Summary
ここでは、レニフォーム線虫耐性に対する綿のゲノムタイプの迅速な非破壊スクリーニングのためのプロトコルが提示される。このプロトコルは、線虫に感染した綿の苗の根を視覚的に調べて感染反応を決定することを含む。各植物からの栄養芽は、種子生産のための植物を回復するために伝播されます。
Abstract
線虫管理を改善するためには、耐性綿(ゴシピウムヒルストゥム)品種の開発には、迅速な非破壊性線虫線虫(ロティレンクルス・レニフォルミス)スクリーニングプロトコルが必要である。ほとんどのプロトコルは、綿根系またはポッティング土壌からバーミフォーム線虫または卵を抽出して、人口密度または再生速度を決定することを含む。これらのアプローチは、一般的に、評価される少数のジェノタイプで時間がかかります。ルートシステムが線虫感染について視覚的に検査される別のアプローチについて説明します。このプロトコルは、角線虫で植えた7日後に綿の苗を接種し、接種後28日目に根系に付着した雌の数を決定することを含む。データは、根の成長の変動を調整するために、新鮮な根の体重のグラムあたりの女性の数として表されます。プロトコルは、感染部位を確立する線虫の能力に関連する宿主植物耐性を評価するための優れた方法を提供します。しかし、線虫再生を妨げる抵抗は評価されない。他のスクリーニングプロトコルと同様に、実験内および実験間の個々のゲノタイプ間の線虫感染には一般的に変化が認められる。データは、プロトコルを使用して観察される変動の範囲を示すために提示される。このバリエーションを調整するために、コントロールジェノタイプが実験に含まれています。それにもかかわらず、プロトコルは、ホスト植物耐性を評価するためのシンプルで迅速な方法を提供します。このプロトコルは、G からの耐性アクシビリティを識別するために正常に使用されています。樹木胚芽を収集し、抵抗の遺伝学を決定するために300人以上の個体の分離集団を評価する。また、耐性繁殖のための植物を回収するための栄養伝播法も開発された。線虫評価のための根系を除去した後、栄養シュートは新しい根系の開発を可能にするために植え替えられる。芽の95%以上は、通常、植物が成熟に達する新しい根システムを開発します。
Introduction
ロティレンチュルス・レニホルビス(リンフォードおよびオリベイラ)は、一般にレニフォーム線虫と呼ばれ、米国南東部の土壌に存在する主要な寄生線虫種の1つであり、1、2、3である。線虫は、そのライフサイクル2、4を完了するためにホストプラントを必要とする義務的な、座りっぱなしの半エンドパラサイトです。Vermiformの前成人女性線虫は、ステレ2、3に給餌部位を確立するために宿主根系に侵入する。線虫が供給および成熟するにつれて、宿主根の外側に残る後部は卵の産生時に膨らみ、特徴的な腎臓の形を形成する(図1)。ロティレンチュルス・レニフォルムは、綿4を含む300種以上の植物種の根系に餌を与えることができる。高地綿(ゴシピウムヒルスタムL.)は、米国南東部で広く栽培されていますが、Rの欠如. レニホルミス耐性品種は線虫管理2、3を妨げる。ネマチド処理や非宿主作物種による回転などの管理戦略は、土壌Rを減少させるために使用されてきた。レニフォルムは人口密度5、6、しかし、種子綿収量損失は一般的に1から5%2の範囲であり得る。Rの症状.レニホルビス感染は、植物の衝撃、抑制された根の成長、栄養欠乏、果実中絶、および遅れた成熟2を含むことができる。しかし, フィールド全体の症状の均一性のために症状が明らかでない場合があります。;したがって、R を評価するアプローチ。レニホルビス感染症は、耐性の高地綿の品種を同定し、開発するために必要とされる。Rの評価 .綿のレニフォーム耐性は困難と考えられている7は、感染した根系は、植物が感染の症状を示す場合でも正常に見えることがあるので8.
