Vi tillhandahåller en metod för generering, odling och systematisk analys av organotypic skivor härrör från murina lungtumörer. Vi beskriver också hur du optimerar för slice tjocklek och hur du väljer läkemedelskoncentrationen att behandla tumören skivor.
Organotypic primära explant vävnadskulturer, bland annat precision-cut skivor, representerar tredimensionell (3-D) vävnad arkitekturen samt de flercelliga interaktioner av infödda vävnad. Vävnaden skivor omedelbart skär från färska opererande tumörer bevara rumsliga aspekter intratumor heterogenitet, vilket gör dem användbara surrogat i vivo biologi. Noggrann optimering av vävnad slice villkor för förberedelse och odling är grundläggande för den prediktiva diagnostiska potentialen av tumör skiva explants. I detta avseende är murina modeller värdefulla, eftersom dessa ger en konsekvent materialflödet tumör att utföra replikera och reproducerbara experiment. Det här protokollet beskriver odling av murina lung tumör-derived vävnad skivor med hjälp av en roterande inkubation enhet, ett system som möjliggör intermittent exponering av vävnader att syre och näringsämnen. Vårt tidigare arbete visade att användning av roterande inkubation enheter förbättrar lönsamheten för vävnad jämfört med andra kultur metoder, särskilt flytande skivor och stagnerande filtret stöder. Här visar vi ytterligare att skiva tjocklek påverkar lönsamheten av odlade skivor, vilket tyder på att optimering av slice tjocklek bör göras för olika vävnadstyper. Uttalad ITH i relevanta onkogena funktioner, såsom signalering verksamhet, stromal cell infiltration eller uttryck av differentiering markörer, kräver utvärdering av intilliggande vävnad skivor av uttryck för markörer ändras genom läkemedelsbehandling eller odling själv. Sammanfattningsvis, detta protokoll beskriver generationen av murina lung tumör skivor och deras kultur på en roterande inkubation enhet och visar hur skivor bör analyseras systematiskt av uttryck för heterogen vävnad markörer, som en förutsättning innan läkemedlet svar studier.
Solid tumör vävnader, inklusive lungcancer, uppvisar genetiska och fenotypiska heterogenitet, och hamnen komplexa mikromiljö1,2. Samspelet mellan tumörceller och deras omgivande närmiljön inflytande på drogen känslighet och resistens mekanismer3. Detta belyser behovet av prekliniska modeller som exakt kan modellera biologisk komplexitet och funktioner agerar i native tumörer. Precision-cut skivor omedelbart härrör från färska tumörer ger en unik resurs, eftersom de har en rektor kapacitet att representera i vivo biologi, åtminstone för ett kort tidsfönster, inklusive fenotyper rumsligt fördelade i en enskild tumör. Opererande kliniska tumörer är en av få personliga exemplar som kan erhållas från en cancerpatient och deras diagnostik förtjänar granskning.
Historien av organotypic kulturer har anor från det tidigt 19: e århundradet, när intrakraniella tumörer var handskurna i vävnad bitar och odlade med hjälp av den så kallade hängande släpp-metoden. Vävnaden fragment var kopplad till ett täckglas och tillåtet att doppa i hepariniserad humanplasma, varefter coverslips var inverterad, förseglade och odlade för flera veckor4. Manuellt klippa tumören bitar har sedan varit odlade med en mängd andra metoder, såsom på plasma blodproppar5, i flytande media6, eller på 0,45 µm porstorlek storlek filter6. Termen ”organotypic” användes först 1954, i en studie på retinal differentiering av chick embryo ögat7. Detta följdes av studier som använde lunga och hjärta vävnad bladsticklingar härrör från chick embryon8och hjärnan bladsticklingar från vuxna råttor9.
Olika metoder för skivning har varit beskrivs, nämligen manuell choppers10,11, Krumdieck vävnad slicer12,13och vibratomes11,14,15, 16. Utsnittet Krumdieck vävnad genererar cylindriska vävnad kärnor, som sedan skivas i cirkulär vävnad skivor använder en mikrotom. En vibratome, däremot, använder en vibrerande blad mikrotomen. I en studie på levern skivor visades det att den Leica vibratome genererar fler reproducerbara och konsekvent skivor jämfört med de Krumdieck slicer15. Slice tjocklekar allt från 250 till 500 µm har använts, och studier rapporterar underhåll av livskraft och morfologiska egenskaper ända till 16 dagar14,10,17,18. Dock tumörer har variabel metaboliska profiler som kan påverka näringsbehov och parametrar såsom vävnadssammansättning stelhet och matris kan påverka på luftning och näringsämnen flöde. Det är därför troligt att varje vävnadstyp kräver optimering av skivning och odlingsbetingelser.
