Summary
この原稿は、単層カーボンナノ チューブ (SWCNT) の合成を説明します-共役、SWCNT の確実な配信との強力な治療効果を発揮する MALAT1 gapmer アンチセンス DNA オリゴヌクレオチド (SWCNT 対策 MALAT1)反 MALAT1 の in vitro および in vivo。合成、修正、活用方法を使用し、SWCNT 反 MALAT1 の注入.
Abstract
単層カーボンナノ チューブ (SWCNT) は、合成小分子薬、オリゴヌクレオチド、タンパク質などの細胞に複数の種類の薬を提供するのに使用されているナノ粒子の新しいタイプです。SWCNT、カスタマイズ可能な寸法、表面的な広域がありその表面にさまざまな変更を薬で柔軟にバインドできます。したがって、それは細胞に薬を輸送するための理想的なシステムです。長鎖非コード Rna (lncRNAs) 性 RNA 200 以上のクラスターは、nt では、蛋白質に翻訳することはできませんが、生物学的および病態生理学的プロセスに重要な役割を果たします。転移による肺腺癌成績証明書 1 (MALAT1) は非常に節約された lncRNA です。ハイレベル MALAT1 多発性骨髄腫 (MM) を含む様々 な癌の予後に関連していることを示した。我々 は MALAT1 が MM; 重さ: DNA 修復と細胞死を調節することを明らかにしました。したがって、MALAT1 は、ミリメートルのため治療上のターゲットとして考えることが。しかし、体内の MALAT1 の抑制/ノックダウンするアンチセンスの oligo の効率的な配信はまだ問題です。本研究で我々 ペグ 2000 SWCNT を変更してそれに反 MALAT1 オリゴを共役、この化合物の in vitro の配信をテスト、播種 MM マウス モデルに静脈内に挿入し、観察する示す MM 進行を大幅に抑制その SWCNT 反 MALAT1 gapmer DNA の最適な配信シャトルしています。
Introduction
SWCNT は理想的な忍容性と体外1と生体2で最小毒性安定的かつ効率的に薬、タンパク質、低分子核酸などの様々 なタイプを提供できる斬新なナノ材料です。機能性 SWCNT 素晴らしい生体適合性と水への溶解度が小さい分子シャトルとして使用することができます、細胞膜3,4,5を貫通するそれらを運ぶことができます。
lncRNAs は RNA のクラスター (> 200 nt) それはゲノムから mRNA に転写されますが、タンパク質に変換することはできません。増加する証拠は、lncRNAs 遺伝子式6の規制に参加し、開始と MM7,8,9を含むがんのほとんどの種類の進行に関与していることを示しています。MALAT1 は核濃縮の非翻訳転写 2 (NEAT2) と非常に節約された lncRNA10。MALAT1 転移性肺非小細胞癌 (NSCLC)11、当初認識されましたが数多く腫瘍5,12,13; で過剰に発現されています。それは最も高い表現の lncRNAs の一つで、MM8,14の予後と相関しています。MALAT1 の発現レベルは致命的なコース髄 MM 患者のみ15MM と診断されたものと比較して有意に高かった。
以前の研究では、ターゲット MALAT1 gapmer DNA アンチセンス オリゴヌクレオチドを使用してによって、反 MALAT1 oligos 確実 DNA 損傷と MM16アポトーシスにつながるを確認した (アンチ MALAT1) MM 細胞に。Gapmer DNA をアンチセンス DNA 構成・ 2'-青梅-Rna、RNase H 一度バインド活動17MALAT1 胸の谷間を促す可能性がありますしました。アンチセンス oligos の in vivo デリバリー効率はまだその臨床での使用を制限します。
配信をテストするには、DNA は DSPE PEG2000 アミン標識抗 MALAT1 gapmer 抗 MALAT1 gapmer oligos の SWCNT の効果は、SWCNT を官能基化。SWCNT 反 MALAT1、静脈内に注入 MM 播種性マウス モデル;4 回の治療後は、印象的な抑制が観察されます。
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Protocol
