Summary
Her presenteres en protokoll for den raske ikke-destruktive screening av bomulls genotyper for kantet nematode motstand. Protokollen innebærer visuelt undersøke røttene av nematode-infiserte bomull frøplanter å bestemme infeksjon respons. Den vegetative skyte fra hver plante er deretter spres for å gjenopprette planter for frøproduksjon.
Abstract
En rask ikke-destruktiv kantet nematode (Rotylenchulus reniformis) screening protokollen er nødvendig for utvikling av resistente bomull (syrer hirsutum) varianter for å forbedre nematode ledelse. De fleste protokollene innebære utpakking vermiform nematoder eller egg fra bomull rotsystemet eller potting jord for å bestemme befolkningstetthet eller reproduksjon rate. Disse tilnærmingene er vanligvis tidkrevende med et lite antall genotyper evaluert. En alternativ tilnærming er beskrevet her hvor rotsystemet er visuelt undersøkt for nematode infeksjon. Protokollen innebærer vaksinere bomull frø 7 dager etter planting med vermiform nematoder og bestemme antall kvinner festet til roten systemet 28 dager etter inoculation. Data uttrykkes som antall hunner per gram av fersk rot vekt for å justere for variasjon i rot vekst. Protokollen gir en utmerket metode for å evaluere verts anlegget motstand forbundet med evne til nematode å etablere en infeksjon området; motstand som hindrer nematode reproduksjon, vurderes imidlertid ikke. Som med andre screening protokoller, er variasjon ofte observert i nematode infeksjon blant enkelte genotyper innenfor og mellom eksperimenter. Data presenteres for å illustrere omfanget av variasjon som er observert ved bruk av protokollen. For å justere for denne variasjonen, er kontroll genotyper inkludert i eksperimenter. Likevel gir protokollen en enkel og rask metode for å evaluere verts anlegget motstand. Protokollen har blitt brukt til å identifisere resistente tiltredelser fra G. arboreum germplasm samling og evaluere segregerende bestander av mer enn 300 individer å bestemme genetikk av resistens. En vegetative forplantning metode for å utvinne planter for resistens avl ble også utviklet. Etter fjerning av rotsystemet for nematode evaluering, er vegetative skyte omplantede å tillate utvikling av et nytt rotsystem. Mer enn 95% av skuddene vanligvis utvikle et nytt rotsystem med planter nå modenhet.
Introduction
Rotylenchulus reniformis (Linford og Oliveira), ofte referert til som kantet nematode, er en av de store parasitt nematode arter som finnes i jordsmonnet i det sørøstlige USA1,2,3. Den nematode er en forplikte, stillesittende semi-endoparasite krever en vert plante for å fullføre sin livssyklus2,4. Vermiform preadult kvinnelig nematoder trenge inn i verts rotsystemet for å etablere et fôrings sted i stele2,3. Som nematode feeds og modnes, den bakre delen gjenværende utenfor verten roten vil svelle på eggproduksjon, danner en karakteristisk nyre form (figur 1). Rotylenchulus reniformis er i stand til fôring på rotsystemet av mer enn 300 plantearter, inkludert bomull4. Upland bomull (syrer hirsutum L.) er mye dyrket i det sørøstlige USA, men mangelen på R. reniformis resistente varianter hindrer nematode Management2,3. Management strategier som nematicide behandling og rotasjon med ikke-vert beskjære arter har blitt brukt til å redusere jord R. reniformis befolkningstetthet5,6, men frø bomull yield tap kan vanligvis varierer fra 1 til 5%2. Symptomer på R. reniformis infeksjon kan inkludere plante stunting, undertrykt rot vekst, ernæringsmessige mangler, frukt abort, og forsinket modenhet2. Imidlertid kan symptomene ikke være tydelig på grunn av ensartethet av symptomer på tvers av feltet; Derfor tilnærminger for å vurdere R. reniformis infeksjon er nødvendig for å identifisere og utvikle resistente Upland bomull varianter. Evaluering av R. reniformis motstand i bomull anses vanskelig7, fordi det infiserte rotsystemet kan vises normalt selv om anlegget kan vise symptomer på infeksjon8.
En effektiv nematode screening protokollen er nødvendig for identifisering av R. reniformis motstandsdyktig tiltredelser fra bomull germplasm samlingen, og for fastsettelse av motstanden genetikk for disse tiltredelser. En slik protokoll vil hjelpe til med overføring av motstands gener til høyereliggende bomull. Ulike fotokarsinogenetisk metoder har blitt brukt til å vurdere R. reniformis infeksjon i bomull8,9,10,11,12,13,14,15. Generelt har to store tilnærminger blitt brukt for identifisering av R. reniformis motstandsdyktig bomulls genotyper. Den mest brukte tilnærmingen innebærer utpakking egg og/eller vermiform nematoder fra infiserte planter eller jord8, 11,12,14,15. Den generelle metodikk for denne tilnærmingen innebærer planting frø for den enkelte bomull genotyper i separate Potter, slik at frøplanter å utvikle i 7 til 14 dager, vaksinere frøplanter ved å legge en blanding av vermiform stadier av R. reniformis til jord, og la nematoder å infisere rotsystemet for 30 til 60 dager. Neste, vermiform nematoder og/eller egg er Hentet fra det infiserte rotsystemet av hver plante eller fra potting jord. Antall utpakkede nematoder eller egg er deretter fast bestemt på å anslå befolkningstettheten og reproduksjons hastigheten, som sammenlignes med kontroll genotyper for å identifisere resistente genotyper.
En alternativ tilnærming, som beskrevet her, innebærer mikroskopisk undersøke bomull rotsystem som har blitt smittet med nematoder å bestemme antall kvinnelige nematoder igle røttene10,16. I likhet med andre tilnærminger, er bomull genotyper plantet i separate Potter og inokulert med vermiform nematoder ca 7 dager etter planting. Innen 30 dager etter inoculation, rotsystemet er fjernet fra enkelte planter og jorda er skylt fra røttene. Deretter nematoder festet til rotsystemet er farget med rød mat coloring17, og røtter er mikroskopisk undersøkt for å fastslå antall infeksjoner nettsteder med resistente bomull genotyper (identifisert basert på antall nematoder per gram av root) sammenlignet med en mottakelig kontroll16. Denne andre tilnærmingen har fordelen av økt gjennomstrømning ved å redusere antall dager som kreves for evaluering og øke antall individuelle genotyper som evalueres i et enkelt eksperiment. Screening metoder som vurderer befolkningstetthet eller reproduksjon rate er ofte mer tidkrevende enn de som er basert på visuelle observasjoner av smitte tegn7. Men en begrensning av denne tilnærmingen er at verts anlegget motstand som hindrer nematode reproduksjon som bestemmes av eggproduksjon er ikke vurdert13.
Screening protokoller for R. reniformis motstand ofte ødelegge det rotsystem i løpet av bedømmelse7 og innvolvere det vegetative skudd tilværelse kasserte. For å overvinne denne begrensningen, har en metode for vegetative forplantning blitt utviklet for å tillate gjenvinning av planter for frøproduksjon18. Etter fjerning av rotsystemet for nematode evaluering, er vegetative skyte plantet i potting jord for å la rotsystemet til regrow. Denne metoden har brede programmer for de fleste R. reniformis screening protokoller. En enkel og rask metode for vegetative forplantning er av avgjørende betydning for avl R. reniformis motstandsdyktig Upland bomull varianter, hvor utvinning av avkom er nødvendig for å fremme motstandsdyktig genotyper til neste generasjon.
En protokoll er presentert for stor skala screening av bomull genotyper for kantet nematode motstand. Målet er å utvikle en enkel og rask ikke-destruktiv screening metode for å evaluere bomull avl populasjoner for nematode motstand for å hjelpe i avl av resistente Upland bomull varianter. Ved hjelp av denne protokollen, er data vanligvis innhentet innen 35 dager, med mer enn 300 genotyper evaluert i et enkelt eksperiment. Data presenteres for resistente og mottakelige genotyper for å illustrere variasjonen som vanligvis observeres ved hjelp av disse metodene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. opprettholde en kilde til R. reniformis Inokulum
- Fyll Terra Cotta leire potter (15 cm i diameter, 13,5 cm i høyde) med en damp pasteurisert blanding av 1-del sand leirjord og 2-deler sand. Plant en mottakelig tomat (Solanum Lycopersicon) variasjon i hver pott og plassere pottene i en glasshouse.
Merk: andre mottakelige plantesorter som bomull kan brukes i stedet for tomat. - Vaksinere tomat plantene med vermiform kantet nematoder (se trinn 3,3). Oppretthold plantene i Glasshouse ved en temperatur på ca. 28 ° c.
2. planting Cotton genotyper for R. reniformis Vurdering av motstand
- Forbered jord ved å kombinere 2-deler fin sand med 1-del sand leirjord samlet inn fra feltet.
- Steam pasteurize jord blandingen for å sikre at jorda er fri for nematoder og jord-borne plante patogener.
- Tilsett jord blandingen til koniske plast Potter (4 cm i diameter, 21 cm i høyde). Før fylle pottene, plasserer en ball av bomull i bunnen av potten for å hindre tap av jord. Delvis fylle pottene med jord ca 2 cm fra toppen.
- Forbered en plastinnsats for hver pott for å utpeke genotype som skal plantes.
- Plante frø av bomull genotyper valgt for evaluering.
- Plant et enkelt frø i hver pott for evalueringen av segregerende populasjoner, der hvert frø representerer en unik genotype.
- For bomull varianter eller germplasm tiltredelser, plante 2 til 3 frø i en enkelt pott for å sikre spire på minst en plante med de andre frøplanter fjernet fra pottene før nematode inoculation.
Merk: Alternativt kan frø være spirer for 24 til 72 h før planting å minimere antall potter med ikke-levedyktige frø.
- Plant frø av utvalgte motstandsdyktig og mottakelige kontroll genotyper.
Merk: kontroll genotyper blir replisert 5 til 10 ganger for å vurdere naturlige variasjoner som ligger til screening-metodikken. - Fyll potter med ekstra jord for å dekke frøet i hver pott.
- Plasser pottene i vekst kammeret. Opprettholde en konstant temperatur på 28 ° c, en omgivelsesluft temperatur, for vekst kammeret. Gi kunstig belysning med en blanding av fluorescerende og glødelamper med en 16 h photoperiod.
- Plasser vann sendere i hver pott, og vann pottene to ganger per dag ved hjelp av et automatisk vanningssystem. Juster vanning systemet å forsyne ekstra vann som planten vokser.
3. nematode inoculation av Cotton planter og utarbeidelse av root samples
- Pakk vermiform kantet nematoder vedlikeholdes på mottakelige tomat planter (se trinn 1) ved hjelp av elutriation19 og sentrifugal flyte20 metoder dagen før inoculation. Oppbevar den utpakkede nematoder ved 4 ° c.
Merk: Baermann trakt ekstraksjon21 er en alternativ metode for nematode ekstraksjon. - Bestem antall nematoder ekstrahert ved å telle antall nematoder i en 100 μL subsample og Forbered en suspensjon av 1 000 nematoder/mL i vann fra springen til vaksiner.
- Vaksinere bomull frøplanter 7 d etter planting med nematode suspensjon. Lag en liten depresjon i jorda ved siden av anlegget, og Pipetter 1 mL av kantet nematode suspensjon inn i depresjonen.
- Fjern planter fra pottene 28 d etter inoculation for nematode evaluering.
Merk: på dette stadiet, planter er ca 15 cm høy med 4 til 6 fullt utvidet blader.- Fjern de fleste av de fullt utvidet bladene fra plantene ved hjelp av saks før du fjerner plantene fra pottene.
- For å fjerne planter fra pottene, klem potten og skyv jorda ut i hånden.
- Forsiktig fjerne jord fra røttene ved agitating roten systemet i vann fra springen i en 10 L container. Skyll et kort rotsystem i en beholder med rent vann fra springen.
- Fjern rotsystemet fra anlegget ca 1 cm under jord linjen ved hjelp av saks.
- Plasser rotsystemet i en 120 mL plast, ikke-steril, en gangs prøve beholder sammen med plast innsatsen fra potten som brukes til identifisering.
Merk: flere prøver behandles før du går videre til trinn 3,7. Fortsett til trinn 4 for vegetative forplantning av anlegget skyte. - Forbered en 12,5% (v/v) løsning av rød konditorfarge17 i vann fra springen for å farge nematoder festet til rotsystemet.
- Tilsett ca. 30 mL av den røde konditorfarge løsningen på rot prøven i prøvebeholderen for å dekke rotsystemet fullstendig.
- Plasser prøvebeholderen i en mikrobølgeovn og varm opp rot prøven til farge løsningen begynner å koke. Fjern prøven fra mikrobølgeovnen og la prøven avkjøles ved romtemperatur.
- Dekanter den røde konditorfarge løsningen fra rot prøven og tilsett ca. 100 mL vann fra springen til prøvebeholderen for å fjerne overflødig beis. Plasser dekselet på prøvebeholderen og oppbevar prøven i et kjøleskap ved 4 ° c. Fortsett til trinn 5 for evaluering av rot infeksjon.
Merk: protokollen kan stanses midlertidig her før du går videre til trinn 5.
4. vegetative forplantning å gjenopprette planter for Seed Production
- Plasser en ball av bomull i bunnen av en konisk plast pott (se trinn 2,3) og delvis fylle potten med torv mose potting medier. Deretter plasserer vegetative skyte i potten og fast legge potting Media å fylle potten. Plasser en ny merket plastinnsats i hver pott for å angi bomulls genotype.
- Plasser skuffen i potter i en plast container (73,6 cm lengde x 45,7 cm bredde x 15,2 cm høyde) med vann og kort vann plantene å fukte potting Media. Plasser pottene i en vekst kammer med en konstant temperatur på 28 ° c ved hjelp av en 16 h photoperiod. Tilsett ekstra vann til plast beholderen etter behov for å opprettholde fuktighet i jordsmonnet.
- Transplant plantene til større Potter for frøproduksjon etter ca 30 d. delvis fylle en 6 L plast gryte med potting medier (se trinn 4,1), fjerne anlegget fra den lille potten, plasserer anlegget i 6 L potten, og fast legge potting Media å fylle potten.
- Plasser plantene i en glasshouse og tilsett vann for å fukte potting Media. Oppretthold temperaturen i Glasshouse ved ca. 28 ° c (kunstig belysning er ikke nødvendig).
- Vann planter for hånd som trengs for ca 30 d.
- Når ca 75% av plantene krever daglig vanning, vann planter daglig ved hjelp av en automatisk vanning system. Juster automatisk vanningssystem til vann oftere etter behov for plantevekst.
- Tilsett ca 10 g av en langsom-Release gjødsel til hver pott før starten av floral innvielse.
- Harvest planter på modenhet og behandle bomull frø prøvene å få frø for videre evaluering.
- Å høste bomull frø, fjerne bomull fra den åpne bolls på anlegget for hånd og plassere den i en merket papirpose. Frøene er festet til bomullsfibrene, som er fjernet i følgende trinn.
- Fjern lo fibre fra frø prøvene ved hjelp av en 10-sag laboratorium gin.
- Fjern Fuzz fibre fra frø prøvene ved hjelp av konsentrert svovelsyre. Nøytraliserer frø prøver i en løsning med 15% (v/v) natrium, skyll prøvene med vann fra springen og tørk prøvene i en tvungen luft tørrere.
- Plasser frø prøvene i merket konvolutter for lagring.
5. evaluering av R. reniformis Root infeksjon
- Fjern rot prøven fra prøvebeholderen og Tell antallet kvinnelige nematoder som er festet til rotsystemet ved hjelp av en stereomikroskopet (20X forstørrelse).
Merk: kun kvinnelige kantet nematoder er i stand til å infisere planterøtter. - Plasser rotsystemet på papirhåndklær i ca 10 min for å fjerne overflødig fuktighet. Veie det rotsystem å avgjøre det frisk rot vekt.
- Angi nematode telle og friske rot vekt data i en datamaskin regnearkprogram og beregne antall kvinner per gram av root.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rotylenchulus reniformis infeksjon av rotsystemet for to varianter er presentert i figur 1. Relativt færre kvinnelige kantet nematoder er i stand til å etablere en fôring nettsted for resistente bomull genotype sammenlignet med mottakelige genotype. Variasjon i rot veksten er vanlig mellom tiltredelser, som illustrert i figur 2. Denne variasjonen målt av fersk rot vekt kan også observeres mellom planter av samme genotype (tabell 1). Syrer arboreum genotyper ofte viser lavere rot vekstrater enn Upland bomull genotyper. For å kompensere for denne variasjonen samles data på nye rot vekter, som brukes til å beregne antall kvinnelige kantet nematode per gram rot vev for hver genotype. Antallet kvinnelige kantet nematoder per gram av rot for resistente genotyper er generelt mindre enn 10, mens mottakelige genotyper vanligvis har større enn 30 nematoder per gram rot.
En utfordring for screening bomull genotyper for R. reniformis motstand er den potensielle variasjonen som kan forekomme i og mellom eksperimenter. For å evaluere og justere for denne varianten, er resistente og mottakelige bomulls genotyper inkludert som kontroller og replikeres i hvert eksperiment. Tabell 1 viser data for to genotyper brukt som kontroller i to separate eksperimenter ved hjelp av protokollen som er beskrevet ovenfor. Genotyper ble kopiert 10 ganger og inokulert 7 dager etter planting med 1 000 vermiform nematoder, deretter rotsystemer ble høstet 28 dager etter inoculation å telle nematoder knyttet til røttene. Fordi eksperimentene ble gjennomført på forskjellige tidspunkter, kilden til nematoder brukes til vaksiner var annerledes; ellers var alle andre parametre like. Disse dataene illustrerer variasjonen som kan observeres i kantet nematode evalueringer. Kvinnelige nematode teller og rot vekter var høyere i eksperiment 1 for de to kontrollene sammenlignet med eksperiment 2, noe som resulterte i et høyere antall kvinner per gram av roten for eksperiment 1. Fordi den kvinnelige teller var betydelig høyere for eksperiment 1, økningen i rot vekter ikke senke antall kvinner per gram rot til nivåene observert for eksperiment 2. Det ble også observert betydelig variasjon mellom replikeringer av individuelle genotyper. Men motstandsdyktig G. arboreum genotype PI 615699 ofte viste vesentlig lavere kvinnelige teller og lavere antall kvinner per gram av rot enn mottakelige G. hirsutum genotype PI 529251. Genotyper kan være lett klassifiseres som motstandsdyktig eller mottakelig når disse midlene brukes til sammenligning. Genotyper er klassifisert som motstandsdyktig når antall kvinner per gram av root er ca 10% av mottakelig kontroll.
Et delsett av data fra en segregerende F2 befolkning som ble evaluert ved hjelp av protokollen er presentert i tabell 2. Befolkningen inkluderte 300 F2 planter, og data for 50 planter som representerer området i variasjon presenteres. For befolkningen i 300 planter, antall observerte nematoder infiserer roten systemer varierte fra 0 til 50, med en middelverdi på 9,4. Root vekter varierte fra 0,01-1.22 g, med en gjennomsnittlig 0,38 g. kvinnelig nematoder per gram av root varierte fra 0-400, med en middelverdi på 33,6. Foreldrene ble kopiert i evalueringen. Den resistente forelder (PI 417895) viste en gjennomsnittlig 5,8 kvinner per gram av rot, med en gjennomsnittlig rot vekt på 0,8 g; i kontrast viste den mottakelige forelder (PI 529729) en gjennomsnittlig 40,8 hunner per gram av rot, med en gjennomsnittlig rot vekt på 0,35 g. tjue planter viste ingen nematode infeksjon og ble klassifisert som motstandsdyktig, men dette kan representere rømming. Både disse plantene og plantene med dårlig rot vekst er vanligvis fjernet fra dataanalyse. Dette området i variasjon for rot vekst og nematode infeksjon i rotsystemer er ofte observert for nematode evalueringer; Dermed kan evnen til skjermen et stort antall planter i et enkelt eksperiment minimere denne variasjonen og gi rom for nøyaktig vurdering av genetikk av resistens. Befolkningen viste kvantitativ variasjon for nematode infeksjon, og planter ble klassifisert som resistente basert på data fra den mottakelige forelder, som foreslo at motstanden ble overdratt av to resessivt gener for denne populasjonen. I tillegg ble den vegetative overføringsprotokollen som er beskrevet ovenfor, vellykket brukt til å gjenopprette planter fra denne populasjonen. Vurderingen av F3 avkom avledet fra individuelle f2 planter ofte tilsvarte til vurdering av f2 planten.
Figur 1: Rotylenchulus reniformis infiserte rot prøver. Roten prøven fra en motstandsdyktig bomull genotype (nederst til venstre) viser en enkelt kvinnelig nematode festet til roten, mens mottakelige genotype (øverst til høyre) viser flere kvinner festet til roten. Den svarte linjen representerer en 0,1 mm skala. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Variasjon observert i rot vekst for to bomulls genotyper. Roten systemer for to kantet nematode motstandsdyktig G. arboreum tiltredelser er presentert for å illustrere variasjonen som kan observeres for rot vekst. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1: variasjon observert i kantet nematode infeksjons respons for to bomulls genotyper inkludert som kontroller. Disse dataene illustrerer variasjonen som kan oppstå i og mellom eksperimenter for mottakelige g. hirsutum genotype PI 529251 og motstandsdyktig g. arboreum genotype PI 615699; Men, data betyr var signifikant forskjellige, slik at genotyper å være lett klassifiseres som motstandsdyktig eller mottakelige.
| Genotype betegnelse | Kvinner | Root vekt (g) | Hunner/g root | Klassifisering |
| 88 | 0 | 0,67 | 0,0 | Motstandsdyktig |
| 156 | 0 | 0,10 | 0,0 | Motstandsdyktig |
| 75 | 2 | 1,05 | 1,9 | Motstandsdyktig |
| 298 | 2 | 0,58 | 3,4 | Motstandsdyktig |
| 259 | 3 | 0,77 | 3,9 | Motstandsdyktig |
| 208 | 1 | 0,21 | 4,8 | Motstandsdyktig |
| 322 | 4 | 0,82 | 4,9 | Motstandsdyktig |
| 189 | 2 | 0,35 | 5,7 | Motstandsdyktig |
| 147 | 6 | 0,94 | 6,4 | Motstandsdyktig |
| 267 | 2 | 0,18 | 11,1 | Moderat motstandsdyktig |
| 198 | 5 | 0,43 | 11,6 | Moderat motstandsdyktig |
| 251 | 2 | 0,17 | 11,8 | Moderat motstandsdyktig |
| 95 | 6 | 0,46 | 13,0 | Moderat motstandsdyktig |
| 248 | 3 | 0,23 | 13,0 | Moderat motstandsdyktig |
| 79 | 11 | 0,84 | 13,1 | Moderat motstandsdyktig |
| 340 | 4 | 0,29 | 13,8 | Moderat motstandsdyktig |
| 114 | 9 | 0,64 | 14,1 | Moderat motstandsdyktig |
| 168 | 6 | 0,40 | 15,0 | Moderat motstandsdyktig |
| 117 | 7 | 0,44 | 15,9 | Moderat motstandsdyktig |
| 77 | 10 | 0,57 | 17,5 | Moderat motstandsdyktig |
| 277 | 9 | 0,44 | 20,5 | Moderat motstandsdyktig |
| 47 | 8 | 0,34 | 23,5 | Moderat mottakelige |
| 96 | 20 | 0,85 | 23,5 | Moderat mottakelige |
| 139 | 15 | 0,60 | 25,0 | Moderat mottakelige |
| 253 | 2 | 0,08 | 25,0 | Moderat mottakelige |
| 247 | 15 | 0,53 | 28,3 | Moderat mottakelige |
| 308 | 8 | 0,28 | 28,6 | Moderat mottakelige |
| 152 | 9 | 0,31 | 29,0 | Moderat mottakelige |
| 123 | 8 | 0,26 | 30,8 | Moderat mottakelige |
| 296 | 18 | 0,58 | 31,0 | Moderat mottakelige |
| 138 | 10 | 0,31 | 32,3 | Moderat mottakelige |
| 151 | 5 | 0,15 | 33,3 | Moderat mottakelige |
| 102 | 31 | 0,77 | 40,3 | Moderat mottakelige |
| 67 | 5 | 0,12 | 41,7 | Mottakelige |
| 51 | 18 | 0,43 | 41,9 | Mottakelige |
| 311 | 21 | 0,48 | 43,8 | Mottakelige |
| 334 | 4 | 0,09 | 44,4 | Mottakelige |
| 266 | 33 | 0,74 | 44,6 | Mottakelige |
| 260 | 7 | 0,14 | 50,0 | Mottakelige |
| 49 | 16 | 0,32 | 50,0 | Mottakelige |
| 149 | 20 | 0,39 | 51,3 | Mottakelige |
| 104 | 22 | 0,34 | 64,7 | Mottakelige |
| 238 | 39 | 0,57 | 68,4 | Mottakelige |
| 144 | 24 | 0,33 | 72,7 | Mottakelige |
| 225 | 24 | 0,30 | 80,0 | Mottakelige |
| 87 | 38 | 0,43 | 88,4 | Mottakelige |
| 126 | 50 | 0,51 | 98,0 | Mottakelige |
| 272 | 3 | 0,03 | 100,0 | Mottakelige |
| 154 | 24 | 0,12 | 200,0 | Mottakelige |
| 286 | 3 | 0,01 | 300,0 | Mottakelige |
Tabell 2: kantet nematode infeksjons respons observert i en undergruppe av 50 genotyper fra en G. arboreum F2 befolkning. Disse dataene illustrerer omfanget av variasjon som kan observeres for segregerende populasjoner. Root vekter, nematode teller, og antall kvinner per gram av root er presentert for hver genotype, med planter klassifisert som motstandsdyktig, moderat motstandsdyktig, moderat mottakelige, eller mottakelige.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En effektiv screening-protokoll kreves for 1) identifikasjon av R. reniformis motstandsdyktig bomull genotyper for å evaluere genetikk av motstand og 2) avl av resistente varianter. De fleste protokollene vurdere R. reniformis befolkningstettheten eller reproduksjons ratene ved å trekke ut vermiform nematoder eller egg fra bomulls rotsystemet eller potting jord8,11,12,14,15 . Disse tilnærmingene er ofte mer tidkrevende, og resultatene har en tendens til å være mer varierte i og mellom eksperimenter. I tillegg kan bomulls genotyper være oftere feilkategorisert i ikke-replikerte Glasshouse eksperimenter ved hjelp av disse protokollene11. Likevel kan lignende resultater oppnås for de ulike protokollene eller parametrene evaluert9,13.
En alternativ screening protokollen er presentert der screening av bomull genotyper er utført ved å vurdere antall kvinnelige kantet nematoder igle roten systemet. Motstandsdyktig og mottakelige bomulls genotyper kan i utgangspunktet vise et lignende antall kvinnelige nematoder trenge gjennom roten systemer innen 16 timer etter inoculation, men innen 36 timer, motstandsdyktig genotyper begynner å vise betydelig færre vedlagt kvinnelige nematoder og nematode utvikling er hindret9. Dermed gir denne screening-protokollen en mer direkte måling av nematode infeksjon i bomulls rotsystemet sammenlignet med protokoller som er avhengige av ekstraksjon av nematoder eller egg fra rotsystemet eller potting jord. Metoden for bomull frøplante inoculation med vermiform nematoder er lik blant de tilnærminger. Vaksiner er vanligvis utført 7 til 14 dager etter planting, men timingen av inoculation er mindre kritisk, som frø kan også direkte plantet i kantet nematode jord. Vaksiner er utført ved hjelp 1 000 vermiform nematoder, men protokollen kan endres for å øke eller redusere antallet som brukes for inoculation, eller to vaksiner kan gjennomføres på 7 og 14 dager etter planting for å sikre tilstrekkelig kvinnelige nematoder er tilstede for rot infeksjon. I soyabønner, antall nematoder som brukes for inoculation hadde ingen signifikant effekt på egg masse rangeringer 21 dager etter planting; men høyere karakterer ble vanligvis observert ved høyere nematode befolkningstetthet22. Protokollen kan optimaliseres for å bestemme minimum nematode tetthet for inoculation.
Nematode infeksjon i rotsystemet vurderes 28 dager etter inoculation for denne protokollen, som vanligvis er tidligere enn i andre protokoller. Dette er et kritisk trinn i protokollen, siden vurderinger utføres før egg luken. En betydelig forsinkelse i høsting av rot prøver kan resultere i en andre runde med infeksjon. Denne tidligere evalueringen har imidlertid fordelen av å øke gjennomstrømningen. For protokollen som presenteres, er bomulls genotyper plantet i en blanding av sand og jord, noe som er avgjørende for den enkle og rask fjerning av rotsystemet fra potten. Bruken av en automatisk vanning systemet er viktig når du bruker små potter med en sand og jord blanding for å hindre at pottene tørker ut. Rød konditorfarge brukes til å farge nematoder festet til rotsystemet, som er en enkel og sikker metode17. Når roten systemer er flekkete, kan de lagres i vann fra springen ved 4 ° c før telling antall nematoder festet til rotsystemet; Dermed kan et større antall bomulls genotyper evalueres i et enkelt eksperiment, fordi ingen ytterligere behandling av prøvene er nødvendig før vurderingen av nematode tellinger. Dessuten er det en fordel å lagre rot prøvene i vann fra springen i flere dager, noe som gjør at røttene til de-flekken, noe som gjør tellingen enklere.
Protokollen beskrevet gjør det mulig for screening av større populasjoner for å redusere miljø variasjon som vil oppstå mellom eksperimenter. Ved hjelp av en 900 m2 plantevekst kammer utstyrt med et automatisk vanningssystem, kan bestander av 480 individuelle planter evalueres. Protokollen har blitt brukt til å evaluere segregerende bestander av 300 eller flere individer til å karakterisere genetikk av resistens10,18. Disse befolkningsgruppene viste at kvantitativ variasjon for nematode infeksjon og motstand i G. arboreum kan være oftere assosiert med flere resessivt gener; dermed kreves det større befolkningsgrupper for genetiske studier. I tillegg er kvantitativ variasjon observert i segregerende populasjoner, uavhengig av den brukte protokollen, for å evaluere nematode infeksjons respons.
Host-anlegget motstand i bomull kan hindre evne til nematode å infisere rotsystemet og etablere en fôring området, men det kan også påvirke reproduktive evne til nematode. Screening protokollen beskrevet evaluerer antall nematoder som er i stand til å etablere en fôring nettsted på bomull rotsystemet. Nematode reproduksjon målt ved eggproduksjon ble ikke vurdert i denne protokollen, noe som er en viktig begrensning. Likevel kan protokollen endres for å samle inn denne typen data. Alternativt kan annen metodikk brukes til å samle disse dataene etter at resistente genotyper har blitt identifisert, noe som reduserer behovet for å skjermen et stort antall individer.
Data fra nematode evalueringer av individuelle genotyper kan være variable i og mellom eksperimenter, som er et vanlig problem med alle screening protokoller som brukes til å vurdere R. reniformis motstand for bomulls genotyper. Bruken av en eksperimentell design med flere replikeringer for screening av germplasm tiltredelser vil hjelpe til med å vurdere denne variasjonen for identifisering av resistente genotyper. I tillegg, inkludert den samme resistente og mottakelige kontroll genotyper mellom eksperimenter er nyttig for å vurdere denne variasjonen og sammenligne resultater fra flere eksperimenter. Disse kontrollene brukes også til å overvåke suksessen til nematode inoculation. I tillegg er data betyr fra disse kontrollene brukes til å klassifisere genotyper som motstandsdyktig eller mottakelige10,16. Cotton genotyper er vanligvis klassifisert som motstandsdyktig hvis de viser mindre enn 10% av infeksjonen observert på utsatt kontroll16,23. Root vekst er en annen faktor som bidrar til variasjonen observert i data ved hjelp av protokollen, fordi plantene har et trykk rot med færre laterale røtter tilbyr mindre områder for smitte, noe som kan resultere i færre nematoder per gram av root.
Vanskeligheten i å utvikle nye høyereliggende bomulls varianter ved hjelp av andre bomulls arter som en kilde til motstand gener krever en vegetative forplantning protokoll for å fremme avl linjene til neste generasjon for videre valg eller ytterligere Avl. En enkel vegetative forplantning protokollen som beskrevet ble utviklet for å gjenopprette planter etter nematode evaluering. Protokollen har blitt brukt til å gjenopprette planter fra store befolkningsgrupper18. Vanligvis er rotsystemet gjenopprettes innen 30 dager etter at vegetative skyte er plantet. Overlevelsesratene er ofte større enn 95%. Planter som viser dårlig vigor kan gå tapt når spre et stort antall planter. Generelt, mindre enn 1% av plantene klarte ikke å vise rot eller skyte vekst. Protokollen kan enkelt endres og brukes med andre nematode screening protokoller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble finansiert av det amerikanske Landbruksdepartementet, Agricultural Research Service. Omtale av handelsnavn og kommersielle produkter i denne artikkelen er utelukkende for det formål å gi spesifikk informasjon og ikke antyde anbefalinger eller anbefalinger fra US Department of Agriculture. USDA er en likeverdig mulighet leverandør og arbeidsgiver. Forfatterne har ingen interessekonflikt å erklære. Teknisk assistanse ble levert av Kristi Jordan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ray Leach Cone-tainer | Stuewe and Sons Inc. | SC10U | |
| Cone-tainer tray | Stuewe and Sons Inc. | RL98 | |
| Sand | various | ||
| Cotton balls | various | ||
| Pylon 4 inch plant labels (4 in L x 5/8 in W) | Pylon Platics | L-4-W | Any brand or vendor is acceptible. |
| 4 oz. specimen containers | Fisher Scientific | 16-320-731 | Any brand or vendor is acceptible. |
| Red food coloring | McCormick & Co., Inc. | ||
| 1 mL Pipet tips | various | ||
| 10 L container | various | Inexpensive buckets work well. | |
| 6 L pots | Nursery Supplies Inc. | Poly-Tainer-Can No2A | Any brand or vendor is acceptible. Different size pots can be used |
| Potting media | Sun Gro Horticulture | Metro-Mix 360 | Any brand or vendor is acceptible. |
| Fertilizer | Everris NA Inc. | Osmocote Plus | Any brand or vendor is acceptible. |
| Plastic container (73.6 cm L x 45.7 cm W x 15.2 cm D) | Rubbermaid | 3O29 | Any brand or vendor is acceptible. |
References
- Heald, C. M., Robinson, A. F. Survey of current distribution of Rotylenchulus reniformis. in the United States. Journal of Nematology. 22 (4), 695-699 (1990).
