Summary
Dette manuskriptet beskriver syntesen av en enkelt-vegg carbon nanorør (SWCNT)-konjugert MALAT1 antisense gapmer DNA oligonucleotide (SWCNT-anti-MALAT1), som viser pålitelig levering av SWCNT og den potente terapeutiske effekten av anti-MALAT1 i vitro og in vivo. Metoder brukt for syntese, modifisering, bøyning og injeksjon av SWCNT-anti-MALAT1 er beskrevet.
Abstract
Enkelt-vegg carbon nanorør (SWCNT) er en ny type hydrogenion, som er brukt til å levere flere typer narkotika inn celler, for eksempel proteiner, oligonucleotides og syntetiske små molekyl narkotika. SWCNT har passelig dimensjoner, et stort overfladisk område, og kan fleksibelt binde med narkotika gjennom forskjellige modifikasjoner på overflaten; Derfor er det et ideelt system å transportere narkotika i celler. Lang noncoding RNAs (lncRNAs) er en klynge av noncoding lenger enn 200 nt, som ikke kan oversettes til protein, men spiller en viktig rolle i biologiske og patofysiologiske. Metastasering-assosiert lunge adenocarcinoma transkripsjon 1 (MALAT1) er en høyt konservert lncRNA. Det ble demonstrert at høyere MALAT1 nivåer er knyttet til dårlig prognosen for ulike kreftformer, herunder myelom (MM). Vi har avdekket at MALAT1 regulerer DNA reparasjon og celle død i MM; MALAT1 kan dermed betraktes som et terapeutisk mål for MM. Effektiv levering av den antisense oligo å hemme/knockdown MALAT1 i vivo er imidlertid fortsatt et problem. I denne studien vi endre SWCNT med PEG-2000 og bøy en anti-MALAT1 oligo den, teste levering av denne sammensatte i vitro, injisere den intravenøst i spres MM musemodell og observere en betydelig hemming av MM progresjon, som angir det SWCNT er en ideell levering transporttjeneste for anti-MALAT1 gapmer DNA.
Introduction
SWCNT er en ny nanomaterial som kan levere ulike typer narkotika, som proteiner, små molekyler og atomer syren, stabilt og effektivt med ideelle toleranse og minimum toksisitet i vitro1 og i vivo2. En functionalized SWCNT har stor biocompatibility og vann løselighet, kan brukes som en transporttjeneste for mindre molekyler og kan bære dem å trenge celle membran3,4,5.
lncRNAs er en klynge av RNA (> 200 nt) som er transkribert fra genomet til mRNA men ikke kan oversettes til proteiner. Økende bevis har vist at lncRNAs delta i regulering av gene expression6 og er involvert i oppstart og progresjon av de fleste typer kreft, inkludert MM7,8,9. MALAT1 er en kjernefysisk-beriket noncoding transkripsjon 2 (NEAT2) og en høyt konservert lncRNA10. MALAT1 er først anerkjent i metastatisk ikke-småcellet lungekreft kreft (NSCLC)11, men har vært overexpressed i mange svulster5,12,13; Det er en av de mest uttrykte lncRNAs er korrelert med en dårlig prognose i MM8,14. Hvilket uttrykk MALAT1 er betydelig høyere i dødelig kurs extramedullary MM pasienter sammenlignet med de bare diagnostisert som MM15.
I en tidligere studie, har vi bekreftet at anti-MALAT1 oligos robust føre til DNA skade og apoptose i MM16 ved hjelp gapmer DNA antisense oligonucleotides rettet mot MALAT1 (anti-MALAT1) i MM celler. Gapmer DNA er sammensatt av antisense DNA og forbundet med 2-OMe-RNAs, som kunne be MALAT1 spalting av RNase H aktivitet når bundet17. I vivo levering effektiviteten av antisense oligos fortsatt begrenser klinisk bruk.
For å teste levering functionalized effekten av SWCNT for anti-MALAT1 gapmer oligos, anti-MALAT1 gapmer DNA er konjugert til DSPE-PEG2000-Amin SWCNT. SWCNT-anti-MALAT1 er deretter sprøytes intravenøst inn en MM spres musemodell; en slående hemming er observert etter fire behandlinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter som involverer dyr er forhåndsgodkjent av Cleveland Clinic IACUC (institusjonelle Animal Care og bruk Committee).
1. syntese av Functionalized SWCNTs
- Bland 1 mg av SWCNTs, 5 mg DSPE-PEG2000-Amin og 5 mL sterilisert nuclease uten vann i en scintillation hetteglass (20 mL). Riste den vel å oppløse reagenser helt.
- Sonicate ampullen i en vann bad sonicator på et nivå av 40 W 1t ved romtemperatur (RT, 20 min x 3, endre vannet hver 20 min for å unngå overoppheting). Deretter sentrifuge den 24.000 x g 6 h og samle supernatant løsningen. Funksjonell SWCNT løsningen kan lagres på 4 ° C i 2 måneder.
- Legg 1 mL av SWCNT løsning fra trinn 1.2 en 100 kDa MWCO sentrifugal filter enhet, etterfulgt av 4 mL sterilisert nuclease uten vann. Sentrifuge for 10 min 4000 x g på RT fjerne ekstra DSPE-PEG2000-Amin. Gjenta tillegg av 4 mL vann og sentrifugering 5 x. Mer enn 0,5 mL av leftover SWCNT løsning vil stå i filteret etter hver sentrifugering.
- Måle konsentrasjonen av SWCNT løsningen leftover i filteret en UV/VIS spectrometer på 808 nm etter siste vask. Siste konsentrasjonen er vanligvis ca 50 mg/L (beregnet i henhold til metoden utviklet av Kam et al.18).
