Summary
Aquí, se presenta un protocolo para el cribado rápido no destructivo de genotipos de algodón para la resistencia a los nematodos reniformes. El protocolo consiste en examinar visualmente las raíces de las plántulas de algodón infectadas por nematodos para determinar la respuesta a la infección. El brote vegetativo de cada planta se propaga para recuperar las plantas para la producción de semillas.
Abstract
Se necesita un protocolo de cribado rápido de nematodo reniforme no destructivo (Rotylenchulus reniformis) para el desarrollo de variedades de algodón resistente (Gossypium hirsutum) para mejorar el manejo del nematodo. La mayoría de los protocolos implican la extracción de nematodos o huevos vermiformes del sistema radicular de algodón o el suelo de maceta para determinar la densidad de población o la tasa de reproducción. Estos enfoques generalmente consumen mucho tiempo con un pequeño número de genotipos evaluados. Aquí se describe un enfoque alternativo en el que el sistema radicular se examina visualmente para detectar la infección por nematodos. El protocolo consiste en inocular la plántula de algodón 7 días después de la plantación con nematodos vermiformes y determinar el número de hembras unidas al sistema radicular 28 días después de la inoculación. Los datos se expresan como el número de hembras por gramo de peso fresco de la raíz para ajustar para la variación en el crecimiento de la raíz. El protocolo proporciona un método excelente para evaluar la resistencia huésped-planta asociada con la capacidad del nematodo para establecer un sitio de infección; sin embargo, no se evalúa la resistencia que dificulta la reproducción de nematodos. Al igual que con otros protocolos de cribado, la variación se observa comúnmente en la infección por nematodos entre genotipos individuales dentro y entre experimentos. Los datos se presentan para ilustrar el rango de variación observado mediante el protocolo. Para ajustar esta variación, los genotipos de control se incluyen en los experimentos. No obstante, el protocolo proporciona un método sencillo y rápido para evaluar la resistencia de la planta de host. El protocolo se ha utilizado con éxito para identificar las adhesiones resistentes de la G. arboreum germplasm recoger y evaluar poblaciones segregantes de más de 300 individuos para determinar la genética de la resistencia. También se desarrolló un método de propagación vegetativa para la recuperación de plantas para la cría de resistencia. Después de la eliminación del sistema radicular para la evaluación de nematodos, el brote vegetativo se replanta para permitir el desarrollo de un nuevo sistema radicular. Más del 95% de los brotes suelen desarrollar un nuevo sistema radicular con plantas que alcanzan la madurez.
Introduction
Rotylenchulus reniformis (Linford y Oliveira), comúnmente conocido como el nematodo reniforme, es una de las principales especies de nematodos parásitos presentes en los suelos del sureste de los Estados Unidos1,2,3. El nematodo es un semiendoparásito obligatorio y sedentario que requiere que unaplanta anfitriona complete su ciclo de vida 2,4. Los nematodos hembras preadultos vermiformes penetran en elsistema radicular del huésped para establecer un sitio de alimentación en la estela 2,3. A medida que el nematodo se alimenta y madura, la porción posterior que queda fuera de la raíz del huésped se hinchará tras la producción de óvulos, formando una forma renal característica (Figura1). Rotylenchulus reniformis es capaz de alimentarse del sistema radicular demás de 300 especies de plantas, incluyendo algodón 4. Algodón americano(Gossypium hirsutum L.) es ampliamente cultivado en el sureste de los Estados Unidos, pero la falta de R. las variedades resistentes a reniformis dificultan la gestión de nematodos2,3. Se han utilizado estrategias de gestión como el tratamiento y rotación de nematicidas con especies de cultivos no albergadores para reducir el suelo R. densidades de población de reniformis 5,6, pero las pérdidas de rendimiento de algodón de semilla pueden variar comúnmente de 1 a 5%2. Síntomas de R. infección por reniformis puede incluir retraso en las plantas, crecimiento de la raíz suprimido, deficiencias nutricionales, aborto de frutas, y retraso en la madurez2. Sin embargo, los síntomas pueden no ser evidentes debido a la uniformidad de los síntomas en todo el campo; por lo tanto, enfoques para evaluar R. se necesitan reniformis para identificar y desarrollar variedades resistentes de algodón americano (upland). Evaluación de R. resistencia a los reniformis en el algodón se considera difícil7, porque el sistema radicular infectado puede parecer normal a pesar de que la planta puede mostrar síntomas de infección8.
Se requiere un protocolo eficaz de detección de nematodos para la identificación de R. adhesiones resistentes a los reniformis de la colección de germoplasma de algodón y para la determinación de la genética de resistencia para estas adhesiones. Este protocolo ayudará en la transferencia de genes de resistencia al algodón americano (upland). Se han utilizado varios métodos de bioensayo para evaluar R. infección por reniformis en algodón8,9,10,11,12,13,14,15. En general, se han utilizado dos enfoques principales para la identificación de R. genotipos de algodón resistentes a los reniformis. El enfoque más utilizado consiste en extraer huevos y/o nematodos vermiformes de plantas infectadas o suelo8,11,12,14,15. La metodología general para este enfoque consiste en plantar semillas para los genotipos individuales del algodón en macetas separadas, permitiendo que las plántulas se desarrollen durante 7 a 14 días, inoculando las plántulas añadiendo una mezcla de etapas vermiformes de R. reniformis al suelo, y permitiendo que los nematodos infecten el sistema radicular durante 30 a 60 días. A continuación, los nematodos vermiformes y/o los huevos se extraen del sistema radicular infectado de cada planta o del suelo de maceta. A continuación, se determina el número de nematodos o huevos extraídos para estimar la densidad de población y la tasa de reproducción, que se comparan con los genotipos de control para identificar genotipos resistentes.
Un enfoque alternativo, como se describe aquí, implica examinar microscópicamente el sistema radicular de algodón que ha sido infectado con nematodos para determinar el número de nematodos femeninos parasitando las raíces10,16. Al igual que otros enfoques, los genotipos de algodón se plantan en macetas separadas y se inoculan con nematodos vermiformes aproximadamente 7 días después de la siembra. Dentro de los 30 días después de la inoculación, el sistema radicular se elimina de plantas individuales y el suelo se enjuaga de las raíces. A continuación, los nematodos unidos al sistema radicular están teñidos con colorante alimentario rojo17,y las raíces se examinan microscópicamente para determinar el número de sitios de infección con genotipos de algodón resistentes (identificados en función del número de nematodos por gramo de raíz) en comparación con un control susceptible16. Este segundo enfoque tiene la ventaja de aumentar el rendimiento al reducir el número de días necesarios para la evaluación y aumentar el número de genotipos individuales evaluados en un solo experimento. Las metodologías de cribado que evalúan la densidad de población o la tasa de reproducción suelen llevar más tiempo que las basadas en observaciones visuales de los signos de infección7. Sin embargo, una limitación de este enfoque es que no se evalúa la resistencia huésped-planta que dificulta la reproducción de nematodos determinada por la producción de óvulos13.
Protocolos de cribado para R. resistencia a los reniformis a menudo destruyen el sistema radicular durante la evaluación7 e implican el brote vegetativo que se desecha. Para superar esta limitación, se ha desarrollado un método de propagación vegetativa que permite la recuperación de plantas para la producción de semillas18. Después de la eliminación del sistema radicular para la evaluación de nematodos, el brote vegetativo se planta en el suelo de maceta para permitir que el sistema radicular vuelva a crecer. Este método tiene amplias aplicaciones para la mayoría de R. protocolos de cribado de reniformis. Un método simple y rápido de propagación vegetativa es de importancia crítica para la cría R. reniformis variedades de algodón americano (upland) resistentes, donde la recuperación de la progenie es necesaria para avanzar genotipos resistentes a la próxima generación.
Se presenta un protocolo para el cribado a gran escala de genotipos de algodón para la resistencia al nematodos reniforme. El objetivo es desarrollar un método de cribado no destructivo simple y rápido para evaluar las poblaciones de cría de algodón en busca de resistencia a los nematodos con el fin de ayudar en la cría de variedades resistentes de algodón americano (upland). Con este protocolo, los datos se obtienen normalmente en un plazo de 35 días, con más de 300 genotipos evaluados en un solo experimento. Se presentan datos para genotipos resistentes y susceptibles para ilustrar la variación comúnmente observada utilizando estos métodos.
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Protocol
1. Mantenimiento de una fuente de R. reniformis Inóculo
- Llenar las ollas de arcilla de terracota (15 cm de diámetro, 13,5 cm de altura) con una mezcla pasteurizada al vapor de 1 parte de arena arenosa y arena de 2 partes. Plantar una variedad de tomate susceptible (Solanum lycopersicon) en cada olla y colocar las ollas en un invernadero.
NOTA: Se pueden utilizar otras variedades vegetales susceptibles como el algodón en lugar del tomate. - Inocular las plantas de tomate con nematodos reniformato vermiformes (ver paso 3.3). Mantener las plantas en el invernadero a una temperatura de aproximadamente 28 oC.
2. Plantación de genotipos de algodón para R. reniformis Evaluación de la resistencia
- Preparar el suelo combinando arena fina de 2 partes con loam arenoso de 1 parte recogido del campo.
- Pasteurizar al vapor la mezcla del suelo para asegurarse de que el suelo está libre de nematodos y patógenos vegetales transmitidos por el suelo.
- Añadir la mezcla de suelo a las macetas de plástico cónico (4 cm de diámetro, 21 cm de altura). Antes de llenar las ollas, coloque una bola de algodón en la parte inferior de la olla para evitar la pérdida de suelo. Llenar parcialmente las macetas con tierra aproximadamente a 2 cm de la parte superior.
- Preparar una estaca de plástico para cada maceta para designar el genotipo a plantar.
- Semillas vegetales de los genotipos de algodón seleccionados para su evaluación.
- Plantar una sola semilla en cada maceta para la evaluación de las poblaciones segregadoras, en la que cada semilla representa un genotipo único.
- En el caso de las variedades de algodón o las adhesiones al germoplasma, plantar de 2 a 3 semillas en una sola olla para asegurar la germinación de al menos una planta con las otras plántulas retiradas de las macetas antes de la inoculación de nematodos.
Nota: Alternativamente, las semillas se pueden germinar durante 24 a 72 h antes de la siembra para minimizar el número de macetas con semillas no viables.
- Semillas vegetales de genotipos de control resistentes y susceptibles seleccionados.
Nota: Los genotipos de control se replican de 5 a 10 veces para evaluar las variaciones naturales inherentes a la metodología de cribado. - Llene las ollas con tierra adicional para cubrir la semilla en cada olla.
- Coloque las macetas en la cámara de crecimiento. Mantener una temperatura constante de 28oC, una temperatura ambiente del aire, para la cámara de crecimiento. Proporcionar iluminación artificial con una mezcla de lámparas fluorescentes e incandescentes con un fotoperiodo de 16 h.
- Coloque los emisores de agua en cada olla y rietre las ollas dos veces al día utilizando un sistema de riego automático. Ajuste el sistema de riego para suministrar agua adicional a medida que la planta crece.
3. Inoculación de nematodos de plantas de algodón y preparación de muestras de raíz
- Extraer nematodos reniformes vermiformes mantenidos en plantas de tomate susceptibles (ver paso 1) utilizando metodologías de elutriación19 y flotación centrífuga20 el día antes de la inoculación. Conservar los nematodos extraídos a 4oC.
NOTA: La extracción21 del embudo de Baermann es un método alternativo para la extracción de nematodos. - Determinar el número de nematodos extraídos contando el número de nematodos en una submuestra de 100 l y preparar una suspensión de 1.000 nematodos/ml en agua del grifo para inoculaciones.
- Inocular las plántulas de algodón 7 d después de la plantación con la suspensión de nematodo. Crear una pequeña depresión en el suelo junto a la planta, y pipetear 1 ml de la suspensión de nematodos reniformes en la depresión.
- Retire las plantas de las macetas 28 d después de la inoculación para la evaluación de nematodos.
NOTA: En esta etapa, las plantas miden aproximadamente 15 cm de altura con 4 a 6 hojas completamente expandidas.- Retire la mayoría de las hojas completamente expandidas de las plantas usando tijeras antes de retirar las plantas de las macetas.
- Para eliminar las plantas de las macetas, apriete la olla y deslice el suelo hacia fuera en la mano.
- Retire suavemente el suelo de las raíces agitando el sistema radicular en agua del grifo en un recipiente de 10 L. Enjuague brevemente el sistema radicular en un recipiente con agua limpia del grifo.
- Retire el sistema radicular de la planta aproximadamente 1 cm por debajo de la línea del suelo utilizando tijeras.
- Coloque el sistema radicular en un recipiente de muestra desechable de plástico de 120 ml, no estéril, junto con la estaca de plástico de la olla utilizada para la identificación.
NOTA: Se procesan varias muestras antes de continuar con el paso 3.7. Continúe con el paso 4 para la propagación vegetativa del brote de la planta. - Preparar una solución del 12,5% (v/v) de colorante de alimentos rojos17 en agua del grifo para manchar los nematodos unidos al sistema radicular.
- Añadir aproximadamente 30 ml de la solución para colorear alimentos rojos a la muestra de raíz en el recipiente de la muestra para cubrir completamente el sistema radicular.
- Coloque el recipiente de la muestra en un horno microondas y caliente la muestra de raíz hasta que la solución de tinción comience a hervir. Retire la muestra del horno microondas y deje que la muestra se enfríe a temperatura ambiente.
- Decantar la solución de colorante de alimentos rojos de la muestra de raíz y añadir aproximadamente 100 ml de agua del grifo al recipiente de la muestra para eliminar el exceso de manchas. Coloque la cubierta en el recipiente de la muestra y guárdela en un refrigerador a 4 oC. Continúe con el paso 5 para la evaluación de la infección radicular.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí antes de continuar con el paso 5.
4. Propagación Vegetativa para Recuperar Plantas para la Producción de Semillas
- Coloque una bola de algodón en la parte inferior de una olla de plástico cónico (ver paso 2.3) y llene parcialmente la olla con un medio de maceta de musgo de turba. A continuación, coloque el brote vegetativo en la olla y agregue firmemente los medios de maceta para llenar la olla. Coloque una nueva estaca de plástico etiquetada en cada maceta para designar el genotipo de algodón.
- Coloque la bandeja de macetas en un recipiente de plástico (73,6 cm de largo x 45,7 cm de ancho x 15,2 cm de alto) con agua y regar brevemente las plantas para humedecer los medios de maceta. Colocar las macetas en una cámara de crecimiento con una temperatura constante de 28 oC utilizando un fotoperiodo de 16 h. Agregue agua adicional al recipiente de plástico según sea necesario para mantener la humedad del suelo.
- Trasplantar las plantas a macetas más grandes para la producción de semillas después de aproximadamente 30 d. Llenar parcialmente una olla de plástico de 6 L con medios de maceta (ver paso 4.1), retirar la planta de la olla pequeña, colocar la planta en la olla de 6 L, y agregar firmemente medios de maceta para llenar la olla.
- Coloque las plantas en un invernadero y agregue agua para humedecer los medios de maceta. Mantener la temperatura en el invernadero a aproximadamente 28 oC (no se requiere iluminación artificial).
- Plantas de agua a mano según sea necesario durante aproximadamente 30 d.
- Cuando aproximadamente el 75% de las plantas requieren riego diario, las plantas de agua diariamente utilizan dotan a un sistema de riego automático. Ajuste el sistema de riego automático al agua con más frecuencia según sea necesario para el crecimiento de la planta.
- Añadir aproximadamente 10 g de un fertilizante de liberación lenta a cada maceta antes del inicio de la iniciación floral.
- Cosecha de plantas en la madurez y procesa las muestras de semillas de algodón para obtener semillas para su posterior evaluación.
- Para cosechar semillas de algodón, retire el algodón de las bolas abiertas de la planta a mano y colóquelo en una bolsa de papel etiquetada. Las semillas se unen a las fibras de algodón, que se eliminan en los siguientes pasos.
- Retire las fibras de pelusa de las muestras de semillas utilizando una ginebra de laboratorio de 10 sierras.
- Retire las fibras de pelusa de las muestras de semillas utilizando ácido sulfúrico concentrado. Neutralice las muestras de semillas en una solución de carbonato sódico del 15% (v/v), enjuague las muestras con agua del grifo y seque las muestras en un secador de aire forzado.
- Coloque las muestras de semillas en sobres etiquetados para su almacenamiento.
5. Evaluación de R. reniformis Infección de raíz
- Retire la muestra de raíz del recipiente de la muestra y cuente el número de nematodos hembras conectados al sistema radicular utilizando un estereomicroscopio (aumento 20X).
NOTA: Sólo los nematodos reniformes femeninos son capaces de infectar las raíces de las plantas. - Coloque el sistema radicular sobre las toallas de papel durante aproximadamente 10 minutos para eliminar el exceso de humedad. Pesar el sistema radicular para determinar el peso fresco de la raíz.
- Introduzca el recuento de nematodos y los nuevos datos de peso de raíz en un programa de hoja de cálculo de computadora y calcule el número de mujeres por gramo de raíz.
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Representative Results
La infección por Rotylenchulus reniformis del sistema radicular para dos variedades se presenta en la Figura1. Relativamente menos nematodos reniformes femeninos son capaces de establecer un sitio de alimentación para el genotipo de algodón resistente en comparación con el genotipo susceptible. La variación en el crecimiento de la raíz es común entre las adhesiones, como se ilustra en la Figura2. Esta variación medida por el peso fresco de la raíz también puede observarse entre plantas del mismo genotipo (Tabla1). Los genotipos de Gossypium arboreum con frecuencia muestran tasas de crecimiento de las raíces más bajas que los genotipos del algodón americano (upland). Para compensar esta variación, se recopilan datos sobre los pesos de las raíces frescas, que se utilizan para calcular el número de nematodos reniformato femeninos por tejido radicular gramo para cada genotipo. El número de nematodos reniformato femeninos por gramo de raíz para genotipos resistentes es generalmente inferior a 10, mientras que los genotipos susceptibles suelen tener más de 30 nematodos por gramo de raíz.
Un desafío para la detección de genotipos de algodón para R. resistencia a los reniformis es la variación potencial que puede ocurrir dentro y entre experimentos. Para evaluar y ajustar esta variación, los genotipos de algodón resistentes y susceptibles se incluyen como controles y se replican en cada experimento. La Tabla 1 presenta datos para dos genotipos utilizados como controles en dos experimentos separados utilizando el protocolo descrito anteriormente. Los genotipos se replicaron 10 veces e inocularon 7 días después de la siembra con 1.000 nematodos vermiformes, luego los sistemas radiculares se cosecharon 28 días después de la inoculación para contar los nematodos unidos a las raíces. Debido a que los experimentos se llevaron a cabo en diferentes momentos, la fuente de los nematodos utilizados para las inoculaciones era diferente; de lo contrario, todos los demás parámetros eran similares. Estos datos ilustran la variación que se puede observar en las evaluaciones de nematodos reniformes. El recuento de nematodos femeninos y el peso de las raíces fueron más altos en el experimento 1 para los dos controles en comparación con el experimento 2, lo que resulta en un mayor número de hembras por gramo de raíz para el experimento 1. Debido a que el recuento femenino fue considerablemente mayor para el experimento 1, los aumentos en el peso de las raíces no redujeron el número de hembras por gramo de raíz a los niveles observados para el experimento 2. También se observó una variación considerable entre las replicaciones de genotipos individuales. Sin embargo, el resistente G. genotipo de arboreto PI 615699 con frecuencia mostró recuentos femeninos sustancialmente más bajos y menor número de hembras por gramo de raíz que el gsusceptible. genotipo de hirsutum PI 529251. Los genotipos pueden clasificarse fácilmente como resistentes o susceptibles cuando estos medios se utilizan para la comparación. Los genotipos se clasifican como resistentes cuando el número de hembras por gramo de raíz es aproximadamente el 10% del control susceptible.
En la Tabla 2se presenta un subconjunto de datos de una población F2 de segregación que se evaluó mediante el protocolo. La población incluía 300 plantas f 2, y se presentan datos de 50 plantas que representan el rango de variación. Para la población de 300 plantas, el número de nematodos observados que infectan los sistemas radiculares osciló entre 0 y 50, con una media de 9,4. Los pesos de raíz oscilaron entre 0,01-1,22 g, con una media de 0,38 g. Nematodos femeninos por gramo de raíz oscilaron entre 0-400, con una media de 33,6. Los padres fueron replicados en la evaluación. El padre resistente (PI 417895) mostró una media de 5,8 hembras por gramo de raíz, con un peso medio de la raíz de 0,8 g; en cambio, el padre susceptible (PI 529729) mostró una media de 40,8 hembras por gramo de raíz, con un peso medio de raíz de 0,35 g. Veinte plantas no mostraron infección por nematodos y fueron clasificadas como resistentes, pero esto puede representar escapes. Tanto estas plantas como las plantas con un crecimiento deficiente de las raíces se eliminan típicamente del análisis de datos. Esta gama de variación para el crecimiento de la raíz y la infección por nematodos de los sistemas radiculares se observan comúnmente para las evaluaciones de nematodos; por lo tanto, la capacidad de examinar un gran número de plantas en un solo experimento puede minimizar esta variación y permitir evaluar con precisión la genética de la resistencia. La población mostró variación cuantitativa para la infección por nematodos, y las plantas se clasificaron como resistentes en base a los datos del padre susceptible, lo que sugería que la resistencia era conferida por dos genes recesivos para esta población. Además, el protocolo de propagación vegetativa descrito anteriormente se utilizó con éxito para recuperar plantas de esta población. La clasificación de la progenie F3 derivada de plantas F2 individuales correspondía con frecuencia a la calificación de la planta F2.
Figura 1: Rotylenchulus reniformis muestras de raíz infectadas. La muestra de raíz de un genotipo de algodón resistente (abajo a la izquierda) muestra un solo nematodo femenino unido a la raíz, mientras que el genotipo susceptible (arriba a la derecha) muestra varias hembras unidas a la raíz. La barra negra representa una escala de 0,1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Variación observada en el crecimiento de la raíz para dos genotipos de algodón. Los sistemas radiculares para dos adhesiones G.arboreum resistentes al nematodos reniformes se presentan para ilustrar la variación que se puede observar para el crecimiento de la raíz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Variación observada en la respuesta de infección por nematodos reniformes para dos genotipos de algodón incluidos como controles. Estos datos ilustran la variación que puede producirse dentro y entre los experimentos para el genotipo g.hirsutum susceptible PI 529251 y resistente G. genotipo de arboreto PI 615699; sin embargo, los medios de datos fueron significativamente diferentes, lo que permite que los genotipos se clasifiquen fácilmente como resistentes o susceptibles.
| Designación de genotipo | Hembras | Peso de la raíz (g) | Raíces de las hembras/g | Clasificación |
| 88 | 0 | 0.67 | 0.0 | Resistente |
| 156 | 0 | 0.10 | 0.0 | Resistente |
| 75 | 2 | 1.05 | 1.9 | Resistente |
| 298 | 2 | 0.58 | 3.4 | Resistente |
| 259 | 3 | 0.77 | 3.9 | Resistente |
| 208 | 1 | 0.21 | 4.8 | Resistente |
| 322 | 4 | 0.82 | 4.9 | Resistente |
| 189 | 2 | 0.35 | 5.7 | Resistente |
| 147 | 6 | 0.94 | 6.4 | Resistente |
| 267 | 2 | 0.18 | 11.1 | Moderadamente resistente |
| 198 | 5 | 0.43 | 11.6 | Moderadamente resistente |
| 251 | 2 | 0.17 | 11.8 | Moderadamente resistente |
| 95 | 6 | 0.46 | 13.0 | Moderadamente resistente |
| 248 | 3 | 0.23 | 13.0 | Moderadamente resistente |
| 79 | 11 | 0.84 | 13.1 | Moderadamente resistente |
| 340 | 4 | 0.29 | 13.8 | Moderadamente resistente |
| 114 | 9 | 0.64 | 14.1 | Moderadamente resistente |
| 168 | 6 | 0.40 | 15.0 | Moderadamente resistente |
| 117 | 7 | 0.44 | 15.9 | Moderadamente resistente |
| 77 | 10 | 0.57 | 17.5 | Moderadamente resistente |
| 277 | 9 | 0.44 | 20.5 | Moderadamente resistente |
| 47 | 8 | 0.34 | 23.5 | Moderadamente susceptible |
| 96 | 20 | 0.85 | 23.5 | Moderadamente susceptible |
| 139 | 15 | 0.60 | 25.0 | Moderadamente susceptible |
| 253 | 2 | 0.08 | 25.0 | Moderadamente susceptible |
| 247 | 15 | 0.53 | 28.3 | Moderadamente susceptible |
| 308 | 8 | 0.28 | 28.6 | Moderadamente susceptible |
| 152 | 9 | 0.31 | 29.0 | Moderadamente susceptible |
| 123 | 8 | 0.26 | 30.8 | Moderadamente susceptible |
| 296 | 18 | 0.58 | 31.0 | Moderadamente susceptible |
| 138 | 10 | 0.31 | 32.3 | Moderadamente susceptible |
| 151 | 5 | 0.15 | 33.3 | Moderadamente susceptible |
| 102 | 31 | 0.77 | 40.3 | Moderadamente susceptible |
| 67 | 5 | 0.12 | 41.7 | Susceptibles |
| 51 | 18 | 0.43 | 41.9 | Susceptibles |
| 311 | 21 | 0.48 | 43.8 | Susceptibles |
| 334 | 4 | 0.09 | 44.4 | Susceptibles |
| 266 | 33 | 0.74 | 44.6 | Susceptibles |
| 260 | 7 | 0.14 | 50.0 | Susceptibles |
| 49 | 16 | 0.32 | 50.0 | Susceptibles |
| 149 | 20 | 0.39 | 51.3 | Susceptibles |
| 104 | 22 | 0.34 | 64,7 | Susceptibles |
| 238 | 39 | 0.57 | 68,4 | Susceptibles |
| 144 | 24 | 0.33 | 72.7 | Susceptibles |
| 225 | 24 | 0.30 | 80.0 | Susceptibles |
| 87 | 38 | 0.43 | 88.4 | Susceptibles |
| 126 | 50 | 0.51 | 98.0 | Susceptibles |
| 272 | 3 | 0.03 | 100.0 | Susceptibles |
| 154 | 24 | 0.12 | 200.0 | Susceptibles |
| 286 | 3 | 0.01 | 300.0 | Susceptibles |
Tabla 2: Respuesta de infección por nematodos reniformes observada en un subconjunto de 50 genotipos de un G. arboreum F2 población. Estos datos ilustran el rango de variación que se puede observar para segregar poblaciones. Los pesos de las raíces, el recuento de nematodos y el número de hembras por gramo de raíz se presentan para cada genotipo, con plantas clasificadas como resistentes, moderadamente resistentes, moderadamente susceptibles o susceptibles.
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Discussion
Se requiere un protocolo de cribado eficaz para 1) la identificación de R. genotipos de algodón resistentes a reniformis para evaluar la genética de la resistencia y 2) la cría de variedades resistentes. La mayoría de los protocolos evalúan R. densidades de población de reniformis o tasas de reproducción mediante la extracción de nematodos o huevos vermiformes del sistema radicular de algodón o suelo de maceta8,11,12,14,15 . Estos enfoques a menudo consumen más tiempo, y los resultados tienden a ser más variados dentro y entre experimentos. Además, los genotipos del algodón pueden clasificarse erróneamente con mayor frecuencia en experimentos de invernadero no replicados utilizando estos protocolos11. No obstante, se pueden lograr resultados similares paralos diversos protocolos o parámetros evaluados 9,13.
Se presenta un protocolo de cribado alternativo en el que se realiza el cribado de los genotipos de algodón mediante la evaluación del número de nematodos reniformes femeninos parasitando el sistema radicular. Los genotipos de algodón resistentes y susceptibles pueden mostrar inicialmente un número similar de nematodos femeninos que penetran en los sistemas radiculares dentro de las 16 horas posteriores a la inoculación, pero dentro de las 36 horas, los genotipos resistentes comienzan a mostrar significativamente menos hembras unidas nematodos y el desarrollo de nematodos se ven obstaculizados9. Por lo tanto, este protocolo de cribado proporciona una medida más directa de la infección por nematodos del sistema radicular de algodón en comparación con los protocolos que se basan en la extracción de nematodos o huevos del sistema radicular o del suelo de maceta. El método de inoculación de plántulas de algodón con nematodos vermiformes es similar entre los enfoques. Las inoculaciones se llevan a cabo típicamente de 7 a 14 días después de la siembra, pero el momento de la inoculación es menos crítico, ya que las semillas también se pueden plantar directamente en suelos infestados de nematodos reniformes. Las inoculaciones se llevan a cabo utilizando 1.000 nematodos vermiformes, pero el protocolo se puede modificar para aumentar o disminuir el número utilizado para la inoculación, o dos inoculaciones se pueden llevar a cabo a los 7 y 14 días después de la siembra para asegurar que los nematodos femeninos suficientes son presente para la infección de la raíz. En la soja, el número de nematodos utilizados para la inoculación no tuvo ningún efecto significativo en las clasificaciones de masa de huevo 21 días después de la siembra; aunque, las calificaciones más altas se observaron típicamente en la densidad de población de nematodos más alta22. El protocolo se puede optimizar para determinar la densidad mínima de nematodos para la inoculación.
La infección por nematodos del sistema radicular se evalúa 28 días después de la inoculación para este protocolo, que generalmente es anterior que en otros protocolos. Este es un paso crítico en el protocolo, ya que las evaluaciones se llevan a cabo antes de la eclosión del huevo. Un retraso significativo en la recolección de muestras de raíz puede resultar en una segunda ronda de infección. Sin embargo, esta evaluación anterior tiene la ventaja de aumentar el rendimiento. Para el protocolo presentado, los genotipos de algodón se plantan en una mezcla de arena y suelo, lo que es fundamental para la simple y rápida eliminación del sistema radicular de la olla. El uso de un sistema de riego automático es esencial cuando se utilizan macetas pequeñas con una mezcla de arena y suelo con el fin de evitar que las ollas se sequen. Colorante de alimentos rojos se utiliza para manchar los nematodos unidos al sistema radicular, que es un método simple y seguro17. Una vez que los sistemas radiculares están manchados, se pueden almacenar en agua del grifo a 4 oC antes de contar el número de nematodos conectados al sistema radicular; por lo tanto, un mayor número de genotipos de algodón puede evaluarse en un solo experimento, porque no se requiere ningún procesamiento adicional de las muestras antes de la evaluación del recuento de nematodos. Además, es ventajoso almacenar las muestras de raíz en agua del grifo durante varios días, lo que permite que las raíces se destinden, facilitando el recuento.
El protocolo descrito permite el cribado de poblaciones más grandes con el fin de reducir la variación ambiental que se producirá entre los experimentos. Utilizando una cámara de crecimiento de planta de 900 m2 equipada con un sistema de riego automático, se pueden evaluar poblaciones de 480 plantas individuales. El protocolo se ha utilizado con éxito para evaluar poblaciones segregadas de 300 o más individuos para caracterizar la genética de la resistencia10,18. Estas poblaciones mostraron que la variación cuantitativa de la infección por nematodos y la resistencia en G. arboreum puede estar más a menudo asociado con múltiples genes recesivos; por lo tanto, se requieren poblaciones más grandes para los estudios genéticos. Además, se observa nalentos cuantitativos en la segregación de las poblaciones, independientemente del protocolo empleado, para evaluar la respuesta a la infección por nematodos.
La resistencia huésped-planta en el algodón puede obstaculizar la capacidad del nematodo para infectar el sistema radicular y establecer un sitio de alimentación, pero también puede afectar la capacidad reproductiva del nematodo. El protocolo de cribado descrito evalúa el número de nematodos que son capaces de establecer un sitio de alimentación en el sistema radicular de algodón. La reproducción de nematodos medida por la producción de óvulos no se evaluó en este protocolo, lo que es una limitación importante. No obstante, el protocolo se puede modificar para recopilar este tipo de datos. Alternativamente, se puede utilizar otra metodología para recopilar estos datos después de que se hayan identificado genotipos resistentes, lo que reduce la necesidad de examinar un gran número de individuos.
Los datos de las evaluaciones de nematodos de genotipos individuales pueden ser variables dentro y entre experimentos, lo que es un problema común con todos los protocolos de cribado utilizados para evaluar R. resistencia a los reniformis para los genotipos del algodón. El uso de un diseño experimental con múltiples réplicas para el cribado de las adhesiones de germoplasma ayudará a evaluar esta variación para la identificación de genotipos resistentes. Además, incluir los mismos genotipos de control resistentes y susceptibles entre experimentos es útil para evaluar esta variación y comparar los resultados de múltiples experimentos. Estos controles también se utilizan para controlar el éxito de la inoculación de nematodos. Además, los medios de datos de estos controles se utilizan para clasificar los genotipos como resistentes o susceptibles10,16. Los genotipos del algodón se clasifican típicamente como resistentes si muestran menos del 10% de la infección observada en el control susceptible16,23. El crecimiento de la raíz es otro factor que contribuye a la variación observada en los datos utilizando el protocolo, porque las plantas que tienen una raíz de grifo con menos raíces laterales ofrecen menos sitios para la infección, lo que puede resultar en menos nematodos por gramo de raíz.
La dificultad para desarrollar nuevas variedades de algodón americano (upland) utilizando otras especies de algodón como fuente de genes de resistencia requiere un protocolo de propagación vegetativa para avanzar en las líneas de cría a la siguiente generación para su posterior selección o Cría. Se desarrolló un protocolo simple de propagación vegetativa como se describe para recuperar plantas después de la evaluación del nematodo. El protocolo se ha utilizado con éxito para recuperar plantas de grandes poblaciones18. Típicamente, el sistema radicular se recupera dentro de los 30 días después de que se planta el brote vegetativo. Las tasas de supervivencia con frecuencia son superiores al 95%. Las plantas que muestran mal vigor se pueden perder al propagar un gran número de plantas. En general, menos del 1% de las plantas no mostraron crecimiento de raíces o brotes. El protocolo se puede modificar y utilizar fácilmente con otros protocolos de cribado de nematodos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue financiada por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, Servicio de Investigación Agrícola. La mención de nombres comerciales y productos comerciales en este artículo es únicamente con el propósito de proporcionar información específica y no implica recomendaciones o endosos por parte del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos. USDA es un proveedor y empleador de igualdad de oportunidades. Los autores no tienen conflicto de intereses que declarar. Kristi Jordan prestó asistencia técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ray Leach Cone-tainer | Stuewe and Sons Inc. | SC10U | |
| Cone-tainer tray | Stuewe and Sons Inc. | RL98 | |
| Sand | various | ||
| Cotton balls | various | ||
| Pylon 4 inch plant labels (4 in L x 5/8 in W) | Pylon Platics | L-4-W | Any brand or vendor is acceptible. |
| 4 oz. specimen containers | Fisher Scientific | 16-320-731 | Any brand or vendor is acceptible. |
| Red food coloring | McCormick & Co., Inc. | ||
| 1 mL Pipet tips | various | ||
| 10 L container | various | Inexpensive buckets work well. | |
| 6 L pots | Nursery Supplies Inc. | Poly-Tainer-Can No2A | Any brand or vendor is acceptible. Different size pots can be used |
| Potting media | Sun Gro Horticulture | Metro-Mix 360 | Any brand or vendor is acceptible. |
| Fertilizer | Everris NA Inc. | Osmocote Plus | Any brand or vendor is acceptible. |
| Plastic container (73.6 cm L x 45.7 cm W x 15.2 cm D) | Rubbermaid | 3O29 | Any brand or vendor is acceptible. |
References
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