Summary
Burada, reniform Nematot direnci için pamuk genotiplerinin hızlı yıkıcı olmayan taramasında bir protokol sunulmuştur. Protokol, enfeksiyon tepkisi belirlemek için Nematode enfekte pamuk fide kökleri görsel olarak inceleyerek içerir. Her bitkinin vejetatif çekimi daha sonra tohum üretimi için bitkiler kurtarmak için yayılır.
Abstract
Nematot yönetimini iyileştirmek için dayanıklı pamuk (Gossypium hirsutum) çeşitlerinin geliştirilmesi için hızlı bir şekilde yıkıcı olmayan reniform nematod (rotylenchulus reniformis) tarama protokolü gereklidir. Çoğu protokol, nüfus yoğunluğunu veya üreme hızını belirlemek için pamuk kökü sisteminden veya toprak Çömlekçilik tarafından vermiform nematdes veya yumurta ayıklamak içerir. Bu yaklaşımlar genellikle az sayıda genotipin değerlendirilmesi ile zaman alıcı bir işlemdir. Burada, kök sisteminin nematod enfeksiyonu için görsel olarak incelendiği alternatif bir yaklaşım açıklanmıştır. Protokol, pamuk fide Birmanya içerir 7 gün vermiform nematdes ile dikim ve kök sisteme bağlı kadın sayısını belirlemekten sonra 28 inoculation gün sonra. Veri kök büyüme varyasyonu için ayarlamak için taze kök ağırlığı gram başına kadın sayısı olarak ifade edilir. Protokol, Nematot 'un bir enfeksiyon sitesi kurması ile ilişkili konak-bitki direncini değerlendirmek için mükemmel bir yöntem sağlar; Ancak, nematod üreme engelleyen direnç değerlendirilmez. Diğer tarama protokollerinde olduğu gibi, deney içinde ve arasındaki bireysel genotürleri arasında nematod enfeksiyonunda varyasyon sıklıkla görülür. Veri Protokolü kullanılarak gözlenen varyasyon aralığını göstermek için sunulur. Bu varyasyon için ayarlamak için, kontrol genotip deneyler dahil edilir. Yine de protokol, konak-bitki direncini değerlendirmek için basit ve hızlı bir yöntem sağlar. Protokol, G'den dayanıklı katılımların tanımlanması için başarıyla kullanılmıştır. arboreum Germplazm toplama ve direnç genetiği belirlemek için 300 ' den fazla birey ayırma nüfus değerlendirmek. Direnç üreme için bitkiler kurtarmak için bir vejetatif yayılma yöntemi de geliştirilmiştir. Nematod değerlendirme için kök sisteminin kaldırılmasından sonra, vejetatif ateş yeni bir kök sisteminin gelişmesine izin vermek için yeniden dikilir. Çeklerin% 95 daha fazla genellikle olgunluğa ulaşan bitkiler ile yeni bir kök sistemi geliştirmek.
Introduction
Rotylenchulus reniformis (Linford ve Oliveira), genellikle reniform nematod olarak anılacaktır, Güneydoğu Amerika Birleşik Devletleri 'nin topraklarda mevcut büyük parazitik nematod türlerinden biridir1,2,3. Nematod bir obligate, sedanter yarı endoparazit yaşam döngüsü tamamlamak için bir ev sahibi bitki gerektiren2,4. Vermiform preadult kadın nematodlar stel2,3bir beslenme sitesi kurmak için ana kök sistemi nüfuz. Nematod beslemeleri ve olgunlaşır gibi, ana kök dışında kalan posterior kısmı yumurta üretimi üzerine şişecek, karakteristik bir böbrek şekli oluşturan (Şekil 1). Rotylenchulus reniformis pamuk4dahil olmak üzere 300 ' den fazla bitki türlerinin kök sisteminde beslenme yeteneğine sahiptir. Upland pamuk (Gossypium hirsutum L.) yaygın Güneydoğu Amerika Birleşik Devletleri 'nde yetiştirilir, ancak Reksikliği. reniformis dirençli çeşitleri nematod Management2,3' ü engelliyor. Nematisit tedavisi ve ev sahibi olmayan kırpma türleri ile rotasyon gibi yönetim stratejileri toprak Razaltmak için kullanılmıştır. reniformis nüfus yoğunlukları5,6, ancak tohum pamuk verim kayıpları genellikle 1 ila 5%2arasında değişir. Rbelirtileri. reniformis enfeksiyonu, bitki afet, bastırılmış kök büyüme, beslenme eksiklikleri, meyve kürtaj ve Gecikmeli olgunlaşma2içerebilir. Ancak, belirtiler alan genelinde semptomların tekdüzelik nedeniyle belirgin olmayabilir; Bu nedenle, Rdeğerlendirmek için yaklaşımlar. reniformis enfeksiyonu tespit ve dirençli Upland pamuk çeşitleri geliştirmek için gereklidir. Değerlendirme R. Pamuk reniformis direnci zor kabul edilir7, enfekte kök sistemi olsa bile bitki enfeksiyon belirtileri gösterebilir normal görünebilir8.