Rの同定には効果的な線虫スクリーニングプロトコルが必要である。レンチホルマーは、綿胚芽コレクションからの耐性アクセーション、およびこれらのアクセシビリティに対する耐性遺伝学の決定のために。このようなプロトコルは、高地綿への抵抗遺伝子の伝達に役立ちます。Rを評価するために様々なバイオアッセイ法が用いられてきた。綿8、9、10、11、12、13、14、15におけるレニフォーム感染症。 一般に、R の識別には 2 つの主要なアプローチが使用されています。レニフォームは、耐性綿のジェノタイプです。最も頻繁に使用されるアプローチは、感染した植物または土壌8、11、12、14、15から卵および/またはバーミフォーム線虫を抽出することを含む。このアプローチの一般的な方法論は、個々の綿の異種の種子を別々のポットに植え、苗を7~14日間発達させ、Rのvermiformステージの混合物を加えることによって苗を接種することを含む。線虫を土壌に対して30~60日間根系に感染させる。次に、各植物の感染した根系またはポッティング土壌から、バーミフォーム線虫および/または卵を抽出する。次に、抽出された線虫または卵の数は、耐性のゲノム型を同定するために制御されたゲノタイプと比較される集団密度および再生速度を推定するために決定される。
別のアプローチは、ここで説明するように、線虫に感染した綿根系を顕微鏡的に調べて、根10、16を寄生する雌線虫の数を決定することを含む。他のアプローチと同様に、綿のゲノムは別々の鉢に植えられ、植え付けの約7日後にバーミフォーム線虫で接種される。接種後30日以内に、根系を個々の植物から除去し、土壌を根からすすいでくすいだ。次に、根系に付着した線虫を赤い食品着色剤17で染色し、根を顕微鏡的に調べて、耐性綿の種型を持つ感染部位の数を決定する(1グラム当たりの線虫数に基づいて同定される)のルート)は、影響を受けやすいコントロール16と比較して。この2番目のアプローチは、評価に必要な日数を減らし、単一の実験で評価される個々のジェノタイプの数を増やすことによって、スループットを高める利点があります。集団密度または生殖速度を評価するスクリーニング方法論は、感染徴候7の目視観察に基づくものよりも時間がかかることが多い。しかしながら、このアプローチの1つの制限は、卵産生によって決定される線虫再生を妨げる宿主植物耐性が評価されない13である。
Rのスクリーニング プロトコル 。レニフォーム抵抗は、多くの場合、評価7の間に根系を破壊し、廃棄される栄養シュートを伴う。この制限を克服するために、種子生産のための植物の回収を可能にする栄養伝播の方法が開発された18.線虫評価のための根系を除去した後、栄養シュートは、根系が再成長できるようにポッティング土壌に植えられています。このメソッドは、ほとんどのRに対して広範なアプリケーションを持っています。レニフォームスクリーニングプロトコル。栄養伝播の簡単で迅速な方法は、Rを繁殖するために非常に重要です。レニフォルムは、子孫の回復が次世代に耐性のゲノムを進めるために必要とされる高地綿の品種に耐性があります。
レニフォーム線虫耐性のための綿のゲノタイプの大規模なスクリーニングのためのプロトコルが提示されます。目標は、耐性の高地綿品種の繁殖を支援するために、線虫耐性のための綿の繁殖集団を評価するためのシンプルで迅速な非破壊スクリーニング方法を開発することです。このプロトコルを使用して、データは通常35日以内に取得され、300以上のジェノタイプが1回の実験で評価されます。これらの方法を用いて一般的に観察される変動を示すために、耐性と感受性の高いゲノムタイプに関するデータが提示されます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Rのソースの維持 .レニフォルミスイノクソム
- テラコッタ粘土ポット(直径15cm、高さ13.5cm)を、1部の砂と2部の砂の蒸気低温殺菌ミックスで埋めます。各ポットに感受性トマト(ソラナムライコパシコン)品種を植え、ガラスハウスにポットを置きます。
注:綿などの他の影響を受けやすい植物の品種は、トマトの代わりに使用することができます。 - トマトの植物をvermiform reniform線虫で接種する(ステップ3.3参照)。約28°Cの温度でガラスハウス内の植物を維持します。
2. R用コットンジェノタイプの植え付けレニフォルミス抵抗評価
- 畑から採取した1部の砂と2部の細かい砂を組み合わせて土壌を準備します。
- 蒸気は、土壌が線虫や土壌媒介植物病原体の自由であることを確認するために、土壌混合物を低温殺菌します。
- 円錐形のプラスチックポット(直径4センチメートル、高さ21センチメートル)に土壌混合物を追加します。ポットを充填する前に、土壌の損失を防ぐために、ポットの底に綿のボールを置きます。鍋の上部から約2cmの土を部分的に充填します。
- 植える遺伝子型を指定するために、各ポットのためのプラスチックステークを準備します。
- 評価のために選択された綿のゲノムタイプの植物種子。
- 各種子がユニークな遺伝子型を表す分離集団の評価のために、各ポットに単一の種子を植えます。
