Summary
Здесь представлен протокол для быстрого неразрушающего скрининга хлопковых генотипов на рениформную устойчивость нематод. Протокол включает в себя визуальное изучение корней нематод-инфицированных саженцев хлопка для определения реакции инфекции. Вегетативная съемка с каждого растения затем распространяется для восстановления растений для производства семян.
Abstract
Быстрый неразрушающий reniform nematode (Rotylenchulus reniformis) протокол скрининга необходим для развития резистентного хлопка (Gossypium hirsutum) сортов для улучшения управления нематод. Большинство протоколов включают извлечение нематод вермиформа или яиц из корневой системы хлопка или почвы для заливки для определения плотности населения или скорости воспроизводства. Эти подходы, как правило, отнимают много времени с небольшим количеством оцениваемых генотипов. Здесь описан альтернативный подход, в котором корневая система визуально исследуется на нематодную инфекцию. Протокол включает в себя прививку саженцев хлопка через 7 дней после посадки с вермиформными нематодами и определение количества самок, прикрепленных к корневой системе через 28 дней после прививки. Данные выражаются как количество самок на грамм свежего корневого веса, чтобы приспособиться к изменению роста корней. Протокол предоставляет отличный метод оценки устойчивости хозяина-растения, связанного со способностью нематод установить место заражения; однако, сопротивление, которое препятствует репроизводству нематод не оценивается. Как и в других протоколах скрининга, вариации обычно наблюдаются при нематодной инфекции среди отдельных генотипов внутри и между экспериментами. Данные представлены для иллюстрации диапазона вариаций, наблюдаемых с помощью протокола. Чтобы приспособиться к этому изменению, в эксперименты включены контрольные генотипы. Тем не менее, протокол обеспечивает простой и быстрый метод оценки устойчивости хоста и растений. Протокол успешно используется для выявления устойчивых присоединений от G. сбор зародышевой плазмы и оценка сегрегации популяций более чем 300 особей для определения генетики резистентности. Был также разработан метод вегетативного распространения для восстановления растений для размножения резистентности. После удаления корневой системы для оценки нематод, вегетативная съемка пересаживается, чтобы позволить развитие новой корневой системы. Более 95% побегов обычно развивают новую корневую систему, растения достигают зрелости.
Introduction
Ротиленчулус рениформис (Линфорд и Оливейра), обычно называют reniform нематод, является одним из основных паразитических видов нематод, присутствующих в почвах юго-восточной части Соединенных Штатов1,2,3. Нематод является облик, сидячий полуэндопаразит, требующий принимающей завод для завершения своего жизненного цикла2,4. Vermiform preadult женские нематоды проникают в корневую систему хозяина, чтобы установить место кормления в стеле2,3. Как нематод питается и созревает, задняя часть, оставшаяся за пределами корня хозяина будет набухать на производство яиц, образуя характерную форму почек (Рисунок 1). Rotylenchulus reniformis способен питаться корневой системой более 300 видов растений, в том числе хлопка4. Нагорный хлопок (Gossypium hirsutum L.) широко культивируется на юго-востоке Соединенных Штатов, но отсутствие R. резистентные сорта reniformis препятствуютуправлению нематодом 2,3. Стратегии управления, такие как обработка нематидов и вращение с непринимающими видами сельскохозяйственных культур, были использованы для уменьшения почвы R. reniformis плотность населения5,6, но потери урожайности хлопка семян обычно может варьироваться от 1 до 5%2. Симптомы R. reniformis инфекции может включать задержку роста растений, подавленный рост корней, дефицит питательных веществ, аборт ы плодоовощ, и задержка зрелости2. Тем не менее, симптомы не могут быть очевидными из-за единообразия симптомов по всей области; поэтому подходы к оценке R. reniformis инфекции необходимы для выявления и разработки устойчивых горных сортов хлопка. Оценка R. резистентность reniformis в хлопке считается трудной 7, потому что зараженная корневая система может казаться нормальной, даже если растение может показать симптомы инфекции8.
Эффективный протокол скрининга нематод необходим для идентификации R. reniformis устойчивые присоединения из хлопка зародышевой плазмы коллекции, а также для определения генетики сопротивления для этих присоединений. Такой протокол поможет в передаче генов сопротивления на горн-хлопку. Различные методы биоассажа были использованы для оценки R. reniformis инфекции в хлопке8,9,10,11,12,13,14,15. В целом, для идентификации R. reniformis устойчивых хлопка генотипов. Наиболее часто используемый подход включает в себя извлечение яиц и/иливермиформных нематод из инфицированных растений или почвы 8,11,12,14,15. Общая методология такого подхода включает в себя посадку семян для отдельных генотипов хлопка в отдельных горшках, что позволяет саженцы развиваться в течение 7 до 14 дней, прививки саженцы, добавив смесь vermiform этапов R. reniformis к почве, и позволяет нематод заразить корневую систему в течение 30 до 60 дней. Далее, vermiform нематод и / или яйца извлекаются из зараженной корневой системы каждого растения или из почвы заливки. Затем определяется количество извлеченных нематод или яиц для оценки плотности населения и скорости размножения, которые сравниваются с контрольными генотипами для выявления устойчивых генотипов.