Olika odlingsmetoder har använts för att stödja slice kulturer: jag) stationära interphase kultur, även kallad stillastående stöd kulturen, där skivor placeras ovanpå en semi porösa membran infoga nedsänkt i odlingssubstratet. I detta exponeras toppen av skivor för luften, medan botten kompletteras med näringsämnen via porösa infoga14,19; (II) murslev metoden utvecklades ursprungligen för kultur hela organ eller embryonal vävnad skivor. I detta segment är placerade ovanpå ett bomull lakan eller filter som stöds av ett metallgaller och filtret är indränkt i odlingssubstratet. För att hålla vävnader fuktig, läggs ett tunt lager av medium ovanpå skivor20,21,22. De två första är så kallade luft-vätska interphase kulturer; (III) rulle tube kulturer, där skivor är placerade inuti den platta sidan av ett plaströr som innehåller medium och långsam tube rotation garanterar att vävnaden är täckt med medium under den första delen av en cykel, eller kolsyrat under den andra23; IV) roterande inkubation enheter, där skivor utsätts ibland för medium med näringsämnen och luftning. Olika från rullen rör i denna metod skivor placeras ovanpå porösa Titan galler placeras i 6-väl plattor med odlingsmedium24.
Vävnaden skivor härrör från opererande solida tumörer logiskt närvarande en attraktiv ex vivo modell där att testa behandlingssvar av anti-cancer, som de medger utvärdering av livskraft, riktade väg aktivitet och molekylära profiler av en specifik tumör i närvaro av dess infödda tumör mikromiljö. För att utvärdera om läkemedlet Svaren mätt i tumör skivor är prediktiva för i situ svaren, är det dock viktigt att bedöma i vilken utsträckning vävnad skivor bevara tumör-specifika biologiska funktioner såsom cellproliferation, histopatologi-specifika celldifferentiering eller onkogena signalering verksamhet. Effekterna av mekanisk stress framkallas under slice förberedelse, slice hantering eller kultur-inducerad anpassningar på både kvalitet och biologiska funktioner av vävnad skivor är grundläggande frågor, tätt kopplad till förmågan att genomföra tumör-derived skivor för funktionsdiagnostik.
Vårt IMI-finansierade konsortiet projekt PREDECT (http://www.predect.eu) fastställs att systematiskt adress dessa grundläggande frågor, genom att studera slice bladsticklingar från olika källor. Använda skivor som härrör från bröst-, prostata- och lung cancer modeller, utnyttjas denna gemensamma insats kvalitativa Läs-outs samt kvantitativa hematoxylin och eosin (H & E) – baserat utläsningar att demonstrera ett krav för luftens syre och stagnerande filter stöd för att upprätthålla livskraften hos odlade skivor tills 72 h. Immunhistokemi (IHC) analyser på odlade skivor visade dessutom intra-slice livskraft övertoningar, framgår som nekros övertoningar i skivor som härrör från murina icke-småcellig lungcancer (NSCLC), östrogenreceptor (ER), HIF1α och γH2AX övertoningar i bröst cancer skivor eller androgen receptor (AR) uttryck övertoningar i prostatacancer skivor25. Intressant, intra-slice livskraft övertoningar i 24 h kulturer av murina NSCLC räddades av odling i en roterande inkubation enhet, och vår senaste studie visade att livskraft förlängdes till 72 h26. Särskilt på ovansidan återstod mest livskraftiga26, godkänna att drogen svar analyser på skivor utförs bäst på denna sida av vävnaden.
