Summary
Her præsenteres en protokol for den hurtige ikke-destruktive screening af bomulds genotyper for reniform fyrretræsnematoden resistens. Protokollen indebærer visuelt at undersøge rødderne af nematode-inficerede bomuld frøplanter til at bestemme infektion respons. Den vegetativt shoot fra hver plante er derefter formeret til at inddrive planter til frøproduktion.
Abstract
En hurtig ikke-destruktiv reniform fyrretræsnematoden (rotylenchulus reniformis) screening protokol er nødvendig for udviklingen af resistente bomuld (Gossypium Dueurt) sorter til at forbedre fyrretræsnematoden forvaltning. De fleste protokoller omfatter udvinding af vermiform-nematoder eller æg fra bomuldsrodsystemet eller pottejord til bestemmelse af befolkningstæthed eller reproduktions hastighed. Disse tilgange er generelt tidskrævende med et lille antal genotyper evalueret. En alternativ fremgangsmåde er beskrevet her, hvor Rodsystemet er visuelt undersøgt for fyrretræsnematoden infektion. Protokollen involverer inokulerende bomuldsfrøning 7 dage efter plantning med vermiform nematoder og bestemme antallet af hunner fastgjort til rodsystemet 28 dage efter inokulation. Data udtrykkes som antallet af hunner pr. gram frisk rodvægt til justering for variation i rodvækst. Protokollen giver en glimrende metode til vurdering af Host-Plant resistens i forbindelse med fyrretræsnematoden evne til at etablere en infektion site; resistens, der hæmmer fyrretræsnematoden reproduktion, vurderes dog ikke. Som med andre screening protokoller, er variation almindeligvis observeret i fyrretræsnematoden infektion blandt individuelle genotyper inden for og mellem eksperimenter. Der fremlægges data til illustration af, hvor mange variationer der er observeret ved hjælp af protokollen. For at justere for denne variation, er kontrol genotyper inkluderet i eksperimenter. Ikke desto mindre, protokollen giver en enkel og hurtig metode til at evaluere Host-Plant modstand. Protokollen er blevet anvendt med succes til at identificere resistente tiltrædelser fra G. arboreum kimplasma indsamling og evaluere adskilte populationer af mere end 300 individer til at bestemme genetik af resistens. En vegetativ formering metode til at inddrive planter til resistens avl blev også udviklet. Efter fjernelse af rodsystemet til fyrretræsnematoden evaluering, er den vegetativt shoot genplantet for at tillade udvikling af et nyt rodsystem. Mere end 95% af skuddene typisk udvikle et nyt rodsystem med planter nå modenhed.
Introduction
Rotylenchulus reniformis (Linford og Oliveira), almindeligvis benævnt reniform fyrretræsnematoden, er en af de vigtigste parasitære fyrretræsnematoden arter, der findes i jord i det sydøstlige USA1,2,3. Fyrretræsnematoden er et obligat, stillesiddende semi-Endoparasite, der kræver en værtsplante for at fuldføre sin livscyklus2,4. Vermiform preadult Female kartoffelcystenematoder trænge ind i værts roden system til at etablere en fodring sted i stele2,3. Som fyrretræsnematoden feeds og modnes, vil den bageste del forbliver uden for værten roden svulme på ægproduktion, danner en karakteristisk nyre form (figur 1). Rotylenchulus reniformis er i stand til at fodre på rodsystemet af mere end 300 plantearter, herunder bomuld4. Upland bomuld (Gossypium Dueurt L.) er almindeligt dyrket i det sydøstlige USA, men manglen på R. reniformis resistente sorter hindrer fyrretræsnematoden Management2,3. Der er anvendt forvaltningsstrategier såsom nematicid behandling og rotation med ikke-værts afgrødearter til at reducere jord R. reniformis befolkning tætheder5,6, men frø bomuld afkast tab kan almindeligvis spænder fra 1 til 5%2. Symptomer på R. reniformis infektion kan omfatte plante bedøvelse, undertrykt rodvækst, ernæringsmæssige mangler, frugt abort, og forsinket modenhed2. Symptomerne kan dog ikke ses på grund af ensartetheden af symptomerne på tværs af marken; Derfor er tilgange til at vurdere R. reniformis infektion er nødvendig for at identificere og udvikle resistente Upland bomuld sorter. Evaluering af R. reniformis resistens i bomuld anses for svært7, fordi det inficerede rodsystem kan synes normal, selvom planten kan vise symptomer på infektion8.
Der kræves en effektiv fyrretræsnematoden screening protokol til identifikation af R. reniformis resistente tiltrædelser fra bomuld kimplasma kollektion, og til bestemmelse af resistens genetik for disse tiltrædelser. En sådan protokol vil hjælpe med overførsel af resistensgener til Upland bomuld. Forskellige bioassay metoder er blevet anvendt til at vurdere R. reniformis infektion i bomuld8,9,10,11,12,13,14,15. Generelt er der anvendt to hoved tilgange til identifikation af R. reniformis resistente bomulds genotyper. Den hyppigst anvendte fremgangsmåde omfatter udvinding af æg og/eller vermiform-nematoder fra inficerede planter eller jord8,11,12,14,15. Den generelle metode til denne fremgangsmåde indebærer plantning af frø til de enkelte bomulds genotyper i separate Potter, så frøplanterne kan udvikle sig i 7 til 14 dage, inokulere frøplanterne ved at tilføje en blanding af vermiform stadier af R. reniformis til jorden, og giver kartoffelcystenematoder at inficere rodsystemet for 30 til 60 dage. Næste, vermiform kartoffelcystenematoder og/eller æg udvindes fra det inficerede rodsystem af hver plante eller fra pottejord. Antallet af ekstraherede nematoder eller æg bestemmes derefter for at anslå befolkningstætheden og reproduktionshastigheden, som sammenlignes med kontrol genotyper for at identificere resistente genotyper.