- 綿の品種または胚芽のアクセシレーションの場合、線虫接種の前にポットから取り除かれた他の苗を持つ少なくとも1つの植物の発芽を保証するために、単一のポットに2〜3種子を植えます。
注:または、種子は、非実行可能な種子を持つポットの数を最小限に抑えるために、植え付け前に24〜72時間発芽することができます。
- 選択された耐性と感受性制御ジェノタイプの植物種子。
注: コントロールジェノタイプは5~10回複製され、スクリーニング方法論に固有の自然変動を評価します。 - 各ポットの種子をカバーするために追加の土壌でポットを埋めます。
- 成長室にポットを置きます。成長室の周囲の気温である28°Cの一定温度を維持します。16時間の光周期で蛍光灯と白熱ランプの混合物で人工照明を提供します。
- 各ポットに水エミッタを置き、自動給水システムを使用して1日2回ポットに水をやります。植物が成長するにつれて追加の水を供給するために水やりシステムを調整します。
3. 綿植物の線虫接種と根試料の調製
- 抽出可能なトマト植物上に維持された抽出物レニフォーム線虫(ステップ1参照)は、接種前日に溶出体19及び遠心浮他20の方法論を用いた。抽出した線虫を4°Cに保存します。
注:バーマン漏斗抽出21は、線虫抽出のための代替方法である。 - 100 μLサブサンプル中の線虫の数を数えて抽出した線虫の数を決定し、接種用に水道水中に1,000線虫/mLの懸濁液を準備します。
- 線虫懸濁液で植えた後、綿の苗7dを接種する。植物の隣の土壌に小さなくぼみを作成し、うつ病にレニフォーム線虫懸濁液のピペット1 mL。
- 線虫評価のための接種後、ポット28 dから植物を取り除きます。
注:この段階では、植物は約15センチメートルの高さで、4〜6完全に膨張した葉です。- 鉢から植物を取り除く前に、はさみを使って植物から完全に膨張した葉のほとんどを取り除きます。
- ポットから植物を取り除くために、鍋を絞り、手に土をスライドさせます。
- 10Lコンテナで水道水の根系を攪拌して根からゆっくりと土を取り除きます。きれいな水道水の容器で根系を簡単に洗い流します。
- はさみを使って、土壌線から約1cm下の植物から根系を取り外します。
- ルートシステムを120 mLプラスチック、非滅菌、使い捨て標本容器に入れ、同定に使用するポットのプラスチックステークと一緒に置きます。
注: ステップ 3.7 に進む前に、複数のサンプルが処理されます。植物の芽の栄養伝播のためのステップ4に進みます。 - 根系に取り付けられた線虫を染色するために、水道水に赤い食品着色17の12.5%(v/v)溶液を調べます。
- 約30mLの赤い食品着色液を試料容器内の根試料に加え、根系を完全に覆います。
- 試料容器を電子レンジに入れ、染色液が沸騰し始めるまで根試料を加熱します。電子レンジからサンプルを取り出し、室温で冷却します。
- 根試料から赤い食品着色液をデカントし、余分な汚れを除去するために、試料容器に約100mLの水道水を加えます。蓋を試料容器に置き、4°Cの冷蔵庫に保管します。ルート感染の評価のためにステップ5に進みます。
注: 手順 5 に進む前に、プロトコルをここで一時停止できます。
4. 種子生産のための植物を回収するための栄養伝播
- 円錐形のプラスチックポットの底に綿のボールを置き(ステップ2.3を参照)、部分的に泥炭苔ポッティングメディアでポットを埋めます。その後、ポットに栄養シュートを置き、しっかりとポットを埋めるためにポッティングメディアを追加します。綿の遺伝子型を指定するために、各ポットに新しいラベルのプラスチックステークを配置します。
- ポットのトレイをプラスチック容器(長さ73.6cm×幅45.7cm×高さ15.2cm)に水を入れ、植物に短時間水を入れ、ポッティングメディアを湿らせます。16時間の光周期を使用して28 °Cの一定温度で成長室にポットを置きます。土壌水分を維持するために必要に応じてプラスチック容器に追加の水を追加します。
- 約30d.後に種子生産のための大きなポットに植物を移植し、部分的にポッティングメディアで6Lプラスチックポットを充填(ステップ4.1参照)、小さなポットから植物を削除し、6Lポットに植物を配置し、しっかりとポットを埋めるためにポッティングメディアを追加します。
- 植物をガラスハウスに入れ、ポッティングメディアを湿らせる水を加えます。約28°Cでガラスハウスの温度を維持します(人工照明は必要ありません)。
- 水は約30dのために必要に応じて手で植物を。
- 植物の約75%が毎日の給水を必要とする場合、自動給水システムを使用して毎日水の植物。植物の成長に必要に応じて、自動給水システムをより頻繁に水に調整します。
- 花の開始前に各ポットに約10gの遅放出肥料を追加します。
- 成熟時に植物を収穫し、綿の種子サンプルを処理して、さらなる評価のために種子を得ます。
- 綿の種子を収穫するには、手で植物の開いたボルから綿を取り出し、ラベル付きの紙袋に入れます。種子は綿繊維に取り付けられ、次のステップで除去される。
- 10ソーの実験室ジンを使用して種子サンプルから糸くず繊維を取り除きます。
