In Vitro Methode voor controle concentraties van gehalogeneerde gassen in gekweekte alveolaire epitheliale cellen

Summary

Beschrijven we een eenvoudig protocol speciaal ontworpen voor het bereiken van nauwkeurige en gecontroleerde concentraties van Sevofluraan of Isofluraan in vitro ter verbetering van ons begrip van de mechanismen die betrokken zijn bij de epitheliale long letsel en voor het testen van de roman therapieën voor acute respiratory distress syndrome.

Abstract

Acute respiratory distress syndrome (ARDS) is een syndroom van diffuse alveolaire schade met verminderde alveolaire vloeistof goedkeuring en ernstige ontstekingen. Het gebruik van gehalogeneerde agenten, zoals Sevofluraan of Isofluraan, voor de sedatie van intensive care afdeling (ICU) patiënten kan verbeteren gasuitwisseling, alveolaire oedeem verminderen en verzachten van ontsteking tijdens ARDS. Gegevens over het gebruik van geïnhaleerde agenten voor continue sedatie in de ICU te behandelen of te voorkomen longschade ontbreekt echter. Om te bestuderen van de effecten van gehalogeneerde agenten op alveolaire epitheliale cellen “fysiologische” omstandigheden, we beschrijven een gemakkelijk systeem om cultuur cellen op het raakvlak van de lucht-vloeistof en hen blootstellen aan gehalogeneerde agentia te bieden nauwkeurige gecontroleerde “lucht” breuken en de concentraties van het “medium” voor deze agenten. We ontwikkelden een verzegelde luchtdichte kamer waarin platen met menselijke alveolaire vereeuwigd epitheliale cellen kunnen worden blootgesteld aan de Fractie van een nauwkeurige en gecontroleerde van Sevofluraan of Isofluraan met behulp van een constante gasstroom geboden door een verdoving machine-circuit. Cellen werden blootgesteld aan 4% van Sevofluraan en 1% van Isofluraan voor 24 uur. Spectrometrie van de massa van het gas werd uitgevoerd om te bepalen van de concentratie van gehalogeneerde agenten opgelost in het medium. Na het eerste uur, de concentraties van Sevofluraan en Isofluraan in het medium waren 251 mg/L en 25 mg/L, respectievelijk. De curven die vertegenwoordigen de concentraties van zowel Sevofluraan en Isofluraan opgelost in het medium toonde soortgelijke cursussen na verloop van tijd met een plateau bereikt op één uur na blootstelling.

Dit protocol is speciaal ontworpen voor het bereiken van nauwkeurige en gecontroleerde concentraties van Sevofluraan of Isofluraan in vitro verbetering van ons inzicht in de mechanismen die betrokken zijn in epitheliale long letsel tijdens ARDS en het testen van nieuwe therapieën voor de syndroom.

Introduction

Acute respiratory distress syndrome (ARDS) is een klinisch syndroom gekenmerkt door diffuse alveolaire letsel, Long oedeem en hypoxemic respiratoir falen. Hoewel ARDS vertegenwoordigt meer dan 10% van de intensive care afdeling (ICU) bekentenissen en bijna 25% van de patiënten van de ICU mechanische ventilatie vereisen, is het nog steeds een uitdaging onder-erkend voor clinici, met een ziekenhuis-sterftecijfer van 35-45%¹. Ondanks intensief onderzoek heeft de identificatie van een effectieve ARDS farmacologische therapie of preventie tot nu toe. Twee belangrijke eigenschappen bij te dragen tot sterfte in ARDS: verminderde alveolaire vloeistof klaring (AFC), wat (dat wil zeggen, de gewijzigde resorptie van alveolaire oedeem vloeistof uit distale Long luchtruimvanvastgestelde) en de ernstige ontsteking². Aangezien ARDS sterfte hoog blijft, moeten lopende initiatieven ook primaire preventie; echter is een belangrijke uitdaging het identificeren van risicogroepen patiënten in wie ARDS dreigt te ontwikkelen en wie zou profiteren als ARDS werden verhinderd.

Vluchtige gehalogeneerde anesthetica, zoals Sevofluraan en Isofluraan, worden veel gebruikt om algemene anesthesie in de operatiekamer. Wereldwijd meer dan 230 miljoen patiënten een grote operatie ondergaan jaarlijks vereisen narcose en mechanische ventilatie³, en postoperatieve complicaties van de longen nadelig beïnvloeden, klinische resultaten en gezondheidszorg gebruik⁴ . Het gebruik van Sevofluraan in plaats van propofol werd geassocieerd met verbeterde Long ontsteking bij patiënten ondergaan thoracale chirurgie en significante dalingen in ongewenste voorvallen, zoals ARDS en postoperatieve pulmonale complicaties⁵. Voorbehandeling met Isofluraan had ook beschermende effecten op de luchtwegen mechanica, oxygenatie en hemodynamiek in experimentele dierlijke modellen van ARDS^6,7. Hoewel verder onderzoek gerechtvaardigd zijn om de gevolgen van geïnhaleerde agenten op resultaten in noncardiac chirurgie, een vergelijkbare daling in pulmonale complicaties onlangs geconstateerd in een meta-analyse, aan te tonen dat inademing verdoving agenten — als tegenstelling tot de intraveneuze anesthesie — zijn sterk geassocieerd met een vermindering van sterfte voor Cardiale Heelkunde⁸.

Specifieke toekomstige gegevens over het gebruik van vluchtige stoffen voor de sedatie van ICU patiënten te voorkomen of behandelen van longschade ontbreekt. Echter verschillende proeven ondersteunen nu de werkzaamheid en veiligheid van geïnhaleerde Sevofluraan voor de sedatie voor ICU patiënten en preklinische studies hebben aangetoond dat geïnhaleerde Sevofluraan en Isofluraan^7,9 gasuitwisseling te verbeteren, verminderen alveolaire oedeem en keerzijde ontsteking in experimentele modellen van ARDS. Bovendien vermindert Sevofluraan type II epitheliale cellen schade¹⁰, terwijl Isofluraan eraan vasthoudt aan de integriteit van de barrière van de alveolaire-capillair via modulatie van strakke junction eiwit¹¹. Echter, verdere studies zijn nodig om te controleren in hoeverre de experimentele bewijs van orgel bescherming van geïnhaleerde Sevofluraan en Isofluraan kan worden vertaald voor de mens. Een eerste single-center gerandomiseerde gecontroleerde-trial (RCT) uit onze fractie vond dat vroege gebruik van geïnhaleerde Sevofluraan bij patiënten met ARDS werd geassocieerd met verbeterde oxygenatie, lagere niveaus van een aantal pro-inflammatoire merkers, en verminderde Long epitheliale schade, zoals beoordeeld door de niveaus van de oplosbare vorm van de receptoren voor advanced glycation end-producten (sRAGE) in plasma en alveolaire vloeistof¹².

Samen genomen, de positieve effecten van Sevofluraan en Isofluraan op Long letsel zou kunnen wijzen op meerdere biologische trajecten of functionele processen die afhankelijk zijn van de woede weg, namelijk alveolaire vloeistof klaring (AFC), epitheliale letsel, translocatie van nucleaire factor (NF)-recombination, en macrofaag activering. Daarnaast Sevofluraan invloed kan hebben op de expressie van het eiwit RAGE zelf. Aangezien eerdere onderzoek door ons onderzoeksteam e.a. centrale rol voor woede in alveolaire ontsteking en longkanker epitheliale letsel/reparatie tijdens ARDS ondersteunt, ontwierpen we een experimenteel model om een translationeel inzicht in de mechanismen van Sevofluraan in Long letsel en reparatie^13,14,15. De in vitro -effecten van Sevofluraan en Isofluraan werden onderzocht in een roman menselijke alveolaire epitheliale primaire cellijn specifiek ontworpen om te bestuderen van de lucht-bloed barrière van de perifere Long, hAELVi (menselijke alveolaire epitheliale LentiVirus onsterfelijk), met alveolaire type-achtige kenmerken met inbegrip van functionele strakke kruispunten¹⁶.