En alternativ tilgang, som beskrevet her, involverer mikroskopisk undersøgelse af bomuldsrodsystemet, der er blevet inficeret med nematoder for at bestemme antallet af kvindelige nematoder parasitiserende rødderne10,16. På samme måde som andre tilgange, er bomulds genotyper plantet i separate Potter og podet med vermiform kartoffelcystenematoder ca. 7 dage efter plantning. Inden for 30 dage efter inokulering fjernes rodsystemet fra de enkelte planter, og jorden skylles fra rødderne. Næste, kartoffelcystenematoder knyttet til Rodsystemet er plettet med rød mad farvelægning17, og rødder er mikroskopisk undersøgt for at bestemme antallet af infektions steder med resistente bomuld genotyper (identificeret baseret på antallet af nematoder per gram af roden) sammenlignet med en modtagelig kontrol16. Denne anden tilgang har fordelen af øget gennemløb ved at reducere antallet af dage, der kræves til evaluering, og øge antallet af individuelle genotyper evalueret i et enkelt eksperiment. Screeningsmetoder, der evaluerer befolkningstæthed eller reproduktions hastighed, er ofte mere tidskrævende end dem, som er baseret på visuelle observationer af infektions tegn7. En begrænsning af denne fremgangsmåde er imidlertid, at Host-Plant resistens, der hindrer fyrretræsnematoden reproduktion som bestemt ved ægproduktion, ikke vurderes13.
Screening protokoller for R. reniformis resistens ødelægger ofte rodsystemet under evaluering7 og involverer den vegetativt shoot, der kasseres. For at overvinde denne begrænsning er der udviklet en metode til vegetativ formering for at muliggøre genvinding af planter til frøproduktion18. Efter fjernelse af rodsystemet til fyrretræsnematoden evaluering, er den vegetativt shoot plantet i pottejord for at tillade rodsystemet at regrow. Denne metode har brede applikationer for de fleste R. reniformis screening protokoller. En enkel og hurtig metode til vegetativ formering er af afgørende betydning for avl R. reniformis resistente Upland Cotton-sorter, hvor genfinding af afkom er påkrævet for at fremme resistente genotyper til den næste generation.
En protokol er præsenteret for storstilet screening af bomuld genotyper for reniform fyrretræsnematoden resistens. Målet er at udvikle en enkel og hurtig ikke-destruktiv screeningmetode til at evaluere bomuld avlspopulationer for fyrretræsnematoden resistens for at støtte i avl af resistente Upland bomuld sorter. Ved hjælp af denne protokol, data er typisk opnået inden for 35 dage, med mere end 300 genotyper evalueret i et enkelt eksperiment. Data præsenteres for resistente og modtagelige genotyper for at illustrere den variation, der almindeligvis observeres ved hjælp af disse metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. opretholdelse af en kilde til R. reniformis Inokulum
- Fyld Terra Cotta ler potter (15 cm i diameter, 13,5 cm i højden) med en damp pasteuriseret blanding af 1-del sandede loam og 2-dele sand. Plant en modtagelig tomat (Solanum Lycopersicon) sort i hver gryde og placere Potter i et Glashuset.
Bemærk: andre modtagelige plantesorter såsom bomuld kan anvendes i stedet for tomat. - Der inokulerer tomat planterne med vermiform-reniform-nematoder (Se trin 3,3). Planterne i Glashuset holdes ved en temperatur på ca. 28 °C.
2. plantning bomuld genotyper for R. reniformis Vurdering af resistens
- Forbered jord ved at kombinere 2-dele fint sand med 1-del Sandy loam indsamlet fra marken.
- Damp pasteuriserer jord blandingen for at sikre, at jorden er fri for nematoder og jordbårne plante patogener.
- Tilsæt jord blandingen til koniske plastik Potter (4 cm i diameter, 21 cm i højden). Før påfyldning af Potter, placere en kugle af bomuld i bunden af gryden for at forhindre tab af jord. Delvist fylde Potter med jord ca. 2 cm fra toppen.
- Forbered en plastik stav for hver gryde for at udpege den genotype, der skal plantes.
- Plantefrø af de bomulds genotyper, som udvælges til evaluering.
- Plant et enkelt frø i hver gryde til vurdering af adskilte populationer, hvor hvert frø repræsenterer en unik genotype.
- For bomuld sorter eller kimplasma tiltrædelser, plante 2 til 3 frø i en enkelt gryde til at forsikre spiring af mindst én plante med de andre frøplanter fjernet fra Potter før fyrretræsnematoden inokulation.
Bemærk: Alternativt kan frø spiret for 24 til 72 h før plantning for at minimere antallet af Potter med ikke-levedygtige frø.
- Plantefrø af udvalgte resistente og modtagelige kontrol genotyper.
Bemærk: kontrol genotyper replikeres 5 til 10 gange for at vurdere de naturlige variationer, der er forbundet med screeningsmetoden. - Fyld Potter med ekstra jord til at dække frø i hver gryde.
- Placer Potter i vækst kammeret. Opretholde en konstant temperatur på 28 °C, en omgivende lufttemperatur, for vækst kammeret. Give kunstig belysning med en blanding af fluorescerende og glødelamper med en 16 h fotoperiode.
- Placer vand udledere i hver gryde, og vand potterne to gange om dagen ved hjælp af et automatisk vandingssystem. Juster vandingssystemet til at levere ekstra vand, som planten vokser.
3. nematode inokulering af Bomuldsplanter og forberedelse af rodprøver
- Ekstrakt vermiform reniform kartoffelcystenematoder vedligeholdt på modtagelige tomatplanter (Se trin 1) ved hjælp af elutriation19 og centrifugal flotation20 metoder dagen før inokulation. De ekstraherede nematoder opbevares ved 4 °C.
Bemærk: Baermann tragt ekstraktion21 er en alternativ metode til fyrretræsnematoden ekstraktion. - Antallet af nematoder, der ekstraheres, bestemmes ved at tælle antallet af nematoder i en 100 μL delprøve og forberede en suspension på 1.000 nematoder/mL i vand fra hanen til inokulationer.
- Inokulere bomulds frøplanter 7 d efter plantning med fyrretræsnematoden suspension. Lav en lille depression i jorden ved siden af planten, og afpipettér 1 mL af reniform-fyrretræsnematoden suspensionen i depressionen.
- Fjern planter fra potterne 28 d efter inokulation til fyrretræsnematoden evaluering.
Bemærk: på dette stadium er planterne ca. 15 cm høje med 4 til 6 fuldt ekspanderede blade.- Fjern de fleste af de fuldt ekspanderede blade fra planterne ved hjælp af en saks, før planterne fjernes fra Potter.
- For at fjerne planter fra Potter, klem gryden og skub jorden ud i hånden.
- Fjern forsigtigt jorden fra rødderne ved at agitere rodsystemet i ledningsvand i en 10 L container. Skyl rodsystemet kortvarigt i en beholder med rent ledningsvand.
- Fjern rodsystemet fra planten ca. 1 cm under jord linjen ved hjælp af en saks.
- Placer rodsystemet i en 120 mL plast, ikke-steril, engangs objektbeholder sammen med plastik staven fra gryden, der bruges til identifikation.
Bemærk: flere prøver behandles, før du fortsætter til trin 3,7. Fortsæt til trin 4 for vegetativ formering af planten skyde. - Forbered en 12,5% (v/v) opløsning af rød mad farve17 i ledningsvand for at plette Nematoderne, der er fastgjort til rodsystemet.
- Tilsæt ca. 30 mL af den røde madfarve opløsning til rodprøven i objektbeholderen for helt at dække rodsystemet.
- Anbring objektbeholderen i en mikrobølgeovn, og Opvarm rodprøven, indtil Farvningsopløsningen begynder at koge. Fjern prøven fra mikrobølgeovnen, og lad prøven køle af ved stuetemperatur.
- Decant den røde madfarve opløsning fra roden prøven og tilsæt ca. 100 mL ledningsvand til objektbeholderen for at fjerne overskydende bejdsning. Anbring dækslet på objektbeholderen, og opbevar prøven i køleskab ved 4 °C. Fortsæt til trin 5 for evaluering af root infektion.
Bemærk: protokollen kan sættes på pause her, før du fortsætter til trin 5.
4. vegetativ formering til at inddrive planter til frøproduktion
- Placer en kugle af bomuld i bunden af en konisk plastik gryde (Se trin 2,3) og fyld delvist gryden med Tørve mos potte medier. Derefter placere den vegetativt skyde i puljen og fast tilføje indstøbning medier til at fylde puljen. Placer en ny mærket plastik stav i hver gryde for at betegne bomulds genotypen.
- Placer bakken af Potter i en plastikbeholder (73,6 cm længde x 45,7 cm bredde x 15,2 cm højde) med vand og kort vand planterne til at fugte indstøbning medierne. Potterne placeres i et vækstkammer med en konstant temperatur på 28 °C ved brug af en 16 h-fotoperiode. Tilsæt ekstra vand til plastikbeholderen efter behov for at opretholde jordens fugt.
- Transplantation planterne til større Potter til frøproduktion efter ca. 30 d. delvist fylde en 6 l plastik gryde med indstøbning medier (Se trin 4,1), fjerne planten fra den lille gryde, placere planten i 6 l pot, og fast tilføje indstøbning medier til at fylde puljen.
- Placer planterne i et drivhus og tilsæt vand for at fugte de potte ende medier. Bevar temperaturen i Glashuset ved ca. 28 °C (kunstig belysning er ikke påkrævet).
- Vandplanter i hånden efter behov i ca. 30 d.
- Når ca 75% af planterne kræver daglig vanding, vandplanter dagligt ved hjælp af en automatisk vanding system. Juster det automatiske vandingssystem til vand oftere efter behov for plantevækst.
- Tilsæt ca. 10 g af en langsom-Release gødning til hver gryde før starten af blomster initiering.
- Høst planter ved udløb og forarbejde bomuldsfrøprøverne for at opnå frø til yderligere vurdering.
- For at høste bomuldsfrø skal du fjerne bomulden fra de åbne bolte på planten i hånden og placere den i en etiket papirpose. Frøene er fastgjort til bomuld fibre, som er fjernet i de følgende trin.
- Fjern fnug fibrene fra frøprøverne ved hjælp af en 10-savs laboratorie gin.
- Fjern fuzz-fibrene fra frøprøverne ved hjælp af koncentreret svovlsyre. Neutraliserer frøprøverne i en 15% (v/v) opløsning af natriumcarbonat, skyl prøverne med ledningsvand, og tør prøverne i en tvungen luft tørrere.
- Læg frøprøverne i mærkede konvolutter til opbevaring.
5. evaluering af R. reniformis Root infektion
- Fjern rodprøven fra objektbeholderen, og Tæl antallet af kvindelige nematoder, der er fastgjort til rodsystemet, ved hjælp af et stereomicroskop (20X forstørrelse).
Bemærk: kun kvindelige reniform-nematoder kan inficere planterødder. - Placer rodsystemet på papirhåndklæder i ca. 10 minutter for at fjerne overskydende fugt. Veje rodsystemet til at bestemme den friske rod vægt.
- Indtast fyrretræsnematoden tælle og friske rod vægtdata i en computer regneark program og beregne antallet af hunner per gram rod.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rotylenchulus reniformis infektion af rodsystemet for to sorter er præsenteret i figur 1. Relativt færre kvindelige reniform-nematoder er i stand til at etablere et fodrings sted for den resistente bomulds genotype sammenlignet med den følsomme genotype. Variation i rodvæksten er almindelig mellem tiltrædelserne, som illustreret i figur 2. Denne variation målt ved frisk rodvægt kan også observeres mellem planter af samme genotype (tabel 1). Gossypium arboreum genotyper viser ofte lavere rodvækst rater end Upland-bomulds genotyper. For at kompensere for denne variation indsamles der data om friske rodvægte, som anvendes til at beregne antallet af kvindelige reniform-fyrretræsnematoden pr. gram rodvæv for hver genotype. Antallet af kvindelige reniform-nematoder pr. gram rod for resistente genotyper er generelt mindre end 10, hvorimod følsomme genotyper typisk har mere end 30 nematoder pr. gram rod.
En udfordring for screening af bomulds genotyper for R. reniformis resistens er den potentielle variation, der kan forekomme inden for og mellem eksperimenter. For at evaluere og justere for denne variation, er resistente og modtagelige bomulds genotyper inkluderet som kontrol og replikeres i hvert eksperiment. Tabel 1 præsenterer data for to genotyper, der anvendes som kontrol i to separate eksperimenter ved hjælp af den ovenfor beskrevne protokol. Geno typerne blev replikeret 10 gange og inokuleret 7 dage efter plantning med 1.000 vermiform nematoder, derefter blev rodsystemer høstet 28 dage efter inokulering for at tælle nematoder knyttet til rødderne. Da forsøgene blev gennemført på forskellige tidspunkter, var kilden til de nematoder, der blev anvendt til vaccinationer, anderledes. ellers var alle andre parametre ens. Disse data illustrerer den variation, der kan observeres i reniform fyrretræsnematoden evalueringer. Antallet af kvindelige nematoder og rodvægte var højere i eksperiment 1 for de to Kontroller sammenlignet med eksperiment 2, hvilket resulterede i et højere antal hunner pr. gram rod for eksperiment 1. Da kvinde tællinger var betydeligt højere for eksperiment 1, var stigningen i rodvægten ikke lavere end antallet af hunner pr. gram rod til de observerede niveauer for eksperiment 2. En betydelig variation mellem replikationer af individuelle genotyper blev også observeret. Men den resistente G. arboreum genotype pi 615699 viste hyppigt betydeligt lavere kvindelig tælling og lavere antal hunner pr. gram rod end den modtagelige G. Dueurt genotype pi 529251. Geno typerne kan let klassificeres som resistente eller modtagelige, når disse midler anvendes til sammenligning. Genotyper klassificeres som resistente, når antallet af hundyr pr. gram rod er ca. 10% af den modtagelige kontrol.
En delmængde af data fra en separat F2 -population, der blev evalueret ved hjælp af protokollen, vises i tabel 2. Populationen omfattede 300 F2 planter, og data for 50 anlæg, der repræsenterer intervallet i variation er præsenteret. For populationen af 300-planter varierede antallet af observerede nematoder, der inficerer rodsystemerne, fra 0 til 50 med et gennemsnit på 9,4. Rodvægten varierede fra 0,01-1.22 g, med et gennemsnit på 0,38 g. kvindelige nematoder pr. gram rod varierede fra 0-400, med et gennemsnit på 33,6. Forældrene blev gentaget i evalueringen. Den resistente forælder (PI 417895) viste et gennemsnit på 5,8 hunner pr. gram rod, med en gennemsnitlig rodvægt på 0,8 g; i modsætning hertil viste den modtagelige forælder (PI 529729) et gennemsnit på 40,8 hunner pr. gram rod, med en gennemsnitlig rodvægt på 0,35 g. tyve planter viste ingen fyrretræsnematoden infektion og blev klassificeret som resistente, men dette kan repræsentere undslipper. Både disse planter og planter med dårlig rodvækst er typisk fjernet fra dataanalyse. Dette interval i variation for rodvækst og fyrretræsnematoden infektion af rodsystemer er almindeligt observeret for fyrretræsnematoden evalueringer; således kan evnen til at screene et stort antal planter i et enkelt eksperiment minimere denne variation og give mulighed for præcist at vurdere genetik af resistens. Populationen viste kvantitativ variation for fyrretræsnematoden infektion, og planterne blev klassificeret som resistente baseret på data fra den modtagelige forælder, hvilket tydede på, at modstanden blev overdraget af to recessiv gener for denne population. Desuden blev den vegetativt formering protokol beskrevet ovenfor med succes brugt til at inddrive planter fra denne population. Klassificeringen af F3 -afkom afledt af individuelle f2 -anlæg svarede ofte til klassificeringen af f2 -anlægget.
Figur 1: rotylenchulus reniformis inficerede rodprøver. Rodprøven fra en resistent bomulds genotype (nederst til venstre) viser en enkelt kvindelig fyrretræsnematoden, der er fastgjort til roden, mens den modtagelige genotype (øverst til højre) viser flere kvinder knyttet til roden. Den sorte bjælke repræsenterer en 0,1 mm skala. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Variation observeret i rodvækst for to bomulds genotyper. Roden systemer til to reniform fyrretræsnematoden resistente G. arboreum tiltrædelser præsenteres for at illustrere den variation, der kan observeres for rodvækst. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1: variation observeret i reniform fyrretræsnematoden infektion respons for to bomulds genotyper inkluderet som kontrol. Disse data illustrerer den variation, der kan forekomme inden for og mellem eksperimenter for den modtagelige g. hirsutum genotype pi 529251 og resistente g. arboreum genotype pi 615699; data midlerne var imidlertid signifikant forskellige, så Geno typerne let kunne klassificeres som resistente eller modtagelige.
| Genotype betegnelse | Kvinder | Rodvægt (g) | Hunner/g rod | Klassificering |
| 88 | 0 | 0,67 | 0,0 | Resistente |
| 156 | 0 | 0,10 | 0,0 | Resistente |
| 75 | 2 | 1,05 | 1,9 | Resistente |
| 298 | 2 | 0,58 | 3,4 | Resistente |
| 259 | 3 | 0,77 | 3,9 | Resistente |
| 208 | 1 | 0,21 | 4,8 | Resistente |
| 322 | 4 | 0,82 | 4,9 | Resistente |
| 189 | 2 | 0,35 | 5,7 | Resistente |
| 147 | 6 | 0,94 | 6,4 | Resistente |
| 267 | 2 | 0,18 | 11,1 | Moderat resistente |
| 198 | 5 | 0,43 | 11,6 | Moderat resistente |
| 251 | 2 | 0,17 | 11,8 | Moderat resistente |
| 95 | 6 | 0,46 | 13,0 | Moderat resistente |
| 248 | 3 | 0,23 | 13,0 | Moderat resistente |
| 79 | 11 | 0,84 | 13,1 | Moderat resistente |
| 340 | 4 | 0,29 | 13,8 | Moderat resistente |
| 114 | 9 | 0,64 | 14,1 | Moderat resistente |
| 168 | 6 | 0,40 | 15,0 | Moderat resistente |
| 117 | 7 | 0,44 | 15,9 | Moderat resistente |
| 77 | 10 | 0,57 | 17,5 | Moderat resistente |
| 277 | 9 | 0,44 | 20,5 | Moderat resistente |
| 47 | 8 | 0,34 | 23,5 | Moderat modtagelig |
| 96 | 20 | 0,85 | 23,5 | Moderat modtagelig |
| 139 | 15 | 0,60 | 25,0 | Moderat modtagelig |
| 253 | 2 | 0,08 | 25,0 | Moderat modtagelig |
| 247 | 15 | 0,53 | 28,3 | Moderat modtagelig |
| 308 | 8 | 0,28 | 28,6 | Moderat modtagelig |
| 152 | 9 | 0,31 | 29,0 | Moderat modtagelig |
| 123 | 8 | 0,26 | 30,8 | Moderat modtagelig |
| 296 | 18 | 0,58 | 31,0 | Moderat modtagelig |
| 138 | 10 | 0,31 | 32,3 | Moderat modtagelig |
| 151 | 5 | 0,15 | 33,3 | Moderat modtagelig |
| 102 | 31 | 0,77 | 40,3 | Moderat modtagelig |
| 67 | 5 | 0,12 | 41,7 | Modtagelige |
| 51 | 18 | 0,43 | 41,9 | Modtagelige |
| 311 | 21 | 0,48 | 43,8 | Modtagelige |
| 334 | 4 | 0,09 | 44,4 | Modtagelige |
| 266 | 33 | 0,74 | 44,6 | Modtagelige |
| 260 | 7 | 0,14 | 50,0 | Modtagelige |
| 49 | 16 | 0,32 | 50,0 | Modtagelige |
| 149 | 20 | 0,39 | 51,3 | Modtagelige |
| 104 | 22 | 0,34 | 64,7 | Modtagelige |
| 238 | 39 | 0,57 | 68,4 | Modtagelige |
| 144 | 24 | 0,33 | 72,7 | Modtagelige |
| 225 | 24 | 0,30 | 80,0 | Modtagelige |
| 87 | 38 | 0,43 | 88,4 | Modtagelige |
| 126 | 50 | 0,51 | 98,0 | Modtagelige |
| 272 | 3 | 0,03 | 100,0 | Modtagelige |
| 154 | 24 | 0,12 | 200,0 | Modtagelige |
| 286 | 3 | 0,01 | 300,0 | Modtagelige |
Tabel 2: Reniform fyrretræsnematoden-infektions respons observeret i en delmængde af 50 genotyper fra en G. arboreum F2 population. Disse data illustrerer det Variations interval, der kan observeres for at adskille populationer. Rodvægte, fyrretræsnematoden tællinger og antal hunner pr. gram rod er præsenteret for hver genotype, med planter klassificeret som resistente, moderat resistente, moderat modtagelig, eller modtagelig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der kræves en effektiv screening protokol for 1) identifikation af R. reniformis resistente bomuld genotyper for at evaluere genetik af resistens og 2) avl af resistente sorter. De fleste protokoller vurderer R. reniformis befolkningstæthed eller reproduktionsrater ved ekstraktion af vermiformematoder eller æg fra bomuldsrodsystemet eller pottejord8,11,12,14,15 . Disse tilgange er ofte mere tidskrævende, og resultaterne har tendens til at være mere varierede inden for og mellem eksperimenter. Desuden kan bomuldsgeno typer oftere blive forkert klassificeret i ikke-replikerede væksthus eksperimenter ved hjælp af disse protokoller11. Ikke desto mindre kan der opnås lignende resultater for de forskellige protokoller eller parametre evalueret9,13.
Der fremlægges en alternativ Screenings protokol, hvor screening af bomulds genotyper foretages ved at vurdere antallet af kvindelige reniform-nematoder, der parasitiserende rodsystemet. Resistente og følsomme bomulds genotyper kan i første omgang vise et lignende antal kvindelige nematoder, der trænger ind i rodsystemerne inden for 16 timer efter inokulering, men inden for 36 timer begynder resistente genotyper at vise signifikant færre tilknyttede udvikling af nematoder og fyrretræsnematoden hæmmes9. Således, denne screening protokol giver en mere direkte måling af fyrretræsnematoden infektion af bomuld rodsystemet i forhold til protokoller, der er afhængige af udvinding af nematoder eller æg fra rodsystemet eller pottejord. Metoden til bomuldsfrøning inokulation med vermiform kartoffelcystenematoder er den samme blandt de tilgange. Inokulationer udføres typisk 7 til 14 dage efter plantning, men timingen af inokulering er mindre kritisk, da frø også kan være direkte plantet i reniform nematode-angrebne jord. Inokulationer udføres ved hjælp af 1.000 vermiform nematoder, men protokollen kan ændres for at øge eller mindske det antal, der anvendes til inokulering, eller to vaccinationer kan udføres på 7 og 14 dage efter plantning for at sikre tilstrækkelige kvindelige nematoder er til stede for rodinfektion. I sojabønner havde antallet af nematoder, der blev anvendt til inokulering, ingen signifikant indvirkning på ægmasse klassificeringer 21 dage efter plantning; selv om højere ratings typisk blev observeret ved den højere fyrretræsnematoden befolkningstæthed22. Protokollen kan optimeres til at bestemme den mindste fyrretræsnematoden tæthed for inokulation.
Nematode infektion i rodsystemet vurderes 28 dage efter inokulation for denne protokol, hvilket er normalt tidligere end i andre protokoller. Dette er et kritisk skridt i protokollen, da vurderingerne udføres før ægluge. En betydelig forsinkelse i høst af rodprøver kan resultere i en anden runde af infektion. Denne tidligere evaluering har imidlertid den fordel, at den øger gennemstrømningen. For den forelagte protokol, er bomulds genotyper plantet i en blanding af sand og jord, som er afgørende for den enkle og hurtige fjernelse af rodsystemet fra puljen. Brugen af en automatisk vanding system er afgørende, når du bruger små potter med en sand og jordblanding for at forhindre Potter fra udtørring. Rød mad farve bruges til at plette kartoffelcystenematoder fastgjort til rodsystemet, som er en enkel og sikker metode17. Når rodsystemerne er plettet, kan de opbevares i ledningsvand ved 4 °C, før de tæller antallet af nematoder, der er fastgjort til rodsystemet; et større antal af bomulds genotyper kan således evalueres i et enkelt eksperiment, fordi der ikke er behov for yderligere behandling af prøverne forud for vurderingen af antallet af fyrretræsnematoden. Også, det er fordelagtigt at opbevare roden prøver i vand fra hanen i flere dage, som tillader rødder at de-plette, hvilket gør optællingen lettere.
Den beskrevne protokol gør det muligt at screene større populationer for at mindske den miljømæssige variation, der vil opstå mellem forsøgene. Ved hjælp af en 900 m2 plantevækst kammer udstyret med en automatisk vanding system, populationer af 480 individuelle planter kan evalueres. Protokollen er blevet anvendt med succes til at evaluere adskilte populationer af 300 eller flere individer til at karakterisere genetik af resistens10,18. Disse populationer viste, at kvantitative variationer for fyrretræsnematoden infektion og resistens i G. arboreum kan oftere forbindes med flere recessive gener; Derfor er større populationer er nødvendige for genetiske undersøgelser. Derudover observeres der kvantitative variationer i adskilte populationer, uanset hvilken protokol der anvendes, for at evaluere respons på fyrretræsnematoden infektion.
Host-Plant resistens i bomuld kan hæmme fyrretræsnematoden evne til at inficere rodsystemet og etablere en fodring site, men det kan også påvirke den reproduktive evne af fyrretræsnematoden. Den beskrevne Screenings protokol evaluerer antallet af nematoder, der er i stand til at etablere et fodrings sted på bomulds rodsystemet. Nematode reproduktion som målt ved ægproduktion blev ikke vurderet i denne protokol, hvilket er en vigtig begrænsning. Ikke desto mindre kan protokollen ændres til at indsamle denne type data. Alternativt kan andre metoder bruges til at indsamle disse data efter resistente genotyper er blevet identificeret, hvilket reducerer behovet for at screene et stort antal individer.
Data fra fyrretræsnematoden evalueringer af individuelle genotyper kan være variable inden for og mellem eksperimenter, hvilket er et almindeligt problem med alle Screenings protokoller, der anvendes til at vurdere R. reniformis resistens over for bomulds genotyper. Brugen af et eksperimentelt design med flere replikationer til screening af kimplasma-tiltrædelser vil hjælpe med at vurdere denne variation til identifikation af resistente genotyper. Derudover, herunder de samme resistente og modtagelige kontrol genotyper mellem eksperimenter er nyttigt i vurderingen af denne variation og sammenligne resultater fra flere eksperimenter. Disse kontroller anvendes også til at overvåge, om fyrretræsnematoden inokulation lykkes. Derudover anvendes data midler fra disse kontroller til at klassificere genotyper som resistente eller modtagelige10,16. Bomulds genotyper klassificeres typisk som resistente, hvis de viser mindre end 10% af infektionen observeret på den modtagelige kontrol16,23. Root vækst er en anden faktor, der bidrager til variationen observeret i data ved hjælp af protokollen, fordi planter med en Tap rod med færre laterale rødder tilbyde mindre steder for infektion, hvilket kan resultere i færre kartoffelcystenematoder per gram rod.
Vanskelighederne ved at udvikle nye Upland-bomuldssorter, der anvender andre bomulds arter som en kilde til resistensgener, kræver en vegetativ formerings protokol for at fremme avls linjerne til næste generation for yderligere udvælgelse eller yderligere Avl. En simpel vegetativ formering protokol som beskrevet blev udviklet til at inddrive planter efter fyrretræsnematoden evaluering. Protokollen er blevet anvendt med succes til at inddrive planter fra store populationer18. Typisk, Rodsystemet er genoprettet inden for 30 dage efter den vegetativt skyde er plantet. Overlevelsesraten er ofte større end 95%. Planter, der viser dårlig kraft, kan gå tabt, når de formerings et stort antal planter. I almindelighed, mindre end 1% af planterne undladt at vise rod eller skyde vækst. Protokollen kan nemt ændres og bruges sammen med andre fyrretræsnematoden screening protokoller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne forskning blev finansieret af Usa's ministerium for landbrug, landbrugsforskning service. Omtale af handelsnavne og kommercielle produkter i denne artikel er udelukkende med henblik på at give specifikke oplysninger og ikke indebærer anbefalinger eller påtegninger af det amerikanske landbrugsministerium. USDA er en udbyder af lige muligheder og arbejdsgiver. Forfatterne har ingen interessekonflikt at erklære. Der blev ydet teknisk bistand af Kristi Jordan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ray Leach Cone-tainer | Stuewe and Sons Inc. | SC10U | |
| Cone-tainer tray | Stuewe and Sons Inc. | RL98 | |
| Sand | various | ||
| Cotton balls | various | ||
| Pylon 4 inch plant labels (4 in L x 5/8 in W) | Pylon Platics | L-4-W | Any brand or vendor is acceptible. |
| 4 oz. specimen containers | Fisher Scientific | 16-320-731 | Any brand or vendor is acceptible. |
| Red food coloring | McCormick & Co., Inc. | ||
| 1 mL Pipet tips | various | ||
| 10 L container | various | Inexpensive buckets work well. | |
| 6 L pots | Nursery Supplies Inc. | Poly-Tainer-Can No2A | Any brand or vendor is acceptible. Different size pots can be used |
| Potting media | Sun Gro Horticulture | Metro-Mix 360 | Any brand or vendor is acceptible. |
| Fertilizer | Everris NA Inc. | Osmocote Plus | Any brand or vendor is acceptible. |
| Plastic container (73.6 cm L x 45.7 cm W x 15.2 cm D) | Rubbermaid | 3O29 | Any brand or vendor is acceptible. |
References
- Heald, C. M., Robinson, A. F. Survey of current distribution of Rotylenchulus reniformis. in the United States. Journal of Nematology. 22 (4), 695-699 (1990).
- Koenning, S. R., Wrather, J. A., Kirkpatrick, T. L., Walker, N. R., Starr, J. L., Mueller, J. D. Plant-parasitic nematodes attacking cotton in the United States: old and emerging production challenges. Plant Disease. 88 (2), 100-113 (2004).
- Robinson, A. F. Reniform in U.S. cotton: when, where, why, and some remedies. Annual Review of Phytopathology. 45, 263-288 (2007).
- Robinson, A. F., Inserra, R. N., Caswell-Chen, E. P., Vovlas, N., Troccoli, A. Rotylenchulus species: identification, distribution, host ranges, and crop plant resistance. Nematropica. 27 (2), 127-180 (1997).
- Davis, R. F., Koenning, S. R., Kemerait, R. C., Cummings, T. D., Hurley, W. D. Rotylenchulus reniformis management in cotton with crop rotation. Journal of Nematology. 35 (1), 58-64 (2003).
- Starr, J. L., Koenning, S. R., Kirkpatrick, T. L., Robinson, A. F., Roberts, P. A., Nichols, R. L. The future of nematode management in cotton. Journal of Nematology. 39 (4), 283-294 (2007).
- Weaver, D. B., Lawrence, K. S., van Santen, E. Reniform nematode resistance in upland cotton germplasm. Crop Science. 47 (1), 19-24 (2007).
- Robinson, A. F., Cook, C. G., Percival, A. E. Resistance to Rotylenchulus reniformis and Meloidogyne incognita race 3 in the major cotton cultivars planted since 1950. Crop Science. 39 (3), 850-858 (1999).
- Carter, W. W. Resistance and resistant reaction of Gossypium arboreum to the reniform nematode, Rotylenchulus reniformis. Journal of Nematology. 13 (3), 368-374 (1981).
- Erpelding, J. E., Stetina, S. R. Genetics of reniform nematode resistance in Gossypium arboreum germplasm line PI 529728. World Journal of Agricultural Research. 1 (4), 48-53 (2013).
- Robinson, A. F., Bridges, A. C., Percival, A. E. New sources of resistance to the reniform (Rotylenchulus reniformis) and root-knot (Meloidogyne incognita) nematode in upland (Gossypium hirsutum L.) and sea island (G. barbadense L.) cotton. Journal of Cotton Science. 8 (3), 191-197 (2004).
- Robinson, A. F., Percival, A. E. Resistance to Meloidogyne incognita race 3 and Rotylenchulus reniformis in wild accessions of Gossypium hirsutum and G. barbadense from Mexico. Journal of Nematology. 29 (4), 746-755 (1997).
- Stetina, S. R., Young, L. D. Comparisons of female and egg assays to identify Rotylenchulus reniformis resistance in cotton. Journal of Nematology. 38 (3), 326-332 (2006).
- Usery, S. R. Jr, Lawrence, K. S., Lawrence, G. W., Burmester, C. H. Evaluation of cotton cultivars for resistance and tolerance to Rotylenchulus reniformis. Nematropica. 35 (2), 121-133 (2005).
- Yik, C. -P., Birchfield, W. Resistant germplasm in Gossypium species and related plants to Rotylenchulus reniformis. Journal of Nematology. 16 (2), 146-153 (1984).
- Stetina, S. R., Erpelding, J. E. Gossypium arboreum accessions resistant to Rotylenchulus reniformis. Journal of Nematology. 48 (4), 223-230 (2016).
- Thies, J. A., Merrill, S. B., Corley, E. L. Red food coloring stain: new, safer procedures for staining nematodes in roots and egg masses on root surfaces. Journal of Nematology. 34 (2), 179-181 (2002).
- Erpelding, J. E., Stetina, S. R. Genetic characterization of reniform nematode resistance for Gossypium arboreum accession PI 417895. Plant Breeding. 137 (1), 81-88 (2018).
- Byrd, D. W. Jr, et al. Two semi-automatic elutriators for extracting nematodes and certain fungi from soil. Journal of Nematology. 8 (3), 206-212 (1976).
- Jenkins, W. R. A rapid centrifugal-flotation technique for separating nematodes from soil. Plant Disease Reporter. 48 (9), 692 (1964).
- Robinson, A. F., Heald, C. M. Carbon dioxide and temperature gradients in Baermann funnel extraction of Rotylenchulus reniformis. Journal of Nematology. 23 (1), 28-38 (1991).
- Williams, C., Gilman, D. F., Fontenot, D. S., Birchfield, W. A rapid technique for screening soybeans for reniform nematode resistance. Plant Disease Reporter. 63 (10), 827-829 (1979).
- Schmitt, D. P., Shannon, G. Differentiating soybean responses to Heterodera glycines races. Crop Science. 32 (1), 275-277 (1992).
