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Genetics

Dépistage des génotypes de coton pour la résistance au nématode reniforme

Published: May 2, 2019 doi: 10.3791/58577
Automatic Translation
1, 1
1Crop Genetics Research Unit, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture

Summary

Ici, un protocole est présenté pour le criblage non destructif soudifieux rapide des génotypes de coton pour la résistance aux nématodes reniformes. Le protocole consiste à examiner visuellement les racines des semis de coton infectés par les nématodes afin de déterminer la réponse à l'infection. La pousse végétative de chaque plante est ensuite propagée pour récupérer les plantes pour la production de semences.

Abstract

Un protocole de dépistage rapide du nématode reniforme non destructif (Rotylenchulus reniformis) est nécessaire pour le développement de variétés de coton résistant(Gossypium hirsutum)afin d'améliorer la gestion du nématode. La plupart des protocoles consistent à extraire des nématodes vermiformes ou des œufs du système racinaire du coton ou à mettre en pot le sol pour déterminer la densité de population ou le taux de reproduction. Ces approches prennent généralement beaucoup de temps et un petit nombre de génotypes sont évalués. Une approche alternative est décrite ici dans laquelle le système racinaire est visuellement examiné pour l'infection de nématode. Le protocole consiste à inoculer les semis de coton 7 jours après la plantation avec des nématodes vermiformes et à déterminer le nombre de femelles attachées au système racinaire 28 jours après l'inoculation. Les données sont exprimées comme le nombre de femelles par gramme de poids frais des racines pour s'ajuster à la variation de la croissance des racines. Le protocole fournit une excellente méthode pour évaluer la résistance hôte-plante associée à la capacité du nématode d'établir un site d'infection; cependant, la résistance qui entrave la reproduction des nématodes n'est pas évaluée. Comme avec d'autres protocoles de criblage, la variation est généralement observée dans l'infection de nématode parmi les génotypes individuels à l'intérieur et entre les expériences. Les données sont présentées pour illustrer l'éventail des variations observées à l'aide du protocole. Pour s'adapter à cette variation, des génotypes témoins sont inclus dans les expériences. Néanmoins, le protocole fournit une méthode simple et rapide pour évaluer la résistance hôte-plante. Le protocole a été utilisé avec succès pour identifier les adhésions résistantes du G. arboreum germplasm collection et évaluer les populations de ségrégation de plus de 300 individus pour déterminer la génétique de la résistance. Une méthode de propagation végétative pour la récupération des plantes pour la reproduction de résistance a également été développée. Après l'enlèvement du système racinaire pour l'évaluation des nématodes, la pousse végétative est replantée pour permettre le développement d'un nouveau système racinaire. Plus de 95 % des pousses développent généralement un nouveau système racinaire dont les plantes atteignent leur maturité.

Introduction

Rotylenchulus reniformis (Linford et Oliveira), communément appelé nématode reniforme, est l'une des principales espèces de nématodes parasites présentes dans les sols du sud-est des États-Unis1,2,3. Le nématode est un semi-endoparasite obligatoire et sédentaire nécessitant une plante hôte pour terminer son cycle de vie2,4. Les nématodes femelles préadultes vermiformes pénètrent dans le système racinaire hôte pour établir un site d'alimentation dans la stèle2,3. Au fur et à mesure que le nématode se nourrit et mûrit, la partie postérieure qui reste à l'extérieur de la racine hôte gonflera lors de la production d'œufs, formant une forme rénale caractéristique (figure 1). Rotylenchulus reniformis est capable de se nourrir du système racinaire de plus de 300 espèces végétales, dont le coton4. Le coton upland (Gossypium hirsutum L.) est largement cultivé dans le sud-est des États-Unis, mais l'absence de R. les variétés résistantes au reniformis entravent la gestion du nématode2,3. Des stratégies de gestion telles que le traitement du nématicide et la rotation avec des espèces de cultures non hôtes ont été utilisées pour réduire la Rdu sol. densités de population de reniformis 5,6, mais les pertes de rendement de coton de graine peuvent généralement varier de 1 à 5%2. Symptômes de R. l'infection de reniformis peut inclure le retard de croissance deplante, la croissance supprimée de racine, les insuffisances nutritionnelles, l'avortement de fruit, et la maturité retardée 2. Cependant, les symptômes peuvent ne pas être apparents en raison de l'uniformité des symptômes à travers le champ ; par conséquent, les approches d'évaluation de la R. l'infection de reniformis sont nécessaires pour identifier et développer les variétés résistantes de coton upland. Évaluation de r. la résistance de reniformis dans le coton est considérée difficile7,parce que le système racinaire infecté peut sembler normal même si la plante peut montrer des symptômes d'infection8.