Альтернативный подход, как описано здесь, включает в себя микроскопически изучения корневой системы хлопка, который был инфицирован нематод, чтобы определить количество женщин нематод паразитирующих корни10,16. Как и другие подходы, хлопковые генотипы высаживаются в отдельные горшки и прививаются вермиформными нематодами примерно через 7 дней после посадки. В течение 30 дней после прививки корневая система удаляется из отдельных растений и почва промывается из корней. Далее, нематоды, прикрепленные к корневой системе,окрашены красным пищевым краситель17 , и корни микроскопически рассмотрены, чтобы определить количество инфекции сайтов с устойчивыми генотипами хлопка (определяется на основе количества нематод на грамм корня) по сравнению с восприимчивым контролем16. Преимущество этого второго подхода заключается в увеличении пропускной связи за счет сокращения количества дней, необходимых для оценки, и увеличения числа отдельных генотипов, оцениваемых в рамках одного эксперимента. Методологии скрининга, которые оценивают плотность населения или скорость воспроизводства, часто занимаютбольше времени, чем методы, основанные на визуальных наблюдениях признаков инфекции 7. Однако одним из ограничений этого подхода является то, что устойчивость к растениям, которая препятствует репроизводству нематод, как это определено производством яиц, не оценивается13.
Протоколы скрининга для R. сопротивление reniformis часто разрушают корневую систему во время оценки7 и включают вегетативную съемку, отбрасываемую. Для преодоления этого ограничения был разработан метод вегетативного распространения, позволяющий восстанавливать растения для производства семян18. После удаления корневой системы для оценки нематод, вегетативная съемка посажается в почву заливки, чтобы корневая система вырасти. Этот метод имеет широкие применения для большинства R. протоколы скрининга reniformis. Простой и быстрый метод вегетативного распространения имеет решающее значение для размножения R. reniformis устойчивых горных сортов хлопка, где восстановление потомства требуется для продвижения устойчивых генотипов для следующего поколения.
Представлен протокол для масштабного скрининга хлопковых генотипов на резиформную устойчивость нематод. Цель состоит в том, чтобы разработать простой и быстрый неразрушающий метод скрининга для оценки популяций хлопка для нематодной устойчивости, чтобы помочь в разведении устойчивых сортов хлопка на горней. Используя этот протокол, данные обычно получаются в течение 35 дней, при этом более 300 генотипов оцениваются в одном эксперименте. Данные представлены для устойчивых и восприимчивых генотипов, чтобы проиллюстрировать вариации обычно наблюдаются с помощью этих методов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Поддержание источника R. reniformis Инокулум
- Заполните терракотовые глиняные горшки (15 см в диаметре, 13,5 см в высоту) паровой пастеризованной смесью из 1-часть песчаного суглинка и 2-частей песка. Завод восприимчивых помидоров (Solanum lycopersicon) разнообразие в каждом горшке и место горшки в стеклянной лавке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Другие восприимчивые сорта растений, такие как хлопок могут быть использованы вместо помидоров. - Прививать томатные растения с vermiform reniform нематод (см. шаг 3.3). Поддерживайте растения в стекольном доме при температуре около 28 градусов по Цельсию.
2. Посадка хлопка Генотипы для R. reniformis Оценка сопротивления
- Подготовка почвы путем объединения 2-частей мелкого песка с 1-часть песчаного суглинка, собранного с поля.
- Паровая пастеризация почвенной смеси, чтобы убедиться, что почва свободна от нематод и почвенных растительных патогенов.
- Добавьте почвенную смесь в конические пластиковые горшки (4 см в диаметре, 21 см в высоту). Перед заполнением горшков, поместите шарик хлопка в нижней части горшка, чтобы предотвратить потерю почвы. Частично заполните горшки с почвой примерно на 2 см сверху.
- Подготовьте пластиковый кол для каждого горшка, чтобы обозначить генотип, который будет посажен.
- Завод семена хлопка генотипов, отобранных для оценки.
- Посадите одно семя в каждом горшке для оценки сегрегации популяций, в котором каждое семя представляет собой уникальный генотип.
- Для сортов хлопка или прорастания присоединения, завод от 2 до 3 семян в одной кастрюле, чтобы обеспечить прорастание по крайней мере одно растение с другими саженцами удалены из горшков до прививки нематод.
Примечание: Кроме того, семена могут быть прорастают от 24 до 72 ч до посадки, чтобы свести к минимуму количество горшков с нежизнеспособными семенами.
- Завод семена выбранных устойчивых и восприимчивых генотипов управления.
Примечание: Генотипы управления реплицируются от 5 до 10 раз для оценки естественных изменений, присущих методологии скрининга. - Заполните горшки с дополнительной почвой, чтобы покрыть семена в каждом горшке.