すべての実験動物を含む事前クリーブランド クリニック IACUC (機関動物ケアおよび使用委員会) によって承認されました。
1. 機能性カーボンナノ チューブの合成
- 単層カーボンナノ チューブの 1 mg、5 mg DSPE ・ PEG2000 - アミンとシンチレーション バイアル (20 mL) での滅菌ヌクレアーゼ フリー水 5 mL を混ぜます。それを振るも完全にすべての試薬を溶解します。
- 室温で 1 時間 40 W の電力レベルで水風呂超音波発生装置でバイアルを超音波 (20 分 x 3、RT は、過熱を避けるために水 20 分毎を変更)。6 時間 24,000 × gで遠心分離し、上澄みを収集します。この機能の SWCNT ソリューションは、2 ヶ月の 4 ° C で保存できます。
- 滅菌ヌクレアーゼ フリー水 4 mL に続いて 100 kDa MWCO 遠心ろ過デバイスにステップ 1.2 から SWCNT 溶液 1 mL を追加します。余分な DSPE PEG2000-アミンを削除する RT で 4,000 x gで 10 分間遠心します。水および遠心分離 5 4 mL の添加を繰り返し x。各遠心分離後残った SWCNT 溶液 0.5 mL 以上フィルターにされません。
- 808 で紫外/可視分光器を用いたフィルターの残りの SWCNT の溶液の濃度を測定後は最終的な洗浄。最終濃度は、通常 50 mg/L (カムら18によって開発された方法に従って算出) です。
注:DSPE PEG 修飾単層カーボンナノ チューブが水溶性で 1.4 の手順の後、数週間後表示される集計せず異なる生物学的ソリューションで安定していることを確認します。
2. 2'-O 変更された Rna 機能性 SWCNT が並ぶ反 MALAT1 Gapmer DNA の活用
- DSPE PEG2000 アミンの 450 μ L にスルホ LC SPDP の 0.5 mg 修飾 SWCNT を追加します。10 x PBS の 50 μ L を追加し、室温 2 時間インキュベート
- 余分なスルホ-LC-SPDP を削除するには、ヌクレアーゼ フリー水 4 mL に続いて 100 kDa MWCO 遠心ろ過デバイスにステップ 2.1 からの反応を追加します。5 倍の水と遠心分離した繰り返しの 4 mL を加えて 4,000 x gで 10 分間遠心します。
- 200 nM チオール修飾した反 MALAT1 Cy3 gapmer DNA に商業の DTT 溶液 1.5 mL を追加し、NAP 5 列、次の製造元のプロトコル製品した浄化で 90 分間インキュベートします。溶出が 500 μ L 滅菌ヌクレアーゼ フリー 1 のと反 MALAT1 Cy3 PBS x。
注:機能性の SWCNT はチオール抗 MALAT1 gapmer DNA の貯蔵の間に形成されるジスルフィド結合を切断可能性があります追加の DTT、と共に格納できます。追加の DTT を SWCNT と共役前に、aNAP 5 列で削除できます。 - スルホ LC SPDP 扱われる DSPE PEG2000 アミン SWCNT のソリューションがフィルターに残さを収集し、反 MALAT1 Cy3 ソリューションの 500 μ L で希釈します。その後、4 ° C 24 時間でそれを孵化させなさい。共役 SWCNT 反 MALAT1 は、3 週間の 4 ° C で保存できます。同じ手順に従って、スクランブル アンチセンス オリゴと共役の SWCNT を合成し、SWCNT コントロールとして使用できます。
3 SWCNT 反 MALAT1 の尾静脈注射
-
MM 播種性マウス モデルを生成します。
- 比較の最良の結果を達成するために 14 うなずきをランダムに配置します。試用版または制御グループ (各グループのセブン) を同じ男性/女性の比率が CB17-Prkdcscid/J マウス (8 週齢)。
- 操作ベンチをきれいにし、70% アルコールで消毒します。
- 尾に表示される静脈のためマウスを暖める暖房ランプを使用します。尾注入落と正しくマウスを抑制します。