Un protocole efficace de dépistage des nématodes est nécessaire pour l'identification de r. adhésions résistantes de la collection de germplasme de coton, et pour la détermination de la génétique de résistance pour ces adhésions. Un tel protocole facilitera le transfert des gènes de résistance vers le coton upland. Diverses méthodes de bio-analyse ont été utilisées pour évaluer R. infection à reniformis en coton8,9,10,11,12,13,14,15. En général, deux approches principales ont été utilisées pour l'identification de r. génotypes de coton résistants aux reniformis. L'approche la plus fréquemment utilisée consiste à extraire des œufs et/ou des nématodes vermiformes à partir de plantes infectées ou du sol8,11,12,14,15. La méthodologie générale de cette approche consiste à planter des graines pour les génotypes de coton individuels dans des pots séparés, permettant aux semis de se développer pendant 7 à 14 jours, en inocérant les semis en ajoutant un mélange d'étapes vermiformes de R. reniformis au sol, et permettant aux nématodes d'infecter le système racinaire pendant 30 à 60 jours. Ensuite, les nématodes vermiformes et/ou les œufs sont extraits du système racinaire infecté de chaque plante ou du sol de mise en pot. Le nombre de nématodes ou d'œufs extraits est alors déterminé pour estimer la densité de population et le taux de reproduction, qui sont comparés aux génotypes témoins afin d'identifier les génotypes résistants.

Une autre approche, telle qu'elle est décrite ici, consiste à examiner au microscope le système racinaire du coton qui a été infecté par des nématodes pour déterminer le nombre de nématodes femelles parasitant les racines10,16. Comme d'autres approches, les génotypes de coton sont plantés dans des pots séparés et inoculés avec des nématodes vermiformes environ 7 jours après la plantation. Dans les 30 jours suivant l'inoculation, le système racinaire est retiré des plantes individuelles et le sol est rincé des racines. Ensuite, les nématodes attachés au système racinaire sont tachés de colorant alimentaire rouge17, et les racines sont examinées au microscope pour déterminer le nombre de sites d'infection avec des génotypes de coton résistants (identifiés en fonction du nombre de nématodes par gramme de racine) par rapport à un contrôle sensible16. Cette deuxième approche présente l'avantage d'augmenter le débit en réduisant le nombre de jours requis pour l'évaluation et en augmentant le nombre de génotypes individuels évalués dans une seule expérience. Les méthodes de dépistage qui évaluent la densité de population ou le taux de reproduction prennent souvent plus de temps que celles basées sur les observations visuelles des signes d'infection7. Cependant, l'une des limites de cette approche est que la résistance des plantes hôtes qui entrave la reproduction des nématodes, telle qu'elle est déterminée par la production d'œufs, n'est pas évaluée13.

Protocoles de dépistage pour R. La résistance au reniformis détruit souvent le système racinaire lors de l'évaluation7 et implique que la pousse végétative soit jetée. Pour surmonter cette limitation, une méthode de propagation végétative a été développée pour permettre la récupération des plantes pour la production de semences18. Après l'enlèvement du système racinaire pour l'évaluation des nématodes, la pousse végétative est plantée dans le sol de mise en pot pour permettre au système racinaire de repousser. Cette méthode a de larges applications pour la plupart des R. protocoles de dépistage reniformis. Une méthode simple et rapide de propagation végétative est d'une importance cruciale pour la reproduction R. variétés de coton upland résistantes aux reniformis, où la récupération de la progéniture est nécessaire pour faire progresser les génotypes résistants à la prochaine génération.

Un protocole est présenté pour le criblage à grande échelle des génotypes de coton pour la résistance aux nématodes reniformes. L'objectif est de développer une méthode de dépistage non destructive simple et rapide pour évaluer les populations de reproduction du coton pour la résistance aux nématodes afin d'aider à l'élevage de variétés de coton résistantes des terres des terres. À l'aide de ce protocole, les données sont généralement obtenues dans les 35 jours, avec plus de 300 génotypes évalués en une seule expérience. Les données sont présentées pour les génotypes résistants et sensibles pour illustrer la variation couramment observée à l'aide de ces méthodes.

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Protocol

1. Maintenir une source de R. reniformis (en) Inoculum

  1. Remplir les pots d'argile en terre cuite (15 cm de diamètre, 13,5 cm de hauteur) avec un mélange pasteurisé à la vapeur de limon sablonneux en 1 partie et de sable en 2 parties. Plantez une variété de tomate sensible (socopersicon) dans chaque pot et placez les pots dans une serre.
    REMARQUE : D'autres variétés végétales sensibles comme le coton peuvent être utilisées à la place de la tomate.
  2. Inoculer les plants de tomates avec des nématodes reniformes vermiformes (voir l'étape 3.3). Maintenir les plantes dans la serre à une température d'environ 28 oC.