Även om det återstår en fråga om hur långt vävnad skivor kan sammanfatta i situ tumör funktioner, de har använts i stor utsträckning att testa Svaren till anti-cancer, inklusive riktade läkemedel, monoklonala antikroppar och cytostatika 10,11,13,14,18,27. Vi visade nyligen att murina NSCLC skivor Visa dynamiska förändringar i spridning och onkogena signalering aktiviteter efter odling jämfört med nyklippt 0 h skivor26. Detta indikerar att det är viktigt att undersöka huruvida de riktade i situ biologiska funktionerna bevaras på rätt sätt under odling, innan störning studier. Trots dessa fynd, visade vi att tumören skivor kan modellen rumsliga svar riktade terapier, mitt läkemedel behandlingar förbli kort (24 h) och inleds i början av odlingsskålar26. Följande protokoll beskriver viktiga validering aspekter relevanta för etablering och analys av tumören slice kulturer, innan deras tillämpning i farmakologiska drogtester.
Olika komplexa in vitro- tumör modeller, inklusive 3D kulturer och organoids, har utvecklats för att sammanfatta arkitektur och onkogena funktioner i vivo tumör vävnad29,30. Dock innebär inrättandet av 3D kulturer eller organoids vävnad dissociation och selektiv tillväxt av en enda celltyp eller samtidig odling av en Välj några celltyper i en artificiell miljö. Följaktligen, fånga sådana modeller ofullständigt krångligheter av tumör heterogenitet och tumör-stroma interaktioner. Organotypic tumör skivor, upprätthålla däremot, den vävnad arkitektur och biologiska komplexiteten i situ tumören, utan omfattande manipulation. Denna förmåga av vävnad skivor till modell tumörceller i deras infödda närmiljön gör dem särskilt attraktiv för prekliniska studier. Vi tidigare rapporterat ett optimerat arbetsflöde för etablering och analys av precision-cut tumör skivor, och visade att, jämfört med om du vill filtrera stöder, en roterande inkubation enhet förbättra lönsamheten för kortsiktiga murina NSCLC slice kulturer25 , 31. men odling på roterande enheter är tekniskt utmanande och kräver ständig övervakning. Vi presenterar här ett protokoll för tumör vävnad slice generation och praktisk användning av en roterande inkubation enhet till kultur dem, samt kompletterande metoder för att övervaka skivor förmåga att fånga i situ tumörbiologi, en förutsättning innan drogen Response Test.
Flera kritiska steg i protokollet säkra vävnad integritet och livskraft i tumör skivor. Om normal lungvävnad omger tumören, kan vibratome generera skivor med inkonsekvent tjocklek eller skada skivor, på grund av skillnader i textur och styvhet mellan normal och tumör vävnader. Det är således viktigt att ta bort den omgivande normal lungvävnaden före tumör skivning. Ett annat viktigt steg är skivning tjockleken, som noga bör optimeras för varje vävnadstyp. Dessutom när skivad, är det kritiskt att segmentet är placerad ungefär i mitten av rutnätet, så för att säkerställa korrekt intermittent doppning i odlingsmedium och syrgasexponeringen. Slutligen är det viktigt att följa positionen för en bit under dess rotationstid, som en bit kan släppa till medium; om detta händer, kan ytterligare åtgärder vidtas som förklaras i steg 3.6 i protokollet.
Förutom vävnad hantering för att säkerställa integritet, finns det också kritiska steg i IHC analysen att tolka hur segmentet liknar infödda vävnaden. Vår tidigare studie visade att murina NSCLC tumörer uppvisar uttalad intra-tumör rumslig heterogenitet i onkogena signalering verksamhet26. Detta innebär att användningen av rumsligt skilda vävnad skivor för kontroller eller drog-behandlade prover kan påverka tillförlitlig experimentella data tolkning, och därmed nära angränsande skivor bör användas som kontroller och proven. Vi ytterligare visade att medan spridning eller onkogena phosphoprotein uttryck i nyklippt obildade 0 h skivor liknade i situ tumörer, odlade skivor visade förändrad onkogena phosphoprotein uttryck, speciellt förändrad p4EBP1 och pSRC, samt förändrade spridning analyseras av Ki67 IHC. Förändrad p4EBP1 uttryck upptäcktes på samma sätt i 24 h mänskliga NSCLC och prostatacancer skiva kulturer (Narhi et al., kompletterande figur S3B-S3C, S5 och S7)26. Dessa resultat stöder att jämförelse av odlade skivor med deras närmaste 0 h obildade skiva är avgörande för att bedöma bevarandet av i situ tumör funktioner i odlade skivor.