- 濃縮硫酸を使用して種子サンプルからファズ繊維を除去します。炭酸ナトリウムの15%(v/v)溶液中で種子サンプルを中和し、水道水でサンプルをすすいで、強制空気乾燥機でサンプルを乾燥させます。
- シードサンプルをラベル付きの封筒に入れて保管します。
5. Rの評価.レニフォルミスルート感染
- 試料容器から根試料を取り出し、立体顕微鏡(20X倍)を使用して根系に取り付けられた雌線虫の数を数えます。
注:唯一の女性のレニフォーム線虫は、植物の根に感染することができる。 - 余分な水分を取り除くために、約10分間ペーパータオルの上に根系を置きます。ルートシステムの重量を量り、新しい根の重量を決定します。
- 線虫数と新鮮なルートウェイトデータをコンピュータスプレッドシートプログラムに入力し、ルートのグラムあたりのメスの数を計算します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
2種類の根系のロティレンチュルス・レニホルム感染を図1に示す。比較的少ない雌のレニフォーム線虫は、感受性遺伝子型と比較して耐性綿遺伝子型の供給部位を確立することができる。ルートの成長の変化は、図 2に示すように、アクシビリティ間で一般的です。新鮮な根の重量によって測定されるこの変動は、同じ遺伝子型の植物間でも観察することができる(表1)。ゴシピウム樹木性ゲノム型は、高地綿の植物型よりも根の成長率が低いことを頻繁に示す。この変動を補うために、データは、各遺伝子型のグラム根組織あたりの雌レニフォーム線虫の数を計算するために使用される新鮮な根の重みで収集されます。耐性ゲノム型の根の1グラム当たりの雌ルネフォーム線虫の数は一般的に10未満であるのに対し、感受性の高いゲノム型は一般的に根の1グラム当たり30以上の線虫を持つ。
Rの綿のゲノムタイプをスクリーニングするための1つの課題.レニフォーム耐性は、実験の内外で起こりうる潜在的な変動である。この変動を評価および調整するために、耐性と感受性の高い綿のジェノタイプがコントロールとして含まれ、各実験で複製されます。表1は、上述したプロトコルを用いた2つの別々の実験において対照として用いられる2つのゲノム型のデータを示す。この種型を10回複製し、1,000バーミフォーム線虫で植え付けた7日後に接種し、その後、根系に付着した線虫を数えるために接種後28日後に採取した。実験は異なる時間に行われたので、接種に使用される線虫の供給源は異なっていた。それ以外の場合、他のすべてのパラメータは似ていました。これらのデータは、線虫評価において観察できる変動を示す。女性線虫数と根重みは実験1で実験2と比較して2つの対照で高く、実験1の根1の1グラム当たりのメス数が多かった。女性の数は実験1でかなり高かったので、根の重みの増加は、実験2で観察されたレベルに根のグラム当たりの女性の数を下げませんでした。個々の遺伝子型の複製間のかなりのばるしも観察された。しかし、耐性G. 樹木遺伝子型PI 615699は、感受性Gよりも根の1グラム当たりの女性数が実質的に低く、メスの数が少ないことを頻繁に示した。ヒルスタム遺伝子型PI 529251。これらの手段を比較に使用すると、ゲノムタイプは耐性または感受性として容易に分類することができます。毛源のグラム当たりのメスの数が感受性制御の約10%である場合、ゲノム型は耐性として分類される。
プロトコルを使用して評価された分離 F2母集団からのデータのサブセットを表 2に示します。人口は300 F2植物を含み、変動の範囲を表す50植物のデータが提示される。300の植物の人口のために、根系に感染する観察された線虫の数は0から50の範囲で、平均は9.4であった。根の重みは0.01~1.22gで、平均は0.38gで、根の1グラム当たりのメスメターデスは0~400で、平均は33.6でした。両親は評価で複製された。耐性親(PI 417895)は、根のグラム当たり5.8メスの平均を示し、平均根重量は0.8gでした。対照的に、感受性親(PI 529729)は、根のグラム当たり40.8メスの平均を示し、0.35gの平均根重量は線虫感染を示さなかったし、耐性として分類されたが、これは脱出を表すかもしれない。根の成長が悪いこれらの植物と植物の両方は、通常、データ分析から削除されます。根系系の根の成長と線虫感染の変動のこの範囲は、線虫評価のために一般的に観察されます。したがって、単一の実験で多数の植物をスクリーニングする能力は、この変動を最小限に抑え、抵抗性の遺伝学を正確に評価することを可能にする。集団は線虫感染の定量的変動を示し、植物は感受性の高い親からのデータに基づいて耐性として分類され、この集団に対する2つの劣性遺伝子によって耐性が与えられたことを示唆した。さらに、上記の栄養伝播プロトコルは、この集団から植物を回復するために正常に使用されました。個々のF2植物に由来するF3子孫の評価は、F2植物の評価に頻繁に対応した。
図1:ロティレンチュルス・レニホルミが感染した根試料。耐性のある綿の遺伝子型(左下)からの根サンプルは、根に付着した単一の雌線虫を示し、一方、影響を受けやすい遺伝子型(右上)は、根に付着した複数の雌を示す。黒いバーは 0.1 mm の縮尺を表します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: 2つの綿の遺伝的型の根の成長に観察された変動。2つのレニフォーム線虫耐性G.arboreumアクサーのルートシステムは、根の成長のために観察することができる変動を示すために提示される。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