2. Planter des génotypes de coton pour R. reniformis (en) Évaluation de la résistance

  1. Préparer le sol en combinant du sable fin en 2 parties avec du loam sablonneux en 1 partie prélevé sur le terrain.
  2. Pasteuriser à la vapeur le mélange de sol pour s'assurer que le sol est exempt de nématodes et d'agents pathogènes végétaux transmis par le sol.
  3. Ajouter le mélange de sol dans des pots en plastique conique (4 cm de diamètre, 21 cm de hauteur). Avant de remplir les pots, placez une boule de coton dans le fond du pot pour éviter la perte de sol. Remplir partiellement les pots de terre à environ 2 cm du sommet.
  4. Préparer un pieu en plastique pour chaque pot pour désigner le génotype à planter.
  5. Graines végétales des génotypes de coton sélectionnés pour évaluation.
    1. Plantez une seule graine dans chaque pot pour l'évaluation des populations de ségrégation, dans laquelle chaque graine représente un génotype unique.
    2. Pour les variétés de coton ou les accessions au germplasme, plantez 2 à 3 graines dans un seul pot pour assurer la germination d'au moins une plante avec les autres semis retirés des pots avant l'inoculation du nématode.
      Remarque : Alternativement, les graines peuvent germer de 24 à 72 h avant la plantation afin de minimiser le nombre de pots avec des graines non viables.
  6. Plantez des graines de génotypes de contrôle résistants et sensibles sélectionnés.
    Remarque : Les génotypes témoins sont reproduits 5 à 10 fois pour évaluer les variations naturelles inhérentes à la méthodologie de dépistage.
  7. Remplir les pots de terre supplémentaire pour couvrir la graine dans chaque pot.
  8. Placez les pots dans la chambre de croissance. Maintenir une température constante de 28 oC, une température de l'air ambiant, pour la chambre de croissance. Fournir un éclairage artificiel avec un mélange de lampes fluorescentes et à incandescence avec une photopériode de 16 h.
  9. Placez les émetteurs d'eau dans chaque pot et arrosez les pots deux fois par jour à l'aide d'un système d'arrosage automatique. Ajustez le système d'arrosage pour fournir de l'eau supplémentaire à mesure que la plante grandit.

3. Inoculation de nématode des plantes de coton et préparation des échantillons de racines

  1. Extrait des nématodes reniformes vermiformes maintenus sur les plants de tomates sensibles (voir étape 1) à l'aide de l'élutriation19 et de la flottation centrifuge20 méthodologies la veille de l'inoculation. Conserver les nématodes extraits à 4 oC.
    REMARQUE : L'extraction d'entonnoir de Baermann21 est une méthode alternative pour l'extraction de nématode.
  2. Déterminez le nombre de nématodes extraits en comptant le nombre de nématodes dans un sous-échantillon de 100 L et préparez une suspension de 1 000 nématodes/mL dans l'eau du robinet pour les inoculations.
  3. Inoculer les semis de coton 7 d après la plantation avec la suspension au nématode. Créer une petite dépression dans le sol à côté de la plante, et pipette 1 ml de la suspension de nématode reniforme dans la dépression.
  4. Retirer les plantes des pots 28 d après l'inoculation pour l'évaluation des nématodes.
    REMARQUE : À ce stade, les plantes mesurent environ 15 cm de haut et 4 à 6 feuilles complètement élargies.
    1. Retirer la plupart des feuilles entièrement élargies des plantes à l'aide de ciseaux avant d'enlever les plantes des pots.
    2. Pour retirer les plantes des pots, presser le pot et faire glisser le sol dans la main.
    3. Enlevez délicatement le sol des racines en agitant le système racinaire dans l'eau du robinet dans un récipient de 10 L. Rincer brièvement le système racinaire dans un récipient d'eau du robinet propre.
    4. Retirer le système racinaire de la plante à environ 1 cm sous la ligne de sol à l'aide de ciseaux.
  5. Placez le système racinaire dans un contenant de spécimens en plastique, non stérile et jetable de 120 ml, ainsi que le pieu en plastique du pot utilisé pour l'identification.
    REMARQUE : Plusieurs échantillons sont traités avant de passer à l'étape 3.7. Passez à l'étape 4 pour la propagation végétative de la pousse de la plante.
  6. Préparer une solution de 12,5 % (v/v) de colorant alimentaire rouge17 dans l'eau du robinet pour tacher les nématodes attachés au système racinaire.
  7. Ajouter environ 30 ml de la solution de colorant alimentaire rouge à l'échantillon de racine dans le récipient de spécimen pour couvrir complètement le système racinaire.
  8. Placer le contenant dans un four à micro-ondes et chauffer l'échantillon de racines jusqu'à ce que la solution de coloration commence à bouillir. Retirer l'échantillon du four à micro-ondes et laisser refroidir l'échantillon à température ambiante.
  9. Décanter la solution de colorant alimentaire rouge de l'échantillon de racine et ajouter environ 100 ml d'eau du robinet au récipient du spécimen pour enlever l'excès de tache. Placer le couvercle sur le contenant du spécimen et conserver l'échantillon dans un réfrigérateur à 4 oC. Passez à l'étape 5 pour l'évaluation de l'infection des racines.
    REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici avant de passer à l'étape 5.

4. Propagation végétative pour récupérer des plantes pour la production de semences

  1. Placer une boule de coton dans le fond d'un pot en plastique conique (voir l'étape 2.3) et remplir partiellement le pot de récipient de pot de mousse de tourbe. Ensuite, placez la pousse végétative dans le pot et ajoutez fermement les supports de mise en pot pour remplir le pot. Placez un nouveau pieu en plastique étiqueté dans chaque pot pour désigner le génotype de coton.
  2. Placer le plateau de pots dans un récipient en plastique (73,6 cm de longueur x 45,7 cm de largeur x 15,2 cm de hauteur) avec de l'eau et arroser brièvement les plantes pour humidifier le support de mise en pot. Placer les pots dans une chambre de croissance à température constante de 28 oC à l'aide d'une photopériode de 16 h. Ajouter de l'eau supplémentaire au contenant en plastique au besoin pour maintenir l'humidité du sol.
  3. Transplanter les plantes dans de plus grands pots pour la production de graines après environ 30 d. Remplir partiellement un pot en plastique de 6 L avec des supports de mise en pot (voir l'étape 4.1), retirer la plante du petit pot, placer la plante dans le pot de 6 L, et fermement ajouter des supports de mise en pot pour remplir le pot.
  4. Placer les plantes dans une serre et ajouter de l'eau pour humidifier le support de mise en pot. Maintenir la température dans la serre à environ 28 oC (l'éclairage artificiel n'est pas nécessaire).
    1. Plantes d'eau à la main au besoin pendant environ 30 d.
    2. Lorsqu'environ 75 % des plantes ont besoin d'arrosage quotidien, arroser les plantes quotidiennement à l'aide d'un système d'arrosage automatique. Ajuster le système d'arrosage automatique à l'eau plus fréquemment au besoin pour la croissance des plantes.
    3. Ajouter environ 10 g d'engrais à libération lente dans chaque pot avant le début de l'initiation florale.
  5. Récoltez les plantes à maturité et traitez les échantillons de graines de coton pour obtenir des graines en temps d'évaluation.
    1. Pour récolter les graines de coton, retirer le coton des bolls ouverts sur la plante à la main et le placer dans un sac en papier étiqueté. Les graines sont attachées aux fibres de coton, qui sont enlevées dans les étapes suivantes.
    2. Retirer les fibres de la fibre de fibre de fibre de fibre use des échantillons de graines à l'aide d'un gin de laboratoire à 10 scies.
    3. Retirer les fibres de fuzz des échantillons de graines à l'aide d'acide sulfurique concentré. Neutraliser les échantillons de graines dans une solution de 15 % (v/v) de carbonate de sodium, rincer les échantillons à l'eau du robinet et sécher les échantillons dans un séchoir à air forcé.
    4. Placer les échantillons de semences dans des enveloppes étiquetées pour les entreposer.

5. Évaluation de R. reniformis (en) Infection des racines

  1. Retirez l'échantillon de racine du contenant du spécimen et comptez le nombre de nématodes femelles attachés au système racinaire à l'aide d'un stéréomicroscope (grossissement 20X).
    REMARQUE : Seuls les nématodes reniformes femelles sont capables d'infecter les racines des plantes.
  2. Placer le système racinaire sur du papier absorbant pendant environ 10 min pour éliminer l'excès d'humidité. Peser le système racinaire pour déterminer le poids des racines fraîches.
  3. Entrez le nombre de nématodes et les données sur le poids des racines fraîches dans un programme de feuilles de calcul de l'ordinateur et calculez le nombre de femelles par gramme de racine.

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Representative Results

Rotylenchulus reniformis infection du système racinaire pour deux variétés est présenté dans la figure 1. Relativement moins de nématodes reniformes femelles sont en mesure d'établir un site d'alimentation pour le génotype de coton résistant par rapport au génotype sensible. La variation de la croissance des racines est courante entre les adhésions, comme l'illustre la figure 2. Cette variation mesurée par le poids des racines fraîches peut également être observée entre les plantes du même génotype (tableau 1). Les génotypes d'arboreum de Gossypium montrent fréquemment des taux de croissance des racines plus faibles que les génotypes de coton upland. Pour compenser cette variation, des données sont recueillies sur les poids des racines fraîches, qui sont utilisés pour calculer le nombre de nématodes reniformes femelles par gramme de tissu racinaire pour chaque génotype. Le nombre de nématodes reniformes femelles par gramme de racine pour les génotypes résistants est généralement inférieur à 10, tandis que les génotypes sensibles ont généralement plus de 30 nématodes par gramme de racine.

Un défi pour le dépistage des génotypes de coton pour R. la résistance au reniformis est la variation potentielle qui peut se produire à l'intérieur et entre les expériences. Pour évaluer et ajuster cette variation, les génotypes de coton résistants et sensibles sont inclus comme contrôles et reproduits dans chaque expérience. Le tableau 1 présente les données de deux génotypes utilisés comme témoins dans deux expériences distinctes à l'aide du protocole décrit ci-dessus. Les génotypes ont été reproduits 10 fois et inoculés 7 jours après la plantation avec 1 000 nématodes vermiformes, puis les systèmes racinaires ont été récoltés 28 jours après l'inoculation pour compter les nématodes attachés aux racines. Étant donné que les expériences ont été menées à des moments différents, la source des nématodes utilisés pour les vaccinations était différente; autrement, tous les autres paramètres étaient similaires. Ces données illustrent la variation qui peut être observée dans les évaluations des nématodes reniformes. Le nombre de nématodes femelles et le poids des racines étaient plus élevés dans l'expérience 1 pour les deux témoins par rapport à l'expérience 2, ce qui a entraîné un nombre plus élevé de femelles par gramme de racine pour l'expérience 1. Étant donné que les numérations féminines étaient considérablement plus élevées pour l'expérience 1, l'augmentation du poids des racines n'a pas réduit le nombre de femelles par gramme de racine aux niveaux observés pour l'expérience 2. On a également observé des variations considérables entre les réplications de génotypes individuels. Cependant, le Grésistant . le génotype d'arboreum PI 615699 a fréquemment montré des numérations féminines sensiblement plus faibles et un nombre plus faible de femelles par gramme de racine que le Gsensible. hirsutum génotype PI 529251. Les génotypes peuvent être facilement classés comme résistants ou sensibles lorsque ces moyens sont utilisés pour la comparaison. Les génotypes sont classés comme résistants lorsque le nombre de femelles par gramme de racine est d'environ 10 % du contrôle sensible.

Un sous-ensemble de données provenant d'une population f2 ségréguée qui a été évaluée à l'aide du protocole est présenté au tableau 2. La population comprenait 300 plantes F2, et les données pour 50 plantes représentant l'aire de répartition sont présentées. Pour la population de 300 plantes, le nombre de nématodes observés infectant les systèmes racinaires variait de 0 à 50, avec une moyenne de 9,4. Le poids des racines variait de 0,01 à 1,22 g, avec une moyenne de 0,38 g. Les nématodes femelles par gramme de racine variaient de 0 à 400, avec une moyenne de 33,6. Les parents ont été reproduits dans l'évaluation. Le parent résistant (PI 417895) a montré une moyenne de 5,8 femelles par gramme de racine, avec un poids de racine moyen de 0,8 g; en revanche, le parent susceptible (PI 529729) a montré une moyenne de 40,8 femelles par gramme de racine, avec un poids de racine moyen de 0,35 g. Vingt plantes n'ont montré aucune infection de nématode et ont été classifiées comme résistantes, mais ceci peut représenter des évasions. Ces plantes et les plantes dont la croissance des racines est faible sont généralement retirées de l'analyse des données. Cette gamme de variation pour la croissance de racine et l'infection de nématode des systèmes radiculaires sont généralement observées pour des évaluations de nématode ; ainsi, la capacité de dépister un grand nombre de plantes dans une seule expérience peut minimiser cette variation et permettre d'évaluer avec précision la génétique de la résistance. La population a montré la variation quantitative pour l'infection de nématode, et les usines ont été classifiées comme résistantes basées sur les données du parent susceptible, qui a suggéré que la résistance ait été conférée par deux gènes récessifs pour cette population. En outre, le protocole de propagation végétative décrit ci-dessus a été utilisé avec succès pour récupérer les plantes de cette population. La cote de la progéniture F3 dérivée des plantes F2 individuelles correspondait souvent à la cote de la plante F2.

Figure 1
Figure 1: Rotylenchulus reniformis échantillons de racines infectées. L'échantillon de racine d'un génotype de coton résistant (en bas à gauche) montre un nématode femelle unique attaché à la racine, tandis que le génotype sensible (en haut à droite) montre plusieurs femelles attachées à la racine. La barre noire représente une échelle de 0,1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Variation observée dans la croissance des racines pour deux génotypes de coton. Les systèmes racinaires de deux accessions g.arboreum résistantes au nématode reniformes sont présentés pour illustrer la variation qui peut être observée pour la croissance des racines. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Table 1
Tableau 1 : Variation observée dans la réponse à l'infection à nématodes reniformes pour deux génotypes de coton inclus comme témoins. Ces données illustrent la variation qui peut se produire à l'intérieur et entre les expériences pour le génotype pi 529251 et g résistant de G.hirsutum. arboreum génotype PI 615699; cependant, les moyens de données étaient significativement différents, permettant aux génotypes d'être facilement classés comme résistants ou sensibles.

Désignation de génotype Femelles Poids des racines (g) Femelles/g Racine classification
88 Annonces 0 (en) 0,67 0,0 Résistant
156 Annonces 0 (en) 0,10 0,0 Résistant
75 Annonces 2 (en) 1,05 1,9 Résistant
298 Annonces 2 (en) 0,58 3,4 Résistant
259 Annonces 3 (en) 0,77 3,9 Résistant
En 208, états-unis 1 Fois 0,21 4,8 Annonces Résistant
322, états-unis 4 ( en plus) 0,82 4,9 Résistant
En 189, 2 (en) 0,35 5,7 Annonces Résistant
147 Annonces 6 Annonces 0,94 6,4 Annonces Résistant
267 Annonces 2 (en) 0,18 11,1 Modérément résistant
En 198, états-unis qui en est 5 Annonces 0,43 11,6 Annonces Modérément résistant
251 Annonces 2 (en) 0,17 11,8 Annonces Modérément résistant
95 Annonces 6 Annonces 0,46 13,0 Modérément résistant
248 Annonces 3 (en) 0,23 13,0 Modérément résistant
79 Annonces 11 Ans, états-unis ( 0,84 13,1 Modérément résistant
340, états-unis 4 ( en plus) 0,29 13,8 Annonces Modérément résistant
114, en plus d'avoir 9 (en) 0,64 14,1 Modérément résistant
168 Annonces 6 Annonces 0,40 15,0 Modérément résistant
117 Annonces 7 Annonces 0,44 15,9 Annonces Modérément résistant
77 Annonces 10 Ans et plus 0,57 17,5 annonces Modérément résistant
277 Annonces 9 (en) 0,44 20,5 annonces Modérément résistant
47 Annonces 8 Annonces 0,34 23,5 Modérément sensible
96 Annonces 20 Ans, états-unis 0,85 23,5 Modérément sensible
139 Ans et plus 15 Annonces 0,60 25,0 Modérément sensible
253 Annonces 2 (en) 0,08 25,0 Modérément sensible
247 Annonces 15 Annonces 0,53 28,3 Modérément sensible
308, en plus, en plus, y 8 Annonces 0,28 28,6 annonces Modérément sensible
152 Annonces 9 (en) 0,31 29,0 Modérément sensible
123 , États-Unis 8 Annonces 0,26 30,8 Modérément sensible
296 Annonces 18 ans, états-unis qui 0,58 31,0 Modérément sensible
138 Annonces 10 Ans et plus 0,31 32,3 Modérément sensible
151 Annonces 5 Annonces 0,15 33,3 Modérément sensible
102, en plus 31 Ans, états-unis ( 0,77 40,3 Modérément sensible
67 Annonces 5 Annonces 0,12 41,7 Annonces sensible à
51 Annonces 18 ans, états-unis qui 0,43 41,9 sensible à
311 , États-Unis 21 Ans, états-unis 0,48 43,8 sensible à
334, en plus d'en avoir pour 4 ( en plus) 0,09 44,4 sensible à
266 Annonces 33 Ans, états-unis ( 0,74 44,6 Annonces sensible à
260 Annonces 7 Annonces 0,14 50,0 sensible à
49 ans, en plus 16 Annonces 0,32 50,0 sensible à
149 Ans et plus 20 Ans, états-unis 0,39 51,3 Annonces sensible à
104, en plus d'avoir été 22 Ans 0,34 64,7 sensible à
238 Annonces 39 Ans et plus qu'ils 0,57 68,4 Annonces sensible à
144, en plus d'avoir 24 Ans, états-unis 0,33 72,7 sensible à
225 Annonces 24 Ans, états-unis 0,30 80,0 sensible à
87 Annonces 38 Annonces 0,43 88,4 sensible à
126 Annonces 50 Annonces 0,51 98,0 sensible à
272 Annonces 3 (en) 0,03 100,0 sensible à
154 Annonces 24 Ans, états-unis 0,12 200,0 sensible à
286 Annonces 3 (en) 0,01 300,0 sensible à

Tableau 2 : Réponse à l'infection au nématode reniforme observée dans un sous-ensemble de 50 génotypes d'un G. arboreum F2 population. Ces données illustrent l'éventail des variations qui peuvent être observées pour la ségrégation des populations. Les poids des racines, le nombre de nématodes et le nombre de femelles par gramme de racine sont présentés pour chaque génotype, les plantes étant classées comme résistantes, modérément résistantes, modérément sensibles ou sensibles.

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Discussion

Un protocole de dépistage efficace est nécessaire pour 1) l'identification de R. génotypes de coton résistants aux reniformis afin d'évaluer la génétique de la résistance et 2) l'élevage de variétés résistantes. La plupart des protocoles évaluent R. densités de population de reniformis ou taux de reproduction en extrayant des nématodes vermiformes ou des œufs du système racinaire de coton ou du sol de miseenpot 8,11,12,14,15 . Ces approches prennent souvent plus de temps, et les résultats ont tendance à être plus variés à l'intérieur et entre les expériences. En outre, les génotypes de coton peuvent être plus fréquemment mal classés dans des expériences de serre non répliquées utilisant ces protocoles11. Néanmoins, des résultats similaires peuvent être obtenus pour les différents protocoles ou paramètres évalués9,13.

Un protocole de dépistage alternatif est présenté dans lequel le dépistage des génotypes de coton est effectué en évaluant le nombre de nématodes reniformes femelles parasitant le système racinaire. Les génotypes de coton résistants et sensibles peuvent au commencement montrer un nombre semblable de nématodes femelles pénétrant les systèmes radiculaires dans les 16 heures suivant l'inoculation, mais dans les 36 heures, les génotypes résistants commencent à montrer sensiblement moins de femelles attachées nématodes et le développement des nématodes est entravé9. Ainsi, ce protocole de dépistage fournit une mesure plus directe de l'infection nématode du système racinaire du coton par rapport aux protocoles qui reposent sur l'extraction de nématodes ou d'œufs du système racinaire ou du sol de mise en pot. La méthode d'inoculation des semis de coton avec des nématodes vermiformes est similaire parmi les approches. Les vaccinations sont généralement effectuées 7 à 14 jours après la plantation, mais le moment de l'inoculation est moins critique, car les graines peuvent également être directement plantées dans un sol infesté de nématodes. Les inoculations sont effectuées à l'aide de 1 000 nématodes vermiformes, mais le protocole peut être modifié pour augmenter ou diminuer le nombre utilisé pour l'inoculation, ou deux inoculations peuvent être effectuées à 7 et 14 jours après la plantation pour assurer suffisamment de nématodes femelles sont présent pour l'infection de racine. Dans le soja, le nombre de nématodes utilisés pour l'inoculation n'a eu aucun effet significatif sur les cotes de masse des œufs 21 jours après la plantation; bien que des cotes plus élevées aient généralement été observées à la densité de population de nématodes plus élevée22. Le protocole peut être optimisé pour déterminer la densité minimale de nématode pour l'inoculation.

L'infection de nématode du système racinaire est évaluée 28 jours après l'inoculation pour ce protocole, qui est généralement plus tôt que dans d'autres protocoles. Il s'agit d'une étape cruciale du protocole, car les évaluations sont effectuées avant l'éclosion des œufs. Un retard important dans la récolte d'échantillons de racines peut entraîner une deuxième série d'infections. Toutefois, cette évaluation antérieure a l'avantage d'augmenter le débit. Pour le protocole présenté, les génotypes de coton sont plantés dans un mélange de sable et de sol, ce qui est essentiel pour l'élimination simple et rapide du système racinaire du pot. L'utilisation d'un système d'arrosage automatique est essentielle lors de l'utilisation de petits pots avec un mélange de sable et de sol afin d'empêcher les pots de se dessécher. Colorant alimentaire rouge est utilisé pour tacher les nématodes attachés au système racinaire, qui est une méthode simple et sûre17. Une fois que les systèmes racinaires sont tachés, ils peuvent être stockés dans l'eau du robinet à 4 oC avant de compter le nombre de nématodes attachés au système racinaire; ainsi, un plus grand nombre de génotypes de coton peut être évalué dans une seule expérience, parce qu'aucun traitement supplémentaire des échantillons n'est nécessaire avant l'évaluation des numérations de nématode. En outre, il est avantageux de stocker les échantillons de racines dans l'eau du robinet pendant plusieurs jours, ce qui permet aux racines de se détachant, ce qui facilite le comptage.

Le protocole décrit permet le dépistage de populations plus importantes afin de réduire les variations environnementales qui se produiront entre les expériences. À l'aide d'une chambre de croissance végétale de 900 m2 équipée d'un système d'arrosage automatique, des populations de 480 plantes individuelles peuvent être évaluées. Le protocole a été utilisé avec succès pour évaluer les populations ségréguées de 300 individus ou plus pour caractériser la génétique de la résistance10,18. Ces populations ont montré que la variation quantitative pour l'infection et la résistance aux nématodes dans G. l'arboreum peut être plus souvent associé à de multiples gènes récessifs; ainsi, de plus grandes populations sont exigées pour des études génétiques. En outre, des variations quantitatives sont observées dans la ségrégation des populations, quel que soit le protocole utilisé, pour évaluer la réponse à l'infection nématode.

La résistance des plantes hôtes dans le coton peut nuire à la capacité du nématode d'infecter le système racinaire et d'établir un site d'alimentation, mais elle peut également affecter la capacité reproductrice du nématode. Le protocole de dépistage décrit évalue le nombre de nématodes qui sont en mesure d'établir un site d'alimentation sur le système racinaire du coton. La reproduction des nématodes mesurée par la production d'œufs n'a pas été évaluée dans ce protocole, ce qui est une limitation importante. Néanmoins, le protocole peut être modifié pour recueillir ce type de données. Alternativement, d'autres méthodologies peuvent être utilisées pour recueillir ces données après que des génotypes résistants ont été identifiés, ce qui réduit la nécessité de dépister un grand nombre d'individus.

Les données provenant d'évaluations nématodes de génotypes individuels peuvent être variables à l'intérieur et entre les expériences, ce qui est un problème courant avec tous les protocoles de dépistage utilisés pour évaluer r. résistance au reniformis pour les génotypes de coton. L'utilisation d'une conception expérimentale avec de multiples réplications pour le dépistage des accessions au germplasme aidera à évaluer cette variation pour l'identification des génotypes résistants. En outre, l'inclusion des mêmes génotypes de contrôle résistants et sensibles entre les expériences est utile pour évaluer cette variation et comparer les résultats de plusieurs expériences. Ces contrôles sont également utilisés pour surveiller le succès de l'inoculation des nématodes. En outre, les moyens de données de ces contrôles sont utilisés pour classer les génotypes comme résistants ou sensibles10,16. Les génotypes de coton sont généralement classés comme résistants s'ils montrent moins de 10 % de l'infection observée sur le contrôle sensible16,23. La croissance des racines est un autre facteur contribuant à la variation observée dans les données utilisant le protocole, parce que les plantes ayant une racine de robinet avec moins de racines latérales offrent moins de sites pour l'infection, ce qui peut entraîner moins de nématodes par gramme de racine.

La difficulté de développer de nouvelles variétés de coton upland utilisant d'autres espèces de coton comme source de gènes de résistance nécessite un protocole de propagation végétative afin de faire progresser les lignées de reproduction vers la prochaine génération pour une sélection ultérieure ou d'autres reproduction. Un protocole de propagation végétatif simple tel que décrit a été développé pour récupérer des usines après évaluation de nématode. Le protocole a été utilisé avec succès pour récupérer les plantes de grandes populations18. Typiquement, le système racinaire est récupéré dans les 30 jours après la prise de pousse végétative est planté. Les taux de survie sont souvent supérieurs à 95 %. Les plantes dont la vigueur est faible peuvent être perdues lors de la propagation d'un grand nombre de plantes. En général, moins de 1 % des plantes n'ont pas montré de racine ou de croissance de pousse. Le protocole peut être facilement modifié et utilisé avec d'autres protocoles de dépistage des nématodes.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Cette recherche a été financée par le Département de l'agriculture des États-Unis, Le Service de recherche agricole. La mention des noms commerciaux et des produits commerciaux dans cet article a pour but uniquement de fournir des renseignements précis et n'implique pas de recommandations ou d'approbations de la part du ministère de l'Agriculture des États-Unis. L'USDA est un fournisseur et un employeur de l'égalité des chances. Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêts à déclarer. L'assistance technique a été fournie par Kristi Jordan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ray Leach Cone-tainer Stuewe and Sons Inc. SC10U
Cone-tainer tray Stuewe and Sons Inc. RL98
Sand various
Cotton balls various
Pylon 4 inch plant labels (4 in L x 5/8 in W) Pylon Platics L-4-W Any brand or vendor is acceptible.
4 oz. specimen containers Fisher Scientific 16-320-731 Any brand or vendor is acceptible.
Red food coloring McCormick & Co., Inc.
1 mL Pipet tips various
10 L container various Inexpensive buckets work well.
6 L pots Nursery Supplies Inc. Poly-Tainer-Can No2A Any brand or vendor is acceptible. Different size pots can be used
Potting media Sun Gro Horticulture Metro-Mix 360 Any brand or vendor is acceptible.
Fertilizer Everris NA Inc. Osmocote Plus Any brand or vendor is acceptible.
Plastic container (73.6 cm L x 45.7 cm W x 15.2 cm D) Rubbermaid 3O29  Any brand or vendor is acceptible.

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Génétique Numéro 147 Coton germplasme Gossypium arboreum résistance aux plantes hôtes criblage nématode nématode reniforme élevage de résistance Rotylenchulus reniformis propagation végétative
Dépistage des génotypes de coton pour la résistance au nématode reniforme
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