Trots att förbättra lönsamheten för organotypic skivor25, finns det begränsningar med rotator systemet i fråga om teknikaliteter. Att placera vävnad skivor på Titan stödraster är mer utmanande jämfört om du vill filtrera skär och en roterande inkubation enhet kanske inte är tillgängliga. Som ett alternativ, stillastående filtret stöder kan användas, men i så fall bara den air-exponerade sidan av skivor bör analyseras, som luft-till-filter lutningar i livskraft och hypoxi mätt av HIF1α uttryck bildas snabbt i filter-stödda slice kulturer (Davies et al., figur 5 och figur 7A-7B)25. Vi har vidare visat att tumören slice kulturer kan uppvisar förändrad spridning och onkogena signalering aktiviteter jämfört med deras infödda tumörer26, möjligen på grund av sårläkning Svaren eller metabol anpassning av skivor till ex vivo kultur32. Trots att brutto morfologiska egenskaper av murina NSCLC tumörer bibehölls under 72 h odling, kan kultur-inducerad proliferativa förändringar påverka korrekt gradering av odlade skivor. Vävnad skivor bör således endast användas för funktionella korttidsstudier.
Användning av en roterande inkubation enhet räddar åtminstone delvis intra-slice livskraft eller biomarkör uttryck övertoningar, särskilt under de första 24 h av kultur. När validerat för integritet och funktion, ger detta vävnadsmaterial för funktionella studier, såsom narkotika behandlingsstudier. Förutom läkemedel svar profilering får förändrad mål uttryck efter läkemedelsbehandling också antikropp validering. Detta är särskilt relevant för detektion av murina epitoper med musen monoklonala antikroppar, eftersom dessa tenderar att ge hög färgning bakgrund. Dessutom är väl validerade antikroppar krävs för att uppnå tillförlitliga och reproducerbara data i diagnostiska och kliniska inställningar. Modulering av överflödet eller fosforylering av relevanta epitoper efter läkemedelsbehandling i vävnader skivor ger således en händig praktisk tillämpning i antikropp validering. En stor fördel med tumör slice kulturer är möjligheten till modell rumsligt-distribuerade funktioner, inklusive onkogena signalering verksamhet eller narkotika svar i tumören eller stromaceller, vilket gör dem en attraktiv ex vivo -modell. Men skivor rotera under odling, och processen för odling kan ytterligare skada vävnaden särskilt i kanterna. Det därför svårt att just overlay biomarkör-färgade IHC bilder av 0 h skivor med nekrotiska områden upptäcks i odlade skivor, som äventyrar möjligheten att länka just rumsliga biomarkör aktiviteter till narkotika svar. Tumör-inneboende, kultur-inducerad och läkemedelsinducerad nekrotisk svar är dessutom omöjlig att skilja minst i murina NSCLC vävnad skivor, att kompromissa med noggrann kvantitering av rumsliga drog svaren. Slutligen, tillåter användning av tumör slice kulturer forskare på prov flera föreningar på samma tumören, utan att behöva behandla djuren, därmed förfina, minska och ersätta experiment på laboratoriedjur.
Som en framtida ansökan, kan beskrivna protokollet antas att kliniska solid tumörprover. Ytterligare krävs vävnad typberoende modifieringar eller optimeringar sannolikt börjar med justeringar till vibratome inställningar inklusive skiva tjocklek och vibrationer hastighet att optimera dessa för tumör textur eller stelhet. Dessutom kan näringsämne och tillväxtfaktor krav variera för olika tumörvävnad. Som ett exempel, har breast cancer skivor varit odlade med insulin kompletteras i medelstora13,18. Med tanke på att begränsad vävnadsmaterial erhålls under operation eller biopsi, kan optimering av patientderiverade tumör slice kulturer vara svårt på grund av svårigheter att få tillräckligt antal identiska prover. Dessutom är data reproducerbarhet också utmanas av uttalad patient-till-patient prov heterogenitet, särskilt i procentandelen av tumörceller jämfört med fibrotiska regioner eller stromal infiltrat samt nekrotisk vävnad komponenter. Slutligen skulle tillämpningen av tumör skivor i diagnostikinställningar kräva undersökning av i vilken utsträckning som drog svaren i slice bladsticklingar av förbehandling biopsier matcher till efterbehandling i vivo svaren.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete fick finansiella forskningsstöd från gemensamma företaget av den innovativa läkemedel initiativ bevilja avtal no 115188, Helsingfors universitet doktorandprogrammet i biomedicin stipendier (A.S.N.) och den Sigrid Juselius och Orion-Farmos stiftelser (E.W.V.). Vi tackar våra PREDECT vävnad slice plattform konsortiemedlemmar (Taija af Hällström och Siv Knaappila för stöd i upprättandet av rotator systemet och Riku Turkki för stöd med MATLAB analysen. Jouko Siro är tackade för att fånga fotografierna som figur 1. Vi tackar FIMM WebMicroscope laget för skanning histologiska bilderna, och laboratorium djur centrum för djurhållning stöd.
