Summary
이 원고는 단일 벽 탄소 나노튜브 (SWCNT)의 합성에 설명 합니다-는 SWCNT의 안정적인 납품과의 강력한 치료 효과 보여 주는 MALAT1 센스 gapmer DNA oligonucleotide (SWCNT-안티-MALAT1) 활용 안티-MALAT1 생체 외에서 그리고 vivo. 합성, 수정, 활용, 사용 하는 방법 그리고 주입 SWCNT-안티-MALAT1의 설명.
Abstract
단일 벽 탄소 나노튜브 (SWCNT)는 새로운 유형의 나노, 세포, 단백질, oligonucleotides, 합성 작은 분자 약물 등으로 약의 여러 종류를 제공 하는 데 사용 되었습니다. SWCNT 사용자 정의 크기, 큰 표면 영역 있고 유연 하 게 표면;에 다른 수정 마약으로 바인딩할 수 있습니다. 따라서, 셀으로 마약을 수송 하는 이상적인 시스템 이다. 긴 noncoding RNAs (lncRNAs)는 200 이상 noncoding RNA의 클러스터 nt는 단백질에 번역 될 수 없습니다 하지만 생물 학적 및 병 태 생리 과정에 중요 한 역할. 전이 관련 된 폐 선 암 사본 1 (MALAT1)은 매우 보존된 lncRNA 이다. 그것은 상부 MALAT1 여러 발성 (MM)를 포함 한 다양 한 암에서의 빈약한 예 지에 관련 된 시연 했다. 우리 MALAT1 mm; DNA 수리 및 세포 죽음 통제 밝혀졌다 따라서, MALAT1 m M에 대 한 치료 대상으로 간주 될 수 있습니다. 그러나, 센스 oligo의 억제/최저 MALAT1 vivo에서 효율적인 배달 여전히 문제입니다. 이 연구에서 우리 못 2000 SWCNT 수정 그것에 안티 MALAT1 올리고 켤레, 테스트 생체 외에서 화합물의 배달, 전파 m M 마우스 모델, 정 맥 주입 하 고 나타내는 m M 진행의 중요 한 금지를 관찰 그 SWCNT 안티 MALAT1 gapmer DNA에 대 한 이상적인 배달 셔틀 이다.
Introduction
SWCNT 소설을 접한 제공할 수 있는 다양 한 유형의 약물, 단백질, 작은 분자, 핵 산 등 안정적이 고 효율적으로 이상적인 tolerability와 시험관1 에 vivo에서2최소 독성입니다. 기능성된 SWCNT 좋은 생체 적합성 및 물 가용성, 작은 분자에 대 한 셔틀으로 사용 될 수 있으며 세포 막3,,45에 침투 하는 그들을 가져올 수 있다.
lncRNAs는 RNA의 클러스터 (> 200 nt) 게놈에서 mRNA를 복사할 수는 있지만 단백질에 번역 될 수 없습니다. LncRNAs 유전자 식6 의 규칙에 참여 하 고 개시와 대부분의 유형의 암, m M7,8,9등의 진행에 관련 된 증거를 증가 보이고 있다. MALAT1 핵 농축 noncoding 사본을 2 (NEAT2)은 매우 보존된 lncRNA10. MALAT1 전이성 비 작은 세포 폐 암 (NSCLC)11, 처음 인식 하지만 수많은 종양5,,1213;에 overexpressed 되었습니다. 그것은 가장 높은 표현된 lncRNAs 중 하나 이며 m M8,14에서 가난한 예 후와 상관 된다. MALAT1 식 수준 치명적인 코스 extramedullary m M 환자 m M15로 진단만 그에 비해 크게 높은 수준 이다.
