] 1.3
ح 1 22 [18-27] 0.9
ح 4 30 [25-31] 1.4
ح 8 22 [15-26] 1.2
ح 24 (إيقاف) 26 [23-27] 1.1
إيقاف + 5 دقيقة 19 [12-25] 0
إيقاف + 30 دقيقة 4 [4-4] 0
إيقاف + ح 1 1 [0.8-1] 0

الجدول 2: تركيزات isoflurane حله في المتوسط مع مرور الزمن. يتم التعبير عن البيانات العددية كقيمة وسيط باستخدام نطاق المجال للتركيز والنسبة المئوية للكسر. IQR (لنطاق المجال)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

لدينا بروتوكول وصف طريقة سهلة للكشف عن خلايا لجزء محدد من عامل مخدر المهلجنة، مثل سيفوفلوراني أو إيسوفلوراني. وعلاوة على ذلك، لدينا تقرير هنا – لأول مرة – علاقة صارمة بين الكسر الغاز وتركيز سيفوفلوراني وإيسوفلوراني داخل المتوسطة الثقافة نفسها. هذه الخطوة الأساسية الآن يسمح لنا باستخدام أمان لدينا غرفة الغلق لدراسة آثار هذه العوامل المهلجنة في أحادي الطبقة مثقف للخلايا الظهارية السنخية البشرية.

حاليا، تستخدم معظم فرق البحث دراسة آثار سيفوفلوراني في الخلايا السنخية جرة أولاً المشبعة بالغاز المهلجنة وثم مختومة. في هذه الحالة، قد تكون استقلاب سيفوفلوراني، ويمكن أن يكون تكهنت أن كسر عامل المتقلبة قد ينخفض خطيا مع مرور الوقت، مما يؤدي إلى تركيز غاز غير مستقرة. ومع ذلك، العلاقة بين الكسر الغاز من سيفوفلوراني وتركيزه على المديين المتوسط والثقافة لم تبلغ الواضح في الأدب. عادة، يتم اختيار تركيز sevoflurane المستخدمة في هذه التجارب استناداً إلى علاقة بسيطة بين الكسر الغاز ونظام ماكنتوش. ماك استحدث في عام 1965 وهو تركيز بخار في الرئتين ما هو مطلوب لمنع استجابة الحركية (الحركة) في 50% مواضيع استجابة ل حافز جراحية (الألم)22. ماك يستخدم لمقارنة بالقوة، أو الفاعلية، الأبخرة مخدر. في مرضى العناية المركزة، يرتبط ماك فيسيبو و مقياس الانفعالات-التخدير التقييم ريتشموند (رأس) السريرية23. على الرغم من أنها مؤشرا مفيداً في الممارسة السريرية اليومية، ابدأ تم التحقيق بأهمية هذه المعلمة في إعداد البحوث التجريبية في المختبر . لدينا بروتوكول، باستخدام التحليل اللوني المتوسط، عقدنا العزم الترابط الدقيق بين sevoflurane الواردة في الكسر الغاز و sevoflurane حله في المتوسط. مع هذا الأسلوب، محددة أثر عامل التقلب أعرب طبقاً لتركيز حقيقي في الأجل المتوسط بدلاً من استناداً إلى تقدير تقريبي لتأثير السريرية. ويسمح هذا العنصر الهام دراسة تأثير تركيز عامل المهلجنة دقيقة في الخلايا التي تنمو في متوسط، من أجل مقارنة آثار تركيزات مختلفة من العوامل المستنشقة محددة. وعلاوة على ذلك، كما دائرة الغلق سهل جداً للاستخدام، يسمح هذا الأسلوب الباحثين لتكرار التجربة بدقة.

هناك نقطة هامة أخرى قد تحول دون استخدام الارتباط بين ماك وكسر الغاز في البحوث التجريبية أن عامل مهلجنة انخفاض معدلي الذوبان في الدم (الدم/غاز معامل في 37 ° C = 0.63 إلى 0.69 ل sevoflurane). كمية ضئيلة من sevoflurane مكلف تذوب في الدم قبل الضغط في الحويصلات الهوائية يحقق التوازن مع الضغط الشرياني. وبالتالي، أثناء إدخال التخدير، السنخية (نهاية المد) التركيز (AF، كسر السنخية) سيفوفلوراني يزيد سرعة حول تركيز مستوحاة (وأي فأي، وحي الكسر). بيد أن في المختبر الثقافة الظروف لا تسمح هذه الآليات ووسائل الإعلام المعتادة خلية تتكون أساسا من المحاليل. وعلاوة على ذلك، أن معامل القابلية للذوبان بين الغاز/المياه (معامل في 37 ° C = 0.36 ل sevoflurane) أقل من بين الدم والغاز، الكامنة وراء الأهمية القصوى لإجراء تحليلات اللوني.