Hank’s Balanced salt solution (HBSS) | Sigma | H6648 | |
Penicillin Streptomycin solution | Thermo Fischer Scientific | 15140-122 | |
Ham's F-12 medium | Thermo Fischer Scientific | 21765-037 | |
Glucose | VWR | 101174Y | |
FBS | Thermo Fischer Scientific | 10270-106 | |
Glutamine 200mM | Thermo Fischer Scientific | 25030-024 | |
Cyanoacrylate adhesive (GLUture) | Abbott | 32046-90-1 | |
Leica VT1200 S vibrating blade microtome | Leica Biosystems | 14048142066 | |
Slicing blade | VWR | PERS60-0138 | |
Titanium grids | Albamma Research and Development | MA0036 | |
Slice incubation unit | Albamma Research and Development | MD2500 | |
10 cm tissue culture plate | Sarstedt | 83.1802 | |
24-well plate | Sarstedt | 83.1836 | |
6-well plate | Sarstedt | 83.1839 | |
Neolus Hypodermic Needles | Terumo Neolus | NN2525R | |
50 mL falcon tube | Greiner | 227261 | |
PBS | Lonza | BE17-517Q | |
Formaldehyde | Fisher | F/1501/PB08 | |
Trifold histo cassette paper | Cancer Diagnostics | DX26280 | |
Histo cassettes | VWR | 720-2199 | |
KOS The microwave multifunctional tissue processor | Milestone SRL | CAT307EN-003 | |
Microtome | Thermo Fischer Scientific | HM355S | |
Superfrost Ultra plus slides | VWR | 631-0099 | |
BSA | Sigma | A2153 | |
NGS | Thermo Fischer Scientific | 16210-064 | |
Citric acid | Sigma | C1909 | |
PT-Module | Thermo Fischer Scientific | A80400012 | |
Hematoxylin for H&E staining | Merck | 1.09249.0500 | |
Hematoxylin for counter staining | Dako | S3309 | |
Eosin | Sigma | E4382 | |
NKX2-1 antibody | Abcam | ab133638 | Lot Number: GR98031-12 |
pERK 1/2 antibody | Cell Signaling Technologies | CST 4370 | Lot Number: 17 |
p4EBP1 antibody | Cell Signaling Technologies | CST 2855 | Lot Number: 20 |
BrightVision poly-HRP Goat anti-rabbit secondary antibody | ImmunoLogic | VWRKDPVR-110HRP | |
Mounting medicum pertex | VWR | MEDT41-4021-00 | |
DAB | ImmunoLogic | VWRKBSO4-110 | |
Dactolisib (NVP BEZ-235) | Selleckchem | S1009 | |
Selumetinib (AZD2644) | Selleckchem | S1008 | |
Pannoramic 250 slide scaner | 3DHISTECH | ||
MATLAB | MathWorks | https://se.mathworks.com/products/matlab.html | |
3DHISTECH PANNORAMIC VIEWER | 3DHISTECH | https://www.3dhistech.com/pannoramic_viewer | |
Adobe Photoshop CS6 | Adobe | https://www.adobe.com/products/photoshop.html?sdid=KKQIN&mv=search&s_kwcid=AL!3085!3!247821564908!e!!g!!adobe%20photoshop&ef_id=U8T1GwAABVTK3gDR:20180712103259:s | |
Fiji-ImageJ | ImageJ | https://imagej.net/Fiji | |
CellProfiler | CellProfiler cell image analysis software | http://cellprofiler.org/ |