이전 연구에서 우리는 안티-MALAT1 oligos 튼튼하게 이어질 DNA 손상 및 m M16 에서 apoptosis gapmer DNA 센스 oligonucleotides MALAT1 타겟팅을 사용 하 여 확인 했습니다 (안티-MALAT1) MM 셀에서. Gapmer DNA 센스 DNA의 구성 이며 2'-오메-RNAs, RNase H 한 번 바운드 활동17여 MALAT1 분열을 프롬프트 수 있는 연결. 센스 oligos의 생체 조건 납품 효율성은 아직도 그것의 임상 사용을 제한합니다.
배달 테스트 안티 MALAT1 gapmer oligos, DNA DSPE-PEG2000-아민에 활용 된 안티 MALAT1 gapmer에 대 한 SWCNT의 효과 기능성 SWCNT. SWCNT 안티 MALAT1 다음 주입 정 맥 MM 전파 마우스 모델; 눈에 띄는 억제 4 치료 후 관찰 됩니다.
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Protocol
모든 실험 동물 관련 된 사전 (기관 동물 관리 및 사용 위원회) 클리블랜드 클리닉 IACUC에 의해 승인 되었다.
1입니다. 기능성된 SWCNTs의 합성
- SWCNTs, DSPE-PEG2000-아민의 5 mg 및 유리 섬광 유리병 (20 mL) 소독된 nuclease 무료 물 5 mL의 혼합 1 밀리 그램. 흔들어 모든 시 약을 완전히 분해 하는 게.
- 실 온에서 1 h 40 W의 전력 레벨에서 물 목욕 sonicator에 유리병을 sonicate (RT, 20 분 x 3, 과열 방지를 위해 물 매 20 분을 변경). 그리고, 24000 x g 6 h에서 원심 표면에 뜨는 솔루션을 수집 합니다. 이 기능 SWCNT 솔루션 2 개월 동안 4 ℃에 저장할 수 있습니다.
- 이어서 소독된 nuclease 무료 물 4 mL 100 kDa MWCO 원심 필터 장치, 단계 1.2에서에서 SWCNT 솔루션의 1 mL를 추가 합니다. 여분의 DSPE-PEG2000-아민을 제거 하는 RT에 4000 x g 에서 10 분 원심 분리기. 물과 원심 분리 5의 4 mL의 추가 반복 x. 남은 SWCNT 솔루션의 0.5 mL 이상 각 원심 분리 후 필터에 남아 있을 것입니다.
- 808에 UV/VIS 분 광 계를 사용 하 여 필터에 남은 SWCNT 용액의 농도 측정 최종 세척 후 nm. 최종 농도 일반적으로 약 50 mg/L (캄 외.18에 의해 개발 된 방법에 따라 계산).
참고: DSPE-말뚝-기능성된 SWCNTs 수용 단계 1.4 후는 몇 주 후 보이는 집계 없이 다른 생물학 솔루션 안정 확인 하십시오.
2. 안티 MALAT1 Gapmer DNA의 활용 기능성된 SWCNT 2'-O 수정된 RNAs에 의해 형벌
- DSPE-PEG2000-아민의 450 µ L에 0.5 mg Sulfo-LC-SPDP의 공업화 SWCNT를 추가 합니다. 10 x PBS의 50 µ L을 추가 하 고 실시간에 2 h에 대 한 품 어
- 여분의 Sulfo-LC-SPDP를 제거 하려면 다음 nuclease 무료 물 4 mL 100 kDa MWCO 원심 필터 장치, 단계 2.1에서에서 반응을 추가 합니다. 물과는 원심 분리의 실시간 반복 4 mL의 추가에서 4000 x g 에서 10 분 원심 5 배.
- 200 nM thiol 수정 안티 MALAT1 Cy3 gapmer DNA 상업 DTT 솔루션의 1.5 mL에 추가 하 고 제조 업체의 프로토콜에 따라 NAP-5 열 제품 실시간 Purify에서 90 분 동안 품 어. 500 µ L의 멸 균된 nuclease 무료 1와 안티 MALAT1 Cy3 elute PBS x.
참고: 기능성된 SWCNT 이황화 결합 thiolated 안티 MALAT1 gapmer DNA의 저장 동안 쪼개 다 수 추가 된 DTT와 함께 저장할 수 있습니다. 추가 된 DTT aNAP-5 열 SWCNT와 활용 하기 전에 제거할 수 있습니다. - 필터에 남아 sulfo LC-SPDP-대우 DSPE-PEG2000-아민 SWCNT 솔루션을 수집 하 고 안티 MALAT1 Cy3 솔루션의 500 µ L로 희석. 그런 다음, 24 h 4 ° C에서 품 어. 활용 된 SWCNT-안티-MALAT1 3 주 동안 4 ℃에 저장할 수 있습니다. 동일한 절차에 따라 출 격 센스 올리고 함께 활용된 SWCNT 합성 고 SWCNT 제어로 사용 될 수 있습니다.
3. 꼬리 정 맥 주입 SWCNT-안티-MALAT1의
-
MM 전파 마우스 모델을 생성 합니다.
- 비교의 최상의 결과 얻기 위해 임의로 14 끄 덕을 정렬 합니다. 재판 또는 컨트롤 그룹 (각 그룹에서 7) 같은 남성/여성 비율으로 CB17-Prkdcscid/J 쥐 (8 주 정도)
- 작업 벤치를 청소 하 고 70% 알코올로 소독.
- 나타나는 정 맥 꼬리 수 있도록 마우스를 따뜻하게 하는 난방 램프를 사용 합니다. 꼬리 주입 restrainer와 마우스를 제대로 제 지.
- 주사 마 취 없이 꼬리 정 맥을 통해 PBS의 50 µ L에서 5 x 106 MM.1S-뤽-mCherry 셀. 30 s. 마크 삽입 된 마우스에 대 한 알코올 면봉으로 사출 사이트를 누르고 깨끗 한 케이지를 반환 합니다.
-
하루 7 MM.1S 세포 주입 후에 치료를 시작 합니다.
- 마우스의 꼬리 정 맥에 SWCNT-안티-MALAT1를 포함 하는 PBS의 50 µ L을 주입. 사용 하 여 PBS SWCNT 컨트롤로 제어 포함.
- 30 대 알코올 면봉으로 사출 사이트를 눌러 s.
- 꼬리와 1 분에 대 한 마우스의 일반적인 동작에 로컬 출혈을 관찰 하 고 깨끗 한 케이지를 반환 합니다. 다시 주사 잘 용납 되도록 랙에 케이지를 반환 하기 전에 모든 주입 된 쥐를 관찰 합니다.
-
주사는 실험 종료까지 7 일 마다 반복 합니다.
- 마우스의 일반 건강 저하 때 실험을 종료: 때 안 먹고 마시거나, 창백한 발 모양, 피하 출혈, 호흡 곤란 감소 활동, 더 낮은 사지에 만질 수 있는 질량의 마비는 복 부는 관찰 했다.
4입니다. 질병의 진행의 평가
- MM.1S-뤽-mCherry 세포 주입 후 매일 쥐의 일반적인 상태를 평가 합니다. 특정 주의 쥐 개발 하는 경우 더 낮은 사지의 마비.
-
종양의 성장 시스템을 사용 하는 vivo에서 이미징 1 주, x SWCNT-안티-MALAT1 주입 하기 전에 평가 합니다.
- 1 x PBS와 신선한 15 mg/mL D 소를 준비 합니다.
- Isoflurane 기화 기 (유도 대 한 3-5% 및 유지 보수, 쥐의 상태에 따라 1-3%)와 마우스 anesthetize
- Intraperitoneally D 소 각 마우스에 150 mg/kg을 주사, 이미징; 하기 전에 5 분, 그런 다음는 스펙트럼 이미징 시스템 경향이 위치에 마우스를 이미지.
- 냉 광 채도 도달할 때까지 마우스 마다 2 분의 연속 이미지를 수집 합니다. D-소 글귀/신호에 따라 간격을 조정 합니다.
- CO2 를 사용 하 여 실험의 종료에 도달 하면 쥐를 희생.
-
이 MM 전파 모델 이므로, 쥐를 다음과 같이 처리 합니다.
- 해 부 하기 전에 마우스 무게.
- 완전 한 혈액 검사 (CBC) 분석 결과 혈액 세포 카운터 기계에 의해 수행에 대 한 마음에서 말 초 혈액을 수집 합니다. 백혈구와 적혈구의 뿐만 아니라 림프 톨의 비율은 기본 인덱스.
- 비장을 분리 하 고 그것의 무게. 비장/몸 무게;의 비율을 계산 고려 > 비장 확대로 0.5%.
- 골 수, 비장, 림프절, 신장, 조직 및 보이는 전이 함께 조직 수집 합니다.
- 마우스는 더 낮은 사지의 마비를 개발 하는 경우 척추를 수집 합니다.
- 골 수 샘플에서 RNA와 단백질을 추출 합니다.
- 포 르 말린에 모든 나머지 조직 수정.
- Decalcification, 정착의 24 h 후 5 일 동안 0.25 M EDTA 용액 (pH 8.0)에 뼈 샘플을 담가.
- 모든 샘플 장기 저장을 위한 75% 알코올에 담가.
- 두 그룹에 같은 시간 지점에서 luciferase의 신호 강도 비교 합니다. 두 그룹에서 각 마우스의 희생 날짜를 기록 하 고 소프트웨어와 함께 두 그룹의 생존 곡선을 계산 합니다.
참고: 모든 절차는 그림 1에서 요약 된다.
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Representative Results
안티 MALAT1 gapmer m M에서 DNA의 억제 효과 보여, 우리 MALAT1의 식을 무 너 뜨 하 고 H929 및 MM.1S 세포에 그것을 사용. 48 시간 후, 셀 눕 힘 효율성의 분석을 위해 수집 하 고 안티 MALAT1 gapmer 또는 컨트롤 DNA transfected 세포에 있는 apoptosis 상태. qRT-PCR 결과 안티 MALAT1 gapmer DNA 뜨 MALAT1 식 H929 및 MM.1S 세포에 효율적으로 나타났다 (그림 2A). Apoptosis의 상태 cytometry 아래로 MALAT1 크게 apoptosis 유도 공개에 의해 결정 되었다 (그림 2B).
이 결과 안티 MALAT1 oligos MM 효과적으로 생체 외 억제를 나타냅니다. 그러나,는 효율적인 전달 방법/안티 MALAT1 oligos vivo에서 셔틀 하는 데 필요한 개발, 임상 응용; 센스 oligos의 장애물입니다. 따라서 SWCNT에 우리의 관심. SWCNT는 적절 한 수정; 후 화란과 dissolubility을 개발할 수 있는 약물 전달에 대 한 소설을 접한 따라서, 그것은 oligonucleotide 마약 등 다양 한 형태의 화물을 제공할 수 있습니다. Vivo에서 SWCNT의 배달 효율성을 확인 하기 위해 우리는 먼저 SWCNT19화란 및 바인딩 특이성을 부여 DSPE-PEG2000-아민으로 SWCNT functionalized. 그런 다음이 기능 SWCNT sulfo-LC-SPDP는 oligo와 연결 하는 데 사용 됩니다 무료 sulfhydryl 그룹을 만들로 대우 되었다. 안티 MALAT1 올리고 고 sulfo LC SPDP 대우 SWCNT 켤레를 안티 MALAT1 올리고의 5' 끝 수정 thiol 그룹 (S S); 가시는 배달 추적, 안티 MALAT1 oligo의 3' 끝 cyanine 3 (Cy3)로 수정 되었습니다. 모든 합성 단계 후 SWCNT 안티 MALAT1 Cy3 (그림 1)12를 취득 했다. 다음, 그것은 배달 효율성을 확인 하기 위해 H929 GFP와 MM.1S GFP 셀의 문화 매체에 추가 되었습니다.
그림 2C같이 SWCNT 안티 MALAT1 Cy3 m M 세포의 핵에 효율적으로 전달 했다 그리고 H929 및 MM.1S 셀 (그림 2D)에 생 MALAT1 수준 크게 억제. 정상 세포에서 SWCNT의 안전과 독성 검사, SWCNT 안티 MALAT1 Cy3 다른 농도; BMEC-1 셀의 매체에 추가 되었습니다. Lipofectamine은 치료 제어; 일반 매체 필수 컨트롤 (그림 2E)으로 사용 되었다. 다음, 세포 생존 세포 생존 능력 분석 실험 키트를 사용 하 여 1 일, 하루 2, 3 일에 발견 되었다. 세포 생존 능력 저해에 큰 차이 SWCNT 안티 MALAT1 Cy3 다른 복용량과 시간 지점에서 치료 컨트롤 간에 발견 됐다. 거기는 차이가 없습니다, 일반 매체 (NC)에 비해 SWCNT 안티 MALAT1 Cy3의 독성은 높은 복용량에 정상 세포에 제한 하 고 수락 가능한 독성을가지고 치료 컨트롤과 유사 하 게 나타냅니다.
다음으로, 인간-m M 전파 마우스 모델 SWCNT-안티-MALAT1 vivo에서의 치료 효과 평가 하기 위해 설립 되었다. 첫째, 각 SCID 베이지색 마우스 (8 주 정도)의 주사 5 x 106 MM.1S-뤽-mCherry 세포와 정 맥 (그림 3). 14 마우스의 총 MM.1S 세포;로 주입 했다 그 중 7 쥐 SWCNT 안티 MALAT1 Cy3 치료 그룹으로 무작위로 배열 되었다 하 고 다른 7 제어 그룹에서 했다. SWCNT-안티-MALAT1 및 SWCNT 제어 oligos 1 x PBS의 0.5 mL에 용 해 되었고 종양 세포 주입 후 7 일 꼬리 정 맥을 통해 주입. SWCNT 안티 MALAT1 Cy3 치료 실험의 종료까지 7 일 마다 반복 되었다. 종양 부담 평가, 소 신호는 vivo에서 이미징 시스템 (IVIS) 1 소 주사 후 30 분 SWCNT 올리고 주입 전에 주 x에 의해 관찰 되었다. 우리 SWCNT-안티-MALAT1 처리 그룹에서 마우스의 소 신호 처리 (28 일)에서 21 일 후 SWCNT 제어 치료 그룹의 그들과 현저 하 게 낮은 비교 했다 발견. 그들의 건강 및 생존 상태 체크는 매일 기록 하 고 카 플 란-마이어 곡선에 요약. 이러한 결과에서 우리는 정 맥 주입을 통해 SWCNT-안티-MALAT1 치료를 제공할 수 있습니다 안티-MALAT1 oligos 종양 세포에 효과적으로 결론을 내렸다. 우리, 다음, 종양 짐 제한 및 쥐의 수명을 연장 (p = 0.04) 예상 대로 생체 외에서 결과 비슷합니다. 우리가 찾지 못했습니다 어떤 중요 한 부작용은 치료의 쥐에 SWCNT-안티-MALAT1 주입은 쥐;에 대 한 안전한 치료 표시 모든 실험 기간 동안 따라서, SWCNT 안티 MALAT1에 대 한 안전 하 고 안정적인 vivo에서 배달 시스템입니다.
그림 1 : 합성, 흡수의 회로도 SWCNT 안티 MALAT1 Cy3 gapmer oligo의 vivo에서 분리. (A) SWCNT DSPE-PEG2000-아민으로 공업화 되었고, 그 후, 안티-MALAT1-Cy3 이황화 결합 Sulfo-LC-SPDP에 의해 중재를 통해 함께 활용. (B) SWCNT 활용 된 안티-MALAT1 꼬리 정 맥을 통해 MM.1S-뤽-mCherry 세포를 가진 쥐에 주입 했다. (C) SWCNT 활용 된 안티-MALAT1 삽입 또는 endocytosis 통해 인지질 bilayer 막 침투. (D) SWCNT-안티-MALAT1 셀;에 의해 흡수 후 초기 endosomes 내 포장 되었다 그리고 초기 endosome 늦은 endosome 성숙는 endolysosome를 형성 하는 리소좀과 병합 합니다. endolysosome 이황화 결합을 끊어서 안티-MALAT1는 SWCNT에서 출시 하는 데 도움이 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : SWCNT-안티-MALAT1 최소 독성으로 효율적으로 전달 했다 그리고 MM 셀 라인에서 apoptosis 유도. SWCNT-안티-MALAT1 gapmer oligo 또는 SWCNT 제어 올리고 각각 H929 및 MM.1S 셀으로 Lipofectamine에 의해 페 했다. 48 시간 후, 우리는 수집 셀 (A) MALAT1 식의 분석에 대 한 qRT-PCR 및 (B) apoptosis 분석 cytometry에 의해. (C) H929-GFP와 MM.1S GFP 셀 48 시간; SWCNT 안티 MALAT1 Cy3와 공동 경작 했다 전달 효율은 형광 현미경에 의해 결정 되었다 (규모 바 = 100 µ m). (D) 식 수준 ofMALAT1 qRT-PCR, 그것은 성공적으로 H929 및 MM.1S 셀에서 절 했다 보여주었다에 의해 발견 되었다 (* * p < 0.01, * * * p < 0.001). (E) SWCNT와 치료 컨트롤 다른 복용량에서 BMEC-1 세포의 문화 매체에 추가 되었습니다. 확산은 세포 생존 능력 분석 실험 키트를 사용 하 여 측정 했다. 이 그림은 후 외.16에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : SWCNT-안티-MALAT1 발성 MM.1S 셀 건설 MM 전파 마우스 모델에서 성장 억제. (A) 5 x 106 MM.1S-뤽-mCherry 셀 비친된 SCID 베이지색 쥐 (각 그룹에서 7);의 꼬리 정 맥에 정 맥 주입 했다 50 μ SWCNT-안티-MALAT1 또는 SWCNT 제어 솔루션의 MM.1S 세포 주입 후 7 일에서 꼬리 정 맥을 통해 7 일 마다 주입 했다. IVIS 종양 성장 모니터링 하는 데 사용 되었다. (B) 뒷 다리 마비와 종양 부담 끝점으로 사용 되었다 그리고 카 플 란-마이어 분석에 의해 생존 데이터 분석 했다. 이 그림에서 Hu 수정 되었습니다 외.16. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
LncRNAs m M7,,89;를 포함 하 여 암에 수많은 생리 및 병 태 생리 절차의 규칙에 참여를 보이고 있다는 증거 그들은 센스 oligonucleotides20,,2122에 의해 실현 될 수 있는 암 치료에 대 한 타겟이 될 가능성이 있다. 미국 식품 및 의약품 안전 청 (FDA)는 세포 망막23, homozygous 가족성 콜레스테롤 혈 증24에 대 한 nusinersen mipomersen fomivirsen를 포함 하 여 여러 센스 oligonucleotide 약물 승인 척추 근육 위축25, 그리고 듀 켄 씨 근이 영양 증26eteplirsen. 이 연구에서 우리는 2'-오메-RNA와 안티 MALAT1 gapmer DNA를 수정 하 고 기능 SWCNT와 활용. SWCNT를 전달 하 고 뿐만 아니라 그것의 유연성과 다중 로드 올리고 대상의 선호도 향상 또한는 oligos 안정화 및 전달27 중 nuclease 저하를 방지 하는 데 도움이 하는 셔틀으로 안티 MALAT1 oligos를 제공 .
SWCNTs의 표면에 적당 한 수정 생리학 관련, 수성 환경에서 안정적인 dispersibility 얻을 하 고 그들의 biodistribution28,29홍보 수 있습니다. 우리 SWCNT에 이식 하 고 그것의 수성 가용성을 향상 시킬 수 입증 되었습니다, SWCNT를 수정 하려면 DSPE-PEG2000-아민을 사용 하 고 또한, 그것은 생물 학적 미디어30덩어리 없이 우수한 안정성을 보였다. Sulfo-LC-SPDP는 이황화 결합을 통해 안티 MALAT1 gapmer DNA 바인딩 이후 세포로 그들을 제공 하는 기능성된 SWCNT를 도운 실험에서 crosslinker로 사용 되었다. 일단은 SWCNT m M 세포에 침투, 그들은 다음 늦은 endosomes (pH 5.0 ~) 동반 감소 pH 값31을 성숙 초기 endosomes (pH 6.0 ~)에 의해 채택 되었다. 못 링크의 장점은 결합은 pH에 안정 > pH 5.5 미만32,,3334일단 2 시간 못 연결 약물의 75-95%까지 하지만 6 릴리스 되었습니다. SWCNT-안티-MALAT1 들고 Endosomes 병합 리소좀 (pH 4.5 ~)는 endolysosome를 그리고 이황화 채권35낮은 pH 최적으로 활성화 되었다 lysosomal thiol reductase에 의해 촉매 했다. 이것, 그 후, 무료 안티-MALAT1 gapmer DNA를 발표 했다. 실험 결과 생체 외에서 그리고 vivo에서 SWCNT SWCNT-안티-MALAT1를 효과적으로 전달 하 고 안티-MALAT1 체 외에 함수에서 유사 하 게 작동 하는 데 도움이.
두 가지 패턴을 통해 인지질 bilayer 통해 기능성된 SWCNTs 패스: 삽입36,및 endocytosis37 38,39. 이 절차는 SWCNT의 독성을 감소 따라서 세포 막의 안정화를 방해 하지 않고 셀에 화물을 전달 SWCNT 도움이 됩니다. 우리는 각 마우스 (~ 20 g);에 SWCNT-안티-MALAT1 (~ 40 mg/L)의 50 µ L를 주입 따라서, 최종 약물 농도 우리가 독성 실험 (2 mg/L와 4 mg/L)에 사용 되는 복용량 보다 훨씬 낮은 0.1 mg/kg 이었다. 결과, SWCNT 치료 컨트롤 (예: Lipofectamine)으로 비슷한 효과 세포 성장에 그리고 생존 능력에 일치 복용량 이전. 치료 컨트롤 이며 세포 transfection에 대 한 일반적인 시 약을 셀;에 제한 하 고 수락 가능한 독성을가지고 있다고 따라서, 우리 SWCNT만 정상 세포에 대 한 최소 독성을 가진다 고 믿는다.
센스 oligonucleotides 셔틀으로 대사 SWCNT의 안전에 대 한 또 다른 중요 한 고려 사항입니다. 그것은 기능성된 SWCNT 사 및 관 독성40없이 신장 통해 배설 주로 증명 되었습니다. 우리가 찾지 못한 신장 역 기능 관련 증상, oliguria, anuria, 부 종, 신장의 모양 변경 등, SWCNT 주입을 허용 하는 마우스. 따라서, SWCNTs는 정상적인 신장 기능을 가진 마우스에 어떤 비정상적인 축적 때문 아니 독성 효과 있다.
우리는 먼저 켤레 안티 감각 oligonucleotides 기능성된 SWCNT와 lncRNA를 대상으로 하 고 m M 치료를 위해 그것을 사용 하 여. SWCNT 일관 카이랄성, 선택적 직경 및 길이 분포는 소설을 접한의 유형입니다. 기능화 치료 후, SWCNTs 물 용 해도 및 생체 적합성 개발 마약 유통 증가 하 고 치료 효과 강화 함으로써 세포 막을 통해 수많은 화물을 제공 하는 이상적인 생물 셔틀 되 고. 또한, SWCNT nuclease 소화1에서 안티 감각 oligonucleotide 분자 안정 수 있습니다. 결과 표시, 기능성된 SWCNT-안티-MALAT1 m M 세포로 MALAT1를 효율적으로 전달 하 고 극적으로 선에서 세포 생체 외에서 그리고 vivo에서 전파 마우스 모델에서 MM 성장을 저해. 지금까지 우리가 이러한 실험에 SWCNT 처리 때문에 어떤 독성을 관찰 하지 않았다. 이 연구에서는 SWCNT 센스 oligonucleotide 약물에 대 한 안전 하 고 효과적인 배달 차량 이며, 환자 치료 분자 캐리어로 사용 되는 보여 줍니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자 러너 연구소 proteomic, 게놈, 및 그들의 지원에 대 한 이미징 코어를 감사 하 고 지원 합니다. 자금:이 작품 NIH/NCI 부여 R00 CA172292 (J.J.Z.) (J.J.Z.)을 창업 자금 및 임상 및 변환 과학 공동 (CTSC) 케이스 서쪽 예비 대학 코어 사용률 파일럿 부여 (J.J.Z.)의 의해 재정적으로 지원 되었다. 이 작품 활용 건강 SIG의 국가 학회 교부 금 1S10OD019972-01 자금 구입 했던 Leica SP8 confocal 현미경.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SWCNTs | Millipore-Sigma | 704113 | |
| DSPE-PEG2000-Amine | Avanti Polar Lipids | 880128 | |
| bath sonicator | VWR | 97043-992 | |
| 4 mL centrifugal filter | Millipore-Sigma | Z740208-8EA | |
| UV/VIS spectrometer | Thermo Fisher Scientific | accuSkan GO UV/Vis Microplate Spectrophotometer | extinction coefficient of 0.0465 L/mg/cm at 808 nm |
| Sulfo-LC-SPDP | ProteoChem | c1118 | |
| DTT solution | Millipore-Sigma | 43815 | |
| NAP-5 column | GE Healthcare | 17-0853-01 | |
| in vivo imaging system | PerkinElmer | ||
| NOD.CB17-Prkdcscid/J mice | Charles River lab | 250 | |
| Flow cytometer | Becton Dickinso | ||
| Lipofectamine | Invitrogen | 11668019 | Lipofectamine2000 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 10437-028 | |
| RMPI-1640 medium | Invitrogen | 11875-093 | |
| MALAT1-QF: | synthesized by IDT Company | 5’- GTTCTGATCCCGCTGCTATT - 3’ | |
| MALAT1-QR: | synthesized by IDT Company | 5’- TCCTCAACACTCAGCCTTTATC - 3’ | |
| GAPDH-QF: | synthesized by IDT Company | 5’- CAAGAGCACAAGAGGAAGAGAG - 3’ | |
| GAPDH-QR: | synthesized by IDT Company | 5’- CTACATGGCAACTGTGAGGAG - 3’ | |
| Quantitative PCR using SYBR Green PCR master mix | Thermo Fisher Scientific | A25780 | |
| RevertAid first-stand cDNA synthesis kit | Thermo Fisher Scientific | K1621 | |
| anti-MALAT1 | synthesized by IDT Company | 5’-mC*mG*mA*mA*mA*C*A*T*T *G*G*C*A*C*A*mC*mA*mG*mC*mA-3’ |
|
| Cell Viability Assay Kit | Promega Corporation | G7570 | CellTiter-GloLuminescent Cell Viability Assay Kit |
| accuSkan GO UV/Vis Microplate Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| centrifugal filter | Millipore-Sigma | UFC910008 | |
| SPSS software | IBM | version 24.0 | |
| D-Luciferin | Millipore-Sigma | L9504 |
References
- Jiang, X., et al. RNase non-sensitive and endocytosis independent siRNA delivery system: delivery of siRNA into tumor cells and high efficiency induction of apoptosis. Nanoscale. 5 (16), 7256-7264 (2013).
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