表1:コントロールとして含まれる2つの綿の遺伝的型に対する線虫感染応答において観察された変動。これらのデータは、感受性G.hirsutum遺伝子型PI 529251および耐性Gに対する実験の間および間に起こりうる変動を示す。樹木遺伝子型 PI 615699;しかし、データ平均は有意に異なり、ゲノム型は耐性または感受性として容易に分類される。
| 遺伝子型指定 | 女性 | 根の重み(g) | 女性/g ルート | 分類 |
| 88歳 | 0 | 0.67 | 0.0年 | 耐性 |
| 156名 | 0 | 0.10 | 0.0年 | 耐性 |
| 75歳 | 2 | 1.05分 | 1.9年 | 耐性 |
| 298の | 2 | 0.58円 | 3.4年 | 耐性 |
| 259名 | 3 | 0.77 | 3.9年 | 耐性 |
| 208年 | 1 | 0.21分 | 4.8年 | 耐性 |
| 322の | 4 | 0.82円 | 4.9年 | 耐性 |
| 189年 | 2 | 0.35 | 5.7年 | 耐性 |
| 147の | 6 | 0.94件 | 6.4年 | 耐性 |
| 267の | 2 | 0.18円 | 11.1年 | 適度に抵抗力がある |
| 198年 | 5 | 0.43分 | 11.6年 | 適度に抵抗力がある |
| 251名 | 2 | 0.17 | 11.8年 | 適度に抵抗力がある |
| 95歳 | 6 | 0.46分 | 13.0年 | 適度に抵抗力がある |
| 248の | 3 | 0.23 | 13.0年 | 適度に抵抗力がある |
| 79歳 | 11歳 | 0.84円 | 13.1年 | 適度に抵抗力がある |
| 340の | 4 | 0.29件 | 13.8歳 | 適度に抵抗力がある |
| 114の | 9 | 0.64年 | 14.1年 | 適度に抵抗力がある |
| 168の | 6 | 0.40年 | 15.0年 | 適度に抵抗力がある |
| 117の | 7 | 0.44分 | 15.9年 | 適度に抵抗力がある |
| 77歳 | 10歳 | 0.57分 | 17.5年 | 適度に抵抗力がある |
| 277の | 9 | 0.44分 | 20.5年 | 適度に抵抗力がある |
| 47歳 | 8 | 0.34 | 23.5年 | 適度に感受性 |
| 96歳 | 20歳 | 0.85円 | 23.5年 | 適度に感受性 |
| 139の | 15歳 | 0.60年 | 25.0年 | 適度に感受性 |
| 253名 | 2 | 0.08円 | 25.0年 | 適度に感受性 |
| 247の | 15歳 | 0.53年 | 28.3年 | 適度に感受性 |
| 308の | 8 | 0.28円 | 28.6年 | 適度に感受性 |
| 152名 | 9 | 0.31 | 29.0年 | 適度に感受性 |
| 123の | 8 | 0.26分 | 30.8歳 | 適度に感受性 |
| 296の | 18歳 | 0.58円 | 31.0年 | 適度に感受性 |
| 138の | 10歳 | 0.31 | 32.3歳 | 適度に感受性 |
| 151名 | 5 | 0.15 | 33.3歳 | 適度に感受性 |
| 102の | 31歳 | 0.77 | 40.3歳 | 適度に感受性 |
| 67歳 | 5 | 0.12分 | 41.7歳 | 受け やすい |
| 51名 | 18歳 | 0.43分 | 41.9歳 | 受け やすい |
| 311の | 21歳 | 0.48円 | 43.8歳 | 受け やすい |
| 334の | 4 | 0.09年 | 44.4歳 | 受け やすい |
| 266の | 33歳 | 0.74年 | 44.6歳 | 受け やすい |
| 260の | 7 | 0.14 | 50.0年 | 受け やすい |
| 49歳 | 16歳 | 0.32分 | 50.0年 | 受け やすい |
| 149の | 20歳 | 0.39件 | 51.3年 | 受け やすい |
| 104の | 22歳 | 0.34 | 64.7歳 | 受け やすい |
| 238の | 39歳 | 0.57分 | 68.4歳 | 受け やすい |
| 144の | 24歳 | 0.33 | 72.7歳 | 受け やすい |
| 225名 | 24歳 | 0.30 | 80.0年 | 受け やすい |
| 87歳 | 38歳 | 0.43分 | 88.4歳 | 受け やすい |
| 126の | 50歳 | 0.51年 | 98.0年 | 受け やすい |
| 272の | 3 | 0.03 | 100.0年 | 受け やすい |
| 154名 | 24歳 | 0.12分 | 200.0年 | 受け やすい |
| 286の | 3 | 0.01 | 300.0年 | 受け やすい |
表2:50のゲノムのサブセットで観察されたレニフォーム線虫感染応答 G. 植物園F2集団.これらのデータは、集団を分離するために観察できる変動の範囲を示しています。根の重さ、線虫数、および根のグラムあたりのメスの数は、耐性、適度に耐性、適度に感受性、または感受性に分類される植物で、各遺伝子型に提示されます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1)Rの同定には効果的なスクリーニングプロトコルが必要である。レジフォルムは耐性の遺伝的な耐性を評価するために、2)耐性品種の繁殖を評価するために耐性綿の遺伝子型。ほとんどのプロトコルはRを評価します。レンチホルミス集団密度または綿根系またはポッティング土壌8、11、12、14、15からバーミフォーム線虫または卵を抽出することによって、生殖速度.これらのアプローチは、多くの場合、より時間がかかり、結果は実験内および実験間でより多様になる傾向があります。さらに、綿のゲノム型は、これらのプロトコル11を用いた非複製ガラスハウス実験において、より頻繁に誤分類されうる。それにもかかわらず、同様の結果は、評価された様々なプロトコルまたはパラメータ9、13のために達成することができる。
根系に寄生する雌レニフォーム線虫の数を評価することによって綿のジェノタイプのスクリーニングを行う代替スクリーニングプロトコルが提示される。耐性と感受性の綿のゲノム型は、最初は接種後16時間以内に根系に侵入する同様の数の雌線虫を示すかもしれませんが、36時間以内に、耐性ゲノム型は有意に少ない付着した女性を示し始めます。線虫と線虫の発達が妨げられている9.したがって、このスクリーニングプロトコルは、根系またはポッティング土壌からの線虫または卵の抽出に依存するプロトコルと比較して、綿根系の線虫感染のより直接的な尺度を提供する。バーミフォーム線虫による綿苗接種の方法は、アプローチ間で同様である。接種は通常、植え付け後7~14日で行われますが、種子はレニフォーム線虫出出土壌に直接植え付けることもできますので、接種のタイミングはあまり重要ではありません。接種は1,000バーミフォーム線虫を用いて行われるが、プロトコルは接種に使用される数を増減するように変更することができ、または十分な女性線虫を保証するために植え付け後7日と14日で2回の接種を行うことができる。ルート感染のために存在する。大豆では、接種に使用される線虫の数は、植え付け後21日目の卵質量評価に有意な影響を及ぼさなかった。しかし、より高い評価は、通常、より高い線虫集団密度22で観察された。プロトコルは接種のための最低線虫密度を決定するために最大限に活用することができる。
ルートシステムの線虫感染は、このプロトコルの接種後28日後に評価され、これは一般的に他のプロトコルよりも早い。卵の孵化の前に評価が行われるので、これはプロトコルの重要なステップです。ルートサンプルの収集に大幅な遅延が発生すると、2回目の感染が発生する可能性があります。ただし、この以前の評価には、スループットを向上させる利点があります。提示されたプロトコルのために、綿のゲノムは、ポットから根系の簡単かつ迅速な除去のために重要である砂と土壌の混合物に植えられています。ポットが乾燥するのを防ぐために、砂と土壌の混合物を含む小さな鍋を使用する場合は、自動給水システムの使用が不可欠です。赤い食品の着色は、単純かつ安全な方法である根系に取り付けられた線虫を染色するために使用される17.根系が染色されると、ルートシステムに取り付けられた線虫の数を数える前に、4°Cの水道水に保存することができます。したがって、線虫数の評価の前にサンプルの追加処理は必要ないため、単一の実験でより多くの綿のゲノタイプを評価することができます。また、根のサンプルを数日間水道水に保存すると、根が汚れを落とし、カウントが容易になります。
記載されたプロトコルは、実験間に起こる環境変動を低減するために、より大きな集団のスクリーニングを可能にする。自動給水システムを備えた900m2植物成長室を使用して、480の個々の植物の集団を評価することができる。このプロトコルは、抵抗10、18の遺伝学を特徴付けるために300人以上の個体の分離集団を評価するために成功した。これらの集団は、線虫感染およびGにおける耐性に対する定量的変動を示した。樹木は、より頻繁に複数の劣性遺伝子に関連付けられていてもよい。したがって、遺伝子研究には、より大きな集団が必要です。さらに、集団分離において定量的変動が観察され、採用されたプロトコルにかかわらず、線虫感染応答を評価する。
綿の宿主植物耐性は、線虫が根系に感染し、摂食部位を確立する能力を妨げる可能性があるが、線虫の生殖能力にも影響を与える可能性がある。記載されたスクリーニングプロトコルは、綿根系上に供給部位を確立することができる線虫の数を評価する。卵の産生によって測定された線虫生殖は、このプロトコルでは評価されなかったが、これは重要な制限である。それにもかかわらず、プロトコルは、このタイプのデータを収集するために変更することができます。また、他の方法論を使用して、耐性のゲノム型が同定された後にこれらのデータを収集することができ、多数の個体をスクリーニングする必要性を減らす。
個々のゲノタイプの線虫評価からのデータは、実験の中および実験間で可変であり、Rを評価するために使用されるすべてのスクリーニングプロトコルに共通する問題である。綿のジェノタイプに対するレニフォーム耐性。胚芽のアクセシレーションのスクリーニングのための複数の複製を持つ実験設計の使用は、耐性遺伝子型の同定のためのこの変動を評価するのに役立ちます。さらに、実験間の同じ耐性および感受性制御ジェノタイプを含むことは、この変動を評価し、複数の実験からの結果を比較するのに役立ちます。これらのコントロールは、線虫接種の成功を監視するためにも使用されます。さらに、これらのコントロールからのデータ手段は、耐性または感受性10、16としてゲノタイプを分類するために使用されます。綿のゲノム型は、一般的に、感受性制御16、23で観察された感染の10%未満を示す場合、耐性として分類される。ルートの成長は、横根の少ないタップルートを有する植物が感染のためのより少ないサイトを提供し、ルートのグラム当たりの線虫が少なくなる可能性があるため、プロトコルを使用してデータに観察される変動に寄与するもう一つの要因です。
耐性遺伝子の源として他の綿種を使用して新しい高地綿品種を開発する難しさは、さらなる選択または追加のために繁殖ラインを次世代に進めるために栄養伝播プロトコルを必要とします繁殖。記載されている簡単な栄養伝播プロトコルは、線虫評価後に植物を回収するために開発された。プロトコルは、大きな集団18から植物を回復するために正常に使用されています。典型的には、根系は、栄養撮影が植えられた後30日以内に回復される。生存率は95%を超える場合が多い。多数の植物を伝播すると、活力の低い植物が失われる可能性があります。一般に、植物の1%未満は、根または芽の成長を示すことができなかった。プロトコルは簡単に変更でき、他の線虫スクリーニングプロトコルと一緒に使用できます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
この研究は、米国農務省、農業研究サービスによって資金提供されました。この記事の商号および商用製品に関する言及は、特定の情報を提供する目的でのみ行われ、米国農務省の勧告または推奨を意味するものではありません。USDAは、機会均等プロバイダーであり、雇用者です。著者は、宣言する利益相反を持っていません。技術支援はクリスティ・ヨルダンによって提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ray Leach Cone-tainer | Stuewe and Sons Inc. | SC10U | |
| Cone-tainer tray | Stuewe and Sons Inc. | RL98 | |
| Sand | various | ||
| Cotton balls | various | ||
| Pylon 4 inch plant labels (4 in L x 5/8 in W) | Pylon Platics | L-4-W | Any brand or vendor is acceptible. |
| 4 oz. specimen containers | Fisher Scientific | 16-320-731 | Any brand or vendor is acceptible. |
| Red food coloring | McCormick & Co., Inc. | ||
| 1 mL Pipet tips | various | ||
| 10 L container | various | Inexpensive buckets work well. | |
| 6 L pots | Nursery Supplies Inc. | Poly-Tainer-Can No2A | Any brand or vendor is acceptible. Different size pots can be used |
| Potting media | Sun Gro Horticulture | Metro-Mix 360 | Any brand or vendor is acceptible. |
| Fertilizer | Everris NA Inc. | Osmocote Plus | Any brand or vendor is acceptible. |
| Plastic container (73.6 cm L x 45.7 cm W x 15.2 cm D) | Rubbermaid | 3O29 | Any brand or vendor is acceptible. |
References
- Heald, C. M., Robinson, A. F. Survey of current distribution of Rotylenchulus reniformis. in the United States. Journal of Nematology. 22 (4), 695-699 (1990).
- Koenning, S. R., Wrather, J. A., Kirkpatrick, T. L., Walker, N. R., Starr, J. L., Mueller, J. D. Plant-parasitic nematodes attacking cotton in the United States: old and emerging production challenges. Plant Disease. 88 (2), 100-113 (2004).
- Robinson, A. F. Reniform in U.S. cotton: when, where, why, and some remedies. Annual Review of Phytopathology. 45, 263-288 (2007).
- Robinson, A. F., Inserra, R. N., Caswell-Chen, E. P., Vovlas, N., Troccoli, A. Rotylenchulus species: identification, distribution, host ranges, and crop plant resistance. Nematropica. 27 (2), 127-180 (1997).
- Davis, R. F., Koenning, S. R., Kemerait, R. C., Cummings, T. D., Hurley, W. D. Rotylenchulus reniformis management in cotton with crop rotation. Journal of Nematology. 35 (1), 58-64 (2003).
- Starr, J. L., Koenning, S. R., Kirkpatrick, T. L., Robinson, A. F., Roberts, P. A., Nichols, R. L. The future of nematode management in cotton. Journal of Nematology. 39 (4), 283-294 (2007).
- Weaver, D. B., Lawrence, K. S., van Santen, E. Reniform nematode resistance in upland cotton germplasm. Crop Science. 47 (1), 19-24 (2007).
- Robinson, A. F., Cook, C. G., Percival, A. E. Resistance to Rotylenchulus reniformis and Meloidogyne incognita race 3 in the major cotton cultivars planted since 1950. Crop Science. 39 (3), 850-858 (1999).
- Carter, W. W. Resistance and resistant reaction of Gossypium arboreum to the reniform nematode, Rotylenchulus reniformis. Journal of Nematology. 13 (3), 368-374 (1981).
- Erpelding, J. E., Stetina, S. R. Genetics of reniform nematode resistance in Gossypium arboreum germplasm line PI 529728. World Journal of Agricultural Research. 1 (4), 48-53 (2013).
- Robinson, A. F., Bridges, A. C., Percival, A. E. New sources of resistance to the reniform (Rotylenchulus reniformis) and root-knot (Meloidogyne incognita) nematode in upland (Gossypium hirsutum L.) and sea island (G. barbadense L.) cotton. Journal of Cotton Science. 8 (3), 191-197 (2004).
- Robinson, A. F., Percival, A. E. Resistance to Meloidogyne incognita race 3 and Rotylenchulus reniformis in wild accessions of Gossypium hirsutum and G. barbadense from Mexico. Journal of Nematology. 29 (4), 746-755 (1997).
- Stetina, S. R., Young, L. D. Comparisons of female and egg assays to identify Rotylenchulus reniformis resistance in cotton. Journal of Nematology. 38 (3), 326-332 (2006).
- Usery, S. R. Jr, Lawrence, K. S., Lawrence, G. W., Burmester, C. H. Evaluation of cotton cultivars for resistance and tolerance to Rotylenchulus reniformis. Nematropica. 35 (2), 121-133 (2005).
- Yik, C. -P., Birchfield, W. Resistant germplasm in Gossypium species and related plants to Rotylenchulus reniformis. Journal of Nematology. 16 (2), 146-153 (1984).
- Stetina, S. R., Erpelding, J. E. Gossypium arboreum accessions resistant to Rotylenchulus reniformis. Journal of Nematology. 48 (4), 223-230 (2016).
- Thies, J. A., Merrill, S. B., Corley, E. L. Red food coloring stain: new, safer procedures for staining nematodes in roots and egg masses on root surfaces. Journal of Nematology. 34 (2), 179-181 (2002).
- Erpelding, J. E., Stetina, S. R. Genetic characterization of reniform nematode resistance for Gossypium arboreum accession PI 417895. Plant Breeding. 137 (1), 81-88 (2018).
- Byrd, D. W. Jr, et al. Two semi-automatic elutriators for extracting nematodes and certain fungi from soil. Journal of Nematology. 8 (3), 206-212 (1976).
- Jenkins, W. R. A rapid centrifugal-flotation technique for separating nematodes from soil. Plant Disease Reporter. 48 (9), 692 (1964).
- Robinson, A. F., Heald, C. M. Carbon dioxide and temperature gradients in Baermann funnel extraction of Rotylenchulus reniformis. Journal of Nematology. 23 (1), 28-38 (1991).
- Williams, C., Gilman, D. F., Fontenot, D. S., Birchfield, W. A rapid technique for screening soybeans for reniform nematode resistance. Plant Disease Reporter. 63 (10), 827-829 (1979).
- Schmitt, D. P., Shannon, G. Differentiating soybean responses to Heterodera glycines races. Crop Science. 32 (1), 275-277 (1992).