- Koenning, S. R., Wrather, J. A., Kirkpatrick, T. L., Walker, N. R., Starr, J. L., Mueller, J. D. Plant-parasitic nematodes attacking cotton in the United States: old and emerging production challenges. Plant Disease. 88 (2), 100-113 (2004).
- Robinson, A. F. Reniform in U.S. cotton: when, where, why, and some remedies. Annual Review of Phytopathology. 45, 263-288 (2007).
- Robinson, A. F., Inserra, R. N., Caswell-Chen, E. P., Vovlas, N., Troccoli, A. Rotylenchulus species: identification, distribution, host ranges, and crop plant resistance. Nematropica. 27 (2), 127-180 (1997).
- Davis, R. F., Koenning, S. R., Kemerait, R. C., Cummings, T. D., Hurley, W. D. Rotylenchulus reniformis management in cotton with crop rotation. Journal of Nematology. 35 (1), 58-64 (2003).
- Starr, J. L., Koenning, S. R., Kirkpatrick, T. L., Robinson, A. F., Roberts, P. A., Nichols, R. L. The future of nematode management in cotton. Journal of Nematology. 39 (4), 283-294 (2007).
- Weaver, D. B., Lawrence, K. S., van Santen, E. Reniform nematode resistance in upland cotton germplasm. Crop Science. 47 (1), 19-24 (2007).
- Robinson, A. F., Cook, C. G., Percival, A. E. Resistance to Rotylenchulus reniformis and Meloidogyne incognita race 3 in the major cotton cultivars planted since 1950. Crop Science. 39 (3), 850-858 (1999).
- Carter, W. W. Resistance and resistant reaction of Gossypium arboreum to the reniform nematode, Rotylenchulus reniformis. Journal of Nematology. 13 (3), 368-374 (1981).
- Erpelding, J. E., Stetina, S. R. Genetics of reniform nematode resistance in Gossypium arboreum germplasm line PI 529728. World Journal of Agricultural Research. 1 (4), 48-53 (2013).
- Robinson, A. F., Bridges, A. C., Percival, A. E. New sources of resistance to the reniform (Rotylenchulus reniformis) and root-knot (Meloidogyne incognita) nematode in upland (Gossypium hirsutum L.) and sea island (G. barbadense L.) cotton. Journal of Cotton Science. 8 (3), 191-197 (2004).
- Robinson, A. F., Percival, A. E. Resistance to Meloidogyne incognita race 3 and Rotylenchulus reniformis in wild accessions of Gossypium hirsutum and G. barbadense from Mexico. Journal of Nematology. 29 (4), 746-755 (1997).
- Stetina, S. R., Young, L. D. Comparisons of female and egg assays to identify Rotylenchulus reniformis resistance in cotton. Journal of Nematology. 38 (3), 326-332 (2006).
- Usery, S. R. Jr, Lawrence, K. S., Lawrence, G. W., Burmester, C. H. Evaluation of cotton cultivars for resistance and tolerance to Rotylenchulus reniformis. Nematropica. 35 (2), 121-133 (2005).
- Yik, C. -P., Birchfield, W. Resistant germplasm in Gossypium species and related plants to Rotylenchulus reniformis. Journal of Nematology. 16 (2), 146-153 (1984).
- Stetina, S. R., Erpelding, J. E. Gossypium arboreum accessions resistant to Rotylenchulus reniformis. Journal of Nematology. 48 (4), 223-230 (2016).
- Thies, J. A., Merrill, S. B., Corley, E. L. Red food coloring stain: new, safer procedures for staining nematodes in roots and egg masses on root surfaces. Journal of Nematology. 34 (2), 179-181 (2002).
- Erpelding, J. E., Stetina, S. R. Genetic characterization of reniform nematode resistance for Gossypium arboreum accession PI 417895. Plant Breeding. 137 (1), 81-88 (2018).
- Byrd, D. W. Jr, et al. Two semi-automatic elutriators for extracting nematodes and certain fungi from soil. Journal of Nematology. 8 (3), 206-212 (1976).
- Jenkins, W. R. A rapid centrifugal-flotation technique for separating nematodes from soil. Plant Disease Reporter. 48 (9), 692 (1964).
- Robinson, A. F., Heald, C. M. Carbon dioxide and temperature gradients in Baermann funnel extraction of Rotylenchulus reniformis. Journal of Nematology. 23 (1), 28-38 (1991).
- Williams, C., Gilman, D. F., Fontenot, D. S., Birchfield, W. A rapid technique for screening soybeans for reniform nematode resistance. Plant Disease Reporter. 63 (10), 827-829 (1979).
- Schmitt, D. P., Shannon, G. Differentiating soybean responses to Heterodera glycines races. Crop Science. 32 (1), 275-277 (1992).