بالإضافة إلى ذلك، عند استخدام جرة مختومة، يمتص الأكسجين الغلاف الجوي في الجرة من قبل الخلايا مع جيل واحد من ثاني أكسيد الكربون. هذا التأثير هو الإجراءات التجريبية باختصار ربما تافهة، ولكن لفترة أطول المدد التجريبية، أن تبديل الخلايا التي يحرم من الأكسجين الأيض اللاهوائي؛ وقد حمل هذا التغيير في التمثيل الغذائي درجة معينة من التحيز في التحليلات التجريبية. على النقيض من جرة مختومة، عند استخدام لدينا غرفة الغلق، الأوكسجين والتدفقات عامل المهلجنة قابلة للتعديل مع مرور الوقت للحفاظ على المستوى المستهدف. هذه السمة الرئيسية لدينا بروتوكول يسمح لذلك تصميم التجارب في المختبر لفترات زمنية طويلة (مثلاً، يوم واحد أو أكثر)، ويجعلها مثيرة لأداة لدراسة الآليات الخلوية التي تشارك في إصابة الرئة الظهارية و إصلاح على مر الزمن، لا سيما عندما وكلاء المهلجنة المستخدمة. في الواقع، يظل آثار عوامل مخدر المستنشقة على خلايا الرئة أو الأنسجة أثناء الإصابة السنخية سيئة التحقيق حتى الآن في حين يبدو أن هذا العلاج البديل لإظهار نتائج مشجعة للغاية12.

ومع ذلك، هناك قيود على هذا الأسلوب. أولاً، حلبة آلة تخدير ضروري لتوفير الأكسجين، ثاني أكسيد الكربون، والمهلجنه تدفقات الغاز عامل. استخدام مثل هذا جهاز إلزامي تعيين معدل التدفق، والحفاظ على تركيزات مستقرة على مر الزمن. ثانيا، في عينة المتوسطة قبل التحليل اللوني، بإيجاز فتح قاعة الغلق، مما يدفع انخفاض عابر في تركيزات غاز. كما نستخدم حلبة آلة مخدر، يتم بعد ذلك زيادة تدفقات الغاز حتى تتحقق التركيزات المتوقعة مرة أخرى على محلل الغاز. ثالثا، وقد قمنا بقياس التركيز في الأجل المتوسط لجزء واحد فقط من كل عامل المهلجنة، اختارت مسبقاً بناء على الدراسة السابقة. رابعا، على استقرار الخلية المتوسطة لنمو الخلايا الظهارية السنخية، نحن بحاجة لاستخدام ثاني أكسيد الكربون بتركيز 5%. وفي الواقع، يوفر لا دارة آلة مخدر مثل تركيز ثاني أكسيد الكربون. ولذا يلزم على حلبة آلة مخدر تخصيصها للسماح باتصال تدفق غاز ثاني أكسيد الكربون بدلاً من أكسيد النيتروز. اتصال من هذا القبيل ينبغي أن تستخدم حصرا في إعداد البحوث التجريبية ويجب أن يكون موصول بحذر بعد كل تجربة. وعلاوة على ذلك، لتجنب أي خطر بالنسبة للبشر، ونحن ندعو الباحثين استخدام دارة آلة مخدر مكرسة لتنفيذ هذا البروتوكول، ولا استخدام آلة مخصصة للتخدير السريري.

المزايا الرئيسية لهذه التقنية أنها غير مكلفة نسبيا ومن السهل جداً أن تعتمد، حتى عندما الباحثين قد ابدأ التلاعب دائرة محكم قبل. وعلاوة على ذلك، مع أن البروتوكول، نتائج تركيزات sevoflurane و isoflurane المذاب استنساخه، مما يمثل معيار جودة رئيسية للبحوث التجريبية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يسمح نظامنا لدراسة عوامل المهلجنة الأخرى المتقلبة، مثل ديسفلوراني. والواقع أن تغيير بسيط في نوع الجهاز مبخر الغاز سيكون كافياً في هذه الحالة. وبالمثل، لدينا نظام يمكن أن توفر وسيلة لدراسة تركيزات سيفوفلوراني أو إيسوفلوراني الذائبة في أي نوع من المتوسطة مع مختلف درجات الذوبان الكربون، مثل الماء أو الدم، أو النفط.