R'nin tanımlanması için etkili bir nematod tarama protokolü gereklidir. Pamuk Germplazm koleksiyonundan reniformis dirençli Erişmeler ve bu katılımların direnç genetik belirlenmesi için. Böyle bir protokol, direnç genlerinin Upland pamuğa aktarılması konusunda yardımcı olacaktır. Çeşitli Biyotahlil yöntemleri Rdeğerlendirmek için kullanılmıştır. pamuktan reniformis enfeksiyonu8,9,10,11,12,13,14,15. Genel olarak, R'nin tanımlanması için iki büyük yaklaşım kullanılmıştır. reniformis dayanıklı pamuk genotypes. En sık kullanılan yaklaşım enfekte bitkiler veya toprak8,11,12,14,15yumurta ve/veya vermiform nematdes ayıklamak içerir. Bu yaklaşım için genel metodoloji ayrı tencerelerde bireysel pamuk genotip için tohum Ekim içerir, fide 7 ila 14 gün geliştirmek için izin, Rvermiform aşamalarında bir karışımı ekleyerek fide Birmanya. toprak reniformis ve nematlerin 30 ila 60 gün kök sistemi bulaştırmak için izin. Sonra, vermiform nematdes ve/veya yumurta her bitkinin virüslü kök sisteminden veya Çömlekçilik topraktan ayıklanır. Ayıklanan nematdes veya yumurta sayısı, daha sonra dirençli genotiplerin belirlenmesi için kontrol genotipleri ile karşılaştırıldığında nüfus yoğunluğu ve üreme hızını tahmin etmek için belirlenir.
Alternatif bir yaklaşım, burada açıklandığı gibi, mikroskobik olarak nematdes ile enfekte olan pamuk kökü sistemi inceleyerek içerir kökleri parazitize kadın nematid sayısını belirlemek için10,16. Diğer yaklaşımlara benzer şekilde, pamuk genotipler ayrı tencere içinde dikilir ve Ekim sonrası yaklaşık 7 gün boyunca vermiform nematid ile aşı edilir. İnoculation sonra 30 gün içinde, kök sistemi bireysel bitkilerin kaldırılır ve toprak kökleri durulanır. Sonra, kök sisteme bağlı nematdes kırmızı gıda17boyama ile lekelenmiş ve kökleri mikroskopik olarak dirençli pamuk genotip ile enfeksiyon sitelerin sayısını belirlemek için incelenmiştir (gram başına nematid sayısına göre tespit duyarlı kontrol16ile karşılaştırıldığında). Bu ikinci yaklaşım, değerlendirme için gereken gün sayısını azaltarak ve tek bir denemede değerlendirilen bireysel genotiplerin sayısını artırarak artan verimlilik avantajına sahiptir. Nüfus yoğunluğunu veya üreme oranını değerlendirecek tarama metodolojileri genellikle enfeksiyon belirtileri7' nin görsel gözlemlerine dayalı olandan daha zaman alıcı bir işlemdir. Bununla birlikte, bu yaklaşımın bir sınırlama, yumurta üretimi ile belirlenen nematod üreme engelleyen konak-bitki direnci değerlendirilmemiştir13.
R. için tarama protokolleri reniformis direnci genellikle değerlendirme7 sırasında kök sistemi yok ve atılan vejetatif ateş içerir. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, tohum üretimi için bitkilerin kurtarılmasına izin vermek üzere bir vejetatif yayılma yöntemi geliştirilmiştir18. Nematod değerlendirme için kök sisteminin kaldırılmasından sonra, vejetatif ateş kök sistemi regrow izin vermek için toprak Çömlekçilik dikilir. Bu yöntem çoğu Riçin geniş uygulamalara sahiptir. reniformis tarama protokolleri. Vejetatif yayılma basit ve hızlı bir yöntem Rüreme için kritik öneme sahiptir. reniformis dirençli Upland pamuk çeşitleri, nerede Döl kurtarma yeni nesil dirençli genotip ilerlemek için gereklidir.
Reniform nematod direnci için pamuk genotiplerinin büyük ölçekli taraması için bir protokol sunulmuştur. Amaç, dayanıklı Upland pamuk çeşitlerinin üreme yardımcı olmak için nematod direnci için pamuk üreme nüfus değerlendirmek için basit ve hızlı yıkıcı olmayan tarama yöntemi geliştirmektir. Bu protokol kullanılarak, veriler genellikle 35 gün içinde elde edilir ve tek bir denemede 300 ' den fazla genotip değerlendirilir. Veriler, bu yöntemler kullanılarak sıklıkla gözlenen varyasyonu göstermek için dayanıklı ve duyarlı genotiplerde sunulur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Rkaynağının korunması. reniformis İnokulumunu
- 1 parçalı kumlu killi ve 2 parça kumun Buhar pastörize karışımı ile Terra Cotta kil kaplar (çapı 15 cm, 13,5 cm yükseklikte) doldurun. Her pot bir duyarlı domates (Solanum Lycopersicon) çeşitli bitki ve bir Glasshouse içinde tencere yerleştirin.
Not: pamuk gibi diğer duyarlı bitki çeşitleri, domates yerine kullanılabilir. - Vermiform reniform nematdes ile domates bitkileri inoculate (bkz. Adım 3,3). Yaklaşık 28 °C sıcaklıkta buzluk içindeki bitkileri koruyun.
2. R. Için Pamuk Genotypes dikim reniformis Direnç değerlendirmesi
- Tarladan toplanan 1 parçalı kumlu killi ile 2 parçalı ince kumu birleştirerek toprağı hazırlayın.
- Buhar toprak nematdes ve toprak kaynaklı bitki patojenleri ücretsiz olduğundan emin olmak için toprak karışımı pastörize.
- Konik plastik kaplar (çapı 4 cm, yüksekliği 21 cm) toprak karışımı ekleyin. Önce tencere doldurma, toprak kaybı önlemek için pot alt pamuk bir top yerleştirin. Kısmen üst yaklaşık 2 cm toprak ile tencere doldurun.
- Her pot için bir plastik bahis hazırlamak genotip yerleştirilir atamak için.
- Pamuk genotiplerinin bitki tohumları değerlendirme için seçildi.
- Her bir tohumun benzersiz bir genotipi temsil ettiği, ayrı nüfusların değerlendirilmesi için her bir tencerede tek bir tohum bitki.
- Pamuk çeşitleri veya Germplazm Erişmeler için, bitki 2-3 tohum tek bir tencerede diğer fide ile en az bir bitkinin germinasyon nematod inoculation önce tencere kaldırıldı.
Not: Alternatif olarak, tohumlar uygun olmayan tohumlar ile tencere sayısını en aza indirmek için Ekim öncesinde 24 ila 72 h için çimlenme olabilir.
- Seçilen dayanıklı ve duyarlı kontrol genotypes bitki tohumları.
Not: kontrol genotipleri, tarama metodolojisine özgü doğal varyasyonları değerlendirmek için 5 ila 10 kez çoğaltılır. - Her Pot tohum kapsayacak şekilde ek toprak ile kaplar doldurun.
- Kaplar büyüme odasına yerleştirin. Büyüme odası için bir ortam hava sıcaklığı, 28 °C sabit sıcaklık koruyun. Floresan ve akkor lambalar bir karışımı ile yapay aydınlatma sağlamak 16 h photoperiod.
- Her tencerede su emitörleri yerleştirin ve otomatik sulama sistemi kullanarak günde iki kez tencere su. Bitki büyüdükçe ek su sağlamak için sulama sistemi ayarlayın.
3. pamuk tesislerinin Nematot Inoculation ve kök numunelerin hazırlanması
- Hassas domates bitkiler üzerinde tutulan vermiform reniform nematdes Extract (adım 1) elutrasyon kullanarak19 ve Santrifüjlü flotasyon20 metodolojileri inoculation önce gün. Çıkarılan nematdes 4 °C ' de saklayın.
Not: Baermann huni ekstraksiyon21 nematod ekstraksiyon için alternatif bir yöntemdir. - 100 μL alt örnekteki nematid sayısını sayarak çıkarılan nematid sayısını belirleyin ve inoculations için musluk suyunda 1.000 nematdes/mL süspansiyonu hazırlayın.
- Nematot süspansiyonu ile diktikten sonra pamuk fidanları 7 d inoculate. Bitkinin yanındaki toprakta küçük bir depresyon oluşturun ve 1 ml reniform nematod süspansiyonunun depresyon içine pipet.
- Nematod değerlendirme için aşı sonra tencere 28 d bitkiler çıkarın.
Not: Bu aşamada, bitkiler 4 ila 6 tam genişletilmiş yaprakları ile yaklaşık 15 cm yüksekliğinde.- Tencere bitkiler çıkarmadan önce makas kullanarak bitkilerin tamamen genişletilmiş yaprakları çoğunu çıkarın.
- Tencere bitkileri kaldırmak için, pot sıkmak ve el içine toprak kaydırın.
- 10 L Konteynırdaki musluk suyunda kök sistemini ajitasyon ederek toprağı kökleri yavaşça çıkarın. Kök sistemi temiz musluk suyunun bir kapsayıcısında kısaca durulayın.
- Root sistemini, makas kullanarak toprak hattının yaklaşık 1 cm altında bulunan bitkinden çıkarın.
- Kök sistemi bir 120 mL plastik, steril olmayan, tek kullanımlık numune konteynırı ile birlikte kimlik için kullanılan pot plastik payına yerleştirin.
Not: birden çok örnek 3,7 adıma geçmeden önce işlenir. Bitki çekimi vejetatif yayılması için adım 4 ' e geçin. - Hazırlamak bir 12,5% (v/v) kırmızı Gıda çözüm17 renk musluk suyu kök sisteme bağlı nematdes leke için.
- Kök sistemi tamamen kapsayacak şekilde numune konteynerinde kök örneğe yaklaşık 30 mL kırmızı gıda boyama çözümünü ekleyin.
- Numune kabı bir mikrodalga fırında yerleştirin ve boyama solüsyonu kaynatmaya başlayana kadar kök numuneyi ısıtın. Numuneyi mikrodalga fırınından çıkarın ve numunenin oda sıcaklığında soğumasını bekleyin.
- Kök örnekten kırmızı gıda boyama çözümü decant ve aşırı leke kaldırmak için numune kabı yaklaşık 100 mL musluk suyu ekleyin. Kapağı numune konteynerine yerleştirin ve numuneyi 4 °C ' de bir buzdolabında saklayın. Kök enfeksiyonunun değerlendirilmesi için adım 5 ' e geçin.
Not: protokol, 5. adıma geçmeden önce burada duraklatılabilir.
4. tohum üretimi için bitkiler kurtarmak için vejetatif yayılma
- Bir konik plastik pot alt pamuk bir top yerleştirin (bkz. Adım 2,3) ve kısmen turba yosun çömlekçilik medya ile pot doldurun. Sonra, tencereye vejetatif ateş yerleştirin ve sıkıca pot doldurmak için çömlekçilik medya ekleyin. Pamuk genotipi atamak için her pot yeni bir etiketli plastik bahis yerleştirin.
- Tencere tepsisini plastik bir kapta (73,6 cm uzunluğunda x 45,7 cm genişlik x 15,2 cm yükseklikte) su ile yerleştirin ve bitkiler, çömlekçilik medyasını nemlendirerek kısa bir süre su kaplar. 16 h fotoperiod kullanılarak 28 °C sabit sıcaklığa sahip bir büyüme odasına tencere yerleştirin. Toprak nemi korumak için gerektiğinde Plastik kabına ek su ekleyin.
- Yaklaşık 30 d sonra tohum üretimi için daha büyük tencere ekimi bitkiler. kısmen çömlekçilik medya ile 6 l plastik pot doldurmak (adım 4,1 bakınız), küçük pot bitki kaldırmak, 6 L pot içine bitki yerleştirmek, ve sıkıca pot doldurmak için çömlekçilik medya ekleyin.
- Bir Glasshouse içinde bitkiler yerleştirin ve çömlekçilik medya nemlendiren su ekleyin. Yaklaşık 28 °C ' de (yapay aydınlatma gerekli değildir) buzaktaki sıcaklığı koruyun.
- Yaklaşık 30 d için gerektiğinde el ile su santralleri.
- Bitkin yaklaşık% 75 ' si günlük sulama, günlük su santralleri, otomatik sulama sistemi kullanarak her gün gereklidir. Otomatik sulama sistemini bitki büyümesi için gerektiğinde daha sık suya ayarlayın.
- Çiçek başlatılması başlamadan önce her pot için yavaş serbest gübre yaklaşık 10 gr ekleyin.
- Olgunlukta hasat bitkiler ve daha fazla değerlendirme için tohum elde etmek için pamuk çekirdeği örneklerini işlemek.
- Pamuk tohumlarını hasat etmek için, pamuğu bitkinin açık bollarından elle çıkarın ve etiketli bir kağıt çantaya yerleştirin. Tohumlar aşağıdaki adımlarla kaldırılır pamuk lifleri, iliştirilir.
- 10 testere laboratuvar cin kullanarak tohum örneklerinden tüy bırakmayan lifleri çıkarın.
- Konsantre sülfürik asit kullanarak tohum örneklerinden Fuzz lifleri çıkarın. Tohumlu numuneleri% 15 (v/v) sodyum karbonat çözeltisi ile nötralize eder, numuneleri musluk suyuyla durulayın ve numuneleri zorla hava kurutıcısı halinde kurutun.
- Çekirdek örneklerini depolama için etiketli zarflara yerleştirin.
5. R. değerlendirilmesi reniformis Kök enfeksiyon
- Kök numuneyi numune konteynerinden çıkarın ve mikroskoptan (20X büyütme) kullanarak kök sisteme bağlı dişi nematid sayısını saymak.
Not: sadece kadın reniform nematdes bitki kökleri bulaşmasını yeteneğine sahiptir. - Aşırı nemi kaldırmak için yaklaşık 10 dakika boyunca kağıt havlulara kök sistemi yerleştirin. Taze kök ağırlığı belirlemek için kök sistemi tartın.
- Bir bilgisayar elektronik tablo programına nematod sayımı ve taze kök ağırlık verileri girin ve kök gram başına kadın sayısını hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İki çeşit için kök sisteminin Rotylenchulus reniformis enfeksiyonu Şekil 1' de sunulmuştur. Nispeten daha az kadın reniform nematid duyarlı genotürü ile karşılaştırıldığında dayanıklı pamuk genotipi için bir beslenme sitesi kurmak edebiliyoruz. Şekil 2' de gösterildiği gibi kök büyümede varyasyon, katılımların arasında yaygındır. Taze kök ağırlığı ile ölçülen bu varyasyon aynı genotipteki bitkiler arasında da gözlenebilir (Tablo 1). Gossypium arboreum genotip sık Upland pamuk genotip daha düşük kök büyüme oranları gösterir. Bu varyasyonu telafi etmek için, veri her genotip için gram kök dokusu başına dişi reniform nematod sayısını hesaplamak için kullanılan taze kök ağırlıkları üzerinde toplanır. Dayanıklı genotipler için kök gram başına dişi reniform nematid sayısı genellikle 10 ' dan azdır, ancak duyarlı genotipler genellikle gram kök başına 30 ' dan fazla nematid 'dir.
Riçin pamuk genotipleri tarama için bir zorluk. reniformis direnci içinde ve deneyler arasında oluşabilecek potansiyel varyasyonudur. Bu varyasyon için değerlendirmek ve ayarlamak için, dayanıklı ve hassas pamuk genotipler kontrol olarak dahil edilir ve her deney çoğaltılır. Tablo 1 , yukarıda açıklanan protokolü kullanarak iki ayrı denemelerde denetimler olarak kullanılan iki genotip için veri sunar. Genotipler 10 kez çoğaltıldı ve 1.000 vermiform nematdes ile Ekim sonrası 7 gün aşı, daha sonra kök sistemleri köklerine bağlı nematid saymak için aşı sonra 28 gün hasat edildi. Deneyler farklı zamanlarda gerçekleştirildiğinden, aşılar için kullanılan nematid kaynağı farklıydı; Aksi takdirde, diğer tüm parametreler benzer. Bu veriler, reniform nematod değerlendirmelerinde gözlenen varyasyonu göstermektedir. Kadın nematod sayar ve kök ağırlıkları deneme 2, deneme 1 için kök gram başına kadın daha yüksek sayıda sonuçlanan iki kontrol için deney 1 daha yüksek oldu. Kadın sayıları deney için oldukça yüksek olduğu için 1, kök ağırlıklarında artış deney için gözlenen düzeylere kök gram başına kadın sayısını düşürmedi 2. Bireysel genotiplerin çoğalabilir arasında önemli varyasyon da gözlenmiştir. Ancak, dayanıklı G. arboreum genotip PI 615699 sık önemli ölçüde düşük kadın sayıları ve duyarlı Gdaha kök gram başına kadın sayısı daha düşük gösterdi. hirsutum genotip PI 529251. Bu araçlar karşılaştırma için kullanıldığında genotürleri kolay dirençli veya duyarlı olarak sınıflandırılabilir. Genotipler, gram kökü başına kadın numaraları duyarlı kontrol yaklaşık% 10 olduğunda dirençli olarak sınıflandırılır.
Protokol kullanılarak değerlendirilen bir ayrılmış F2 popülasyonundan veri alt kümesi Tablo 2' de sunulur. Nüfus 300 F2 bitkiler dahil, ve 50 varyasyon aralığını temsil eden tesisler için veri sunulmaktadır. 300 bitki nüfusu için, kök sistemleri enfekte gözlenen nematid sayısı 0 ile 50 arasında değişmektedir, bir ortalama ile 9,4. Kök ağırlıkları 0.01-1,22 g 'den, ortalama 0,38 g 'ye kadar değişmektedir. kök gram başına kadın nematdes 0-400 arasında değişmektedir, bir ortalama ile 33,6. Ebeveynler değerlendirmede çoğaltıldı. Dayanıklı ebeveyn (PI 417895) bir ortalama gösterdi 5,8 kadın başına gram root, ortalama kök ağırlığı ile 0,8 g; Buna karşılık, duyarlı ebeveyn (PI 529729) bir ortalama gösterdi 40,8 kadın başına gram root, ortalama kök ağırlığı ile 0,35 g. yirmi bitki hiçbir nematod enfeksiyonu gösterdi ve dirençli olarak sınıflandırıldı, ama bu kaçar temsil edebilir. Hem bu bitkiler ve kötü kök büyüme ile bitkiler genellikle veri analizinden kaldırılır. Kök sistemlerin kök büyüme ve nematod enfeksiyonu için varyasyon bu aralığı genellikle nematod değerlendirmeleri için görülür; Böylece, tek bir denemede bitkilerin çok sayıda ekran yeteneği bu varyasyon en aza indirmek ve doğru direnç genetiği değerlendirmek için izin verebilir. Nüfus, Nematot enfeksiyonu için niceliksel varyasyon gösterdi ve bitkiler duyarlı ebeveynin verilerine göre dirençli olarak sınıflandırıldı, bu da direnişin bu nüfus için iki resessif Gen tarafından verildi olduğunu söyledi. Ayrıca, yukarıda açıklanan vejetatif yayılma Protokolü başarıyla bu nüfusun bitkiler kurtarmak için kullanıldı. F3 Döl 'nin bireysel f2 tesislerinden elde edilen reytingi, f2 fabrikasının derecelendirmesi ile sıklıkla ilişkilendirilmiştir.
Şekil 1: rotylenchulus reniformis enfekte kök örnekleri. Dayanıklı bir pamuk genotip (sol alt) kök örnek kök bağlı tek bir kadın nematod gösterir, hassas genotip (sağ üst) köküne bağlı birden fazla kadın gösterir ise. Siyah çubuk 0,1 mm ölçeğini temsil eder. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2 : İki pamuk genotürleri için kök büyüme gözlenen varyasyon. İki reniform nematod dirençli G. arboreum katılımları için kök sistemleri kök büyüme için gözlemlenebilir varyasyon göstermek için sunulmaktadır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Tablo 1: iki pamuk genotürleri için reniform nematod enfeksiyon tepkisi gözlenen varyasyon kontrol olarak dahil. Bu veriler, duyarlı g için denemeler arasında ve arasında oluşabilecek varyasyonu göstermektedir . hirsutum genotip PI 529251 ve dayanıklı g. arboreum genotip PI 615699; Ancak, veri anlamına gelir önemli ölçüde farklı, genotiplerin kolayca dayanıklı veya duyarlı olarak sınıflandırılması için izin.
| Genotip tanımı | Kadın | Kök ağırlığı (g) | Kadın/g kökü | Sınıflandırma |
| 88 | 0 | 0,67 | 0,0 | Dayanıklı |
| 156 | 0 | 0,10 | 0,0 | Dayanıklı |
| 75 | 2 | 1,05 | 1,9 | Dayanıklı |
| 298 | 2 | 0,58 | 3,4 | Dayanıklı |
| 259 | 3 | 0,77 | 3,9 | Dayanıklı |
| 208 | 1 | 0,21 | 4,8 | Dayanıklı |
| 322 | 4 | 0,82 | 4,9 | Dayanıklı |
| 189 | 2 | 0,35 | 5,7 | Dayanıklı |
| 147 | 6 | 0,94 | 6,4 | Dayanıklı |
| 267 | 2 | 0,18 | 11,1 | Orta derecede dirençli |
| 198 | 5 | 0,43 | 11,6 | Orta derecede dirençli |
| 251 | 2 | 0,17 | 11,8 | Orta derecede dirençli |
| 95 | 6 | 0,46 | 13,0 | Orta derecede dirençli |
| 248 | 3 | 0,23 | 13,0 | Orta derecede dirençli |
| 79 | 11 | 0,84 | 13,1 | Orta derecede dirençli |
| 340 | 4 | 0,29 | 13,8 | Orta derecede dirençli |
| 114 | 9 | 0,64 | 14,1 | Orta derecede dirençli |
| 168 | 6 | 0,40 | 15,0 | Orta derecede dirençli |
| 117 | 7 | 0,44 | 15,9 | Orta derecede dirençli |
| 77 | 10 | 0,57 | 17,5 | Orta derecede dirençli |
| 277 | 9 | 0,44 | 20,5 | Orta derecede dirençli |
| 47 | 8 | 0,34 | 23,5 | Orta derecede duyarlı |
| 96 | 20 | 0,85 | 23,5 | Orta derecede duyarlı |
| 139 | 15 | 0,60 | 25,0 | Orta derecede duyarlı |
| 253 | 2 | 0,08 | 25,0 | Orta derecede duyarlı |
| 247 | 15 | 0,53 | 28,3 | Orta derecede duyarlı |
| 308 | 8 | 0,28 | 28,6 | Orta derecede duyarlı |
| 152 | 9 | 0,31 | 29,0 | Orta derecede duyarlı |
| 123 | 8 | 0,26 | 30,8 | Orta derecede duyarlı |
| 296 | 18 | 0,58 | 31,0 | Orta derecede duyarlı |
| 138 | 10 | 0,31 | 32,3 | Orta derecede duyarlı |
| 151 | 5 | 0,15 | 33,3 | Orta derecede duyarlı |
| 102 | 31 | 0,77 | 40,3 | Orta derecede duyarlı |
| 67 | 5 | 0,12 | 41,7 | Duyarlı |
| 51 | 18 | 0,43 | 41,9 | Duyarlı |
| 311 | 21 | 0,48 | 43,8 | Duyarlı |
| 334 | 4 | 0,09 | 44,4 | Duyarlı |
| 266 | 33 | 0,74 | 44,6 | Duyarlı |
| 260 | 7 | 0,14 | 50,0 | Duyarlı |
| 49 | 16 | 0,32 | 50,0 | Duyarlı |
| 149 | 20 | 0,39 | 51,3 | Duyarlı |
| 104 | 22 | 0,34 | 64,7 | Duyarlı |
| 238 | 39 | 0,57 | 68,4 | Duyarlı |
| 144 | 24 | 0,33 | 72,7 | Duyarlı |
| 225 | 24 | 0,30 | 80,0 | Duyarlı |
| 87 | 38 | 0,43 | 88,4 | Duyarlı |
| 126 | 50 | 0,51 | 98,0 | Duyarlı |
| 272 | 3 | 0,03 | 100,0 | Duyarlı |
| 154 | 24 | 0,12 | 200,0 | Duyarlı |
| 286 | 3 | 0,01 | 300,0 | Duyarlı |
Tablo 2:50 genotiplerinin bir alt kümesinde görülen reniform nematod enfeksiyon tepkisi G. arboreum F2 nüfus. Bu veriler, nüfus ayrımı için gözlemlenebilir varyasyon aralığını göstermektedir. Kök ağırlıkları, nematod sayıları, ve kök gram başına kadın sayısı her genotip için sunulmaktadır, dayanıklı olarak sınıflandırılmış bitkiler ile, orta derecede dayanıklı, orta derecede duyarlı, veya duyarlı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1 için etkili bir tarama protokolü gereklidir) Rtanımlaması. direnç genetik değerlendirmek için reniformis dayanıklı pamuk genotip ve 2) dayanıklı çeşitlerin üreme. Çoğu protokol Rdeğerlendirmek. reniformis nüfus yoğunlukları veya üreme oranları vermiform nematdes veya yumurta pamuk kök sisteminden veya Çömlekçilik toprak8,11,12,14,15 ayıklayarak . Bu yaklaşımlar genellikle daha fazla zaman alıcı ve sonuçlar içinde ve deneyler arasında daha çeşitlidir eğilimindedir. Ayrıca, pamuk genotipler daha sık bu protokolleri kullanarak yinelenmeyen Glasshouse deneyler yanlış sınıflandırılmış olabilir11. Bununla birlikte,9,13' ü değerlendirilen çeşitli protokoller veya parametreler için benzer sonuçlar elde edilebilir.
Pamuk genotiplerinin taramasının, kök sistemini parazitleştiren kadın reniform nematid sayısını değerlendirerek gerçekleştirildiği alternatif bir tarama protokolü sunulmuştur. Dayanıklı ve duyarlı pamuk genotipler başlangıçta inoculation sonra 16 saat içinde kök sistemleri nüfuz kadın nematid benzer sayıda gösterebilir, ancak 36 saat içinde, dayanıklı genotip önemli ölçüde daha az bağlı kadın göstermeye başlar nematod ve nem gelişimi engellenmiştir9. Bu nedenle, bu tarama protokolü, kök sistemden veya Çömlekçilik topraklarından nematod veya yumurtaların çıkarılması üzerine dayanan protokollere kıyasla, pamuk kökü sisteminin nem enfeksiyonu ile ilgili daha doğrudan bir ölçü sağlar. Pamuk fide inokülasyon yöntemi, vermiform nematid ile yaklaşımlar arasında benzerdir. İnoculations genellikle yapılmıştır 7 için 14 Ekim sonra gün, ama aşı zamanlaması daha az kritik, tohumlar da doğrudan reniform Nematode-istila toprak içine dikilebilir gibi. Aşılar 1.000 vermiform nematdes kullanılarak gerçekleştirilir, ancak protokol inoculation için kullanılan sayıyı artırmak veya azaltmak için değiştirilebilir, ya da iki inokasyonlar yapılabilir 7 ve 14 gün yeterli kadın nematdes emin olmak için dikim sonra kök enfeksiyon için mevcut. Soya fasulyesi olarak, aşı için kullanılan nematinin sayısı Ekim sonrası 21 gün yumurta kitle derecelendirmeleri üzerinde önemli bir etkisi yoktu; rağmen, daha yüksek derecelendirmeler genellikle yüksek Nematot nüfus yoğunluğu22gözlenen. Protokol inoculation için minimum nematod yoğunluğu belirlemek için optimize edilebilir.
Kök sistemin Nematode enfeksiyonu, genellikle diğer protokollerden daha erken olan bu protokol için aşı sonrasında 28 gün olarak değerlendirilir. Bu protokolde önemli bir adımdır, değerlendirme yumurta kapağı önce gerçekleştirilir gibi. Hasat kökü örneklerinde önemli bir gecikme, ikinci bir enfeksiyon turuna neden olabilir. Ancak, bu önceki değerlendirme verimi artırma avantajı vardır. Sunulan protokol için, pamuk genotipleri kum ve toprak, pot kök sisteminin basit ve hızlı kaldırılması için kritik bir karışımı içinde dikilir. Otomatik sulama sisteminin kullanımı, tencerelerin kurumasını önlemek için bir kum ve toprak karışımı ile küçük tencere kullanırken esastır. Kırmızı gıda boyama basit ve güvenli bir yöntem17kök sisteme bağlı nematdes leke için kullanılır. Kök sistemleri lekelendikten sonra, kök sisteme bağlı nematid sayısını saymadan önce 4 °C ' de musluk suyunda saklanabilir; Bu nedenle, daha fazla sayıda pamuk genotipler tek bir denemede değerlendirilebilir, çünkü nematod sayılarının değerlendirilmesinden önce numunelerin ek işlenmesi gerekli değildir. Ayrıca, birkaç gün için musluk suyu kök örnekleri depolamak için avantajlı, hangi kökleri de-leke sağlar, sayma daha kolay hale.
Açıklanan protokol, deneyler arasında meydana gelecek çevresel varyasyonları azaltmak için daha büyük nüfus taramasına izin verir. Bir 900 m2 bitki büyüme odası otomatik sulama sistemi ile donatılmış kullanarak, 480 bireysel bitkiler nüfusu değerlendirilebilir. Protokol, 300 veya daha fazla kişiden oluşan nüfusunu değerlendirmek için dayanıklılık10,18' in genetiğini karakterize etmek için başarıyla kullanılmıştır. Bu nüfus, Nematot enfeksiyonu ve G'de direnç için niceliksel varyasyon gösterdi. arboreum daha sık birden fazla resessif genler ile ilişkili olabilir; Böylece genetik çalışmalar için daha büyük nüfus gereklidir. Ayrıca, niceliksel varyasyon, kullanılan protokol ne olursa olsun, Nematot enfeksiyonu yanıtını değerlendirmek için ayrılmış nüfus içinde görülür.
Pamuk ev sahibi-bitki direnci kök sistemi bulaştırmak ve bir beslenme sitesi kurmak nematod yeteneğini engelleyebilir, ama aynı zamanda nematod üreme yeteneğini etkileyebilir. Açıklanan tarama protokolü, pamuk kökü sisteminde bir beslenme sitesi kurabilen nematid sayısını değerlendirir. Yumurta üretimi ile ölçülen Nematode üreme Bu protokolde önemli bir sınırlama olarak değerlendirilmez. Yine de, bu tür veri toplamak için protokol değiştirilebilir. Alternatif olarak, diğer metodoloji dayanıklı genotürleri tespit edildikten sonra bu verileri toplamak için kullanılabilir, hangi bireylerin çok sayıda ekran ihtiyacını azaltır.
Bireysel genotiplerin nematod değerlendirmelerindeki veriler, R'nin değerlendirilmesi için kullanılan tüm tarama protokolleri ile ortak bir sorun olan ve deneyler arasında değişken olabilir. Pamuk genotipler için reniformis direnci. Germplazm erişimlerinin taranması için çoklu çoğaltmalar ile deneysel bir tasarımın kullanımı, bu varyasyonun dirençli genotiplerin tanımlanması için değerlendirilmesinde yardımcı olacaktır. Ayrıca, deneyler arasında aynı dirençli ve duyarlı kontrol genotip dahil olmak üzere bu varyasyon değerlendirilmesi ve birden fazla deneylerden sonuçları karşılaştırarak yararlıdır. Bu kontroller de nematod inoculation başarısını izlemek için kullanılır. Ayrıca, bu denetimlerden gelen veriler, genottiplerin dirençli veya duyarlı10,16olarak sınıflandırılması için kullanılır. Pamuk genotipler genellikle dirençli olarak sınıflandırılmıştır% 10 ' dan daha az gösteriyorsanız duyarlı kontrol üzerinde gözlenen enfeksiyon16,23. Kök büyüme, protokol kullanılarak veri gözlenen varyasyona katkıda başka bir faktördür, çünkü bitkiler daha az lateral kökleri olan bir musluk köküne sahiptir enfeksiyon için daha az site sunuyor, hangi kök gram başına daha az nematdes neden olabilir.
Direnç genler kaynağı olarak diğer pamuk türleri kullanarak yeni Upland pamuk çeşitleri geliştirme zorluk daha fazla seçim veya ek için bir sonraki nesilden üreme hatları ilerlemek için bir vejetatif yayılma Protokolü gerektirir ıslahı. Tarif edildiği gibi basit bir vejetatif yayılma Protokolü nematod değerlendirmesinden sonra bitkiler kurtarmak için geliştirilmiştir. Protokol başarıyla büyük nüfusu18bitkiler kurtarmak için kullanılmıştır. Genellikle, kök sistem vejetatif ateş dikildikten sonra 30 gün içinde kurtarılır. Hayatta kalma oranları sıklıkla% 95 ' den büyüktür. Çok sayıda bitki yayılırken kötü canlılık gösteren bitkiler kaybolabilir. Genel olarak, bitkilerin% 1 ' den az kök veya çekim büyüme göstermek için başarısız oldu. Protokol kolayca değiştirilebilir ve diğer nematod tarama protokolleri ile kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu araştırma ABD Tarım Bakanlığı, Tarımsal Araştırma hizmeti tarafından finanse edildi. Bu makaledeki ticari isimler ve ticaret ürünleri söz sadece belirli bilgi sağlamak amacıyla ve öneriler veya ABD Tarım Bakanlığı tarafından onayları anlamına gelmez. USDA bir eşit fırsat sağlayıcı ve işveren. Yazarların hiç bir ilgisi yok. Teknik yardım Kristi Jordan tarafından sağlandı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ray Leach Cone-tainer | Stuewe and Sons Inc. | SC10U | |
| Cone-tainer tray | Stuewe and Sons Inc. | RL98 | |
| Sand | various | ||
| Cotton balls | various | ||
| Pylon 4 inch plant labels (4 in L x 5/8 in W) | Pylon Platics | L-4-W | Any brand or vendor is acceptible. |
| 4 oz. specimen containers | Fisher Scientific | 16-320-731 | Any brand or vendor is acceptible. |
| Red food coloring | McCormick & Co., Inc. | ||
| 1 mL Pipet tips | various | ||
| 10 L container | various | Inexpensive buckets work well. | |
| 6 L pots | Nursery Supplies Inc. | Poly-Tainer-Can No2A | Any brand or vendor is acceptible. Different size pots can be used |
| Potting media | Sun Gro Horticulture | Metro-Mix 360 | Any brand or vendor is acceptible. |
| Fertilizer | Everris NA Inc. | Osmocote Plus | Any brand or vendor is acceptible. |
| Plastic container (73.6 cm L x 45.7 cm W x 15.2 cm D) | Rubbermaid | 3O29 | Any brand or vendor is acceptible. |
References
- Heald, C. M., Robinson, A. F. Survey of current distribution of Rotylenchulus reniformis. in the United States. Journal of Nematology. 22 (4), 695-699 (1990).
- Koenning, S. R., Wrather, J. A., Kirkpatrick, T. L., Walker, N. R., Starr, J. L., Mueller, J. D. Plant-parasitic nematodes attacking cotton in the United States: old and emerging production challenges. Plant Disease. 88 (2), 100-113 (2004).
- Robinson, A. F. Reniform in U.S. cotton: when, where, why, and some remedies. Annual Review of Phytopathology. 45, 263-288 (2007).
- Robinson, A. F., Inserra, R. N., Caswell-Chen, E. P., Vovlas, N., Troccoli, A. Rotylenchulus species: identification, distribution, host ranges, and crop plant resistance. Nematropica. 27 (2), 127-180 (1997).
- Davis, R. F., Koenning, S. R., Kemerait, R. C., Cummings, T. D., Hurley, W. D. Rotylenchulus reniformis management in cotton with crop rotation. Journal of Nematology. 35 (1), 58-64 (2003).
- Starr, J. L., Koenning, S. R., Kirkpatrick, T. L., Robinson, A. F., Roberts, P. A., Nichols, R. L. The future of nematode management in cotton. Journal of Nematology. 39 (4), 283-294 (2007).
- Weaver, D. B., Lawrence, K. S., van Santen, E. Reniform nematode resistance in upland cotton germplasm. Crop Science. 47 (1), 19-24 (2007).
- Robinson, A. F., Cook, C. G., Percival, A. E. Resistance to Rotylenchulus reniformis and Meloidogyne incognita race 3 in the major cotton cultivars planted since 1950. Crop Science. 39 (3), 850-858 (1999).
- Carter, W. W. Resistance and resistant reaction of Gossypium arboreum to the reniform nematode, Rotylenchulus reniformis. Journal of Nematology. 13 (3), 368-374 (1981).
- Erpelding, J. E., Stetina, S. R. Genetics of reniform nematode resistance in Gossypium arboreum germplasm line PI 529728. World Journal of Agricultural Research. 1 (4), 48-53 (2013).
- Robinson, A. F., Bridges, A. C., Percival, A. E. New sources of resistance to the reniform (Rotylenchulus reniformis) and root-knot (Meloidogyne incognita) nematode in upland (Gossypium hirsutum L.) and sea island (G. barbadense L.) cotton. Journal of Cotton Science. 8 (3), 191-197 (2004).
- Robinson, A. F., Percival, A. E. Resistance to Meloidogyne incognita race 3 and Rotylenchulus reniformis in wild accessions of Gossypium hirsutum and G. barbadense from Mexico. Journal of Nematology. 29 (4), 746-755 (1997).
- Stetina, S. R., Young, L. D. Comparisons of female and egg assays to identify Rotylenchulus reniformis resistance in cotton. Journal of Nematology. 38 (3), 326-332 (2006).
- Usery, S. R. Jr, Lawrence, K. S., Lawrence, G. W., Burmester, C. H. Evaluation of cotton cultivars for resistance and tolerance to Rotylenchulus reniformis. Nematropica. 35 (2), 121-133 (2005).
- Yik, C. -P., Birchfield, W. Resistant germplasm in Gossypium species and related plants to Rotylenchulus reniformis. Journal of Nematology. 16 (2), 146-153 (1984).
- Stetina, S. R., Erpelding, J. E. Gossypium arboreum accessions resistant to Rotylenchulus reniformis. Journal of Nematology. 48 (4), 223-230 (2016).
- Thies, J. A., Merrill, S. B., Corley, E. L. Red food coloring stain: new, safer procedures for staining nematodes in roots and egg masses on root surfaces. Journal of Nematology. 34 (2), 179-181 (2002).
- Erpelding, J. E., Stetina, S. R. Genetic characterization of reniform nematode resistance for Gossypium arboreum accession PI 417895. Plant Breeding. 137 (1), 81-88 (2018).
- Byrd, D. W. Jr, et al. Two semi-automatic elutriators for extracting nematodes and certain fungi from soil. Journal of Nematology. 8 (3), 206-212 (1976).
- Jenkins, W. R. A rapid centrifugal-flotation technique for separating nematodes from soil. Plant Disease Reporter. 48 (9), 692 (1964).
- Robinson, A. F., Heald, C. M. Carbon dioxide and temperature gradients in Baermann funnel extraction of Rotylenchulus reniformis. Journal of Nematology. 23 (1), 28-38 (1991).
- Williams, C., Gilman, D. F., Fontenot, D. S., Birchfield, W. A rapid technique for screening soybeans for reniform nematode resistance. Plant Disease Reporter. 63 (10), 827-829 (1979).
- Schmitt, D. P., Shannon, G. Differentiating soybean responses to Heterodera glycines races. Crop Science. 32 (1), 275-277 (1992).