Bij de voorbereiding van het ontwerp van ons onderzoek in vitro (bijvoorbeeld culturen van alveolaire epitheliale cellen op het raakvlak van de lucht-vloeistof met blootstelling aan “geïnhaleerde” Sevofluraan of Isofluraan, we begrepen van eerder gepubliceerde studies die breuken van Sevofluraan zijn alleen beoordeeld in de “lucht” interface^17,18,19 met behulp van standaard monitoren (vergelijkbaar met die welke worden gebruikt in een klinische setting). Gehalogeneerde agent concentraties waren meestal gekozen op basis van de minimale alveolaire concentratie (MAC)-waarden (bijvoorbeeld bij de mens, voor Sevofluraan, 0.5, 1.1 en 2.2 vol %, vertegenwoordigen 0,25 0,5 en 1 MAC, respectievelijk; voor Isofluraan, 0,6, 0.8, en 1.3 vol % respectievelijk 0,25 0,5 en 1 MAC,)²⁰. Inderdaad, Sevofluraan en Isofluraan concentraties zijn nooit onderzocht in het kweekmedium zelf, dus het beperken van de geldigheid van de eerdere experimentele modellen/instrumenten. Bovendien gebruikt de meeste experimenten een anaërobe pot die werd verzegeld nadat de lucht mix met Sevofluraan had zijn gespoeld binnen. Als ons doel was het bestuderen van de alveolaire epitheliale cellen onder “fysiologische” voorwaarden, dachten wij dat die een anaërobe staat niet optimaal wellicht en zou niet verenigbaar zijn met een lange experimentele duur. Dus, we onze eigen systeem naar cultuur cellen op de lucht-vloeistof-interface ontwikkeld en hen blootstellen aan gehalogeneerde agentia (Sevofluraan en Isofluraan) met het doel van het verstrekken van nauwkeurige gecontroleerde “lucht” breuken en “medium” concentraties voor deze agenten. Volgens ons is deze experimentele stap, die tot nu toe in de literatuur niet is gemeld, vóór alle aanvullende in vitro onderzoeken van Sevofluraan en Isofluraan.

Protocol

1. cultuur van alveolaire epitheliale cellen (hAELVi) Ontdooien Pipetteer 4 mL voor teelt kant-en-klare menselijke alveolaire epitheliale (huAEC) medium in een plastic tube van 15 mL en snel ontdooien de ampul in een voorverwarmde waterbad (37 ° C). De ontdooide celsuspensie overbrengen in een plastic tube van 15 mL, met 4 mL van het medium voor het centrifugeren van de buis bij 200 x g gedurende 5 min. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de pellet cel met 5 mL van de kwe…

Representative Results

De concentraties van de Sevofluraan en Isofluraan, die in het medium na verloop van tijd opgelost, worden gemeld in tabel 1 en tabel 2, respectievelijk. De cursussen van de Sevofluraan en Isofluraan concentraties van het medium waren na verloop van tijd vergelijkbaar. Onmiddellijk nadat de vereiste concentratie van gehalogeneerde agent was ingesteld, steeg concentraties over het eerste uur. Verv…

Discussion

Ons protocol beschrijft een eenvoudige methode om cellen met een nauwkeurige gedeelte van een gehalogeneerde verdoving agent, zoals Sevofluraan of Isofluraan bloot te stellen. Bovendien, rapporteren we hier — voor het eerst — een strikte correlatie tussen zowel de Fractie van het gas en de concentratie van Sevofluraan en Isofluraan binnen het kweekmedium zelf. Deze fundamentele stap nu kan we veilig onze luchtdichte kamer gebruiken om te bestuderen van de effecten van deze gehalogeneerde agenten in een gekweekte enke…

Materials

Sevoflurane	Baxter		Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged
Isoflurane	Virbac		Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged
Human Alveolar Epithelial cells	InScreenex	INS-CI-1015
huAEC Medium (ready-to-use)	InScreenex	INS-ME-1013-500ml
Anesthetic machine circuit	Drager	Fabius
Gas analyzer	Drageer	Vamos Plus
Anesthetic gas filter	SedanaMedical	FlurAbsord
Heated Humifier	Fisher&Paykel	MR850
Chamber	Curver	00012-416-00
Gas chromatography coupled with mass detection	Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA	Trace 1310 with TSQ 8000evo
Fused-silica column (30 m x 1.4 µm, 0.25 mm ID)	Restek, Lisses, France	Rxi-624Sil MS