Summary
Qui viene presentato un protocollo per il rapido screening non distruttivo dei genotipi di cotone per la resistenza ai nematodi reniformi. Il protocollo prevede l'esame visivo delle radici delle piantine di cotone infettate dal nematode per determinare la risposta all'infezione. Il germoglio vegetativo di ogni pianta viene quindi propagato per recuperare gli impianti per la produzione di semi.
Abstract
Un rapido protocollo di screening di nematode reniforme non distruttivo (Rotylenchulus reniformis) è necessario per lo sviluppo di varietà di cotone resistente (Gossypium hirsutum) per migliorare la gestione dei nematodi. La maggior parte dei protocolli prevede l'estrazione di nematodi vermiformi o uova dal sistema radicale del cotone o del suolo in vaso per determinare la densità della popolazione o il tasso di riproduzione. Questi approcci sono generalmente dispendiosi in termini di tempo con un piccolo numero di genotipi valutati. Un approccio alternativo è descritto qui in cui il sistema radicale viene esaminato visivamente per l'infezione da nematodi. Il protocollo prevede l'inocuculazione della piantina di cotone 7 giorni dopo la semina con nematodi vermiformi e la determinazione del numero di femmine attaccate al sistema radicale 28 giorni dopo l'inoculazione. I dati sono espressi come il numero di femmine per grammo di peso della radice fresca per regolare per la variazione nella crescita della radice. Il protocollo fornisce un ottimo metodo per valutare la resistenza delle piante ospiti associata alla capacità del nematode di stabilire un sito di infezione; tuttavia, la resistenza che ostacola la riproduzione dei nematodi non viene valutata. Come con altri protocolli di screening, la variazione è comunemente osservata nell'infezione da nematodi tra i singoli genotipi all'interno e tra gli esperimenti. I dati sono presentati per illustrare la gamma di variazioni osservate utilizzando il protocollo. Per adattarsi a questa variazione, i genotipi di controllo sono inclusi negli esperimenti. Ciò nonostante, il protocollo fornisce un metodo semplice e rapido per valutare la resistenza host-impianto. Il protocollo è stato utilizzato con successo per identificare le adesioni resistenti da parte del G. raccolta di germoplasma arboreo e valutare la separazione delle popolazioni di più di 300 individui per determinare la genetica della resistenza. È stato inoltre sviluppato un metodo di propagazione vegetativa per il recupero delle piante per l'allevamento di resistenza. Dopo la rimozione del sistema radicale per la valutazione dei nematodi, il germoglio vegetativo viene ripiantato per consentire lo sviluppo di un nuovo sistema radicale. Più del 95% dei germogli in genere sviluppano un nuovo sistema radicale con piante che raggiungono la maturità.
Introduction
Rotylenchulus reniformis (Linford e Oliveira), comunemente indicati come nematode reniforme, è una delle principali specie parassitarie di nematodi presenti nei suoli del sud-est degli Stati Uniti1,2,3. Il nematode è un semi-endoparassse obbligatorio e sedentario che richiede una pianta ospite per completare il suo ciclo di vita2,4. I nematodi femminili preadulti vermiforma penetrano nella radicedell'ospite per stabilire un sito di alimentazione nella stele 2,3. Man mano che il nematode si nutre e matura, la porzione posteriore rimasta al di fuori della radice ospite si gonfia alla produzione delle uova, formando una caratteristica forma renale (Figura 1). Rotylenchulus reniformis è in grado di nutrirsi del sistema radicale di oltre 300 specie vegetali, tra cui cotone4. Il cotone di montagna (Gossypium hirsutum L.) è ampiamente coltivato nel sud-est degli Stati Uniti, ma la mancanza di R. le varietà resistenti alla reniformis ostacolano la gestione dei nematodi2,3. Strategie di gestione come il trattamento dei nematici e la rotazione con specie di colture non ospiti sono state utilizzate per ridurre il suolo R. densità di popolazione reniformis 5,6, ma le perdite di rendimento del cotone da seme possono comunemente variare da 1 a 5%2. Sintomi di R. Infezione da reniformis può includere arresto delle piante, crescita radicata delle radici, carenze nutrizionali, aborto della frutta, e maturità ritardata2. Tuttavia, i sintomi possono non essere evidenti a causa dell'uniformità dei sintomi in tutto il campo; pertanto, gli approcci per valutare R. sono necessarie infezioni da reniformis per identificare e sviluppare varietà resistenti di cotone altopiano. Valutazione di R. La resistenza alla reniformis nel cotone è considerata difficile7, perché il sistema radicale infetto può apparire normale anche se la pianta può mostrare sintomi di infezione8.
Per l'identificazione di Rè necessario un protocollo efficace di screening dei nematodi. adesioni resistenti alla reniformis della collezione germoplasma del cotone e per la determinazione della genetica della resistenza per queste adesioni. Tale protocollo aiuterà a trasferire i geni della resistenza al cotone di montagna. Vari metodi di bioastipia sono stati utilizzati per valutare R. Infezione da reniformis nel cotone8,9,10,11,12,13,14,15. In generale, sono stati utilizzati due approcci principali per l'identificazione di R. genotipi di cotone resistenti alla reniformis. L'approccio più frequentemente utilizzato prevede l'estrazione di uova e/o nematodi vermiformi da piante infette o suolo8,11,12,14,15. La metodologia generale per questo approccio prevede la semina di semi per i singoli genotipi di cotone in vasi separati, permettendo alle piantine di svilupparsi per 7-14 giorni, inoculando le piantine aggiungendo una miscela di stadi vermiformi di R. reniformis al suolo, e permettendo ai nematodi di infettare il sistema radicale per 30-60 giorni. Successivamente, i nematodi vermiformina e/o le uova vengono estratti dal sistema radicale infetto di ogni pianta o dal terreno da vaso. Il numero di nematodi o uova estratti viene quindi determinato a stimare la densità di popolazione e il tasso di riproduzione, che vengono confrontati con i genotipi di controllo al fine di identificare i genotipi resistenti.
Un approccio alternativo, come descritto qui, prevede l'esame microscopio del sistema radicale del cotone che è stato infettato da nematodi per determinare il numero di nematodi femminili parassitizzando le radici10,16. Simile ad altri approcci, i genotipi di cotone vengono piantati in vasi separati e inoculati con nematodi vermiformi circa 7 giorni dopo la semina. Entro 30 giorni dall'inoculazione, il sistema radicale viene rimosso dalle singole piante e il terreno viene risciacquato dalle radici. Successivamente, i nematodi attaccati al sistema radicale sono macchiati con colorante rosso alimentare17, e le radici sono microscopicamente esaminate per determinare il numero di siti di infezione con genotipi di cotone resistenti (identificati in base al numero di nematodi per grammo di radice) rispetto a un controllo suscettibile16. Questo secondo approccio ha il vantaggio di aumentare la produttività riducendo il numero di giorni necessari per la valutazione e aumentando il numero di genotipi individuali valutati in un singolo esperimento. Le metodologie di screening che valutano la densità di popolazione o il tasso di riproduzione sono spesso più dispendiose in termini di tempo rispetto a quelle basate su osservazioni visive dei segni di infezione7. Tuttavia, una limitazione di questo approccio è che la resistenza delle piante ospiti che ostacola la riproduzione dei nematodi come determinato dalla produzione di uova non è valutata13.
Protocolli di screening per R. La resistenza ai reniformi spesso distrugge il sistema radicale durante la valutazione7 e comporta lo scarto del germoglio vegetativo. Per superare questa limitazione, è stato sviluppato un metodo di propagazione vegetativa per consentire il recupero delle piante per la produzione di seme18. Dopo la rimozione del sistema radicale per la valutazione del nematode, il germoglio vegetativo viene piantato nel terreno da vaso per consentire al sistema radicale di ricrescere. Questo metodo ha ampie applicazioni per la maggior parte R. i protocolli di screening reniformis. Un metodo semplice e rapido di propagazione vegetativa è di fondamentale importanza per l'allevamento di R. varietà di cotone alto-alto resistente reniform, dove il recupero della progenie è necessario per far avanzare genotipi resistenti alla generazione successiva.
Viene presentato un protocollo per lo screening su larga scala dei genotipi di cotone per la resistenza ai nematodi reniformi. L'obiettivo è quello di sviluppare un metodo di screening semplice e rapido non distruttivo per valutare le popolazioni di allevamento del cotone per la resistenza ai nematodi al fine di aiutare nell'allevamento di varietà di cotone altopiano resistenti. Utilizzando questo protocollo, i dati vengono in genere ottenuti entro 35 giorni, con più di 300 genotipi valutati in un singolo esperimento. I dati sono presentati per genotipi resistenti e suscettibili per illustrare la variazione comunemente osservata con questi metodi.
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Protocol
1. Mantenimento di una fonte di R. reniformis Inoculo
- Riempire vasi di terracotta di argilla (15 cm di diametro, 13,5 cm di altezza) con un mix pastorizzato a vapore di 1-parte di telo sabbioso e sabbia 2 parti. Piantare una varietà di pomodoro suscettibile (Solanum lycopersicon) in ogni vaso e posizionare i vasi in una vetraia.
NOTA: Al posto del pomodoro possono essere utilizzate altre varietà vegetali sensibili come il cotone. - Inoculare le piante di pomodoro con nematodi reniformi vermiforme (vedi passo 3.3). Mantenere le piante nella vetrina ad una temperatura di circa 28 gradi centigradi.
2. Piantare genotipi di cotone per R. reniformis Valutazione della resistenza
- Preparare il terreno combinando sabbia fine a 2 parti con 1 parte di salone sabbioso raccolto dal campo.
- Vapore pastorizzare la miscela del suolo per garantire che il terreno è privo di nematodi e agenti patogeni vegetali suolo-borne.
- Aggiungere la miscela di terreno ai vasi di plastica conica (4 cm di diametro, 21 cm di altezza). Prima di riempire le pentole, mettere una palla di cotone sul fondo della pentola per prevenire la perdita di terreno. Riempire parzialmente i vasi con il terreno a circa 2 cm dall'alto.
- Preparare un palo di plastica per ogni vaso per designare il genotipo da piantare.
- Semi vegetali dei genotipi di cotone selezionati per la valutazione.
- Piantare un singolo seme in ogni vaso per la valutazione delle popolazioni che separano, in cui ogni seme rappresenta un genotipo unico.
- Per le varietà di cotone o le nemostate, piantare da 2 a 3 semi in un unico vaso per assicurare la germinazione di almeno una pianta con le altre piantine rimosse dai vasi prima dell'inoculazione dei nematodi.
Nota: In alternativa, i semi possono essere germinati per 24 a 72 h prima di piantare per ridurre al minimo il numero di vasi con semi non vitali.
- Semi vegetali di genotipi di controllo resistenti e suscettibili selezionati.
Nota: I genotipi di controllo vengono replicati da 5 a 10 volte per valutare le variazioni naturali inerenti alla metodologia di screening. - Riempire vasi con terreno aggiuntivo per coprire il seme in ogni pentola.
- Posizionare i vasi nella camera di crescita. Mantenere una temperatura costante di 28 gradi centigradi, una temperatura dell'aria ambiente, per la camera di crescita. Fornire un'illuminazione artificiale con una miscela di lampade fluorescenti e incandescenti con un fotoperiodo di 16 ore.
- Mettere gli emettitori d'acqua in ogni vaso e innaffiare i vasi due volte al giorno utilizzando un sistema di irrigazione automatico. Regolare il sistema di irrigazione per fornire acqua supplementare man mano che la pianta cresce.
3. Inoculazione nematode di piante di cotone e preparazione di campioni di radici
- Estrarre nematodi reniformi vermiformi mantenuti su piante di pomodoro suscettibili (vedi punto 1) utilizzando elutriazione19 e filazione centrifuga20 metodologie il giorno prima dell'inoculazione. Conservare i nematodi estratti a 4 gradi centigradi.
NOTA: l'estrazione a imbuto Baermann21 è un metodo alternativo per l'estrazione dei nematodi. - Determinare il numero di nematodi estratti contando il numero di nematodi in un sottocampione da 100 e preparare una sospensione di 1.000 nematodi/mL nell'acqua del rubinetto per le vaccinazioni.
- Inoculare le piantine di cotone 7 d dopo aver piantato con la sospensione del nematode. Creare una piccola depressione nel terreno accanto alla pianta, e pipetta 1 mL della sospensione nematode reniforme nella depressione.
- Rimuovere le piante dai vasi 28 d dopo l'inoculazione per la valutazione del nematode.
NOTA: In questa fase, le piante sono alte circa 15 cm con 4-6 foglie completamente espanse.- Rimuovere la maggior parte delle foglie completamente espanse dalle piante utilizzando le forbici prima di rimuovere le piante dai vasi.
- Per rimuovere le piante dai vasi, spremere il vaso e far scorrere il terreno nella mano.
- Rimuovere delicatamente il terreno dalle radici agitando l'impianto radicale nell'acqua del rubinetto in un contenitore da 10 L. Risciacquare brevemente il sistema radicale in un contenitore di acqua di rubinetto pulita.
- Rimuovere il sistema radicale dalla pianta circa 1 cm sotto la linea del suolo utilizzando le forbici.
- Collocare il sistema radicale in un contenitore di campioni monouso in plastica da 120 ml e non sterile insieme alla puntata di plastica della pentola utilizzata per l'identificazione.
NOTA: più campioni vengono elaborati prima di procedere al passaggio 3.7. Procedere al passaggio 4 per la propagazione vegetativa del tiro dell'impianto. - Preparare una soluzione del 12,5% (v/v) di cibo rosso colorando17 in acqua di rubinetto per macchiare i nematodi attaccati al sistema radicale.
- Aggiungere circa 30 mL della soluzione di colorazione degli alimenti rossi al campione di radice nel contenitore del provino per coprire completamente il sistema radicale.
- Mettere il contenitore del provino in un forno a microonde e riscaldare il campione di radice fino a quando la soluzione di colorazione inizia a bollire. Togliere il campione dal forno a microonde e lasciare raffreddare il campione a temperatura ambiente.
- Decantare la soluzione di colorazione alimentare rossa dal campione radice e aggiungere circa 100 mL di acqua di rubinetto al contenitore del campione per rimuovere la macchia in eccesso. Collocare il coperchio sul contenitore del provino e conservarlo in frigorifero a 4 gradi centigradi. Procedere al passaggio 5 per la valutazione dell'infezione da radicale.
NOTA: il protocollo può essere sospeso qui prima di procedere al passaggio 5.
4. Propagazione vegetativa per il recupero di impianti per la produzione di semi
- Mettere una palla di cotone sul fondo di un vaso di plastica conica (vedi passo 2.3) e riempire parzialmente la pentola con mezzi di scoppio del muschio di torba. Quindi, mettere il tiro vegetativo nel vaso e aggiungere saldamente i supporti da vaso per riempire il piatto. Inserire una nuova posta in plastica etichettata in ogni vaso per designare il genotipo di cotone.
- Mettere il vassoio di vasi in un contenitore di plastica (lunghezza 73,6 cm x 45,7 cm di larghezza x 15,2 cm di altezza) con acqua e innaffiare brevemente le piante per inumidire il supporto in vaso. Collocare i vasi in una camera di crescita con una temperatura costante di 28 gradi centigradi utilizzando un fotoperiodo di 16 h. Aggiungere ulteriore acqua al contenitore di plastica in base alle esigenze per mantenere l'umidità del suolo.
- Trapiantare le piante in vasi più grandi per la produzione di semi dopo circa 30 d. Riempire parzialmente un vaso di plastica 6 L con mezzi di vaso (vedi passo 4.1), rimuovere la pianta dal piccolo vaso, posizionare la pianta nel vaso 6 L, e aggiungere saldamente i supporti da vaso per riempire il vaso.
- Mettere le piante in una serre e aggiungere acqua per inumidire il supporto in vaso. Mantenere la temperatura nella vetrina a circa 28 gradi centigradi (l'illuminazione artificiale non è necessaria).
- Piante d'acqua a mano, se necessario, per circa 30 d.
- Quando circa il 75% delle piante richiede l'irrigazione quotidiana, le piante d'acqua ogni giorno utilizzano un sistema di irrigazione automatico. Regolare il sistema di irrigazione automatico per innaffiare più frequentemente in base alle esigenze per la crescita delle piante.
- Aggiungere circa 10 g di fertilizzante a rilascio lento in ogni vaso prima dell'inizio dell'iniziazione floreale.
- Raccogliere le piante alla maturità ed elaborare i campioni di semi di cotone per ottenere i semi per un'ulteriore valutazione.
- Per raccogliere i semi di cotone, rimuovere il cotone dalle bolls aperte sulla pianta a mano e metterlo in un sacchetto di carta etichettato. I semi sono attaccati alle fibre di cotone, che vengono rimossi nei seguenti passaggi.