- Поместите горшки в камеру роста. Поддержание постоянной температуры 28 градусов по Цельсию, температура окружающего воздуха, для камеры роста. Обеспечить искусственное освещение со смесью флуоресцентных и ламп накаливания с 16 ч фотопериод.
- Поместите излучатели воды в каждый горшок, и поливать горшки два раза в день с помощью автоматической системы полива. Отрегулируйте систему полива для подачи дополнительной воды по мере роста растения.
3. Нематод прививка хлопковых растений и подготовка корневых образцов
- Извлеките vermiform reniform нематод поддерживается на восприимчивых томатных растений (см. шаг 1) с помощью элутриации19 и центробежной флотации20 методологий за день до прививки. Храните извлеченные нематоды при 4 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Baermann воронка извлечения21 является альтернативным методом для добычи нематод. - Определить количество нематод, извлеченных путем подсчета количества нематод в 100 л подобразца и подготовить подвески 1000 нематод / мл в водопроводной воде для прививок.
- Прививать саженцы хлопка 7 d после посадки с нематод подвески. Создайте небольшую депрессию в почве рядом с растением, и пипетка 1 мл рениформной нематодной подвески в депрессию.
- Удалить растения из горшков 28 d после прививки для оценки нематод.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе, растения примерно 15 см в высоту с 4 до 6 полностью расширенные листья.- Удалите большинство полностью расширенных листьев из растений с помощью ножниц до удаления растений из горшков.
- Чтобы удалить растения из горшков, сожмите горшок и сдвиньте почву в руку.
- Аккуратно удалите почву из корней, агитируя корневую систему в водопроводной воде в контейнере 10 л. Кратко промойте корневую систему в контейнере с чистой водопроводной водой.
- Удалите корневую систему с растения примерно на 1 см ниже линии почвы с помощью ножниц.
- Поместите корневую систему в пластиковый, нестерильный, одноразовый контейнер для образцов, а также пластиковый кол из горшка, используемого для идентификации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько образцов обрабатываются перед переходом к шагу 3.7. Приступить к шагу 4 для вегетативного распространения растения стрелять. - Подготовьте 12,5% (v/v) раствор красного пищевого красителя17 в водопроводной воде, чтобы запятнать нематоды, прикрепленные к корневой системе.
- Добавьте приблизительно 30 мл раствора красного пищевого краситель к корневому образцу в контейнере образца, чтобы полностью покрыть корневую систему.
- Поместите контейнер образца в микроволновую печь и нагрейте образец корня до тех пор, пока раствор окрашивания не закипит. Удалите образец из микроволновой печи и дайте образцу остыть при комнатной температуре.
- Декант красный пищевой окраски раствор из корневого образца и добавить около 100 мл водопроводной воды в контейнер образца для удаления избыточного пятна. Поместите крышку на контейнер образца и храните образец в холодильнике при 4 градусах Цельсия. Приступить к шагу 5 для оценки корневой инфекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь, прежде чем приступить к шагу 5.
4. Вегетативное распространение для восстановления растений для производства семян
- Поместите шарик из хлопка в нижней части конической пластиковой кастрюле (см. шаг 2.3) и частично заполнить горшок с торфяным мохом заливки средств массовой информации. Затем поместите вегетативную стрелять в кастрюлю и твердо добавить заливки средств массовой информации для заполнения горшок. Поместите новую маркированную пластиковую долю в каждый горшок, чтобы обозначить генотип хлопка.
- Поместите лоток горшков в пластиковый контейнер (73,6 см длиной х 45,7 см шириной х 15,2 см высотой) с водой и кратко поливать растения, чтобы смочить горшок средств массовой информации. Поместите горшки в камеру роста с постоянной температурой 28 градусов по Цельсию с помощью фотопериода 16 ч. Добавьте дополнительную воду в пластиковый контейнер по мере необходимости для поддержания влажности почвы.
- Пересадите растения в большие горшки для производства семян примерно через 30 д. Частично заполните 6 л пластикового горшка с помощью подсобных проемов (см. шаг 4.1), удалите растение из небольшого горшка, поместите растение в 6 L горшок, и твердо добавить горшок для заполнения горшка.
- Поместите растения в стеклянный дом и добавить воду, чтобы смочить горшок средств массовой информации. Поддержание температуры в теплицах при температуре около 28 градусов по Цельсию (искусственное освещение не требуется).
- Вода растения вручную по мере необходимости примерно 30 г.
- Когда примерно 75% растений требуют ежедневного полива, водные растения ежедневно используют автоматическую систему полива. Отрегулируйте автоматическую систему полива на воду чаще, как это необходимо для роста растений.
- Добавьте примерно 10 г медленного удобрения к каждому горшку до начала цветочного начала.
- Урожай растений в зрелости и обработки образцов семян хлопка для получения семян для дальнейшей оценки.
- Для сбора семян хлопка, удалить хлопок из открытых столбов на заводе вручную и поместить его в маркированный бумажный пакет. Семена крепятся к хлопковым волокнам, которые удаляются в следующих шагах.
- Удалите ворсволокна из образцов семян с помощью 10-пилового лабораторного джина.
- Удалите волокна пуха из образцов семян с помощью концентрированной серной кислоты. Нейтрализовать образцы семян в 15% (v/v) растворе карбоната натрия, промыть образцы водопроводной водой и высушить образцы в принудительной сушилке воздуха.
- Поместите образцы семян в маркированные конверты для хранения.
5. Оценка R. reniformis Корневая инфекция
- Удалите образец корня из контейнера образца и подсчитайте количество женских нематод, прикрепленных к корневой системе, с помощью стереомикроскопа (увеличение 20X).
ПРИМЕЧАНИЕ: Только женские нематод рениформы способны заражать корни растений. - Поместите корневую систему на бумажные полотенца в течение примерно 10 минут, чтобы удалить избыток влаги. Взвесьте корневую систему, чтобы определить вес свежего корня.
- Введите количество нематод и свежие данные о весе корней в программу электронной таблицы компьютера и вычислите количество самок на грамм корня.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rotylenchulus reniformis инфекции корневой системы для двух сортов представлена на рисунке 1. Относительно меньше женских нематод рениформспособных способны установить место кормления для устойчивого генотипа хлопка по сравнению с восприимчивым генотипом. Вариации в росте корней распространены между присоединениями, как показано на рисунке 2. Это изменение, измеряемое свежим корневым весом, также можно наблюдать между растениями одного генотипа(таблица 1). Генотипы госсипия денборум часто показывают более низкие темпы роста корней, чем генотипы хлопка на горнях. Чтобы компенсировать эту вариацию, собираются данные о свежих весах корней, которые используются для расчета количества женской нематод на грамм корневую ткань для каждого генотипа. Количество женских нематод на грамм корня для устойчивых генотипов, как правило, меньше 10, в то время как восприимчивые генотипы обычно имеют более 30 нематод на грамм корня.
Одна из проблем для скрининга хлопка генотипов для R. резистентность reniformis является потенциальным изменением, которое может произойти внутри и между экспериментами. Для оценки и корректировки для этого варианта, устойчивые и восприимчивые генотипы хлопка включены в качестве элементов управления и реплицируются в каждом эксперименте. В таблице 1 представлены данные по двум генотипам, используемым в качестве элементов управления в двух отдельных экспериментах с использованием описанного выше протокола. Генотипы реплицировались 10 раз и привиты через 7 дней после посадки с 1000 нематодами вермиформа, затем корневые системы были собраны через 28 дней после прививки для подсчета нематод, прикрепленных к корням. Поскольку эксперименты проводились в разное время, источник нематод, используемых для прививок, был другим; в противном случае все остальные параметры были схожими. Эти данные иллюстрируют вариации, которые можно наблюдать в оценках рениформного нематода. Количество женских нематод и вес корней были выше в эксперименте 1 для двух элементов управления по сравнению с экспериментом 2, в результате чего большее количество самок на грамм корня для эксперимента 1. Поскольку женские показатели были значительно выше для эксперимента 1, увеличение веса корней не снизило количество самок на грамм корня до уровней, наблюдаемых для эксперимента 2. Наблюдались также значительные различия между репликациями отдельных генотипов. Тем не менее, устойчивый G. дендрарий генотип PI 615699 часто показал значительно более низкие женские отсчеты и более низкие номера женщин в грамм корня чем susceptible G. геротип гирсутума PI 529251. Генотипы могут быть легко классифицированы как устойчивые или восприимчивы, когда эти средства используются для сравнения. Генотипы классифицируются как устойчивые, когда количество самок на грамм корня составляет примерно 10% восприимчивого контроля.
Подмножество данных из сегрегирующей популяции F 2, которая была оценена с помощью протокола, представлена в таблице 2. Население включало 300 заводов F2, и представлены данные по 50 растениям, представляющим диапазон вариаций. Для населения 300 растений, число наблюдаемых нематод, заражающих корневые системы варьировалось от 0 до 50, в среднем 9,4. Корневые веса варьировались от 0,01-1,22 г, со средним значением 0,38 г. Самки нематоды на грамм корня варьировались от 0-400, в среднем 33,6. Родители были воспроизведены в оценке. Устойчивый родитель (PI 417895) показал среднее значение 5,8 женщин на грамм корня, со средним корнем 0,8 г; в отличие от этого, восприимчивый родитель (PI 529729) показал среднее 40,8 женщин на грамм корня, со средним корневым весом 0,35 г. Двадцать растений не показали нематодной инфекции и были классифицированы как устойчивые, но это может представлять побеги. Как эти растения, так и растения с плохим ростом корней, как правило, удаляются из анализа данных. Этот диапазон в вариации для роста корней и нематод инфекции корневых систем обычно наблюдается для нематод оценки; таким образом, возможность проверки большого количества растений в одном эксперименте может свести к минимуму эту вариацию и позволит точно оценить генетику резистентности. Популяция показала количественные различия для нематодной инфекции, и растения были классифицированы как устойчивые на основе данных восприимчивого родителя, что свидетельствует о том, что сопротивление было предоставлено двумя рецессивными генами для этой популяции. Кроме того, описанный выше протокол распространения растительности был успешно использован для извлечения растений из этой популяции. Рейтинг потомства F 3, полученный из отдельных растений F2, часто соответствовал рейтингу завода F2.
Рисунок 1: Rotylenchulus reniformis инфицированных образцов корня. Образец корня из резистентного хлопка генотипа (нижний левый) показывает одну самку нематода, прикрепленную к корню, в то время как восприимчивый генотип (вверху справа) показывает несколько самок, прикрепленных к корню. Черная планка имеет шкалу 0,1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : Вариации наблюдается в рост корневой для двух генотипов хлопка. Корневые системы для двух резистентных присоединений Г.арбореума, устойчивых к ренформам, представлены для иллюстрации вариаций, которые можно наблюдать для роста корней. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Таблица 1: Вариация наблюдается в реакции нематодной инфекции рениформы для двух генотипов хлопка, включенных в качестве элементов управления. Эти данные иллюстрируют вариации, которые могут происходить внутри и между экспериментами для восприимчивого генотипа G.hirsutum PI 529251 и резистентного G. денбореум генотип PI 615699; однако средства данных значительно отличались друг от друга, что позволяло легко классифицировать генотипы как устойчивые или восприимчивые.
| Обозначение генотипа | Женщин | Корневой вес (г) | Самки/г корня | Классификации |
| 88 | 0.00 | 0,67 | 0,0 | Устойчивы |
| 156 г. | 0.00 | 0,10 | 0,0 | Устойчивы |
| 75 лет | 2 | 1.05 | 1.9 | Устойчивы |
| 298 год | 2 | 0,58 | 3.4 | Устойчивы |
| 259 г. | 3 | 0,77 | 3,9 | Устойчивы |
| 208 год | 1 | 0,21 | 4,8 | Устойчивы |
| 322 г. | 4 | 0,82 | 4,9 | Устойчивы |
| 189 год | 2 | 0,35 | 5,7 | Устойчивы |
| 147 г. | 6 | 0,94 | 6.4 | Устойчивы |
| 267 Г. | 2 | 0,18 | 11.1 | Умеренно устойчивая |
| 198 г. | 5 | 0,43 | 11.6 | Умеренно устойчивая |
| 251 год | 2 | 0,17 | 11.8 | Умеренно устойчивая |
| 95 г. | 6 | 0,46 | 13.0 | Умеренно устойчивая |
| 248 г. | 3 | 0,23 | 13.0 | Умеренно устойчивая |
| 79 | 11 Год | 0,84 | 13.1 | Умеренно устойчивая |
| 340 г. | 4 | 0,29 | 13.8 | Умеренно устойчивая |
| 114 год | 9 До 9 | 0,64 | 14.1 | Умеренно устойчивая |
| 168 г. | 6 | 0,40 | 15.0 | Умеренно устойчивая |
| 117 год | 7 (г. | 0,44 | 15.9 Для того, чтобы | Умеренно устойчивая |
| 77 лет | 10 Лет | 0,57 | 17.5 | Умеренно устойчивая |
| 277 | 9 До 9 | 0,44 | 20.5 | Умеренно устойчивая |
| 47 год | 8 | 0,34 | 23,5 | Умеренно восприимчивы |
| 96 | 20 | 0,85 | 23,5 | Умеренно восприимчивы |
| 139 год | 15 лет | 0,60 | 25.0 | Умеренно восприимчивы |
| 253 г. | 2 | 0,08 | 25.0 | Умеренно восприимчивы |
| 247 Г. | 15 лет | 0,53 | 28.3.2.2.2.2.2 | Умеренно восприимчивы |
| 308 год | 8 | 0,28 | 28.6 Для того, чтобы | Умеренно восприимчивы |
| 152 г. | 9 До 9 | 0,31 | 29.0 | Умеренно восприимчивы |
| 123 г. | 8 | 0,26 | 30.8 Для того, чтобы | Умеренно восприимчивы |
| 296 г. | 18 лет | 0,58 | 31.0 | Умеренно восприимчивы |
| 138 г. | 10 Лет | 0,31 | 32.3.03.2.2.2. | Умеренно восприимчивы |
| 151 год | 5 | 0,15 | 33.3.2.2.2.2.2 | Умеренно восприимчивы |
| 102 г. | 31 год | 0,77 | 40.3.2.2.2.2.2 | Умеренно восприимчивы |
| 67 | 5 | 0,12 | 41,7 | Восприимчивы |
| 51 год | 18 лет | 0,43 | 41,9 часть | Восприимчивы |
| 311 г. | 21 год | 0,48 | 43,8 | Восприимчивы |
| 334 г. | 4 | 0,09 | 44.4.2.2.2.2.2 | Восприимчивы |
| 266 Г. | 33 | 0,74 | 44.6 | Восприимчивы |
| 260 г. | 7 (г. | 0,14 | 50.0 | Восприимчивы |
| 49 | 16 Год | 0,32 | 50.0 | Восприимчивы |
| 149 г. | 20 | 0,39 | 51.3 | Восприимчивы |
| 104 г. | 22 Г. | 0,34 | 64,7 | Восприимчивы |
| 238 год | 39 | 0,57 | 68,4 | Восприимчивы |
| 144 г. | 24 | 0,33 | 72,7 | Восприимчивы |
| 225 год | 24 | 0,30 | 80.0 | Восприимчивы |
| 87 | 38 | 0,43 | 88,4 | Восприимчивы |
| 126 г. | 50 лет | 0,51 | 98.0 | Восприимчивы |
| 272 г. | 3 | 0,03 | 100.0 | Восприимчивы |
| 154 г. | 24 | 0,12 | 200.0 | Восприимчивы |
| 286 год | 3 | 0,01 | 300.0 | Восприимчивы |
Таблица 2: Реакция нематодной инфекции Reniform наблюдается в подмножестве из 50 генотипов из Г. дендрарий F2 населения. Эти данные иллюстрируют диапазон различий, которые можно наблюдать для сегрегации популяций. Корневые веса, количество нематодов и количество самок на грамм корня представлены для каждого генотипа, с растениями, классифицированными как устойчивые, умеренно устойчивые, умеренно восприимчивые, или восприимчивы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эффективный протокол скрининга необходим для 1) идентификации R. reniformis устойчивых хлопковых генотипов для того, чтобы оценить генетику сопротивления и 2) размножения устойчивых сортов. Большинство протоколов оценивают R. reniformis плотность населения или скорость воспроизводства путем извлечения нематод вермиформа или яйца из системы корней хлопка или заливки почвы8,11,12,14,15 . Эти подходы часто отнимают больше времени, и результаты, как правило, более разнообразны в рамках экспериментов и между ними. Кроме того, генотипы хлопка могут чаще быть неправильно классифицированы в нереплицированных экспериментах glasshouse с использованием этих протоколов11. Тем не менее, аналогичные результаты могут бытьдостигнуты для различных протоколов или параметров, оцененных 9,13.
Представлен альтернативный протокол скрининга, в котором скрининг генотипов хлопка проводится путем оценки количества женских нематод, паразитирующих на корневой системе. Устойчивые и восприимчивые генотипы хлопка могут первоначально показать аналогичное количество женских нематод, проникающих в корневые системы в течение 16 часов после прививки, но в течение 36 часов устойчивые генотипы начинают показывать значительно меньше прикрепленных самок нематод и нематод развития препятствует9. Таким образом, этот протокол скрининга обеспечивает более прямое измерение нематодной инфекции корневой системы хлопка по сравнению с протоколами, которые полагаются на извлечение нематод или яиц из корневой системы или заливки почвы. Метод прививки саженцев хлопка с vermiform nematodes аналогичен среди подходов. Прививки, как правило, проводятся через 7-14 дней после посадки, но сроки прививки менее критичны, так как семена также могут быть непосредственно посажены в нематод-зараженной почвой. Прививки проводятся с использованием 1000 вермиформных нематод, но протокол может быть изменен, чтобы увеличить или уменьшить количество используемых для прививки, или две прививки могут быть проведены в 7 и 14 дней после посадки, чтобы застраховать достаточное количество женских нематод присутствует для корневой инфекции. В сое количество нематод, используемых для прививки, не оказало существенного влияния на рейтинги яичной массы через 21 день после посадки; хотя, более высокие рейтинги, как правило, наблюдались при более высокой плотности населения нематод22. Протокол может быть оптимизирован для определения минимальной плотности нематод для прививки.
Нематодная инфекция корневой системы оценивается через 28 дней после прививки для этого протокола, что, как правило, раньше, чем в других протоколах. Это критический шаг в протоколе, так как оценки проводятся до яичного люка. Значительная задержка в сборе корневых образцов может привести ко второму раунду инфекции. Однако эта предыдущая оценка имеет преимущество увеличения пропускной связи. Для представленного протокола генотипы хлопка посажены в смесь песка и почвы, что имеет решающее значение для простого и быстрого удаления корневой системы из горшка. Использование автоматической системы полива имеет важное значение при использовании небольших горшков с песком и почвенной смесью для того, чтобы предотвратить высыхание горшков. Красный пищевой краситель используется для окрашивания нематод, прикрепленных к корневой системе, которая является простым и безопасным методом17. После того, как корневые системы окрашены, они могут храниться в водопроводной воде при 4 градусах Цельсия, прежде чем подсчитать количество нематод, прикрепленных к корневой системе; таким образом, большее число генотипов хлопка может быть оценено в ходе одного эксперимента, поскольку до оценки количества нематод не требуется дополнительная обработка образцов. Кроме того, это выгодно хранить образцы корня в водопроводной воде в течение нескольких дней, что позволяет корни де-пятно, что делает подсчет легче.
Описанный протокол позволяет проводить скрининг больших популяций в целях уменьшения экологических различий, которые будут возникать в период между экспериментами. С помощью камеры роста растений 900 м 2, оснащенной автоматической системой полива, можно оценить популяцию 480 отдельных растений. Протокол был успешно использован для оценки сегрегации популяций 300 или более человек, чтобы охарактеризовать генетику сопротивления10,18. Эти популяции показали, что количественные изменения для нематод ной инфекции и резистентности в G. дендрарий может быть чаще связан с несколькими рецессивными генами; таким образом, для проведения генетических исследований требуется более крупные популяции. Кроме того, количественное изменение наблюдается в сегрегации популяций, независимо от используемого протокола, для оценки реакции нематодной инфекции.
Устойчивость к хлопку может препятствовать способности нематод заразить корневую систему и установить место кормления, но это также может повлиять на репродуктивную способность нематод. В описанном протоколе скрининга оценивается количество нематод, способных установить место кормления в корневой системе хлопка. Нематодное размножение, измеряемое производством яиц, не оценивалось в этом протоколе, что является важным ограничением. Тем не менее, протокол может быть изменен для сбора данных такого типа. Кроме того, другие методологии могут быть использованы для сбора этих данных после устойчивых генотипов были определены, что уменьшает необходимость проверки большого числа лиц.
Данные нематодных оценок отдельных генотипов могут быть различными как внутри, так и между экспериментами, что является общей проблемой со всеми протоколами скрининга, используемыми для оценки R. резистентность reniformis для генотипов хлопка. Использование экспериментального дизайна с несколькими репликациями для скрининга присоединений зародышевой плазмы поможет в оценке этого варианта для идентификации устойчивых генотипов. Кроме того, включение тех же устойчивых и восприимчивых контрольных генотипов между экспериментами полезно для оценки этого варианта и сравнения результатов нескольких экспериментов. Эти элементы управления также используются для контроля за успехом прививки от нематод. Кроме того, средства данных из этих элементов управления используются для классификации генотипов как устойчивых или восприимчивых10,16. Хлопковые генотипы, как правило, классифицируются как устойчивые, если они показывают, менее 10% инфекции наблюдается на восприимчивых контроля16,23. Рост корней является еще одним фактором, способствующим изменению наблюдаемых в данных с помощью протокола, потому что растения, имеющие корень крана с меньшим количеством боковых корней предлагают меньше мест для инфекции, что может привести к меньшему количеству нематод на грамм корня.
Трудности в разработке новых сортов хлопка на горне, используя другие виды хлопка в качестве источника генов устойчивости, требуют протокола распространения растительности для продвижения линий размножения к следующему поколению для дальнейшего отбора или дополнительного Разведения. Простой вегетативного протокола распространения, как описано было разработано для восстановления растений после оценки нематод. Протокол был успешно использован для восстановления растений из больших популяций18. Как правило, корневая система восстанавливается в течение 30 дней после посадки вегетативной съемки. Показатели выживаемости часто превышают 95%. Растения, показывающие слабую энергию могут быть потеряны при распространении большого количества растений. В целом, менее 1% растений не смогли показать рост корней или побега. Протокол может быть легко изменен и использован с другими протоколами скрининга нематод.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование финансировалось Министерством сельского хозяйства Соединенных Штатов, Службой сельскохозяйственных исследований. Упоминание торговых наименований и коммерческих продуктов в данной статье предназначено исключительно для предоставления конкретной информации и не подразумевает рекомендаций или одобрений Со стороны Министерства сельского хозяйства США. Министерство сельского хозяйства США является поставщиком равных возможностей и работодателем. Авторы не имеют конфликта интересов, чтобы объявить. Техническую помощь оказала Кристи Джордан.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ray Leach Cone-tainer | Stuewe and Sons Inc. | SC10U | |
| Cone-tainer tray | Stuewe and Sons Inc. | RL98 | |
| Sand | various | ||
| Cotton balls | various | ||
| Pylon 4 inch plant labels (4 in L x 5/8 in W) | Pylon Platics | L-4-W | Any brand or vendor is acceptible. |
| 4 oz. specimen containers | Fisher Scientific | 16-320-731 | Any brand or vendor is acceptible. |
| Red food coloring | McCormick & Co., Inc. | ||
| 1 mL Pipet tips | various | ||
| 10 L container | various | Inexpensive buckets work well. | |
| 6 L pots | Nursery Supplies Inc. | Poly-Tainer-Can No2A | Any brand or vendor is acceptible. Different size pots can be used |
| Potting media | Sun Gro Horticulture | Metro-Mix 360 | Any brand or vendor is acceptible. |
| Fertilizer | Everris NA Inc. | Osmocote Plus | Any brand or vendor is acceptible. |
| Plastic container (73.6 cm L x 45.7 cm W x 15.2 cm D) | Rubbermaid | 3O29 | Any brand or vendor is acceptible. |
References
- Heald, C. M., Robinson, A. F. Survey of current distribution of Rotylenchulus reniformis. in the United States. Journal of Nematology. 22 (4), 695-699 (1990).
- Koenning, S. R., Wrather, J. A., Kirkpatrick, T. L., Walker, N. R., Starr, J. L., Mueller, J. D. Plant-parasitic nematodes attacking cotton in the United States: old and emerging production challenges. Plant Disease. 88 (2), 100-113 (2004).
- Robinson, A. F. Reniform in U.S. cotton: when, where, why, and some remedies. Annual Review of Phytopathology. 45, 263-288 (2007).
- Robinson, A. F., Inserra, R. N., Caswell-Chen, E. P., Vovlas, N., Troccoli, A. Rotylenchulus species: identification, distribution, host ranges, and crop plant resistance. Nematropica. 27 (2), 127-180 (1997).
- Davis, R. F., Koenning, S. R., Kemerait, R. C., Cummings, T. D., Hurley, W. D. Rotylenchulus reniformis management in cotton with crop rotation. Journal of Nematology. 35 (1), 58-64 (2003).
- Starr, J. L., Koenning, S. R., Kirkpatrick, T. L., Robinson, A. F., Roberts, P. A., Nichols, R. L. The future of nematode management in cotton. Journal of Nematology. 39 (4), 283-294 (2007).
- Weaver, D. B., Lawrence, K. S., van Santen, E. Reniform nematode resistance in upland cotton germplasm. Crop Science. 47 (1), 19-24 (2007).
- Robinson, A. F., Cook, C. G., Percival, A. E. Resistance to Rotylenchulus reniformis and Meloidogyne incognita race 3 in the major cotton cultivars planted since 1950. Crop Science. 39 (3), 850-858 (1999).
- Carter, W. W. Resistance and resistant reaction of Gossypium arboreum to the reniform nematode, Rotylenchulus reniformis. Journal of Nematology. 13 (3), 368-374 (1981).
- Erpelding, J. E., Stetina, S. R. Genetics of reniform nematode resistance in Gossypium arboreum germplasm line PI 529728. World Journal of Agricultural Research. 1 (4), 48-53 (2013).
- Robinson, A. F., Bridges, A. C., Percival, A. E. New sources of resistance to the reniform (Rotylenchulus reniformis) and root-knot (Meloidogyne incognita) nematode in upland (Gossypium hirsutum L.) and sea island (G. barbadense L.) cotton. Journal of Cotton Science. 8 (3), 191-197 (2004).
- Robinson, A. F., Percival, A. E. Resistance to Meloidogyne incognita race 3 and Rotylenchulus reniformis in wild accessions of Gossypium hirsutum and G. barbadense from Mexico. Journal of Nematology. 29 (4), 746-755 (1997).
- Stetina, S. R., Young, L. D. Comparisons of female and egg assays to identify Rotylenchulus reniformis resistance in cotton. Journal of Nematology. 38 (3), 326-332 (2006).
- Usery, S. R. Jr, Lawrence, K. S., Lawrence, G. W., Burmester, C. H. Evaluation of cotton cultivars for resistance and tolerance to Rotylenchulus reniformis. Nematropica. 35 (2), 121-133 (2005).
- Yik, C. -P., Birchfield, W. Resistant germplasm in Gossypium species and related plants to Rotylenchulus reniformis. Journal of Nematology. 16 (2), 146-153 (1984).
- Stetina, S. R., Erpelding, J. E. Gossypium arboreum accessions resistant to Rotylenchulus reniformis. Journal of Nematology. 48 (4), 223-230 (2016).
- Thies, J. A., Merrill, S. B., Corley, E. L. Red food coloring stain: new, safer procedures for staining nematodes in roots and egg masses on root surfaces. Journal of Nematology. 34 (2), 179-181 (2002).
- Erpelding, J. E., Stetina, S. R. Genetic characterization of reniform nematode resistance for Gossypium arboreum accession PI 417895. Plant Breeding. 137 (1), 81-88 (2018).
- Byrd, D. W. Jr, et al. Two semi-automatic elutriators for extracting nematodes and certain fungi from soil. Journal of Nematology. 8 (3), 206-212 (1976).
- Jenkins, W. R. A rapid centrifugal-flotation technique for separating nematodes from soil. Plant Disease Reporter. 48 (9), 692 (1964).
- Robinson, A. F., Heald, C. M. Carbon dioxide and temperature gradients in Baermann funnel extraction of Rotylenchulus reniformis. Journal of Nematology. 23 (1), 28-38 (1991).
- Williams, C., Gilman, D. F., Fontenot, D. S., Birchfield, W. A rapid technique for screening soybeans for reniform nematode resistance. Plant Disease Reporter. 63 (10), 827-829 (1979).
- Schmitt, D. P., Shannon, G. Differentiating soybean responses to Heterodera glycines races. Crop Science. 32 (1), 275-277 (1992).