- 50 μ L の PBS 尾静脈麻酔なしで 5 × 106 MM.1S リュック mCherry セルを挿入します。30 s. マーク挿入されたマウスのアルコール綿で注射部位を押すし、きれいなケージに戻ります。
-
MM.1S 細胞投与後 7 日目に治療を開始します。
- マウスの尾静脈に SWCNT アンチ MALAT1 を含む PBS の 50 μ L を注入します。SWCNT-コントロールをコントロールとしてを含む PBS を使用します。
- 30 アルコール綿で注射部位を押して s。
- 尾と、1 分間マウスの一般的な動作にローカル出血を観察し、清潔なケージに戻します。ケージをラックが、注射がよく容認されるかどうかを確認するに戻る前に再度すべて注入されたマウスを観察します。
-
注入実験の終了まで 7 日ごとを繰り返します。
- マウスの一般的な健康の低下に実験を終了する: ない食事や飲酒、薄い足の外観、皮下出血、息切れの活動に触れることができる質量および/または、下肢の麻痺が減少し、腹部を観察すると。
4。 病気の進行の評価
- 毎日 MM.1S リュック mCherry 細胞の注入後マウスの全般的な状態を評価します。マウスを開発する場合に特定の注意を払うは、下肢の麻痺します。
-
システムを使用して生体内イメージング 1 倍の週、SWCNT 反 MALAT1 注入前に腫瘍の成長を評価します。
- 1x PBS で新鮮な 15 mg/mL D-ルシフェリンを準備します。
- イソフルラン気化器 (誘発のための 3-5% とマウスの状態によって、メンテナンスのための 1-3%) を持つマウスを麻酔します。
- 各マウスにおける D-ルシフェリンを 150 mg/kg を腹腔内に注入、イメージ投射; 前に、5 分その後、イメージング システム、スペクトルと腹臥位でマウスをイメージします。
- 発光飽和に達するまでマウス 2 分ごとの時系列画像を収集します。D-ルシフェリン取り込み/信号に応じて間隔を調整します。
- 実験の終了に達するマウスを犠牲にする CO2を使用します。
-
これは、MM 播種性モデルは、マウスのように処理します。
- 解剖前にマウスの重量を量る。
- 血球カウンター マシンによって実行される完全な血計算 (CBC) 分析のための中心から末梢血を収集します。白血球と赤血球のカウントだけでなく、リンパ球の比率は、プライマリ インデックスです。
- 脾臓を隔離し、それの重量を量る。脾臓/体重比を計算します。検討 > 脾臓の腫大として 0.5%。
- 目に見える転移組織骨髄、脾臓、リンパ節、腎臓の組織を収集します。
- マウス下肢の麻痺を開発する場合は、脊椎を収集します。
- 骨髄のサンプルから RNA やタンパク質を抽出します。
- ホルマリンのすべての残りの組織を修正します。
- 脱灰、固定の 24 h 後 5 日間 0.25 M EDTA 溶液 (pH 8.0) で骨標本を浸します。
- 長期保存のための 75% アルコールのすべてのサンプルを浸します。
- 2 つのグループで同じ時点でルシフェラーゼの信号強度を比較します。両方のグループから各マウスの犠牲の日付を記録し、ソフトウェアで 2 つのグループの生存曲線を計算します。
注:図 1は、すべての手順をまとめたものです。
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Representative Results
反 MALAT1 gapmer MM で DNA の抑制効果を示すためには、我々 は MALAT1 の発現をノックダウンし、H929 および MM.1S 細胞でそれを使用します。48 時間後、ノックダウン効率の分析のため収集された細胞と抗 MALAT1 gapmer またはコントロール DNA 細胞のアポトーシスの状態をトランスフェクトしました。qRT PCR 結果反 MALAT1 gapmer DNA が効率的にノックダウン H929 と MM.1S 細胞における MALAT1 の発現を示した (図 2A)。ダウン規制 MALAT1 アポトーシス明らかにフローサイトメトリーによるアポトーシスの状態を求めた (図 2B)。
反 MALAT1 oligos ミリメートル効果的に体外を抑制することが示唆されました。しかし、体内の抗 MALAT1 oligos の効率的な配信方法/シャトル必要を開発する臨床アプリケーションでアンチセンス oligos の障害物でもあります。したがって SWCNT の私達の興味。SWCNT は適切な修正後親水性と溶解性を開発することが、薬剤の新規ナノ材料です。したがって、オリゴヌクレオチドの薬など、さまざまな形で貨物を提供できます。SWCNT の生体内での配信の効率を検証するため、まず DSPE-PEG2000-アミン、親水性と結合特異性の SWCNT19を恵まれていると SWCNT を修飾しました。その後、この機能の SWCNT はスルホ-LC-SPDP oligo の接続に使用する無料のスルフヒを作成するで処理しました。チオール基 (S); で変更されて反 MALAT1 オリゴの 5' 端反 MALAT1 オリゴとスルホ LC SPDP 扱われる SWCNT を共役するには目に見えての配信を追跡、反 MALAT1 オリゴの 3' 端だったシアニン 3 (Cy3) に変更します。すべての合成手順後 SWCNT-対策-MALAT1-Cy3 (図 1)12が得られました。その後、配信効率を検証する H929 GFP および MM.1S GFP の細胞の培養液に追加されました。
図 2Cに示すように、SWCNT-対策-MALAT1-Cy3 MM 細胞の核に効率的に配信された、H929 と MM.1S の両方の細胞 (図 2D) に内因性の MALAT1 レベルを有意に抑制しました。濃度の異なる; BMEC 1 細胞の培地で追加された SWCNT-対策-MALAT1-Cy3 毒性と正常細胞の SWCNT の安全性を確認するにはLipofectamine は治療コントロール;プレーンの媒体は、必須のコントロール (図 2E) として使用されました。その後、細胞生存率は、1 日目、2 日目と 3 日目のセル実行可能性の試金キットを使用して検出されました。SWCNT-対策-MALAT1-Cy3 と異なる用量と時間の点で治療コントロールの間細胞生存率の抑制作用に大きな違いは見つかりませんでした。あった SWCNT-対策-MALAT1-Cy3 の毒性の高用量で正常細胞に限られており、許容できる毒性のある治療コントロールに似ていることを示すか、平野中 (NC) と比較して違い。
次に、人間 MM 播種性マウス モデルは SWCNT-対策-MALAT1 生体内での治療効果を評価するため設立されました。まず、(8 週齢) の各ベージュ SCID マウスは 5 x 106 MM.1S リュック mCherry 細胞を静脈注射された (図 3)。14 マウスの合計が MM.1S 細胞を注入しました。その中でも、7 マウスが SWCNT-対策-MALAT1-Cy3 治療グループに整理されたランダムとコントロール群, もう 7 つ。SWCNT 反 MALAT1 と SWCNT コントロール oligos が 0.5 mL の 1x PBS に溶解し、腫瘍細胞の注入後 7 日尾静脈を通じて注入します。SWCNT-対策-MALAT1-Cy3 治療実験の終了まで 7 日ごとが繰り返されました。腫瘍の負担を評価するには、インビボ イメージング システム (IVIS) 1 ルシフェリン注入後 30 分 SWCNT オリゴ注入前に、の週 x でルシフェリン信号を認め。SWCNT 反 MALAT1 治療群のマウスのルシフェリン信号が 21 日 (28 日目) から治療の後著しく低い SWCNT コントロール治療群と比較したとわかりました。自分の健康と生存の状態がチェックし毎日を記録、Kaplan-meier 曲線に集計。これらの結果から静脈注射による SWCNT 反 MALAT1 治療が効果的に腫瘍細胞を抗 MALAT1 oligos を実現できることがわかった。我々 は、それから、腫瘍量を制限、マウスの寿命を延長 (p = 0.04) の in vitro の結果に似ている、期待どおりに。マウスの治療の重要な副作用は SWCNT 反 MALAT1 注入がマウスを用いての安全な治療であることを示して全体の実験期間中に見つけられませんでした。したがって、SWCNT は反 MALAT1 の安全かつ信頼性の高い体内配信システムです。
図 1: 合成、吸収の模式図とgapmer、SWCNT-対策-MALAT1-Cy3 の oligo の体内解離。(A) SWCNT と DSPE PEG2000 アミン官能基化され、反-MALAT1-Cy3 スルホ LC SPDP を介した二硫化リンケージを介して、その後、共役します。(B) SWCNT 共役反 MALAT1 は、尾静脈を介して MM.1S リュック mCherry 細胞をマウスに注入されました。(C) SWCNT 共役反 MALAT1 挿入やエンドサイトーシスを介してリン脂質二分子膜に浸透します。(D) SWCNT-対策-MALAT1 はセルによって吸収後早期エンドソーム内にパッケージ化初期エンドソームは後期エンドソームに成熟し、endolysosome を形成するリソソームを吸収合併します。ジスルフィド結合を壊すことによって、SWCNT からアンチ MALAT1 をリリース、endolysosome に役立ちます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2:SWCNT 反 MALAT1 最小毒性と効率的に配布され、MM 細胞株でアポトーシスを誘発。SWCNT 反 MALAT1 gapmer oligo または SWCNT コントロール オリゴそれぞれ H929 と MM.1S のセルに Lipofectamine によって導入されました。48 時間後、我々 は収集細胞 MALAT1 発現の解析 (A) qRT PCR および (B) アポトーシス解析によってフローサイトメトリーによる。(C) H929 GFP および MM.1S GFP の細胞は、48 時間 SWCNT-対策-MALAT1-Cy3 との共培養蛍光顕微鏡による配信効率を求めた (スケールバー = 100 μ m)。H929 と MM.1S の細胞に正常に打ちのめされたことを示した qRT PCR によって検出された (D) 式レベル ofMALAT1 (* * p < 0.01 * * * p < 0.001)。(E) SWCNT と治療コントロールは、異なる用量で BMEC 1 細胞の培養液中に追加されました。増殖は、セル実行可能性の試金キットを用いて測定しました。この図は、胡主席ら16から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: SWCNT 反 MALAT1 抑制性骨髄腫 MM.1S 細胞構築 MM 播種性マウス モデルで成長している。(A) 5 × 106 MM.1S リュック mCherry 細胞を放射線照射した SCID ベージュ マウス (各グループの 7); の尾静脈に静脈内投与SWCNT 反 MALAT1 または SWCNT 制御ソリューションの 50 μ L 注入 MM.1S 細胞投与後 7 日目から尾静脈経由で 7 日間。IVIS は、腫瘍の成長を監視するために使用されました。(B) 後肢の麻痺、腫瘍の負担は、エンドポイントとして使用され、Kaplan-meier 解析による生存データを行った。この図は、胡から変更されているら16。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
証拠は lncRNAs MM7,8,9; を含む癌の多数の生理学的および病態生理学的プロシージャの規則の部分を取ることを示しています。アンチセンスオリゴヌクレオチド20,21,22では実現することができますがん治療の対象となる可能性があります。米国食品医薬品局 (FDA) は、サイトメガロ ウイルス網膜炎23、ホモ接合体家族性高コレステロール血症24の nusinersen の mipomersen の fomivirsen を含むいくつかのアンチセンス オリゴヌクレオチドの薬を承認しました。脊髄性筋萎縮症25日、デュシェンヌ型筋ジストロフィー26eteplirsen。本研究では、2'-青梅-RNA と反 MALAT1 gapmer DNA を変更され、機能性 SWCNT と共役します。SWCNT を運ぶし、シャトルだけでなくその柔軟性と複数読み込みのためオリゴ ターゲットの親和性を向上を oligos を安定化、また分娩27 ヌクレアーゼ劣化を防ぐ助けとして反 MALAT1 oligos を提供.
単層カーボンナノ チューブの表面に適切な修正は、生理学的関連性のある水溶液環境で信頼性の高い分散性を得るし、その体内28,29を促進するそれを助けることができます。我々 は、SWCNT の移植、それの水の溶解度を改善し、実証されている SWCNT を変更する DSPE PEG2000 アミンを使用し、さらに、それは生物学的メディア30で凝集のない優れた安定性を示した。スルホ LC SPDP はジスルフィド結合を介して抗 MALAT1 gapmer DNA をバインドし、その後細胞にそれらを提供する機能性の SWCNT を助けた実験の架橋剤として使用されました。SWCNT は MM 細胞に浸透して、一度、pH 低下値31を伴う後期エンドソーム (pH 5.0 〜) に成熟し、初期エンドソーム (pH 6.0 〜)、によってとられました。ペグ リンクの利点は接着が pH で安定している > 6、PEG リンク薬の 75-95% までが、pH が 5.5 未満32,33,34になった 2 時間以内リリースされました。SWCNT アンチ MALAT1 を運ぶエンドソームはリソソーム (pH 〜 4.5)、endolysosome を形成するし、絆がより最適な低 pH35ライソゾーム チオール還元酵素触媒を用いる二硫化と合併。これはその後、無料アンチ MALAT1 gapmer DNA をリリースしました。In vitro および in vivo の実験結果によると、SWCNT は SWCNT 反 MALAT1 の効率的な配送、それは反 MALAT1 体外する関数が同様に行動を助けた。
2 つのパターンでリン脂質二重膜をパススルーする機能性カーボンナノ チューブ: 挿入36,37とエンドサイトーシス38,39。これらの手順は、したがって、SWCNT の毒性を軽減、細胞膜の安定化を中断することがなく細胞に貨物を提供 SWCNT を助けます。我々 はそれぞれのマウス (~ 20 g); SWCNT-対策-MALAT1 (〜 40 mg/L) の 50 μ L を注入したがって、最終的な薬物濃度は 0.1 mg/kg、我々 は毒性実験 (2 mg/L と 4 mg/L) で使用される用量よりはるかに低い。以前結果、SWCNT 治療コントロール (例えば、Lipofectamine) として同じような効果は、細胞の成長とで生存率は用量を一致します。処理制御セルの transfection のため一般的な試薬および細胞に限られており、許容できる毒性を持つと言われるしたがって、SWCNT は正常細胞の最小毒性と考えています。
アンチセンスオリゴヌクレオチドのシャトルバス、代謝は、SWCNT の安全のためもう一つの重要な考慮事項です。それは官能の SWCNT は主に腎臓糸球体および尿細管毒性40なしを介して排泄されることが実証されています。我々 は機能障害に関連する症状、乏尿、無尿、浮腫、腎臓の外観の変更などその腎臓に見つかりませんでしたSWCNT の注入を受け入れたマウス等。したがって、カーボンナノ チューブにはある任意の異常な蓄積による毒性影響正常腎機能付きのマウス。
私たち共役アンチセンス オリゴヌクレオチド官能 SWCNT と lncRNA をターゲットに最初 MM 治療のため使用しています。SWCNT は一貫したカイラリティ、オプションの直径と長さの分布を持っている、斬新なナノ材料の一種です。機能化処理後カーボンナノ チューブは水容解性と生体適合性を開発し、医薬品流通の増加と、治療の効果を高めることにより細胞膜を通じて多数の貨物を提供する理想的な生物シャトルになります。さらに、SWCNT はヌクレアーゼ消化1からアンチセンス オリゴヌクレオチド分子を安定させる可能性があります。結果を表示、機能性 SWCNT 反 MALAT1 MM 細胞に効率的に MALAT1 を配信、劇的に細胞体外と体内の播種性マウス モデル MM 成長を阻害しました。これまでのところ、我々 はこれらの実験で SWCNT 治療のため任意の毒性を観察しなかった。本研究は、SWCNT のアンチセンス オリゴヌクレオチド薬の安全で効果的な配信手段は、患者の治療上の分子のキャリアとして使用する可能性がありますとを示しています。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者に感謝ラーナー研究所ゲノム、プロテオームと彼らの支援のためのイメージング コアとサポートします。資金: この作業は、財政的に NIH/NCI の助成 R00 CA172292 (J.J.Z.) に (J.J.Z.) をスタートアップ資金と臨床トランスレーショナル科学共同 (CTSC) (J.J.Z.) にケース ウェスタン リザーブ大学コア使用率のパイロット グラントのによって支えられました。この作品は、国立機関の健康 SIG グラント 1S10OD019972-01 からの資金で購入したライカ SP8 共焦点顕微鏡を利用されています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SWCNTs | Millipore-Sigma | 704113 | |
| DSPE-PEG2000-Amine | Avanti Polar Lipids | 880128 | |
| bath sonicator | VWR | 97043-992 | |
| 4 mL centrifugal filter | Millipore-Sigma | Z740208-8EA | |
| UV/VIS spectrometer | Thermo Fisher Scientific | accuSkan GO UV/Vis Microplate Spectrophotometer | extinction coefficient of 0.0465 L/mg/cm at 808 nm |
| Sulfo-LC-SPDP | ProteoChem | c1118 | |
| DTT solution | Millipore-Sigma | 43815 | |
| NAP-5 column | GE Healthcare | 17-0853-01 | |
| in vivo imaging system | PerkinElmer | ||
| NOD.CB17-Prkdcscid/J mice | Charles River lab | 250 | |
| Flow cytometer | Becton Dickinso | ||
| Lipofectamine | Invitrogen | 11668019 | Lipofectamine2000 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 10437-028 | |
| RMPI-1640 medium | Invitrogen | 11875-093 | |
| MALAT1-QF: | synthesized by IDT Company | 5’- GTTCTGATCCCGCTGCTATT - 3’ | |
| MALAT1-QR: | synthesized by IDT Company | 5’- TCCTCAACACTCAGCCTTTATC - 3’ | |
| GAPDH-QF: | synthesized by IDT Company | 5’- CAAGAGCACAAGAGGAAGAGAG - 3’ | |
| GAPDH-QR: | synthesized by IDT Company | 5’- CTACATGGCAACTGTGAGGAG - 3’ | |
| Quantitative PCR using SYBR Green PCR master mix | Thermo Fisher Scientific | A25780 | |
| RevertAid first-stand cDNA synthesis kit | Thermo Fisher Scientific | K1621 | |
| anti-MALAT1 | synthesized by IDT Company | 5’-mC*mG*mA*mA*mA*C*A*T*T *G*G*C*A*C*A*mC*mA*mG*mC*mA-3’ |
|
| Cell Viability Assay Kit | Promega Corporation | G7570 | CellTiter-GloLuminescent Cell Viability Assay Kit |
| accuSkan GO UV/Vis Microplate Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| centrifugal filter | Millipore-Sigma | UFC910008 | |
| SPSS software | IBM | version 24.0 | |
| D-Luciferin | Millipore-Sigma | L9504 |
References
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