- Rimuovere le fibre di lamint dai campioni di semi utilizzando un gin da laboratorio da 10 sega.
- Rimuovere le fibre fuzz dai campioni di semi utilizzando acido solforico concentrato. Neutralizzare i campioni di semi in una soluzione del 15% (v/v) di carbonato di sodio, risciacquare i campioni con acqua del rubinetto e asciugare i campioni in un essiccatore ad aria forzata.
- Collocare i campioni di semi in buste etichettate per l'archiviazione.
5. Valutazione di R. reniformis Infezione della radice
- Rimuovere il campione di radice dal contenitore del provino e contare il numero di nematodi femminili attaccati al sistema radicale utilizzando uno stereomicroscopio (ingrandimento 20X).
NOTA: Solo i nematodi reniformi femminili sono in grado di infettare le radici delle piante. - Posizionare l'impianto radicale su carta assorbente per circa 10 min per rimuovere l'umidità in eccesso. Pesare il sistema radicale per determinare il peso della radice fresca.
- Inserisci il numero di nematode e i dati sul peso della radice in un programma di fogli di calcolo del computer e calcola il numero di femmine per grammo di radice.
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Representative Results
Rotylenchulus reniformis infezione del sistema radicale per due varietà è presentato Figura 1. Relativamente meno nematodi reniformi femminili sono in grado di stabilire un sito di alimentazione per il genotipo di cotone resistente rispetto al genotipo suscettibile. La variazione della crescita delle radici è comune tra le adesioni, come illustrato nella Figura 2. Questa variazione misurata dal peso fresco delle radici può essere osservata anche tra piante dello stesso genotipo (Tabella 1). I genotipi dell'arboreo di Gossypium mostrano spesso tassi di crescita delle radici più bassi rispetto ai genotipi di cotone di altolivello. Per compensare questa variazione, i dati vengono raccolti su pesi radice freschi, che vengono utilizzati per calcolare il numero di nematodi reniformi femminili per tessuto radicale grammo per ogni genotipo. I numeri di nematodi reniformi femminili per grammo di radice per i genotipi resistenti sono generalmente inferiori a 10, mentre i genotipi suscettibili in genere hanno maggiori di 30 nematodi per grammo di radice.
Una sfida per lo screening dei genotipi di cotone per R. la resistenza alla reniformis è la potenziale variazione che può verificarsi all'interno e tra gli esperimenti. Per valutare e regolare questa variazione, i genotipi di cotone resistenti e suscettibili sono inclusi come controlli e replicati in ogni esperimento. La tabella 1 presenta i dati relativi a due genotipi utilizzati come controlli in due esperimenti separati utilizzando il protocollo descritto in precedenza. I genotipi sono stati replicati 10 volte e inoculati 7 giorni dopo la semina con 1.000 nematodi vermiformi, poi i sistemi radicali sono stati raccolti 28 giorni dopo l'inoculazione per contare i nematodi attaccati alle radici. Poiché gli esperimenti sono stati condotti in tempi diversi, la fonte dei nematodi utilizzati per le vaccinazioni era diversa; in caso contrario, tutti gli altri parametri erano simili. Questi dati illustrano la variazione che si può osservare nelle valutazioni dei nematodi reniformi. Il numero di nematodi femminili e i pesi della radice erano più alti nell'esperimento 1 per i due controlli rispetto all'esperimento 2, con conseguente numero più elevato di femmine per grammo di radice per l'esperimento 1. Poiché i conteggi delle femmine erano notevolmente più alti per l'esperimento 1, gli aumenti dei pesi delle radici non hanno abbassato il numero di femmine per grammo di radice ai livelli osservati per l'esperimento 2. È stata osservata anche una notevole variazione tra le repliche dei singoli genotipi. Tuttavia, il resistente G. il genotipo dell'arboreo PI 615699 mostrava spesso un numero di femmine sostanzialmente inferiore e un numero inferiore di femmine per grammo di radice rispetto al suscettibile G. hirsutum genotype PI 529251. I genotipi possono essere facilmente classificati come resistenti o suscettibili quando questi mezzi vengono utilizzati per il confronto. I genotipi sono classificati come resistenti quando il numero di femmine per grammo di radice è circa il 10% del controllo suscettibile.
Un sottoinsieme di dati di una popolazione di F2 che è stata valutata utilizzando il protocollo è presentato nella tabella 2. La popolazione comprendeva 300 F2 piante e sono presentati i dati relativi a 50 piante che rappresentano la gamma di variazione. Per la popolazione di 300 piante, il numero di nematodi osservati che infettano i sistemi radicali variava da 0 a 50, con una media di 9,4. I pesi radice variavano da 0,01-1,22 g, con una media di 0,38 g. nematodi femminili per grammo di radice variavano da 0 a 400, con una media di 33,6. I genitori sono stati replicati nella valutazione. Il genitore resistente (PI 417895) ha mostrato una media di 5,8 femmine per grammo di radice, con un peso della radice media di 0,8 g; al contrario, il genitore suscettibile (PI 529729) ha mostrato una media di 40,8 femmine per grammo di radice, con un peso netto medio di 0,35 g. Venti piante non hanno mostrato alcuna infezione da nematodi e sono state classificate come resistenti, ma questo può rappresentare fughe. Sia queste piante che le piante con una scarsa crescita delle radici vengono in genere rimosse dall'analisi dei dati. Questa gamma di variazione per la crescita delle radici e l'infezione da nematodi dei sistemi radicali sono comunemente osservati per le valutazioni dei nematodi; pertanto, la capacità di vagliare un gran numero di piante in un singolo esperimento può ridurre al minimo questa variazione e consentire una valutazione accurata della genetica della resistenza. La popolazione ha mostrato variazioni quantitative per l'infezione da nematodi, e le piante sono state classificate come resistenti in base ai dati del genitore suscettibile, il che suggerisce che la resistenza è stata conferita da due geni recessivi per questa popolazione. Inoltre, il protocollo di propagazione vegetativa descritto in precedenza è stato utilizzato con successo per recuperare le piante da questa popolazione. La valutazione della progenie F3 derivata da singoli impianti f2 corrispondeva spesso alla valutazione dello stabilimento di F2.
Figura 1: Rotylenchulus reniformis infetta campioni di radice. Il campione di radice di un genotipo di cotone resistente (in basso a sinistra) mostra un singolo nematode femminile attaccato alla radice, mentre il genotipo suscettibile (in alto a destra) mostra più femmine attaccate alla radice. La barra nera rappresenta una scala di 0,1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Variazione osservata nella crescita delle radici per due genotipi di cotone. I sistemi di radici per due adesioni G.arboreo resistenti al nematode reniforme sono presentati per illustrare la variazione che può essere osservata per la crescita delle radici. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Variazione osservata nella risposta all'infezione da nematodi reniforme per due genotipi di cotone inclusi come controlli. Questi dati illustrano la variazione che può verificarsi all'interno e tra gli esperimenti per il genotipo G.hirsutum PEP 529251 e il resistente G. genotipo di arboreo PI 615699; tuttavia, i mezzi di dati erano significativamente diversi, permettendo ai genotipi di essere facilmente classificati come resistenti o suscettibili.
| Denominazione genotipo | Femmine | Peso radice (g) | Femmine/g Radice | classificazione f |
| 88 La | 0 (in vie | 0,67 (in inglese) | 0,0 | Resistente |
| 156 del sistema | 0 (in vie | 0.10 | 0,0 | Resistente |
| 75 Del 13o | 2 Il nome del sistema | 1.05 (in questo stato del documento in stato di | 1.9 (in questo modo) | Resistente |
| 298 | 2 Il nome del sistema | 0,58 (in linguaggio da 18). | 3.4 (in questo stato del documento) | Resistente |
| 259 del 2222 | 3 (COM del nome | 0,77 (in linguaggio 07) | 3.9 | Resistente |
| 208 (in questo stato del | 1 : il nome del | 0.21 (in questo 21) | 4.8 Per quanto | Resistente |
| 322 Del sistema | 4 DEL psu' | 0,82 (in questo da fwlinka che | 4.9 (in questo stato del documento in questo | Resistente |
| 189 del 182 | 2 Il nome del sistema | 0,35 (in questo da fwlinka che) | 5.7 55 | Resistente |
| 147 del sistema | 6 È possibile: | 0,94 (in questo da 24) | 6.4 (in inglese) | Resistente |
| 267 mila | 2 Il nome del sistema | 0.18 | 11.1 1 | Moderatamente resistente |
| 198 (in tissu dall'utente | 5 Del numero 3( | 0,43 (in linguaggio da 22): | 11,6 | Moderatamente resistente |
| 251 | 2 Il nome del sistema | 0.17 | 11,8 | Moderatamente resistente |
| 95 | 6 È possibile: | 0,46 (in inglese) | 13,0 | Moderatamente resistente |
| 248 (248) | 3 (COM del nome | 0.23 | 13,0 | Moderatamente resistente |
| 79 del 132 24 | 11 Del sistema di | 0,84 (in questo da fwlinka che | 13.1 | Moderatamente resistente |
| 340 mila | 4 DEL psu' | 0.29 (invisa 29) | 13,8 | Moderatamente resistente |
| 114 del sistema | 9 (in vie | 0,64 (in inglese) | 14.1 1 | Moderatamente resistente |
| 168 del sistema | 6 È possibile: | 0,40 (in questo da 20>) | 15,0 | Moderatamente resistente |
| 117 del sistema | 7 (in questo stato | 0,44 (in questo da 44) | 15.9 (in tito lo 15.9 | Moderatamente resistente |
| 77 Del 13 | 10 del sistema | 0,57 (in linguaggio da 20>: | 17,5 15 | Moderatamente resistente |
| 277 del sistema | 9 (in vie | 0,44 (in questo da 44) | 20.5 29 9 9 9 9 9 9 9 9 | Moderatamente resistente |
| 47 o | 8 (IN vio | 0.34 | 23,5 23,5 | Moderatamente suscettibile |
| 96 | 20 anni | 0,85 (in questo da fwlinkin base all'indirizzo | 23,5 23,5 | Moderatamente suscettibile |
| 139 del 139 | 15 Mi lasa del sistema | 0,60 (in inglese) | ore 25.0 | Moderatamente suscettibile |
| 253 mi la | 2 Il nome del sistema | 0,08 (in vie tall on. | ore 25.0 | Moderatamente suscettibile |
| 247 del sistema | 15 Mi lasa del sistema | 0,53 (in linguaggio da 20>: | 28.3 24 | Moderatamente suscettibile |
| 308 | 8 (IN vio | 0.28 (in vie al numero di | 28.6 (in inglese) | Moderatamente suscettibile |
| 152 | 9 (in vie | 0.31 | OR e ore su 29.0 . | Moderatamente suscettibile |
| 123 del sistema | 8 (IN vio | 0.26 | 30,8 | Moderatamente suscettibile |
| 296 (di sistema) | 18 mi lato | 0,58 (in linguaggio da 18). | 31,0 | Moderatamente suscettibile |
| 138 del sistema | 10 del sistema | 0.31 | 32.3 | Moderatamente suscettibile |
| 151 del sistema | 5 Del numero 3( | 0.15 | 33.3 | Moderatamente suscettibile |
| 102 | 31 Milia | 0,77 (in linguaggio 07) | 40.3 (in questo stato del documento) | Moderatamente suscettibile |
| 67 ha | 5 Del numero 3( | 0.12 | 41.7 | impressionabile |
| 51 Del sistema : | 18 mi lato | 0,43 (in linguaggio da 22): | 41,9 | impressionabile |
| 311 Il | 21 Mieto | 0,48 (in linguaggio da 18). | 43,8 | impressionabile |
| 334 Milia | 4 DEL psu' | 0,09 | 44,4 | impressionabile |
| 266 (in inglese) | 33 Mi lasa | 0,74 (in questo 04) | 44,6 | impressionabile |
| 260 | 7 (in questo stato | 0.14 | 50.0 (in questo da 50,0) | impressionabile |
| 49 del sistema di | 16 | 0,32 (in linguaggio calibro 0,32 | 50.0 (in questo da 50,0) | impressionabile |
| 149 del sistema | 20 anni | 0.39 | 51.3 5 | impressionabile |
| 104 Del sistema | 22 Milia | 0.34 | 64,7 | impressionabile |
| 238 (di sistema) | 39 mila: l'altro | 0,57 (in linguaggio da 20>: | 68.4 | impressionabile |
| 144 del sistema | 24 Mi lasa' di | 0.33 | 72,7 | impressionabile |
| 225 (di sistema) | 24 Mi lasa' di | 0,30 | 80,0 | impressionabile |
| 87 Il | 38 Mi lasa | 0,43 (in linguaggio da 22): | 88,4 8 | impressionabile |
| 126 ( | 50 anni | 0,51 (in linguaggio da 20>: | 98,0 | impressionabile |
| 272 (in questo stato del 24> | 3 (COM del nome | 0,03 (in vi estati) | 100.0 (in linguaggio 100.0) | impressionabile |
| 154 del | 24 Mi lasa' di | 0.12 | Ore 200.0 (informazioni in base al 23%24 | impressionabile |
| 286 (in inglese) | 3 (COM del nome | 0,01 | 300.0 (in questo da 2000) | impressionabile |
Tabella 2: Risposta all'infezione da nematodi reniforme osservata in un sottoinsieme di 50 genotipi G. arboreo F2 popolazione. Questi dati illustrano la gamma di variazioni che possono essere osservate per le popolazioni segregate. Pesi delle radici, conteggi nematodi, e il numero di femmine per grammo di radice sono presentati per ogni genotipo, con piante classificate come resistenti, moderatamente resistenti, moderatamente suscettibili o suscettibili.
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Discussion
È necessario un protocollo di screening efficace per 1) l'identificazione di R. genotipi di cotone resistenti alla reniformis al fine di valutare la genetica della resistenza e 2) l'allevamento di varietà resistenti. La maggior parte dei protocolli valuta R. reniformis densità di popolazione o tassi di riproduzione estraendo nematodi vermiformi o uova dal sistema di radici di cotone o terriccio8,11,12,14,15 . Questi approcci sono spesso più dispendiosi in termini di tempo e i risultati tendono ad essere più vari all'interno e tra gli esperimenti. Inoltre, i genotipi di cotone possono essere classificati più frequentemente erroneamente negli esperimenti di serre non replicati utilizzando questi protocolli11. Tuttavia, risultati simili possono essere ottenuti per i vari protocolli o parametri valutati9,13.
Viene presentato un protocollo di screening alternativo in cui lo screening dei genotipi di cotone viene condotto valutando il numero di nematodi reniformi femminili che paraccisizzano il sistema radicale. I genotipi di cotone resistenti e suscettibili possono inizialmente mostrare un numero simile di nematodi femminili che penetrano nei sistemi radicali entro 16 ore dall'inoculazione, ma entro 36 ore, i genotipi resistenti iniziano a mostrare un numero significativamente inferiore di femmine nematodi e lo sviluppo di nematodi è ostacolato9. Pertanto, questo protocollo di screening fornisce una misura più diretta dell'infezione da nematode del sistema radicale del cotone rispetto ai protocolli che si basano sull'estrazione di nematodi o uova dal sistema radicale o dal suolo da vaso. Il metodo di inoculazione della piantina di cotone con nematodi vermiformi è simile tra gli approcci. Le vaccinazioni sono tipicamente condotte da 7 a 14 giorni dopo la semina, ma la tempistica dell'inoculazione è meno critica, poiché i semi possono anche essere piantati direttamente in terreno infestato dai nematidi reniformi. Le vaccinazioni sono condotte utilizzando 1.000 nematodi vermiformi, ma il protocollo può essere modificato per aumentare o diminuire il numero utilizzato per l'inoculazione, o due vaccinazioni possono essere condotte a 7 e 14 giorni dopo la semina per assicurare un numero sufficiente di nematodi femminili sono presente per l'infezione della radice. Nella soia, il numero di nematodi utilizzati per l'inoculazione non ha avuto alcun effetto significativo sulle valutazioni di massa delle uova 21 giorni dopo la semina; anche se, valutazioni più alte sono stati tipicamente osservati alla maggiore densità di popolazione di nematodi22. Il protocollo può essere ottimizzato per determinare la densità minima dei nematodi per l'inoculazione.
L'infezione da nematodi del sistema radicale viene valutata 28 giorni dopo l'inoculazione per questo protocollo, che è generalmente prima che in altri protocolli. Si tratta di un passaggio critico del protocollo, in quanto le valutazioni vengono effettuate prima della schiusa dell'uovo. Un ritardo significativo nella raccolta di campioni di radici può provocare un secondo ciclo di infezione. Tuttavia, questa valutazione precedente ha il vantaggio di aumentare la velocità effettiva. Per il protocollo presentato, i genotipi di cotone sono piantati in una miscela di sabbia e terreno, che è fondamentale per la rimozione semplice e rapida del sistema radicale dal vaso. L'uso di un sistema di irrigazione automatico è essenziale quando si utilizzano piccole pentole con una miscela di sabbia e terreno al fine di evitare che le pentole si asciughino. La colorazione alimentare rossa viene utilizzata per macchiare i nematodi collegati al sistema radicale, che è un metodo semplice e sicuro17. Una volta che i sistemi di radici sono macchiati, possono essere conservati nell'acqua del rubinetto a 4 gradi centigradi prima di contare il numero di nematodi attaccati al sistema radicale; pertanto, un maggior numero di genotipi di cotone può essere valutato in un unico esperimento, poiché non è necessaria alcuna elaborazione aggiuntiva dei campioni prima della valutazione dei conteggi dei nematodi. Inoltre, è vantaggioso conservare i campioni di radice in acqua di rubinetto per diversi giorni, il che consente alle radici di decolorarsi, rendendo il conteggio più facile.
Il protocollo descritto consente lo screening di popolazioni più grandi al fine di ridurre la variazione ambientale che si verificherà tra gli esperimenti. Utilizzando una camera di crescita delle piante di 900 m2 dotata di un sistema di irrigazione automatico, è possibile valutare popolazioni di 480 singole piante. Il protocollo è stato utilizzato con successo per valutare popolazioni separate di 300 o più individui per caratterizzare la genetica della resistenza10,18. Queste popolazioni hanno mostrato che la variazione quantitativa per l'infezione e la resistenza dei nematodi in G. l'arboreo può essere più spesso associato a più geni recessivi; quindi, le popolazioni più grandi sono necessarie per gli studi genetici. Inoltre, si osserva una variazione quantitativa nella separazione delle popolazioni, indipendentemente dal protocollo impiegato, per valutare la risposta all'infezione da nematodi.
La resistenza ospite-pianta nel cotone può ostacolare la capacità del nematode di infettare il sistema radicale e stabilire un sito di alimentazione, ma può anche influenzare la capacità riproduttiva del nematode. Il protocollo di screening descritto valuta il numero di nematodi che sono in grado di stabilire un sito di alimentazione sul sistema radicale del cotone. La riproduzione dei nematodi misurata dalla produzione di uova non è stata valutata in questo protocollo, che è una limitazione importante. Tuttavia, il protocollo può essere modificato per raccogliere questo tipo di dati. In alternativa, è possibile utilizzare un'altra metodologia per raccogliere questi dati dopo l'imposizione di genotipi resistenti, il che riduce la necessità di vagliare un gran numero di individui.
I dati delle valutazioni dei nematodi dei singoli genotipi possono essere variabili all'interno e tra gli esperimenti, che è un problema comune con tutti i protocolli di screening utilizzati per valutare R. resistenza reniformis per genotipi di cotone. L'uso di un progetto sperimentale con repliche multiple per lo screening delle adesioni al germoplasma aiuterà a valutare questa variazione per l'identificazione di genotipi resistenti. Inoltre, l'inclusione degli stessi genotipi di controllo resistenti e suscettibili tra gli esperimenti è utile per valutare questa variazione e confrontare i risultati di più esperimenti. Questi controlli sono utilizzati anche per monitorare il successo dell'inoculazione dei nematodi. Inoltre, i mezzi di dati di questi controlli vengono utilizzati per classificare i genotipi come resistenti o suscettibili10,16. I genotipi di cotone sono tipicamente classificati come resistenti se mostrano meno del 10% dell'infezione osservata sul controllo suscettibile16,23. La crescita delle radici è un altro fattore che contribuisce alla variazione osservata nei dati utilizzando il protocollo, perché le piante che hanno una radice di rubinetto con meno radici laterali offrono meno siti per l'infezione, che può provocare meno nematodi per grammo di radice.
La difficoltà nello sviluppo di nuove varietà di cotone di montagna utilizzando altre specie di cotone come fonte di geni di resistenza richiede un protocollo di propagazione vegetativa al fine di far avanzare le linee di allevamento alla generazione successiva per un'ulteriore selezione o razza. Un semplice protocollo di propagazione vegetativa come descritto è stato sviluppato per recuperare le piante dopo la valutazione del nematode. Il protocollo è stato utilizzato con successo per recuperare piante da grandi popolazioni18. Tipicamente, il sistema radicale viene recuperato entro 30 giorni dopo l'impianto del germoglio vegetativo. I tassi di sopravvivenza sono spesso superiori al 95%. Le piante che mostrano scarso vigore possono essere perse quando si propaga un gran numero di piante. In generale, meno dell'1% delle piante non è riuscito a mostrare la crescita della radice o del tiro. Il protocollo può essere facilmente modificato e utilizzato con altri protocolli di screening dei nematode.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata finanziata dal Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti, Servizio di Ricerca Agricola. Menzione di nomi commerciali e prodotti commerciali in questo articolo sono esclusivamente allo scopo di fornire informazioni specifiche e non implicano raccomandazioni o approvazioni da parte del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti. USDA è un fornitore di pari opportunità e datore di lavoro. Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da dichiarare. L'assistenza tecnica è stata fornita da Kristi Jordan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ray Leach Cone-tainer | Stuewe and Sons Inc. | SC10U | |
| Cone-tainer tray | Stuewe and Sons Inc. | RL98 | |
| Sand | various | ||
| Cotton balls | various | ||
| Pylon 4 inch plant labels (4 in L x 5/8 in W) | Pylon Platics | L-4-W | Any brand or vendor is acceptible. |
| 4 oz. specimen containers | Fisher Scientific | 16-320-731 | Any brand or vendor is acceptible. |
| Red food coloring | McCormick & Co., Inc. | ||
| 1 mL Pipet tips | various | ||
| 10 L container | various | Inexpensive buckets work well. | |
| 6 L pots | Nursery Supplies Inc. | Poly-Tainer-Can No2A | Any brand or vendor is acceptible. Different size pots can be used |
| Potting media | Sun Gro Horticulture | Metro-Mix 360 | Any brand or vendor is acceptible. |
| Fertilizer | Everris NA Inc. | Osmocote Plus | Any brand or vendor is acceptible. |
| Plastic container (73.6 cm L x 45.7 cm W x 15.2 cm D) | Rubbermaid | 3O29 | Any brand or vendor is acceptible. |
References
- Heald, C. M., Robinson, A. F. Survey of current distribution of Rotylenchulus reniformis. in the United States. Journal of Nematology. 22 (4), 695-699 (1990).
- Koenning, S. R., Wrather, J. A., Kirkpatrick, T. L., Walker, N. R., Starr, J. L., Mueller, J. D. Plant-parasitic nematodes attacking cotton in the United States: old and emerging production challenges. Plant Disease. 88 (2), 100-113 (2004).
- Robinson, A. F. Reniform in U.S. cotton: when, where, why, and some remedies. Annual Review of Phytopathology. 45, 263-288 (2007).
- Robinson, A. F., Inserra, R. N., Caswell-Chen, E. P., Vovlas, N., Troccoli, A. Rotylenchulus species: identification, distribution, host ranges, and crop plant resistance. Nematropica. 27 (2), 127-180 (1997).
- Davis, R. F., Koenning, S. R., Kemerait, R. C., Cummings, T. D., Hurley, W. D. Rotylenchulus reniformis management in cotton with crop rotation. Journal of Nematology. 35 (1), 58-64 (2003).
- Starr, J. L., Koenning, S. R., Kirkpatrick, T. L., Robinson, A. F., Roberts, P. A., Nichols, R. L. The future of nematode management in cotton. Journal of Nematology. 39 (4), 283-294 (2007).
- Weaver, D. B., Lawrence, K. S., van Santen, E. Reniform nematode resistance in upland cotton germplasm. Crop Science. 47 (1), 19-24 (2007).
- Robinson, A. F., Cook, C. G., Percival, A. E. Resistance to Rotylenchulus reniformis and Meloidogyne incognita race 3 in the major cotton cultivars planted since 1950. Crop Science. 39 (3), 850-858 (1999).
- Carter, W. W. Resistance and resistant reaction of Gossypium arboreum to the reniform nematode, Rotylenchulus reniformis. Journal of Nematology. 13 (3), 368-374 (1981).
- Erpelding, J. E., Stetina, S. R. Genetics of reniform nematode resistance in Gossypium arboreum germplasm line PI 529728. World Journal of Agricultural Research. 1 (4), 48-53 (2013).
- Robinson, A. F., Bridges, A. C., Percival, A. E. New sources of resistance to the reniform (Rotylenchulus reniformis) and root-knot (Meloidogyne incognita) nematode in upland (Gossypium hirsutum L.) and sea island (G. barbadense L.) cotton. Journal of Cotton Science. 8 (3), 191-197 (2004).
- Robinson, A. F., Percival, A. E. Resistance to Meloidogyne incognita race 3 and Rotylenchulus reniformis in wild accessions of Gossypium hirsutum and G. barbadense from Mexico. Journal of Nematology. 29 (4), 746-755 (1997).
- Stetina, S. R., Young, L. D. Comparisons of female and egg assays to identify Rotylenchulus reniformis resistance in cotton. Journal of Nematology. 38 (3), 326-332 (2006).
- Usery, S. R. Jr, Lawrence, K. S., Lawrence, G. W., Burmester, C. H. Evaluation of cotton cultivars for resistance and tolerance to Rotylenchulus reniformis. Nematropica. 35 (2), 121-133 (2005).
- Yik, C. -P., Birchfield, W. Resistant germplasm in Gossypium species and related plants to Rotylenchulus reniformis. Journal of Nematology. 16 (2), 146-153 (1984).
- Stetina, S. R., Erpelding, J. E. Gossypium arboreum accessions resistant to Rotylenchulus reniformis. Journal of Nematology. 48 (4), 223-230 (2016).
- Thies, J. A., Merrill, S. B., Corley, E. L. Red food coloring stain: new, safer procedures for staining nematodes in roots and egg masses on root surfaces. Journal of Nematology. 34 (2), 179-181 (2002).
- Erpelding, J. E., Stetina, S. R. Genetic characterization of reniform nematode resistance for Gossypium arboreum accession PI 417895. Plant Breeding. 137 (1), 81-88 (2018).
- Byrd, D. W. Jr, et al. Two semi-automatic elutriators for extracting nematodes and certain fungi from soil. Journal of Nematology. 8 (3), 206-212 (1976).
- Jenkins, W. R. A rapid centrifugal-flotation technique for separating nematodes from soil. Plant Disease Reporter. 48 (9), 692 (1964).
- Robinson, A. F., Heald, C. M. Carbon dioxide and temperature gradients in Baermann funnel extraction of Rotylenchulus reniformis. Journal of Nematology. 23 (1), 28-38 (1991).
- Williams, C., Gilman, D. F., Fontenot, D. S., Birchfield, W. A rapid technique for screening soybeans for reniform nematode resistance. Plant Disease Reporter. 63 (10), 827-829 (1979).
- Schmitt, D. P., Shannon, G. Differentiating soybean responses to Heterodera glycines races. Crop Science. 32 (1), 275-277 (1992).