لدينا تجربة يمثل خطوة أساسية هو جزء من مشروع أكبر يهدف إلى اختبار الفرضية القائلة بأن سيفوفلوراني وإيسوفلوراني قد بذل آثار مفيدة على إصابة الرئة، والالتهابات، والاتحاد الآسيوي من خلال مسارات الغضب بوساطة. سيتم استخدام ثقافة الأولية للخلايا الظهارية السنخية البشرية للتحقيقات آليا لنقل السوائل ترانسيبيثيليال، الخاصة بقناة السائل النقل (مثلاً، استخدام التنافر الدوائي)، باراسيلولار طلائي النفاذية وإصلاح الجرح، والهجرة الخلية والانتشار، مع أو بدون عامل مخدر مهلجنة (سيفوفلوراني أو إيسوفلوراني)، منفردة أو مجتمعة مع سيتوميكس (في المختبر النموذجي للإصابة السنخية)24.

وفي الختام، هذا البروتوكول صمم خصيصا لتصل إلى تركيزات محددة والتي تسيطر عليها من سيفوفلوراني أو إيسوفلوراني في المختبر لتحسين فهمنا للآليات التي تشارك في إصابة الرئة الظهارية خلال الضائقة واختبار الرواية العلاجات لهذه المتلازمة متكررة ومهددة للحياة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgments

الكتاب يعترف المجلس الإقليمي اوفرن ("برنامج نوفو تشيرتشيور de la ضمور اوفيرني" عام 2013) والفرنسية الوكالة الوطنية للبحث ودي الاتجاه Générale de L'Offre سوينس (برنامج بحوث de ترانسلاتيوننيلي en "الصحة" ANR-13-PRTS-0010) للمنح. وكان الممولين لا تؤثر في تصميم الدراسة والسلوك، والتحليل، أو في إعداد هذه المادة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sevoflurane Baxter Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged
Isoflurane Virbac Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged
Human Alveolar Epithelial cells InScreenex INS-CI-1015
huAEC Medium (ready-to-use) InScreenex INS-ME-1013-500ml
Anesthetic machine circuit Drager Fabius
Gas analyzer Drageer Vamos Plus
Anesthetic gas filter SedanaMedical FlurAbsord
Heated Humifier Fisher&Paykel MR850
Chamber Curver 00012-416-00
Gas chromatography coupled with mass detection Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA Trace 1310 with TSQ 8000evo
Fused-silica column (30 m x 1.4 μm, 0.25 mm ID) Restek, Lisses, France Rxi-624Sil MS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bellani, G., Laffey, J. G., et al. Epidemiology, Patterns of Care, and Mortality for Patients With Acute Respiratory Distress Syndrome in Intensive Care Units in 50 Countries. JAMA:T Journal of the American Medical Association. 315, (8), 788-800 (2016).
  2. Thompson, B. T., Chambers, R. C., Liu, K. D. Acute Respiratory Distress Syndrome. The New England Journal of Medicine. 377, (6), 562-572 (2017).
  3. Weiser, T. G., Regenbogen, S. E., et al. An estimation of the global volume of surgery: a modelling strategy based on available data. The Lancet. (9633), 139-144 (2008).
  4. Khuri, S. F., Henderson, W. G., et al. Determinants of long-term survival after major surgery and the adverse effect of postoperative complications. Annals of Surgery. 242, (3), 341-343 (2005).
  5. De Conno, E., Steurer, M. P., et al. Anesthetic-induced improvement of the inflammatory response to one-lung ventilation. Anesthesiology. 110, (6), 1316-1326 (2009).
  6. Fu, H., Sun, M., Miao, C. Effects of different concentrations of isoflurane pretreatment on respiratory mechanics, oxygenation and hemodynamics in LPS-induced acute respiratory distress syndrome model of juvenile piglets. Experimental Lung Research. 41, (8), 415-421 (2015).
  7. Reutershan, J., Chang, D., Hayes, J. K., Ley, K. Protective effects of isoflurane pretreatment in endotoxin-induced lung injury. Anesthesiology. (3), 511-517 (2006).
  8. Uhlig, C., Bluth, T., et al. Effects of Volatile Anesthetics on Mortality and Postoperative Pulmonary and Other Complications in Patients Undergoing Surgery: A Systematic Review and Meta-analysis. Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 124, (6), 1230-1245 (2016).
  9. Li, Q. F., Zhu, Y. S., Jiang, H., Xu, H., Sun, Y. Isoflurane preconditioning ameliorates endotoxin-induced acute lung injury and mortality in rats. Anesthesia and Analgesia. (5), 1591-1597 (2009).
  10. Voigtsberger, S., Lachmann, R. A., et al. Sevoflurane ameliorates gas exchange and attenuates lung damage in experimental lipopolysaccharide-induced lung injury. Anesthesiology. (6), 1238-1248 (2009).
  11. Englert, J. A., Macias, A. A., et al. Isoflurane Ameliorates Acute Lung Injury by Preserving Epithelial Tight Junction Integrity. Anesthesiology. (2), 377-388 (2015).
  12. Jabaudon, M., Boucher, P., et al. Sevoflurane for Sedation in ARDS: A Randomized Controlled Pilot Study. American Journal of Respiratory and Critical. (2016).
  13. Blondonnet, R., Audard, J., et al. RAGE inhibition reduces acute lung injury in mice. Scientific Reports. 7, (1), (2017).
  14. Jabaudon, M., Blondonnet, R., et al. Soluble Receptor for Advanced Glycation End-Products Predicts Impaired Alveolar Fluid Clearance in Acute Respiratory Distress Syndrome. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 192, (2), 191-199 (2015).
  15. Jabaudon, M., Blondonnet, R., et al. Soluble Forms and Ligands of the Receptor for Advanced Glycation End-Products in Patients with Acute Respiratory Distress Syndrome: An Observational Prospective Study. PloS One. 10, (8), e0135857 (2015).
  16. Kuehn, A., Kletting, S., et al. Human alveolar epithelial cells expressing tight junctions to model the air-blood barrier. ALTEX. 33, (3), 251-260 (2016).
  17. Yue, T., Roth Z'graggen, B., et al. Postconditioning with a volatile anaesthetic in alveolar epithelial cells in vitro. The European Respiratory Journal: Official Journal of the European Society for Clinical Respiratory Physiology. 31, (1), 118-125 (2008).
  18. Suter, D., Spahn, D. R., et al. The immunomodulatory effect of sevoflurane in endotoxin-injured alveolar epithelial cells. Anesthesia and Analgesia. (3), 638-645 (2007).
  19. Schläpfer, M., Leutert, A. C., Voigtsberger, S., Lachmann, R. A., Booy, C., Beck-Schimmer, B. Sevoflurane reduces severity of acute lung injury possibly by impairing formation of alveolar oedema. Clinical and Experimental Immunology. (1), 125-134 (2012).
  20. Nickalls, R. W. D., Mapleson, W. W. Age-related iso-MAC charts for isoflurane, sevoflurane and desflurane in man. British Journal of Anaesthesia. 91, (2), 170-174 (2003).
  21. Bourdeaux, D., Sautou-Miranda, V., et al. Simple assay of plasma sevoflurane and its metabolite hexafluoroisopropanol by headspace GC-MS. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 878, (1), 45-50 (2010).
  22. Eger, E. I., Saidman, L. J., Brandstater, B. Minimum alveolar anesthetic concentration. Anesthesiology. 26, (6), 756-763 (1965).
  23. Perbet, S., Fernandez-Canal, C., Pereira, B., Cardot, J. M., Bazin, J. E., Constantin, J. M. Evaluation of Richmond Agitation Sedation Scale According To Alveolar Concentration of Sevoflurane During a Sedation With Sevoflurane in Icu Patients. Intensive Care Medicine Experimental. 3, (Suppl 1), (2015).
  24. Goolaerts, A., Pellan-Randrianarison, N., et al. Conditioned media from mesenchymal stromal cells restore sodium transport and preserve epithelial permeability in an in vitro model of acute alveolar injury. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 306, (11), L975-L985 (2014).
<em>في المختبر</em> أسلوب التحكم بتركيزات غازات المهلجنة في استزراع الخلايا الظهارية السنخية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Blondonnet, R., Paquette, B., Richard, D., Bourg, R., Laplace, G., Segurel, R., Pouvelle, H., Belville, C., Blanchon, L., Godet, T., Constantin, J. M., Bazin, J. E., Sapin, V., Jabaudon, M. In Vitro Method to Control Concentrations of Halogenated Gases in Cultured Alveolar Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (140), e58554, doi:10.3791/58554 (2018).More

Blondonnet, R., Paquette, B., Richard, D., Bourg, R., Laplace, G., Segurel, R., Pouvelle, H., Belville, C., Blanchon, L., Godet, T., Constantin, J. M., Bazin, J. E., Sapin, V., Jabaudon, M. In Vitro Method to Control Concentrations of Halogenated Gases in Cultured Alveolar Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (140), e58554, doi:10.3791/58554 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter