Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

In Vitro Methode voor controle concentraties van gehalogeneerde gassen in gekweekte alveolaire epitheliale cellen

doi: 10.3791/58554 Published: October 23, 2018

Summary

Beschrijven we een eenvoudig protocol speciaal ontworpen voor het bereiken van nauwkeurige en gecontroleerde concentraties van Sevofluraan of Isofluraan in vitro ter verbetering van ons begrip van de mechanismen die betrokken zijn bij de epitheliale long letsel en voor het testen van de roman therapieën voor acute respiratory distress syndrome.

Abstract

Acute respiratory distress syndrome (ARDS) is een syndroom van diffuse alveolaire schade met verminderde alveolaire vloeistof goedkeuring en ernstige ontstekingen. Het gebruik van gehalogeneerde agenten, zoals Sevofluraan of Isofluraan, voor de sedatie van intensive care afdeling (ICU) patiënten kan verbeteren gasuitwisseling, alveolaire oedeem verminderen en verzachten van ontsteking tijdens ARDS. Gegevens over het gebruik van geïnhaleerde agenten voor continue sedatie in de ICU te behandelen of te voorkomen longschade ontbreekt echter. Om te bestuderen van de effecten van gehalogeneerde agenten op alveolaire epitheliale cellen "fysiologische" omstandigheden, we beschrijven een gemakkelijk systeem om cultuur cellen op het raakvlak van de lucht-vloeistof en hen blootstellen aan gehalogeneerde agentia te bieden nauwkeurige gecontroleerde "lucht" breuken en de concentraties van het "medium" voor deze agenten. We ontwikkelden een verzegelde luchtdichte kamer waarin platen met menselijke alveolaire vereeuwigd epitheliale cellen kunnen worden blootgesteld aan de Fractie van een nauwkeurige en gecontroleerde van Sevofluraan of Isofluraan met behulp van een constante gasstroom geboden door een verdoving machine-circuit. Cellen werden blootgesteld aan 4% van Sevofluraan en 1% van Isofluraan voor 24 uur. Spectrometrie van de massa van het gas werd uitgevoerd om te bepalen van de concentratie van gehalogeneerde agenten opgelost in het medium. Na het eerste uur, de concentraties van Sevofluraan en Isofluraan in het medium waren 251 mg/L en 25 mg/L, respectievelijk. De curven die vertegenwoordigen de concentraties van zowel Sevofluraan en Isofluraan opgelost in het medium toonde soortgelijke cursussen na verloop van tijd met een plateau bereikt op één uur na blootstelling.

Dit protocol is speciaal ontworpen voor het bereiken van nauwkeurige en gecontroleerde concentraties van Sevofluraan of Isofluraan in vitro verbetering van ons inzicht in de mechanismen die betrokken zijn in epitheliale long letsel tijdens ARDS en het testen van nieuwe therapieën voor de syndroom.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Acute respiratory distress syndrome (ARDS) is een klinisch syndroom gekenmerkt door diffuse alveolaire letsel, Long oedeem en hypoxemic respiratoir falen. Hoewel ARDS vertegenwoordigt meer dan 10% van de intensive care afdeling (ICU) bekentenissen en bijna 25% van de patiënten van de ICU mechanische ventilatie vereisen, is het nog steeds een uitdaging onder-erkend voor clinici, met een ziekenhuis-sterftecijfer van 35-45%1. Ondanks intensief onderzoek heeft de identificatie van een effectieve ARDS farmacologische therapie of preventie tot nu toe. Twee belangrijke eigenschappen bij te dragen tot sterfte in ARDS: verminderde alveolaire vloeistof klaring (AFC), wat (dat wil zeggen, de gewijzigde resorptie van alveolaire oedeem vloeistof uit distale Long luchtruimvanvastgestelde) en de ernstige ontsteking2. Aangezien ARDS sterfte hoog blijft, moeten lopende initiatieven ook primaire preventie; echter is een belangrijke uitdaging het identificeren van risicogroepen patiënten in wie ARDS dreigt te ontwikkelen en wie zou profiteren als ARDS werden verhinderd.

Vluchtige gehalogeneerde anesthetica, zoals Sevofluraan en Isofluraan, worden veel gebruikt om algemene anesthesie in de operatiekamer. Wereldwijd meer dan 230 miljoen patiënten een grote operatie ondergaan jaarlijks vereisen narcose en mechanische ventilatie3, en postoperatieve complicaties van de longen nadelig beïnvloeden, klinische resultaten en gezondheidszorg gebruik4 . Het gebruik van Sevofluraan in plaats van propofol werd geassocieerd met verbeterde Long ontsteking bij patiënten ondergaan thoracale chirurgie en significante dalingen in ongewenste voorvallen, zoals ARDS en postoperatieve pulmonale complicaties5. Voorbehandeling met Isofluraan had ook beschermende effecten op de luchtwegen mechanica, oxygenatie en hemodynamiek in experimentele dierlijke modellen van ARDS6,7. Hoewel verder onderzoek gerechtvaardigd zijn om de gevolgen van geïnhaleerde agenten op resultaten in noncardiac chirurgie, een vergelijkbare daling in pulmonale complicaties onlangs geconstateerd in een meta-analyse, aan te tonen dat inademing verdoving agenten — als tegenstelling tot de intraveneuze anesthesie — zijn sterk geassocieerd met een vermindering van sterfte voor Cardiale Heelkunde8.

Specifieke toekomstige gegevens over het gebruik van vluchtige stoffen voor de sedatie van ICU patiënten te voorkomen of behandelen van longschade ontbreekt. Echter verschillende proeven ondersteunen nu de werkzaamheid en veiligheid van geïnhaleerde Sevofluraan voor de sedatie voor ICU patiënten en preklinische studies hebben aangetoond dat geïnhaleerde Sevofluraan en Isofluraan7,9 gasuitwisseling te verbeteren, verminderen alveolaire oedeem en keerzijde ontsteking in experimentele modellen van ARDS. Bovendien vermindert Sevofluraan type II epitheliale cellen schade10, terwijl Isofluraan eraan vasthoudt aan de integriteit van de barrière van de alveolaire-capillair via modulatie van strakke junction eiwit11. Echter, verdere studies zijn nodig om te controleren in hoeverre de experimentele bewijs van orgel bescherming van geïnhaleerde Sevofluraan en Isofluraan kan worden vertaald voor de mens. Een eerste single-center gerandomiseerde gecontroleerde-trial (RCT) uit onze fractie vond dat vroege gebruik van geïnhaleerde Sevofluraan bij patiënten met ARDS werd geassocieerd met verbeterde oxygenatie, lagere niveaus van een aantal pro-inflammatoire merkers, en verminderde Long epitheliale schade, zoals beoordeeld door de niveaus van de oplosbare vorm van de receptoren voor advanced glycation end-producten (sRAGE) in plasma en alveolaire vloeistof12.

Samen genomen, de positieve effecten van Sevofluraan en Isofluraan op Long letsel zou kunnen wijzen op meerdere biologische trajecten of functionele processen die afhankelijk zijn van de woede weg, namelijk alveolaire vloeistof klaring (AFC), epitheliale letsel, translocatie van nucleaire factor (NF)-recombination, en macrofaag activering. Daarnaast Sevofluraan invloed kan hebben op de expressie van het eiwit RAGE zelf. Aangezien eerdere onderzoek door ons onderzoeksteam e.a. centrale rol voor woede in alveolaire ontsteking en longkanker epitheliale letsel/reparatie tijdens ARDS ondersteunt, ontwierpen we een experimenteel model om een translationeel inzicht in de mechanismen van Sevofluraan in Long letsel en reparatie13,14,15. De in vitro -effecten van Sevofluraan en Isofluraan werden onderzocht in een roman menselijke alveolaire epitheliale primaire cellijn specifiek ontworpen om te bestuderen van de lucht-bloed barrière van de perifere Long, hAELVi (menselijke alveolaire epitheliale LentiVirus onsterfelijk), met alveolaire type-achtige kenmerken met inbegrip van functionele strakke kruispunten16.

Bij de voorbereiding van het ontwerp van ons onderzoek in vitro (bijvoorbeeld culturen van alveolaire epitheliale cellen op het raakvlak van de lucht-vloeistof met blootstelling aan "geïnhaleerde" Sevofluraan of Isofluraan, we begrepen van eerder gepubliceerde studies die breuken van Sevofluraan zijn alleen beoordeeld in de "lucht" interface17,18,19 met behulp van standaard monitoren (vergelijkbaar met die welke worden gebruikt in een klinische setting). Gehalogeneerde agent concentraties waren meestal gekozen op basis van de minimale alveolaire concentratie (MAC)-waarden (bijvoorbeeld bij de mens, voor Sevofluraan, 0.5, 1.1 en 2.2 vol %, vertegenwoordigen 0,25 0,5 en 1 MAC, respectievelijk; voor Isofluraan, 0,6, 0.8, en 1.3 vol % respectievelijk 0,25 0,5 en 1 MAC,)20. Inderdaad, Sevofluraan en Isofluraan concentraties zijn nooit onderzocht in het kweekmedium zelf, dus het beperken van de geldigheid van de eerdere experimentele modellen/instrumenten. Bovendien gebruikt de meeste experimenten een anaërobe pot die werd verzegeld nadat de lucht mix met Sevofluraan had zijn gespoeld binnen. Als ons doel was het bestuderen van de alveolaire epitheliale cellen onder "fysiologische" voorwaarden, dachten wij dat die een anaërobe staat niet optimaal wellicht en zou niet verenigbaar zijn met een lange experimentele duur. Dus, we onze eigen systeem naar cultuur cellen op de lucht-vloeistof-interface ontwikkeld en hen blootstellen aan gehalogeneerde agentia (Sevofluraan en Isofluraan) met het doel van het verstrekken van nauwkeurige gecontroleerde "lucht" breuken en "medium" concentraties voor deze agenten. Volgens ons is deze experimentele stap, die tot nu toe in de literatuur niet is gemeld, vóór alle aanvullende in vitro onderzoeken van Sevofluraan en Isofluraan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. cultuur van alveolaire epitheliale cellen (hAELVi)

  1. Ontdooien
    1. Pipetteer 4 mL voor teelt kant-en-klare menselijke alveolaire epitheliale (huAEC) medium in een plastic tube van 15 mL en snel ontdooien de ampul in een voorverwarmde waterbad (37 ° C).
    2. De ontdooide celsuspensie overbrengen in een plastic tube van 15 mL, met 4 mL van het medium voor het centrifugeren van de buis bij 200 x g gedurende 5 min.
    3. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de pellet cel met 5 mL van de kweek medium. Breng de cellen in een erlenmeyer van T25.
    4. Cultiveren van de cellen onder standaardomstandigheden (95% bevochtigde lucht, 5% CO2, 37 ° C)
  2. Splitsen
    1. Controleer de status van de cellen microscopisch. Wanneer de cellen 80-90% heuvels zijn, splitst u de cellen, volgt 1.2.2 via 1.2.10.
    2. De media van de teelt van de cellen met een steriele pipet gecombineerd.
    3. Spoel de cellen een keer met 4 mL van Dulbecco van fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) en de DPBS gecombineerd.
    4. Voeg 1 mL trypsine/EDTA-oplossing (TE) toe aan de cellen vóór het incuberen bij 37 ° C gedurende 3 minuten tot de cellen beginnen te ontkoppelen; Controleer of detachement onder een microscoop.
    5. Resuspendeer de cellen met 2 mL gestolde voedingsbodem en centrifugeer de cellen bij 200 x g gedurende 5 min. Vervolgens gecombineerd het supernatant en resuspendeer de pellet cel opnieuw met 3 mL van de kweek medium.
    6. Gebruik de trypan blauwe kleurstof uitsluiting test om te bepalen van de levensvatbaarheid van de cellen. Neem 30 µl van de celsuspensie en Voeg 30 µl van een oplossing van 0,4% van trypan blauw in een buis. Daarna Meng effectief de oplossing 3 - 5 keer met behulp van een pipet 100 µL. 10 µl van de oplossing en zet het onder het dekglaasje aan van de hemocytometer.
    7. Zowel het totale aantal levensvatbare cellen en tellen het aantal dode cellen (blauw) op het gebied van de hemocytometer. Vervolgens berekenen de levensvatbaarheid van cellen [%] met behulp van de vergelijking: levensvatbaarheid van cellen = 100-(100 / totaal aantal cellen x aantal dode cellen)
    8. Het afgepipetteerde deel met de cel van de geresuspendeerde pellet overbrengen in een nieuwe cel cultuur T25 kolf of een 6 goed-plaat. Het medium teelt toevoegen aan de cellen tot een totaal van 5 mL voor teelt medium in de kolf T25, of 1 mL voor elk putje van de 6 goed-plaat.
    9. Cultiveren van de cellen in een incubator onder standaardomstandigheden (95% bevochtigde lucht, 5% CO2, 37 ° C)
    10. Zodra de cellen volledig confluente zijn, zijn ze klaar voor het experiment.

2. voorbereiding van een luchtdichte kamer

Opmerking: Het plan van de bouw voor de luchtdichte kamer is afgebeeld in Figuur 1.

  1. Gebruik een hermetische polypropyleen doos met een capaciteit van 6.5 L. De lengte, breedte en hoogte zijn 30 x 20 x 15,5 cm, respectievelijk. Houd er rekening mee dat het volume van het vak is lager dan het theoretische volume vanwege de afgeronde hoeken.
  2. Boor een gat van 2,5 cm diameter aan de onderkant van de laterale muur.
  3. Invoegen van een gecorrugeerde buis met een groene mark, die zal fungeren als de gas-lucht mengsel input pijp en zegel met silicium.
  4. Boor een tweede 2,5 cm diameter gat aan de bovenzijde van de tegenovergestelde laterale muur.
  5. Plaats een andere gecorrugeerde buis met een rood tekentje en verbinding te maken met een houtskool filter, dat zal dienen als de gas-lucht mengsel uitvoer pijp, en met silicium zegel.
  6. Boor een strakke 4 mm diameter gat in het midden van de gemiddelde muur van het vak.
  7. Korte infusie buis die is aangesloten op een variëteit met een roterende mannelijke luer-lock, die zal worden aangesloten op een gas analyzer, en verzegel het met silicium invoegen
  8. Plaatst een digitale thermometer/hygrometer in de luchtdichte kamer.

3. bloot alveolaire epitheliale cellen aan gehalogeneerde agentia (Sevofluraan en Isofluraan)

Opmerking: Een schematische tekening van het apparaat is afgebeeld in Figuur 2.

Let op: Hoewel dierlijke studies is gebleken dat geen bewijs van foetale schade of verminderde vruchtbaarheid, en een zeer kleine studie tijdens cesarean secties geen eventuele ongewenste effecten op de moeder of de foetus toonde, de veiligheid van het gebruik van gehalogeneerde agenten (b.v., Sevofluraan of Isofluraan) tijdens de arbeid en de levering niet is gebleken tot nu toe. Bovendien heeft geen gecontroleerde gegevens zijn verzameld tijdens de zwangerschap. Dus, het uitvoeren van experimenten met behulp van Sevofluraan of Isofluraan terwijl zwanger sterk afgeraden moet.

  1. Werken onder een afzuigkap laboratorium.
  2. Een verdoving machine-circuit om over te schakelen van de gasleiding van distikstofoxide door kooldioxide (CO2) aanpassen.
  3. De luchtdichte kamer met de groene-gemarkeerd, gegolfd buis aansluiten op het circuit van aangepaste verdoving machine. Een verwarmde luchtbevochtiger (zoals die worden gebruikt op ICU ventilatoren) invoegen in de pijp tussen de verdoving machine en de luchtdichte kamer te warm het gasmengsel stroom ongeveer 37 ° C
  4. De luchtdichte kamer installeren op een hete plaat, bieden een verwarming plaat temperatuur van 37° C.
  5. Zet de 6 goed-plaat met de hAELVI cellen in de luchtdichte kamer en afdichting van de deksel.
  6. Regelen het gas debiet (dat wil zeggen, het mengsel van lucht en CO2) om te snel verkrijgen de standaardvoorwaarden, gedefinieerd als 5% van CO2 en 95% van bevochtigde lucht.
  7. Opent de verdamper gehalogeneerde agent en kiest u het gewenste percentage (in de huidige studie, de geteste concentraties van Sevofluraan en Isofluraan waren 4% en 1%, respectievelijk).
  8. Opmerking de samenstelling van het mengsel en de Sevofluraan of Isofluraan gasconcentratie als gemeten door een externe gas analyzer en weergegeven op het scherm.
  9. Zodra de streefwaarden zijn bereikt, verminderen het debiet van de verse gas aan 1 L/min.
  10. De luchtdichte kamer kan worden gehandhaafd met deze gasstroom zolang als nodig is voor het experiment.

4. meet Sevofluraan of Isofluraan door chromatografie

  1. Bereiding van de monsters
    1. Heel in het kort open op verschillende tijdstippen, de zaal te nemen uit de bestudeerde monsters (in de huidige studie, gebruikten we een 6 well-plate) en sluit het deksel. Laat de overige monsters in het vak. Vervolgens gecombineerd 1 mL van het medium elk monster met een verstelbare micropipet van meerdere volumes bevat.
    2. Het medium in headspace chromatografie flesjes van 10 mL, die hermetisch strak met een Teflon-verzegelde dop geschroefd moeten worden gebracht. Bevriezen de chromatografie flesjes bij-20 ° C als u hen niet onmiddellijk gebruikt.
    3. Het bereiden van een stamoplossing van Sevofluraan en een ander stockoplossing van Isofluraan, zowel op 50 g/L in methanol. Tegelijkertijd bereiden een stockoplossing van chloroform (interne standaard, IS) bij 2 g/L in methanol. Opslaan van alle standaard oplossingen bij-20 ° C.
    4. Werkoplossingen voor Sevofluraan en Isofluraan op 50, 500 en 5000 mg/L in ultrazuiver water/dimethyl sulfoxyde bereiden (50/50; v/v). Voor interne normalisatie bedraagt de werkoplossing 100 mg/L in methanol.
  2. Analyse van cellulaire monsters
    Opmerking: De extractie procedure is gebaseerd op de eerder gevalideerde methode van gaschromatografie en massaspectrometrie vanaf Bourdeaux et al. 1 en gebruik dezelfde parameters van de gevoeligheid en specificiteit. Sevofluraan en chloroform (IS) werden gebruikt in dit protocol, en Isofluraan werd geassocieerd met de multiparametric analysemethode. Kort, voor de verwerving van de Spectrometrie van de massa, de methode werd ontwikkeld na injectie van de zuivere oplossing. M/z werd vervolgens bevestigd met referentie standaarden en literatuur gegevens. Drie m/z werden geselecteerd voor elke analyt (met uitzondering van IS): één m/z voor kwantificering (de meest voorkomende en hoger) waarvoor overvloed werd berekend door de integratie van het gebied onder de curve voor kwantificering en twee m/z voor bevestiging. Met behulp van drie m/z, kon analyten worden specifiek geïdentificeerd omdat alle m/z had de dezelfde retentietijd, evenals omdat alle m/z bedragen (familielid van ion bevestiging vs. kwantificering) waren hetzelfde in de zuivere standaard en alle monsters. Met deze acquisitie-modus, kon analyten worden geïdentificeerd en gekwantificeerd met goede specificiteit.
    1. Bouwen van een 8-punts kalibratiekrommen met het bereik van de concentratie van 0,5-400 mg/L en meerdere kwaliteit besturingselementen (0,5, 1, 5, 10, 20, 75, 200 en 400 mg/L).
      Opmerking: Om te controleren elke kalibratie, werden vier kwaliteitscontroles gebruikt: de ondergrens van kwantificering (C1 = 0,5 mg/L), twee tussenliggende niveaus (C2 = 20 mg/L en C3 = 75 mg/L) en het uiteindelijke niveau (C4 bij 400 mg/L; bovenverdieping van kwantificering). Alle normen en controles werden geanalyseerd in gekweekte cel matrices om te voorkomen dat het effect van de matrix. Voor elke ijkcurve was een lege matrix geanalyseerd om te valideren dat er geen interferentie met gekweekte cellulaire en interne normen was.
    2. Het bereiden van een stamoplossing van Sevofluraan en een ander stockoplossing van Isofluraan, zowel op 50 g/L in methanol. Tegelijkertijd bereiden een stockoplossing van chloroform (interne standaard, IS) bij 2 g/L in methanol. Opslaan van alle standaard oplossingen bij-20 ° C. Vervolgens bereiden werkoplossingen voor gemengde Sevofluraan/Isofluraan op 50, 500 en 5000 mg/L in ultrazuiver water / dimethyl sulfoxyde (50/50; v/v). Voor IS, wordt de werkoplossing verdund bij 100 mg/L in methanol.
    3. Voor kalibratiekrommen en besturingselementen, bereid de monsters door blancobepalingen 50 µL van IS (100 mg/L) in 1 mL van de cellulaire monster matrices.
    4. Monsteroplossingen met 200 µL van verzadigde natriumchloride water oplossing in een tube 10 mL headspace, geschroefd hermetisch strak met een Teflon-verzegeld GLB voor te bereiden.
  3. Gaschromatografie en massaspectrometrie
    1. Gebruik headspace injecties in een gaschromatografie, in combinatie met de massale detectiemethode voor monster analyses.
    2. Draag headspace buizen voor 10 min bij 80 ° C met een kachel shaker. Vervolgens trekken en 1,5 mL van het gasmonster injecteren in de gaschromatograaf. Stel de parameter van de injector bij 260 ° C met een split-stroom op 100 mL/min gedurende 2 minuten aan het begin van de chromatografie-run.
    3. Split/splitless-injector gebruiken met een drager modus-geprogrammeerde druk. Ten eerste houden de gasdruk bij 40 kPa voor 0,15 min. Vervolgens, vergroten de druk programma tarief tot 150 kPa op 125 kPa/min voordat u een snelheid van 16 kPa/min 300 kPa druk gedurende 5 minuten.
    4. Simultaan voor de injectie, beginnen met een oventemperatuur van 60 ° C gedurende 1 minuut en verhoging tot een temperatuur van 140 ° C is bereikt een snelheid van 20 ° C/min. Vervolgens, de temperatuur weer te stijgen tot 250 ° C wordt bereikt. De totale tijd van de run is 7 min.
    5. De scheiding van de chromatografie met behulp van een capillaire kolom van gesmolten-silica (30 m x 1.4 µm, 0,25 mm ID) uitvoeren. Massa experimenten uitvoeren met een enkele ion monitoring (SIM) voorwaarde, en controleren van ion kwantificering m/z 181 en ion kwalificaties m/z 151 en 51 gelijktijdig op een retentietijd (RT) van 2.30 min voor Sevofluraan, m/z 149 (ion kwantificering), m/z 115 en 87 (ion kwalificaties) voor Isofluraan op RT 2.8 min en m/z 83 (ion kwantificering) voor chloroform op RT 3.70 min.
    6. Bepalen van de concentraties van Sevofluraan en Isofluraan in de cultuur van de cel door hun gebied ratio's met die van de IS met behulp van een gewicht kwadratische pasvorm. De onderste bepalingsgrens (Ondergrens) voor Sevofluraan en Isofluraan was op 0,5 mg/L en de bovengrens van kwantificering (ULOQ) was 400 mg/L.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De concentraties van de Sevofluraan en Isofluraan, die in het medium na verloop van tijd opgelost, worden gemeld in tabel 1 en tabel 2, respectievelijk.

De cursussen van de Sevofluraan en Isofluraan concentraties van het medium waren na verloop van tijd vergelijkbaar. Onmiddellijk nadat de vereiste concentratie van gehalogeneerde agent was ingesteld, steeg concentraties over het eerste uur. Vervolgens werd een plateau bereikt, die bleef tot het beheer van de gehalogeneerde agent werd gestopt. Na de onderbreking van de administratie daalde de concentraties binnen één uur (Figuur 3).

Na het eerste uur, de gemiddelde concentraties van Sevofluraan en Isofluraan in het medium waren 251 mg/L en 25 mg/L, respectievelijk. Geen significant verschil gevonden tussen de verschillende experimenten.

Figure 1
Figuur 1: bouw plan van de luchtdichte kamer Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: schematische tekening van het apparaat Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: concentratie van Sevofluraan (n = 5) en Isofluraan (n = 5) na verloop van tijd. A) concentratie van gehalogeneerde agent na verloop van tijd. Waarden worden uitgedrukt in mg/L. waarden worden uitgedrukt in gemiddelde en SEM. B) concentratie van gehalogeneerde agent na verloop van tijd voor elk experiment. Waarde worden uitgedrukt in mg/L. C) breuk voor gehalogeneerde agent na verloop van tijd in de luchtdichte kamer gemeten door het gas analyzer. Waarden worden uitgedrukt in percentages. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Tijd Concentratie van Sevofluraan in het medium Fractie van Sevofluraan
(mg/L) in de luchtdichte kamer
Mediaan IC (%)
5 min 27 [19 - 31] 4.6
30 min 152 [142 - 152] 4.1
1 h 251 [243 - 332] 4.1
4 h 259 [256 - 271] 4.2
8h 265 [237 - 280] 4.2
24 h (stop) 218 [196 - 247] 4.3
Stop + 5 min 237 [214 - 241] 0
Stop + 30 min 92 [91 - 104] 0
Stop + 1 h 57 [42 - 58] 0

Tabel 1: Concentraties van Sevofluraan opgelost in het medium na verloop van tijd. Numerieke gegevens worden uitgedrukt als een mediane waarde met interkwartielafstand voor de concentratie en als percentage voor de breuk. IQR (voor interkwartielafstand)

Tijd Concentratie van Isofluraan in het medium Fractie van Isofluraan
(mg/L) in de luchtdichte kamer
Mediaan IC (%)
5min 2 [2 - 2.5] 0.8
30min 16 [4 - 18] 1.3
1h 22 [18 - 27] 0.9
4h 30 [25 - 31] 1.4
8h 22 [15 - 26] 1.2
24h (stop) 26 [23 - 27] 1.1
Stop + 5min 19 [12 - 25] 0
Stop + 30min 4 [4 - 4] 0
Stop + 1h 1 [0,8 - 1] 0

Tabel 2: Concentraties van Isofluraan opgelost in het medium na verloop van tijd. Numerieke gegevens worden uitgedrukt als een mediane waarde met interkwartielafstand voor de concentratie en als percentage voor de breuk. IQR (voor interkwartielafstand)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ons protocol beschrijft een eenvoudige methode om cellen met een nauwkeurige gedeelte van een gehalogeneerde verdoving agent, zoals Sevofluraan of Isofluraan bloot te stellen. Bovendien, rapporteren we hier — voor het eerst — een strikte correlatie tussen zowel de Fractie van het gas en de concentratie van Sevofluraan en Isofluraan binnen het kweekmedium zelf. Deze fundamentele stap nu kan we veilig onze luchtdichte kamer gebruiken om te bestuderen van de effecten van deze gehalogeneerde agenten in een gekweekte enkelgelaagde van menselijke alveolaire epitheliale cellen.

Momenteel de meeste onderzoeksteams bestudeert de effecten van Sevofluraan in alveolaire cellen gebruiken een pot die eerst verzadigd met gehalogeneerde gas en vervolgens verzegeld. In dit geval, Sevofluraan kan worden gemetaboliseerd, en er kan worden gespeculeerd dat de Fractie van vluchtige agent kan verminderen lineair na verloop van tijd leidt tot een unstable gasconcentratie. De correlatie tussen de gas-Fractie van Sevofluraan en de concentratie ervan in het kweekmedium is echter niet duidelijk in de literatuur gemeld. Meestal, wordt de concentratie van Sevofluraan gebruikt in deze experimenten gekozen op basis van een enkelvoudige relatie tussen de gas-Fractie en de MAC. MAC werd geïntroduceerd in 1965 en de concentratie van een damp in de longen die nodig is om te voorkomen dat een motorische respons (beweging) is in 50% van de onderwerpen in reactie op een chirurgische stimulans (pijn)22. MAC wordt gebruikt om de sterkte, of sterkte, van verdoving dampen te vergelijken. In ICU patiënten, is MAC gecorreleerd aan de FeSevo en de klinische Richmond beoordeling agitatie-sedatie schaal (RASS)23. Hoewel het een nuttige indicator in de dagelijkse klinische praktijk, is de relevantie van deze parameter nooit onderzocht in het kader van experimentele in vitro onderzoek. In ons protocol, vastbesloten met behulp van chromatografie analyses van het medium, wij de precieze correlatie tussen de Sevofluraan opgenomen in de gas-Fractie en de Sevofluraan ontbonden in het medium. Met deze methode wordt het specifieke effect van een vluchtige agent uitgedrukt volgens de echte concentratie in het medium plaats gebaseerd op de onderlinge aanpassing van een klinische effect. Dit belangrijke element maakt de studie van het specifieke effect van een nauwkeurig concentratie van een gehalogeneerde agent op cellen groeien in een medium om te vergelijken de effecten van verschillende concentraties van geïnhaleerde agenten. Bovendien, zoals de luchtdichte kamer zeer makkelijk te gebruiken is, deze methode maakt het mogelijk onderzoekers om te repliceren het experiment met precisie.

Een ander belangrijk punt dat het gebruik van de correlatie tussen gas breuk en MAC in experimenteel onderzoek beletten kan is dat een gehalogeneerde agent lage oplosbaarheid in bloed (bloed/gas verdelingscoëfficiënt bij 37 ° C = 0,63 aan 0,69 voor Sevofluraan). Een minimale hoeveelheid Sevofluraan is gemandateerd om op te lossen in het bloed voordat de druk in de longblaasjes bereikt evenwicht met de druk in het arterial. Dus tijdens de inductie van de anesthesie verhoogt de alveolaire (einde-getijde) concentratie (AF, alveolaire breuk) van Sevofluraan snel rond de geïnspireerd concentratie (FI, geïnspireerd breuk). Echter, in vitro cultuur voorwaarden dergelijke mechanismen niet toestaan, en gebruikelijke cel media voornamelijk bestaan uit waterige oplossingen. Bovendien is de oplosbaarheid coëfficiënt tussen water-/ gas (verdelingscoëfficiënt bij 37 ° C = 0.36 voor Sevofluraan) lager dan tussen bloed en gas, ten grondslag liggen aan het cruciale belang van het uitvoeren van analyses van de chromatografie.

Bovendien, als een gesloten pot wordt gebruikt, wordt de atmosferische zuurstof in de pot geabsorbeerd door de cellen met de gelijktijdige opwekking van kooldioxide. Dit effect is waarschijnlijk gering Kortom experimentele procedures, maar voor meer experimentele duur, cellen die zijn verstoken van zuurstof zou overschakelen naar een anaërobe metabolisme; deze verandering in metabolisme kan leiden tot een zekere mate van bias in experimentele analyses. In tegenstelling tot de gesloten pot, bij het gebruik van onze luchtdichte kamer, zijn zowel zuurstof als gehalogeneerde agent stromen verstelbaar na verloop van tijd het gerichte niveau te handhaven. Dit belangrijke kenmerk van ons protocol daarom staat het ontwerp van in vitro experimenten voor lange perioden (bijvoorbeeld meer dan één dag), waardoor het een interessante tool om te bestuderen van de cellulaire mechanismen die betrokken zijn bij longkanker epitheliale letsel en herstellen na verloop van tijd, vooral wanneer gehalogeneerde agenten worden gebruikt. Inderdaad, blijven de effecten van geïnhaleerde verdoving agenten op longkanker cellen of weefsel tijdens alveolaire schade slecht onderzocht tot nu toe, terwijl deze alternatieve therapie lijkt aan te tonen van de zeer bemoedigende resultaten12.

Er zijn echter beperkingen aan deze techniek. Eerst een verdoving machine-circuit nodig is om zuurstof, koolstofdioxide, en gehalogeneerde agent gasstromen. Met behulp van een dergelijk apparaat is verplicht te stellen het debiet en het handhaven van stabiele concentraties na verloop van tijd. Tweede, om te proeven van het medium voorafgaand aan analyses van de chromatografie, de luchtdichte kamer is kort geopend, die induceert een voorbijgaande daling in de gasconcentraties. Als we een verdoving machine-circuit moet worden gebruikt, worden de gasstromen daarna verlengd totdat verwachte concentraties opnieuw worden verkregen over de gas analyzer. Ten derde hebben we de concentratie in het medium voor slechts een fractie van elke gehalogeneerde agent, een priori op basis van eerdere onderzoek gekozen gemeten. Ten vierde, om te stabiliseren de cel middellange tot de groei van de alveolaire epitheliale cellen, moeten we gebruik van kooldioxide op een concentratie van 5%. Inderdaad, geen verdoving machine-circuit biedt een dergelijke concentratie van kooldioxide. Daarom moet de verdoving machine-circuit worden aangepast zodat de aansluiting van de gasstroom kooldioxide in plaats van distikstofoxide (lachgas). Een dergelijke verbinding dient uitsluitend in de omgeving van experimenteel onderzoek en moet voorzichtig worden afgesloten na elk experiment. Bovendien, om te voorkomen elk risico voor de mens, wij nodigen uit onderzoekers aan een toegewijde verdoving machine-circuit moet worden gebruikt voor het uitvoeren van dit protocol en niet te gebruiken van een machine gewijd aan klinische anesthesie.

De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het is relatief goedkope en zeer eenvoudig te nemen, zelfs wanneer onderzoekers hebben nooit gemanipuleerd een luchtdichte kamer vóór. Bovendien, met ons protocol, de resultaten van opgeloste Sevofluraan en Isofluraan concentraties zijn reproduceerbaar is, met die Hiermee geeft u een belangrijk kwaliteitscriterium voor experimenteel onderzoek. Ons systeem kan bovendien leiden tot de studie van andere vluchtige gehalogeneerde agenten, zoals Desfluraan. Inderdaad, een eenvoudige wijziging van het type gas verdamper apparaat zou voldoende in dit geval. Ook ons systeem kon een manier bieden waarmee zij bestuderen van de concentraties van Sevofluraan of Isofluraan ontbonden in elk type medium met verschillende oplosbaarheid, zoals water, bloed of olie.

Ons experiment is een fundamentele stap die deel uitmaakt van een groter project ontworpen voor het testen van de hypothese dat Sevofluraan en Isofluraan gunstige effecten op de longen verwonding, ontsteking en AFC via RAGE-gemedieerde wegen kunnen uitoefenen. Een primaire cultuur van menselijke alveolaire epitheliale cellen wordt gebruikt voor mechanistisch onderzoek van transepithelial vloeistof vervoer, kanaal-specifieke vloeistof transport (bijvoorbeeld met behulp van farmacologische antagonisme), epitheliale paracellular permeabiliteit, reparatie van de wond, cel migratie en proliferatie, met of zonder een gehalogeneerde verdoving agent (Sevofluraan of Isofluraan), alleen of in combinatie met cytomix (in vitro model van alveolaire letsel)24.

Kortom, werd dit protocol specifiek ontworpen om het bereiken van nauwkeurige en gecontroleerde concentraties van Sevofluraan of Isofluraan in vitro om ons begrip van de mechanismen die betrokken zijn in epitheliale long letsel tijdens ARDS en te testen van de roman therapieën voor dit frequent en levensbedreigende syndroom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

De auteurs erkennen de regioraad Auvergne ("programma Nouveau Chercheur de la Région Auvergne" 2013) en het Franse Agence Nationale de la Recherche en de richting Générale de L'Offre Soins ("programma de Recherche Translationnelle nl Santé" ANR-13-PRTS-0010) voor de subsidies. De financiers had geen invloed in de studie ontwerp, gedrag en analyse of bij de voorbereiding van dit artikel.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sevoflurane Baxter Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged
Isoflurane Virbac Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged
Human Alveolar Epithelial cells InScreenex INS-CI-1015
huAEC Medium (ready-to-use) InScreenex INS-ME-1013-500ml
Anesthetic machine circuit Drager Fabius
Gas analyzer Drageer Vamos Plus
Anesthetic gas filter SedanaMedical FlurAbsord
Heated Humifier Fisher&Paykel MR850
Chamber Curver 00012-416-00
Gas chromatography coupled with mass detection Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA Trace 1310 with TSQ 8000evo
Fused-silica column (30 m x 1.4 μm, 0.25 mm ID) Restek, Lisses, France Rxi-624Sil MS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bellani, G., Laffey, J. G., et al. Epidemiology, Patterns of Care, and Mortality for Patients With Acute Respiratory Distress Syndrome in Intensive Care Units in 50 Countries. JAMA:T Journal of the American Medical Association. 315, (8), 788-800 (2016).
  2. Thompson, B. T., Chambers, R. C., Liu, K. D. Acute Respiratory Distress Syndrome. The New England Journal of Medicine. 377, (6), 562-572 (2017).
  3. Weiser, T. G., Regenbogen, S. E., et al. An estimation of the global volume of surgery: a modelling strategy based on available data. The Lancet. (9633), 139-144 (2008).
  4. Khuri, S. F., Henderson, W. G., et al. Determinants of long-term survival after major surgery and the adverse effect of postoperative complications. Annals of Surgery. 242, (3), 341-343 (2005).
  5. De Conno, E., Steurer, M. P., et al. Anesthetic-induced improvement of the inflammatory response to one-lung ventilation. Anesthesiology. 110, (6), 1316-1326 (2009).
  6. Fu, H., Sun, M., Miao, C. Effects of different concentrations of isoflurane pretreatment on respiratory mechanics, oxygenation and hemodynamics in LPS-induced acute respiratory distress syndrome model of juvenile piglets. Experimental Lung Research. 41, (8), 415-421 (2015).
  7. Reutershan, J., Chang, D., Hayes, J. K., Ley, K. Protective effects of isoflurane pretreatment in endotoxin-induced lung injury. Anesthesiology. (3), 511-517 (2006).
  8. Uhlig, C., Bluth, T., et al. Effects of Volatile Anesthetics on Mortality and Postoperative Pulmonary and Other Complications in Patients Undergoing Surgery: A Systematic Review and Meta-analysis. Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 124, (6), 1230-1245 (2016).
  9. Li, Q. F., Zhu, Y. S., Jiang, H., Xu, H., Sun, Y. Isoflurane preconditioning ameliorates endotoxin-induced acute lung injury and mortality in rats. Anesthesia and Analgesia. (5), 1591-1597 (2009).
  10. Voigtsberger, S., Lachmann, R. A., et al. Sevoflurane ameliorates gas exchange and attenuates lung damage in experimental lipopolysaccharide-induced lung injury. Anesthesiology. (6), 1238-1248 (2009).
  11. Englert, J. A., Macias, A. A., et al. Isoflurane Ameliorates Acute Lung Injury by Preserving Epithelial Tight Junction Integrity. Anesthesiology. (2), 377-388 (2015).
  12. Jabaudon, M., Boucher, P., et al. Sevoflurane for Sedation in ARDS: A Randomized Controlled Pilot Study. American Journal of Respiratory and Critical. (2016).
  13. Blondonnet, R., Audard, J., et al. RAGE inhibition reduces acute lung injury in mice. Scientific Reports. 7, (1), (2017).
  14. Jabaudon, M., Blondonnet, R., et al. Soluble Receptor for Advanced Glycation End-Products Predicts Impaired Alveolar Fluid Clearance in Acute Respiratory Distress Syndrome. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 192, (2), 191-199 (2015).
  15. Jabaudon, M., Blondonnet, R., et al. Soluble Forms and Ligands of the Receptor for Advanced Glycation End-Products in Patients with Acute Respiratory Distress Syndrome: An Observational Prospective Study. PloS One. 10, (8), e0135857 (2015).
  16. Kuehn, A., Kletting, S., et al. Human alveolar epithelial cells expressing tight junctions to model the air-blood barrier. ALTEX. 33, (3), 251-260 (2016).
  17. Yue, T., Roth Z'graggen, B., et al. Postconditioning with a volatile anaesthetic in alveolar epithelial cells in vitro. The European Respiratory Journal: Official Journal of the European Society for Clinical Respiratory Physiology. 31, (1), 118-125 (2008).
  18. Suter, D., Spahn, D. R., et al. The immunomodulatory effect of sevoflurane in endotoxin-injured alveolar epithelial cells. Anesthesia and Analgesia. (3), 638-645 (2007).
  19. Schläpfer, M., Leutert, A. C., Voigtsberger, S., Lachmann, R. A., Booy, C., Beck-Schimmer, B. Sevoflurane reduces severity of acute lung injury possibly by impairing formation of alveolar oedema. Clinical and Experimental Immunology. (1), 125-134 (2012).
  20. Nickalls, R. W. D., Mapleson, W. W. Age-related iso-MAC charts for isoflurane, sevoflurane and desflurane in man. British Journal of Anaesthesia. 91, (2), 170-174 (2003).
  21. Bourdeaux, D., Sautou-Miranda, V., et al. Simple assay of plasma sevoflurane and its metabolite hexafluoroisopropanol by headspace GC-MS. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 878, (1), 45-50 (2010).
  22. Eger, E. I., Saidman, L. J., Brandstater, B. Minimum alveolar anesthetic concentration. Anesthesiology. 26, (6), 756-763 (1965).
  23. Perbet, S., Fernandez-Canal, C., Pereira, B., Cardot, J. M., Bazin, J. E., Constantin, J. M. Evaluation of Richmond Agitation Sedation Scale According To Alveolar Concentration of Sevoflurane During a Sedation With Sevoflurane in Icu Patients. Intensive Care Medicine Experimental. 3, (Suppl 1), (2015).
  24. Goolaerts, A., Pellan-Randrianarison, N., et al. Conditioned media from mesenchymal stromal cells restore sodium transport and preserve epithelial permeability in an in vitro model of acute alveolar injury. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 306, (11), L975-L985 (2014).
<em>In Vitro</em> Methode voor controle concentraties van gehalogeneerde gassen in gekweekte alveolaire epitheliale cellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Blondonnet, R., Paquette, B., Richard, D., Bourg, R., Laplace, G., Segurel, R., Pouvelle, H., Belville, C., Blanchon, L., Godet, T., Constantin, J. M., Bazin, J. E., Sapin, V., Jabaudon, M. In Vitro Method to Control Concentrations of Halogenated Gases in Cultured Alveolar Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (140), e58554, doi:10.3791/58554 (2018).More

Blondonnet, R., Paquette, B., Richard, D., Bourg, R., Laplace, G., Segurel, R., Pouvelle, H., Belville, C., Blanchon, L., Godet, T., Constantin, J. M., Bazin, J. E., Sapin, V., Jabaudon, M. In Vitro Method to Control Concentrations of Halogenated Gases in Cultured Alveolar Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (140), e58554, doi:10.3791/58554 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter