Summary
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de snelle niet-destructieve screening van katoen genotypen voor reniform nematode resistentie. Het protocol omvat het visueel onderzoeken van de wortels van met nematode besmette katoen zaailingen om de infectie respons te bepalen. De vegetatieve shoot van elke plant wordt vervolgens gekweekt om planten voor zaadproductie te herstellen.
Abstract
Een snelle niet-destructieve reniform nematode (Rotylenchulus reniformis) screening protocol is nodig voor de ontwikkeling van resistente katoen (Gossypium hirsutum) variëteiten om nematode management te verbeteren. De meeste protocollen omvatten het uitpakken van wormvormig nematoden of eieren uit het katoen wortelsysteem of potgrond om de bevolkingsdichtheid of het voortplantings percentage te bepalen. Deze benaderingen zijn over het algemeen tijdrovend met een klein aantal genotypen geëvalueerd. Een alternatieve aanpak wordt hier beschreven waarin het wortelsysteem visueel wordt onderzocht op nematode infectie. Het protocol omvat het inoculeren van katoen zaailing 7 dagen na het planten met wormvormig nematoden en het bepalen van het aantal vrouwtjes dat aan het wortelsysteem is bevestigd 28 dagen na de inoculatie. Gegevens worden uitgedrukt als het aantal vrouwtjes per gram verse wortel gewicht aan te passen voor variatie in de wortelgroei. Het protocol biedt een uitstekende methode voor het evalueren van de weerstand van gastheerplanten in verband met het vermogen van de nematode om een infectie plaats op te zetten; resistentie die de reproductie van nematode belemmert, wordt echter niet beoordeeld. Net als bij andere screening protocollen wordt variatie vaak waargenomen bij nematode infectie tussen individuele genotypen binnen en tussen experimenten. Gegevens worden gepresenteerd ter illustratie van het bereik van de variatie die is waargenomen met behulp van het protocol. Om aan te passen voor deze variatie, controle genotypen zijn opgenomen in experimenten. Niettemin, het protocol biedt een eenvoudige en snelle methode om gastheer-plant resistentie te evalueren. Het protocol is met succes gebruikt om resistente toetredingen van de Gte identificeren. arboreum plasma Collection en evalueer de segregerende populaties van meer dan 300 individuen om de genetica van resistentie te bepalen. Ook werd een vegetatieve propagatie methode voor het terugwinnen van planten voor de resistentie fokkerij ontwikkeld. Na verwijdering van het wortelsysteem voor nematode-evaluatie, wordt de vegetatieve shoot opnieuw geplant om de ontwikkeling van een nieuw wortelsysteem mogelijk te maken. Meer dan 95% van de scheuten ontwikkelt meestal een nieuw wortelsysteem met planten die volwassenheid bereiken.
Introduction
Rotylenchulus reniformis (Linford en Oliveira), gewoonlijk aangeduid als reniform nematode, is een van de belangrijkste parasitaire soorten die aanwezig zijn in de bodems van het zuidoosten van de Verenigde Staten1,2,3. De nematode is een obligate, sedentaire semi-endoparasiet die een gastheerplant nodig heeft om zijn levenscyclus2,4te voltooien. Vermiform preadult vrouwelijke nematoden penetreren het hostwortel systeem om een voerplaats te creëren in de stele2,3. Naarmate de nematode voedt en rijpt, zal het achterste gedeelte dat buiten de gastheer wortel blijft opzwellen bij de eierproductie, een karakteristieke niervorm vormen (Figuur 1). Rotylenchulus reniformis is in staat om te voeden op het wortelsysteem van meer dan 300 plantensoorten, met inbegrip van katoen4. Upland Cotton (Gossypium hirsutum L.) wordt op grote schaal geteeld in het zuidoosten van de Verenigde Staten, maar het ontbreken van R. reniformis resistente rassen belemmert nematode Management2,3. Beheer strategieën zoals nematicide behandeling en rotatie met niet-gastheer gewassoorten zijn gebruikt om bodem Rte verminderen. reniformis bevolkingsdichtheid5,6, maar de opbrengst van zaad katoen kan vaak variëren van 1 tot 5%2. Symptomen van R. reniformis infectie kan omvatten plant stunting, onderdrukt wortelgroei, Voedingstekorten, fruit abortus, en vertraagde volwassenheid2. Symptomen kunnen echter niet duidelijk zijn als gevolg van de uniformiteit van de symptomen in het veld; Daarom zijn benaderingen voor de beoordeling van R. reniformis -infectie is nodig om resistente Upland katoen rassen te identificeren en te ontwikkelen. Evaluatie van R. reniformis resistentie in katoen wordt beschouwd als moeilijk7, omdat het geïnfecteerde wortelsysteem normaal kan lijken, hoewel de plant symptomen van infectie kan vertonen8.
Voor de identificatie van Ris een effectief nematode-screening protocol vereist. reniformis resistente toetredingen uit de katoen plasma collectie, en voor de bepaling van de resistentie genetica voor deze toetredingen. Een dergelijk protocol zal helpen bij de overdracht van resistentiegenen naar Upland Cotton. Er zijn verschillende bioassay methoden gebruikt om Rte beoordelen. reniformis -infectie in katoen8,9,10,11,12,13,14,15. In het algemeen zijn er twee belangrijke benaderingen gebruikt voor de identificatie van R. reniformis resistente katoen genotypes. De meest gebruikte aanpak bestaat uit het extraheren van eieren en/of vermiforme nematoden uit besmette planten of bodems8,11,12,14,15. De algemene methodologie voor deze aanpak omvat het planten van zaden voor de individuele katoen genotypen in afzonderlijke potten, waardoor de zaailingen zich gedurende 7 tot 14 dagen kunnen ontwikkelen, waarbij de zaailingen worden inentend door een mengsel van vermiforme stadia van Rtoe te voegen. reniformis naar de bodem, en waardoor de nematoden om het wortelstelsel te infecteren voor 30 aan 60 dagen. Vervolgens worden vermiforme nematoden en/of eieren geëxtraheerd uit het geïnfecteerde wortelsysteem van elke plant of uit de potgrond. Het aantal geëxtraheerde nematoden of eieren wordt vervolgens bepaald om de bevolkingsdichtheid en het voortplantings percentage te schatten, die worden vergeleken met de controle-genotypen om resistente genotypen te identificeren.
Een alternatieve aanpak, zoals hier beschreven, omvat microscopisch onderzoek van het katoen wortelsysteem dat is geïnfecteerd met nematoden om het aantal vrouwelijke nematoden dat de wortels parastiseert, te bepalen10,16. Net als bij andere benaderingen, worden katoen genotypen geplant in afzonderlijke potten en geënt met vermiforme nematoden ongeveer 7 dagen na het planten. Binnen 30 dagen na de inoculatie wordt het wortelsysteem van de afzonderlijke planten verwijderd en wordt de grond van de wortels afgespoeld. Vervolgens worden de nematoden die aan het wortelsysteem zijn bevestigd gekleurd met rood voedsel kleur17, en wortels worden microscopisch onderzocht om het aantal infectie sites met resistente katoen genotypen te bepalen (geïdentificeerd op basis van het aantal nematoden per gram van de wortel) in vergelijking met een gevoelige controle16. Deze tweede benadering heeft als voordeel dat de doorvoer toeneemt door het aantal dagen dat nodig is voor evaluatie te verminderen en het aantal afzonderlijke genotypen dat in één experiment wordt geëvalueerd, te verhogen. Screeningsmethoden die de bevolkingsdichtheid of de reproductiesnelheid evalueren, zijn vaak meer tijdrovend dan die op basis van visuele waarnemingen van infectieverschijnselen7. Eén beperking van deze aanpak is echter dat de weerstand van gastheerplanten die de reproductie van nematode zoals bepaald door de eierproductie belemmert, niet13wordt beoordeeld.
Screening protocollen voor R. reniformis resistentie vernietigt vaak het wortelsysteem tijdens evaluatie7 en betrek de vegetatieve shoot die wordt weggegooid. Om deze beperking te overwinnen, is een methode van vegetatieve vermeerdering ontwikkeld om het herstel van planten voor zaadproductie18mogelijk te maken. Na verwijdering van het wortelsysteem voor nematode-evaluatie, wordt de vegetatieve shoot geplant in potgrond om het wortelsysteem opnieuw te laten groeien. Deze methode heeft brede toepassingen voor de meeste R. reniformis screening protocollen. Een eenvoudige en snelle methode van vegetatieve vermeerdering is van cruciaal belang voor de fokkerij R. reniformis resistente Upland katoen rassen, waarbij het herstel van de nakomelingen is vereist om te voor gaan resistente genotypen naar de volgende generatie.
Er wordt een protocol gepresenteerd voor de grootschalige screening van katoen genotypen voor reniform nematode resistentie. Het doel is om een eenvoudige en snelle niet-destructieve screeningsmethode te ontwikkelen om de katoen kweek populaties voor nematode resistentie te evalueren om te helpen bij het fokken van resistente Upland katoen variëteiten. Met behulp van dit protocol, gegevens worden meestal verkregen binnen 35 dagen, met meer dan 300 genotypen geëvalueerd in een enkel experiment. Gegevens worden gepresenteerd voor resistente en gevoelige genotypen ter illustratie van de variatie die vaak wordt waargenomen met behulp van deze methoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. instandhouding van een bron van R. reniformis Entmateriaal
- Vul Terra cotta klei potten (15 cm in diameter, 13,5 cm in hoogte) met een stoom gepasteuriseerde mix van 1-delige Sandy leem en 2-delen zand. Plant een vatbare tomaat (Solanum Lycopersicon) in elke pot en leg de potten in een kas.
Opmerking: andere vatbare plantensoorten zoals katoen kunnen in plaats van tomaat gebruikt worden. - Beënt de tomatenplanten met vermiforme reniforme nematoden (zie stap 3,3). Houd de planten in de kas bij een temperatuur van ongeveer 28 °C.
2. het planten van katoen genotypes voor R. reniformis Weerstands evaluatie
- Bereid de grond voor door het combineren van 2-delig fijn zand met 1-delige Sandy leem verzameld van het veld.
- Stoom pasteuriseren het bodem mengsel om ervoor te zorgen dat de bodem vrij is van nematoden en pathogenen die door de bodem worden gedragen.
- Voeg het bodem mengsel toe aan conische plastic potten (4 cm in diameter, 21 cm in hoogte). Voordat u de potten vult, plaatst u een bal van katoen in de bodem van de pot om bodemverlies te voorkomen. Vul de potten deels met een bodem van ongeveer 2 cm van boven.
- Bereid een plastic inzet voor elke pot om het genotype aan te duiden dat moet worden geplant.
- Planten zaden van de voor evaluatie geselecteerde katoen genotypen.
- Plant één zaadje in elke pot voor de beoordeling van de afgescheiden populaties, waarbij elk zaadje een uniek genotype vertegenwoordigt.
- Voor katoen variëteiten of plasma toetredingen, plant 2 tot 3 zaden in een enkele pot om de kiemkracht van ten minste één plant te verzekeren met de andere zaailingen die uit de potten zijn verwijderd voorafgaand aan nematode inoculatie.
Opmerking: als alternatief kunnen zaden worden ontkierd voor 24 tot 72 u vóór het planten om het aantal potten met niet-levensvatbare zaden te minimaliseren.
- Planten zaden van geselecteerde resistente en vatbare controle genotypes.
Opmerking: de genotypen van het besturingselement worden 5 tot 10 keer gerepliceerd om de natuurlijke variaties die inherent zijn aan de screenings methodologie te beoordelen. - Vul potten met extra grond om het zaad in elke pot te bedekken.
- Plaats de potten in de groei kamer. Behoud een constante temperatuur van 28 °C, een omgevingstemperatuur, voor de groei kamer. Zorg voor kunstmatige verlichting met een mengsel van fluorescerende en gloeilampen met een 16 h photoperiod.
- Plaats waterstralers in elke pot en geef de potten twee keer per dag water met behulp van een automatisch irrigatiesysteem. Pas het bewateringssysteem aan om extra water te leveren naarmate de plant groeit.
3. nematode inoculatie van katoen planten en bereiding van wortel monsters
- Extract wormvormig reniforme nematoden gehandhaafd op vatbare tomatenplanten (zie stap 1) met behulp van elutriation19 en centrifugale flotatie20 methodologieën de dag voor de inoculatie. Bewaar de geëxtraheerde nematoden bij 4 °C.
Opmerking: Baermann trechter extractie21 is een alternatieve methode voor nematode extractie. - Bepaal het aantal gezogen nematoden door het aantal nematoden in een Ondermonster van 100 μL te tellen en maak een suspensie van 1.000 nematoden/mL in kraanwater voor inoculaties.
- Beënt de katoen zaailingen 7 d na het planten met de nematode suspensie. Creëer een kleine depressie in de bodem naast de plant en Pipetteer 1 mL van de reniform nematode suspensie in de depressie.
- Verwijder planten uit de potten 28 d na inoculatie voor nematode evaluatie.
Let op: in dit stadium zijn planten ongeveer 15 cm hoog met 4 tot 6 volledig geëxpandeerde bladeren.- Verwijder de meeste van de volledig geëxpandeerde bladeren van de planten met een schaar voordat u de planten uit de potten verwijdert.
- Om planten uit de potten te verwijderen, knijp je in de pot en schuif je de aarde in de hand.
- Verwijder voorzichtig de grond van de wortels door het wortelsysteem in leidingwater in een 10 L-container te agiteren. Spoel het wortelsysteem kort uit in een bakje met schoon kraanwater.
- Verwijder het wortelsysteem van de plant ongeveer 1 cm onder de bodemlijn met een schaar.
- Plaats het wortelsysteem in een 120 mL plastic, niet-steriel, wegwerp specimen container samen met de plastic inzet uit de pot gebruikt voor identificatie.
Opmerking: meerdere voorbeelden worden verwerkt voordat u doorgaat naar stap 3,7. Ga verder naar stap 4 voor de vegetatieve vermeerdering van de plant shoot. - Bereid een 12,5% (v/v) oplossing van rood voedsel kleurplaat17 in kraanwater om de nematoden vast te maken die aan het wortelsysteem zijn bevestigd.
- Voeg ongeveer 30 mL rode voedsel kleurstofoplossing toe aan het wortel monster in de preparaat container om het wortelsysteem volledig te bedekken.
- Plaats de preparaat container in een microgolfoven en verwarm het wortel monster totdat de kleurings oplossing begint te koken. Verwijder het monster uit de microgolfoven en laat het monster afkoelen bij kamertemperatuur.
- Decante de rode voedsel kleurstofoplossing uit het wortel monster en voeg ongeveer 100 mL leidingwater toe aan de preparaat container om overtollige vlek te verwijderen. Plaats de afdekking op de preparaat container en bewaar het monster in een koelkast bij 4 °C. Ga verder met stap 5 voor evaluatie van wortel infectie.
Opmerking: het protocol kan hier worden onderbroken voordat u doorgaat naar stap 5.
4. vegetatieve vermeerdering voor de terugwinning van planten voor de zaadproductie
- Plaats een bal katoen in de bodem van een conische plastic pot (zie stap 2,3) en vul de pot deels met turf motten media. Plaats vervolgens de vegetatieve shoot in de pot en voeg stevig potmedia toe om de pot te vullen. Plaats een nieuwe gelabelde plastic inzet in elke pot om het katoen genotype aan te duiden.
- Plaats de tray van potten in een plastic bakje (73,6 cm lengte x 45,7 cm breedte x 15,2 cm hoogte) met water en breng de planten kort water om de potgrond media te bevochtigen. Plaats de potten in een groei kamer met een constante temperatuur van 28 °C met een 16 h photoperiod. Voeg zo nodig extra water toe aan de plastic container om de bodemvochtigheid te behouden.
- Transplantatie van de planten naar grotere potten voor zaadproductie na ongeveer 30 d. Vul een plastic pot van 6 liter met potgrond media (zie stap 4,1), verwijder de plant uit de kleine pot, plaats de plant in de 6 l pot en voeg stevig potmedia toe om de pot te vullen.
- Plaats de planten in een kas en voeg water toe om de potgrond media te bevochtigen. Houd de temperatuur in de kas bij ongeveer 28 °C (kunstlicht is niet vereist).
- Water planten met de hand zo nodig voor ongeveer 30 d.
- Wanneer ongeveer 75% van de planten dagelijks water nodig hebben, planten ze dagelijks met behulp van een automatisch irrigatiesysteem. Stel het automatische water bewateringssysteem zo vaak als nodig in voor plantengroei.
- Voeg ongeveer 10 g van een slow-release meststof toe aan elke pot voorafgaand aan het begin van de bloemen initiatie.
- Oogst planten op volwassenheid en verwerken de katoenzaad monsters om zaden te verkrijgen voor verdere evaluatie.
- Om katoen zaden te oogsten, verwijder het katoen van de open kapsels op de plant met de hand en plaats het in een gelabelde papieren zak. De zaden zijn bevestigd aan de katoenvezels, die worden verwijderd in de volgende stappen.
- Verwijder pluis vezels uit de zaadmonsters met een 10-Saw laboratorium gin.
- Verwijder fuzz-vezels uit de zaadmonsters met geconcentreerd zwavelzuur. Neutraliseer de zaadmonsters in een oplossing van 15% (v/v) natriumcarbonaat, spoel de monsters met kraanwater en droog de monsters in een geforceerde Luchtdroger.
- Plaats de zaadmonsters in gelabelde enveloppen voor opslag.
5. evaluatie van R. reniformis Wortel infectie
- Verwijder het wortel monster uit de preparaat container en Tel het aantal vrouwelijke nematoden dat aan het wortelsysteem is bevestigd met behulp van een stereomicroscoop (vergroting van 20X).
Opmerking: alleen vrouwelijke reniforme nematoden kunnen planten wortels infecteren. - Plaats het wortelsysteem op papieren handdoeken gedurende ongeveer 10 minuten om overtollig vocht te verwijderen. Weeg het wortelsysteem af om het verse wortel gewicht te bepalen.
- Voer de nematode Count en Fresh root Weight data in een computer spreadsheetprogramma en bereken het aantal vrouwtjes per gram wortel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rotylenchulus reniformis infectie van het wortelstelsel voor twee rassen wordt weergegeven in Figuur 1. Relatief minder vrouwelijke reniforme nematoden zijn in staat om een voerplaats te creëren voor het resistente genotype van het katoen in vergelijking met het vatbare genotype. Variatie in wortelgroei komt vaak voor bij toetredingen, zoals geïllustreerd in Figuur 2. Deze variatie zoals gemeten met vers wortel gewicht kan ook worden waargenomen tussen planten van hetzelfde genotype (tabel 1). Gossypium arboreum genotypen vertonen vaak lagere wortelgroei snelheden dan Upland katoen genotypen. Om deze variatie te compenseren, worden gegevens verzameld over verse wortel gewichten, die worden gebruikt om het aantal vrouwelijke reniform nematode per gram wortel weefsel voor elk genotype te berekenen. Het aantal vrouwelijke reniform nematoden per gram wortel voor resistente genotypen zijn over het algemeen minder dan 10, terwijl gevoelige genotypen doorgaans meer dan 30 nematoden per gram wortel hebben.
Een uitdaging voor het screenen van katoen genotypen voor R. reniformis resistentie is de mogelijke variatie die kan optreden binnen en tussen experimenten. Om te evalueren en aan te passen voor deze variatie, resistente en gevoelige katoen genotypen worden opgenomen als besturingselementen en gerepliceerd in elk experiment. Tabel 1 presenteert gegevens voor twee genotypen die worden gebruikt als controles in twee afzonderlijke experimenten met behulp van het hierboven beschreven protocol. De genotypen werden 10 keer gerepliceerd en geënt 7 dagen na het planten met 1.000 vermiforme nematoden, vervolgens werden wortelsystemen geoogst 28 dagen na de inoculatie om nematoden te tellen die aan de wortels waren bevestigd. Omdat de experimenten op verschillende tijdstippen werden uitgevoerd, was de bron van de nematoden die werden gebruikt voor inoculaties verschillend; anders waren alle andere parameters vergelijkbaar. Deze gegevens illustreren de variatie die kan worden waargenomen in reniform nematode evaluaties. Vrouwelijke nematode graven en wortel gewichten waren hoger in experiment 1 voor de twee controles in vergelijking met experiment 2, resulterend in hogere aantallen vrouwtjes per gram wortel voor experiment 1. Omdat de vrouwelijke tellingen aanzienlijk hoger waren voor experiment 1, verlaagde de stijgingen van de wortel gewichten niet het aantal vrouwtjes per gram wortel tot de niveaus die werden waargenomen voor experiment 2. Er werd ook een aanzienlijke variatie waargenomen tussen de replicaties van individuele genotypen. Echter, de resistente G. arboreum genotype Pi 615699 toonde vaak aanzienlijk lagere vrouwelijke tellingen en lagere aantallen vrouwtjes per gram wortel dan de vatbare G. hirsutum genotype Pi 529251. De genotypen kunnen gemakkelijk worden geclassificeerd als resistent of vatbaar wanneer deze middelen worden gebruikt voor de vergelijking. Genotypes worden geclassificeerd als resistent wanneer het aantal vrouwtjes per gram wortel ongeveer 10% van de vatbare controle is.
Een subset van gegevens van een gescheiden F2 -populatie die is geëvalueerd met behulp van het Protocol, wordt weergegeven in tabel 2. De bevolking omvatte 300 F2 planten en gegevens voor 50 planten die het variatie bereik representeren worden gepresenteerd. Voor de populatie van 300 planten varieerde het aantal waargenomen nematoden dat de wortelsystemen infecterende van 0 tot 50, met een gemiddelde van 9,4. Wortel gewichten varieerden van 0,01-1.22 g, met een gemiddelde van 0,38 g. vrouwelijke nematoden per gram wortel varieerden van 0-400, met een gemiddelde van 33,6. De ouders werden in de evaluatie gerepliceerd. De resistente ouder (PI 417895) toonde een gemiddelde van 5,8 vrouwtjes per gram wortel, met een gemiddelde wortel gewicht van 0,8 g; de gevoelige ouder (PI 529729) toonde daarentegen een gemiddelde van 40,8 vrouwtjes per gram wortel, met een gemiddeld wortel gewicht van 0,35 g. twintig planten toonden geen nematode infectie en werden geclassificeerd als resistent, maar dit kan ontsnapt zijn. Beide planten en planten met een slechte wortelgroei worden meestal verwijderd uit data-analyse. Dit bereik in variatie voor wortelgroei en nematode infectie van de wortelsystemen worden vaak waargenomen voor nematode evaluaties; Zo kan de mogelijkheid om een groot aantal planten in een enkel experiment te schermen deze variatie minimaliseren en zorgen voor een nauwkeurige beoordeling van de genetica van resistentie. De populatie toonde kwantitatieve variatie voor nematode infectie en planten werden geclassificeerd als resistent op basis van de gegevens van de gevoelige ouder, wat suggereerde dat resistentie werd verleend door twee recessieve genen voor deze populatie. Bovendien werd het hierboven beschreven vegetatief propagatie protocol met succes gebruikt om planten uit deze populatie te herstellen. De rating van de F3 -nakomelingen, afgeleid van individuele f2 -planten, kwam vaak overeen met de rating van de f2 -plant.
Figuur 1: rotylenchulus reniformis geïnfecteerde wortel monsters. Het wortel monster van een resistent genotype van katoen (linksonder) toont een enkele vrouwelijke nematode die aan de wortel is bevestigd, terwijl het vatbare genotype (rechtsboven) meerdere vrouwtjes vertoont die aan de wortel zijn bevestigd. De zwarte balk vertegenwoordigt een schaal van 0,1 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Variatie waargenomen in wortelgroei voor twee katoen genotypes. De wortelsystemen voor twee reniform nematode resistente G. arboreum accessies worden gepresenteerd ter illustratie van de variatie die kan worden waargenomen voor wortelgroei. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Tabel 1: variatie waargenomen bij reniform nematode infectie respons voor twee katoenen genotypen als controles. Deze gegevens illustreren de variatie die kan optreden binnen en tussen experimenten voor de vatbare g. hirsutum genotype Pi 529251 en resistent g. arboreum genotype Pi 615699; echter, gegevens middelen waren significant verschillend, waardoor de genotypen gemakkelijk kunnen worden geclassificeerd als resistent of vatbaar.
| Genotype-aanduiding | Vrouwen | Wortel gewicht (g) | Vrouwtjes/g wortel | Indeling |
| 88 | 0 | 0,67 | 0,0 | Resistente |
| 156 | 0 | 0,10 | 0,0 | Resistente |
| 75 | 2 | 1,05 | 1,9 | Resistente |
| 298 | 2 | 0,58 | 3,4 | Resistente |
| 259 | 3 | 0,77 | 3,9 | Resistente |
| 208 | 1 | 0,21 | 4,8 | Resistente |
| 322 | 4 | 0,82 | 4,9 | Resistente |
| 189 | 2 | 0,35 | 5,7 | Resistente |
| 147 | 6 | 0,94 | 6,4 | Resistente |
| 267 | 2 | 0,18 | 11,1 | Matig resistente |
| 198 | 5 | 0,43 | 11,6 | Matig resistente |
| 251 | 2 | 0,17 | 11,8 | Matig resistente |
| 95 | 6 | 0,46 | 13,0 | Matig resistente |
| 248 | 3 | 0,23 | 13,0 | Matig resistente |
| 79 | 11 | 0,84 | 13,1 | Matig resistente |
| 340 | 4 | 0,29 | 13,8 | Matig resistente |
| 114 | 9 | 0,64 | 14,1 | Matig resistente |
| 168 | 6 | 0,40 | 15,0 | Matig resistente |
| 117 | 7 | 0,44 | 15,9 | Matig resistente |
| 77 | 10 | 0,57 | 17,5 | Matig resistente |
| 277 | 9 | 0,44 | 20,5 | Matig resistente |
| 47 | 8 | 0,34 | 23,5 | Matig vatbaar |
| 96 | 20 | 0,85 | 23,5 | Matig vatbaar |
| 139 | 15 | 0,60 | 25,0 | Matig vatbaar |
| 253 | 2 | 0,08 | 25,0 | Matig vatbaar |
| 247 | 15 | 0,53 | 28,3 | Matig vatbaar |
| 308 | 8 | 0,28 | 28,6 | Matig vatbaar |
| 152 | 9 | 0,31 | 29,0 | Matig vatbaar |
| 123 | 8 | 0,26 | 30,8 | Matig vatbaar |
| 296 | 18 | 0,58 | 31,0 | Matig vatbaar |
| 138 | 10 | 0,31 | 32,3 | Matig vatbaar |
| 151 | 5 | 0,15 | 33,3 | Matig vatbaar |
| 102 | 31 | 0,77 | 40,3 | Matig vatbaar |
| 67 | 5 | 0,12 | 41,7 | Gevoelig |
| 51 | 18 | 0,43 | 41,9 | Gevoelig |
| 311 | 21 | 0,48 | 43,8 | Gevoelig |
| 334 | 4 | 0,09 | 44,4 | Gevoelig |
| 266 | 33 | 0,74 | 44,6 | Gevoelig |
| 260 | 7 | 0,14 | 50,0 | Gevoelig |
| 49 | 16 | 0,32 | 50,0 | Gevoelig |
| 149 | 20 | 0,39 | 51,3 | Gevoelig |
| 104 | 22 | 0,34 | 64,7 | Gevoelig |
| 238 | 39 | 0,57 | 68,4 | Gevoelig |
| 144 | 24 | 0,33 | 72,7 | Gevoelig |
| 225 | 24 | 0,30 | 80,0 | Gevoelig |
| 87 | 38 | 0,43 | 88,4 | Gevoelig |
| 126 | 50 | 0,51 | 98,0 | Gevoelig |
| 272 | 3 | 0,03 | 100,0 | Gevoelig |
| 154 | 24 | 0,12 | 200,0 | Gevoelig |
| 286 | 3 | 0,01 | 300,0 | Gevoelig |
Tabel 2: reniform nematode infectie respons waargenomen in een subset van 50 genotypen uit een G. arboreum F2 populatie. Deze gegevens illustreren het variatie bereik dat kan worden waargenomen voor segregerende populaties. Wortel gewichten, nematode tellingen en aantal vrouwtjes per gram wortel worden voor elk genotype gepresenteerd, met planten geclassificeerd als resistent, matig resistent, matig vatbaar of vatbaar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een doeltreffend screening protocol is vereist voor 1) de identificatie van R. reniformis resistente katoen genotypen om de genetica van resistentie te evalueren en 2) het fokken van resistente rassen. De meeste protocollen beoordelen R. reniformis populatie dichtheden of reproductie percentages door vermiforme nematoden of eieren uit het katoen wortelsysteem te winnen of potgrond8,11,12,14,15 . Deze benaderingen zijn vaak meer tijdrovend en de resultaten hebben de neiging om meer gevarieerd binnen en tussen experimenten. Bovendien, katoen genotypen kunnen vaker worden verkeerd ingedeeld in niet-gerepliceerde Glasshouse experimenten met behulp van deze protocollen11. Niettemin kunnen vergelijkbare resultaten worden behaald voor de verschillende protocollen of parameters geëvalueerd op9,13.
Een alternatief screenings protocol wordt gepresenteerd waarin de screening van katoen genotypen wordt uitgevoerd door de beoordeling van het aantal vrouwelijke reniform nematoden die het wortelsysteem parastiseren. Resistente en gevoelige katoen genotypen kunnen in eerste instantie vertonen een vergelijkbaar aantal vrouwelijke nematoden penetreren van de wortelsystemen binnen 16 uur na de inoculatie, maar binnen 36 uur, resistente genotypen beginnen te vertonen significant minder aangesloten vrouwelijke nematoden en nematode ontwikkeling wordt belemmerd9. Dit screening protocol biedt dus een directere meting van nematode infectie van het katoen wortelsysteem in vergelijking met protocollen die afhankelijk zijn van de extractie van nematoden of eieren uit het wortelsysteem of potgrond. De methode van de katoen zaailing inoculatie met wormvormig nematoden is vergelijkbaar onder de benaderingen. Inoculaties worden meestal 7 tot 14 dagen na het planten uitgevoerd, maar de timing van de inoculatie is minder kritisch, omdat zaden ook direct kunnen worden geplant in reniforme met nematode aangetaste grond. Inentingen worden uitgevoerd met behulp van 1.000 vermiforme nematoden, maar het protocol kan worden aangepast om het aantal dat wordt gebruikt voor de inoculatie te verhogen of te verlagen, of twee inentingen kunnen worden uitgevoerd na 7 en 14 dagen na het planten om voldoende vrouwelijke nematoden te verzekeren aanwezig zijn voor wortel infectie. In soja, het aantal nematoden gebruikt voor de inoculatie had geen significant effect op de eicel massa ratings 21 dagen na het planten; Hoewel, hogere ratings werden meestal waargenomen bij de hogere nematode bevolkingsdichtheid22. Het protocol kan worden geoptimaliseerd om de minimale nematode dichtheid voor de inoculatie te bepalen.
Nematode infectie van het wortelstelsel wordt beoordeeld 28 dagen na de inoculatie voor dit protocol, dat is over het algemeen eerder dan in andere protocollen. Dit is een cruciale stap in het Protocol, aangezien de evaluaties voorafgaand aan het Eier Luik worden uitgevoerd. Een aanzienlijke vertraging in het oogsten van wortel monsters kan resulteren in een tweede infectie ronde. Deze eerdere evaluatie heeft echter het voordeel dat de doorvoer toeneemt. Voor het gepresenteerde protocol worden de genotypen van katoen geplant in een mengsel van zand en bodem, wat van cruciaal belang is voor het eenvoudig en snel verwijderen van het wortelsysteem uit de pot. Het gebruik van een automatisch gietsysteem is essentieel bij het gebruik van kleine potten met een zand-en bodem mengsel om te voorkomen dat de potten uitdrogen. Rode voedselkleuring wordt gebruikt om vlekken op de nematoden bevestigd aan het wortelsysteem, dat is een eenvoudige en veilige methode17. Zodra de wortelsystemen zijn gekleurd, kunnen ze worden opgeslagen in kraanwater bij 4 °C alvorens het aantal nematoden dat aan het wortelsysteem is bevestigd, te tellen; Zo kan een groter aantal katoen genotypen in één experiment worden geëvalueerd, omdat voorafgaand aan de beoordeling van nematode tellingen geen aanvullende verwerking van de monsters nodig is. Ook is het voordelig om de wortel monsters in kraanwater voor meerdere dagen op te slaan, waardoor wortels kunnen worden afgebeten, waardoor het tellen gemakkelijker wordt.
Het beschreven protocol maakt het mogelijk om grotere populaties te screenen om de variatie in het milieu te verminderen die zich tussen experimenten zal voordoen. Met behulp van een 900 m2 plantengroei kamer uitgerust met een automatisch irrigatiesysteem, kunnen populaties van 480 individuele planten worden geëvalueerd. Het protocol is met succes gebruikt voor het evalueren van de scheiden populaties van 300 of meer individuen te karakteriseren de genetica van weerstand10,18. Deze populaties toonden aan dat kwantitatieve variatie voor nematode infectie en resistentie in G. arboreum kan vaker worden geassocieerd met meerdere recessieve genen; Er zijn dus grotere populaties nodig voor genetische studies. Bovendien wordt kwantitatieve variatie waargenomen bij segregerende populaties, ongeacht het gebruikte protocol, om de reactie van nematode infectie te evalueren.
Gastheer-plant bestendigheid in katoen kan het vermogen van de nematode om het wortelsysteem te infecteren belemmeren en een voerplaats te creëren, maar het kan ook invloed hebben op het voortplantingsvermogen van de nematode. Het beschreven screening protocol evalueert het aantal nematoden dat een voederplaats op het katoen wortelsysteem kan vestigen. De reproductie van nematode zoals gemeten door de eierproductie werd niet in dit protocol beoordeeld, wat een belangrijke beperking is. Niettemin, het protocol kan worden aangepast om dit soort gegevens te verzamelen. Afwisselend, andere methodologie kan worden gebruikt voor het verzamelen van deze gegevens na resistente genotypen zijn geïdentificeerd, waardoor de noodzaak om een groot aantal individuen te schermen vermindert.
Gegevens van nematode evaluaties van individuele genotypen kunnen variabel zijn binnen en tussen experimenten, wat een veelvoorkomend probleem is met alle screenings protocollen die worden gebruikt om Rte beoordelen. reniformis resistentie voor katoen genotypes. Het gebruik van een experimenteel ontwerp met meerdere replicaties voor de screening van plasma toetredingen zal helpen bij de beoordeling van deze variatie voor de identificatie van resistente genotypes. Bovendien, met inbegrip van de dezelfde resistente en gevoelige controle genotypen tussen experimenten is nuttig bij het beoordelen van deze variatie en het vergelijken van resultaten van meerdere experimenten. Deze controles worden ook gebruikt om het succes van nematode inoculatie te monitoren. Bovendien worden gegevens van deze besturingselementen gebruikt om genotypen te classificeren als resistent of gevoelig10,16. Katoen genotypen zijn typisch geclassificeerd als resistent als ze minder dan 10% van de infectie waargenomen op de gevoelige controle16,23. Wortelgroei is een andere factor die bijdraagt aan de variatie die wordt waargenomen in de gegevens met behulp van het Protocol, omdat planten met een kraan wortel met minder laterale wortels minder sites bieden voor infectie, wat kan resulteren in minder nematoden per gram wortel.
De moeilijkheid bij de ontwikkeling van nieuwe Upland katoen rassen met andere katoen soorten als bron van resistentiegenen vereist een vegetatief propagatie protocol om de foklijnen naar de volgende generatie te brengen voor verdere selectie of aanvullende Fokken. Een eenvoudig vegetatief propagatie protocol zoals beschreven werd ontwikkeld om planten te herstellen na nematode evaluatie. Het protocol is met succes gebruikt om planten te herstellen van grote populaties18. Meestal wordt het wortelsysteem hersteld binnen 30 dagen nadat de vegetatieve shoot is geplant. Overlevingspercentages zijn vaak groter dan 95%. Planten die slechte kracht tonen, kunnen verloren gaan bij het propageren van een groot aantal planten. Over het algemeen is minder dan 1% van de planten niet in staat om wortel-of schiet groei te vertonen. Het protocol kan eenvoudig worden aangepast en gebruikt met andere nematode-screening protocollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gefinancierd door het ministerie van landbouw van de Verenigde Staten, Agricultural Research Service. Vermelding van handelsnamen en commerciële producten in dit artikel zijn uitsluitend bedoeld om specifieke informatie te verstrekken en impliceren geen aanbevelingen of aantekeningen van het Amerikaanse ministerie van landbouw. USDA is een aanbieder van gelijke kansen en werkgever. De auteurs hebben geen belangenconflict te verklaren. De technische bijstand werd geleverd door Kristi Jordan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ray Leach Cone-tainer | Stuewe and Sons Inc. | SC10U | |
| Cone-tainer tray | Stuewe and Sons Inc. | RL98 | |
| Sand | various | ||
| Cotton balls | various | ||
| Pylon 4 inch plant labels (4 in L x 5/8 in W) | Pylon Platics | L-4-W | Any brand or vendor is acceptible. |
| 4 oz. specimen containers | Fisher Scientific | 16-320-731 | Any brand or vendor is acceptible. |
| Red food coloring | McCormick & Co., Inc. | ||
| 1 mL Pipet tips | various | ||
| 10 L container | various | Inexpensive buckets work well. | |
| 6 L pots | Nursery Supplies Inc. | Poly-Tainer-Can No2A | Any brand or vendor is acceptible. Different size pots can be used |
| Potting media | Sun Gro Horticulture | Metro-Mix 360 | Any brand or vendor is acceptible. |
| Fertilizer | Everris NA Inc. | Osmocote Plus | Any brand or vendor is acceptible. |
| Plastic container (73.6 cm L x 45.7 cm W x 15.2 cm D) | Rubbermaid | 3O29 | Any brand or vendor is acceptible. |
References
- Heald, C. M., Robinson, A. F. Survey of current distribution of Rotylenchulus reniformis. in the United States. Journal of Nematology. 22 (4), 695-699 (1990).
- Koenning, S. R., Wrather, J. A., Kirkpatrick, T. L., Walker, N. R., Starr, J. L., Mueller, J. D. Plant-parasitic nematodes attacking cotton in the United States: old and emerging production challenges. Plant Disease. 88 (2), 100-113 (2004).
- Robinson, A. F. Reniform in U.S. cotton: when, where, why, and some remedies. Annual Review of Phytopathology. 45, 263-288 (2007).
- Robinson, A. F., Inserra, R. N., Caswell-Chen, E. P., Vovlas, N., Troccoli, A. Rotylenchulus species: identification, distribution, host ranges, and crop plant resistance. Nematropica. 27 (2), 127-180 (1997).
- Davis, R. F., Koenning, S. R., Kemerait, R. C., Cummings, T. D., Hurley, W. D. Rotylenchulus reniformis management in cotton with crop rotation. Journal of Nematology. 35 (1), 58-64 (2003).
- Starr, J. L., Koenning, S. R., Kirkpatrick, T. L., Robinson, A. F., Roberts, P. A., Nichols, R. L. The future of nematode management in cotton. Journal of Nematology. 39 (4), 283-294 (2007).
- Weaver, D. B., Lawrence, K. S., van Santen, E. Reniform nematode resistance in upland cotton germplasm. Crop Science. 47 (1), 19-24 (2007).
- Robinson, A. F., Cook, C. G., Percival, A. E. Resistance to Rotylenchulus reniformis and Meloidogyne incognita race 3 in the major cotton cultivars planted since 1950. Crop Science. 39 (3), 850-858 (1999).
- Carter, W. W. Resistance and resistant reaction of Gossypium arboreum to the reniform nematode, Rotylenchulus reniformis. Journal of Nematology. 13 (3), 368-374 (1981).
- Erpelding, J. E., Stetina, S. R. Genetics of reniform nematode resistance in Gossypium arboreum germplasm line PI 529728. World Journal of Agricultural Research. 1 (4), 48-53 (2013).
- Robinson, A. F., Bridges, A. C., Percival, A. E. New sources of resistance to the reniform (Rotylenchulus reniformis) and root-knot (Meloidogyne incognita) nematode in upland (Gossypium hirsutum L.) and sea island (G. barbadense L.) cotton. Journal of Cotton Science. 8 (3), 191-197 (2004).
- Robinson, A. F., Percival, A. E. Resistance to Meloidogyne incognita race 3 and Rotylenchulus reniformis in wild accessions of Gossypium hirsutum and G. barbadense from Mexico. Journal of Nematology. 29 (4), 746-755 (1997).
- Stetina, S. R., Young, L. D. Comparisons of female and egg assays to identify Rotylenchulus reniformis resistance in cotton. Journal of Nematology. 38 (3), 326-332 (2006).
- Usery, S. R. Jr, Lawrence, K. S., Lawrence, G. W., Burmester, C. H. Evaluation of cotton cultivars for resistance and tolerance to Rotylenchulus reniformis. Nematropica. 35 (2), 121-133 (2005).
- Yik, C. -P., Birchfield, W. Resistant germplasm in Gossypium species and related plants to Rotylenchulus reniformis. Journal of Nematology. 16 (2), 146-153 (1984).
- Stetina, S. R., Erpelding, J. E. Gossypium arboreum accessions resistant to Rotylenchulus reniformis. Journal of Nematology. 48 (4), 223-230 (2016).
- Thies, J. A., Merrill, S. B., Corley, E. L. Red food coloring stain: new, safer procedures for staining nematodes in roots and egg masses on root surfaces. Journal of Nematology. 34 (2), 179-181 (2002).
- Erpelding, J. E., Stetina, S. R. Genetic characterization of reniform nematode resistance for Gossypium arboreum accession PI 417895. Plant Breeding. 137 (1), 81-88 (2018).
- Byrd, D. W. Jr, et al. Two semi-automatic elutriators for extracting nematodes and certain fungi from soil. Journal of Nematology. 8 (3), 206-212 (1976).
- Jenkins, W. R. A rapid centrifugal-flotation technique for separating nematodes from soil. Plant Disease Reporter. 48 (9), 692 (1964).
- Robinson, A. F., Heald, C. M. Carbon dioxide and temperature gradients in Baermann funnel extraction of Rotylenchulus reniformis. Journal of Nematology. 23 (1), 28-38 (1991).
- Williams, C., Gilman, D. F., Fontenot, D. S., Birchfield, W. A rapid technique for screening soybeans for reniform nematode resistance. Plant Disease Reporter. 63 (10), 827-829 (1979).
- Schmitt, D. P., Shannon, G. Differentiating soybean responses to Heterodera glycines races. Crop Science. 32 (1), 275-277 (1992).