Merk: Sikre at DSPE-PEG-functionalized SWCNTs er vannløselig etter trinn 1.4 og stabil i ulike biologiske løsninger uten synlig aggregering etter noen uker.
2. Bøyning av Anti-MALAT1 Gapmer DNA flankert av 2-O modifisert RNAs å Functionalized SWCNT
- Legg til 0,5 mg Sulfo-LC-SPDP i 450 µL av DSPE-PEG2000-Amin functionalized SWCNT. Legge til 50 µL av 10 x PBS og deretter ruge 2 h på RT.
- For å fjerne ekstra Sulfo-LC-SPDP, legger du til reaksjonen fra trinn 2.1 til en 100 kDa MWCO sentrifugal filter enhet, etterfulgt av 4 mL nuclease gratis vann. Sentrifuge for 10 min på 4000 x g ved RT. Gjenta tillegg av 4 mL vann og sentrifugering 5 x.
- Legg til 200 nM thiol endret anti-MALAT1-Cy3 gapmer DNA i 1,5 mL av kommersiell DTT løsning og ruge for 90 minutter til RT. rense produktet med en NAP-5-kolonnen etter produsentens protokoll. Elute anti-MALAT1-Cy3 med 500 µL sterilisert nuclease-gratis 1 x PBS.
Merk: Functionalized SWCNT kan lagres med ekstra DTT, som kan holde seg disulfide obligasjoner dannet under lagring av thiolated anti-MALAT1 gapmer DNA. Ekstra DTT kan fjernes av aNAP-5-kolonnen før Bøyning med SWCNT. - Samle sulfo LC-SPDP-behandlet DSPE-PEG2000-Amin SWCNT løsningen i filteret og fortynn den med 500 µL av anti-MALAT1-Cy3 løsning. Deretter ruge det ved 4 ° C i 24 timer. Konjugert SWCNT-anti-MALAT1 kan lagres på 4 ° C i 3 uker. Etter samme fremgangsmåte, kan den konjugert SWCNT med scramble antisense oligo syntetisert og brukes som SWCNT-kontroll.
3. hale blodåre injeksjon av SWCNT-Anti-MALAT1
-
Generere en MM spres musemodell.
- For å oppnå de beste resultatene av sammenligningen, tilfeldig ordne 14 NIKK. CB17-Prkdcscid/J mus (8 uker gamle) i rettssaken eller kontroll grupper (syv i hver gruppe) med det samme mann/kvinne-forholdet.
- Feilfri drift benken og steriliseres med 70% alkohol.
- Bruk en varme lampe for å varme for å hjelpe halen vene vises. Holde musen riktig med en hale injeksjon restrainer.
- Injisere 5 x 106 MM.1S-Luc-mCherry celler i 50 µL av PBS gjennom halen åre uten bedøvelse. Trykk injeksjonsstedet med en alkoholholdige vattpinnen 30 s. varemerket injisert musen og gå tilbake til en ren bur.
-
Start behandling på dag 7 etter MM.1S celle injeksjon.
- Sette inn 50 µL av PBS som inneholder SWCNT-anti-MALAT1 i halen venen museklikk. Bruk PBS som inneholder SWCNT-kontrollen som en kontroll.
- Trykk injeksjonsstedet med en alkoholholdige vattpinnen for 30 s.
- Observere lokale blødningen på halen og hvordan musen for 1 min, og kobler den til en ren bur. Observere alle injisert mus igjen før retur buret til stativet, sørge for at injeksjoner er godt tolerert.
-
Gjenta injeksjon hver 7 dager før avslutningen av eksperimentet.
- Avslutte eksperimentet når den generelle helsen til musen forringer: når ikke spise eller drikke, utseendet av blek paws, subkutan blødninger, en kortpustethet, redusert aktivitet, en lammelse av lavere lemmer og/eller en touchable masse i den magen er observert.
4. evaluering av sykdomsprogresjon
- Vurdere den generelle statusen for mus hver dag etter MM.1S-Luc-mCherry celle injeksjon. Betal særlig oppmerksomhet hvis musene utvikler lammer av lavere lemmer.
-
Evaluere tumor vekst med en i vivo tenkelig system 1 x i uken før SWCNT-anti-MALAT1 injeksjon.
- Forberede frisk 15 mg/mL D-Luciferin med 1 x PBS.
- Bedøve mus med en isoflurane vaporizer (3-5% for induksjon og 1-3% for vedlikehold, avhengig av statusen mus).
- Injisere 150 mg/kg D-Luciferin i hver mus intraperitoneally, 5 min før imaging; deretter bildet mus i en utsatt posisjon med en spectrum tenkelig system.
- Samle sekvensielle bilder av mus hver 2 min, inntil luminescence metning er nådd. Justere intervalltiden etter D-Luciferin opptak/signalet.
- Bruke CO2 ofre mus når avslutningen av eksperimentet er nådd.
-
Siden dette er en MM spres modell, behandle musene som følger.
- Veie musen før disseksjon.
- Samle perifert blod fra hjertet for en full blodstatus (CBC) analysen utført av en blodceller teller maskin. Grevene av hvite blodceller og røde blodlegemer, samt forholdet mellom lymfocytter, er de primære indeksene.
- Isolere milten og veie den. Beregne forholdet mellom milt/kropp vekt; vurdere > 0,5% som milt utvidelse.
- Samle vev i beinmarg, milt, lymfeknute, nyre og vevet med synlige metastasering.
- Samle ryggraden Hvis musen utviklet en lammelse av lavere lemmer.
- Pakk ut RNA og protein fra benmargen prøvene.
- Fikse alle gjenværende vev i formalin.
- For Avkalking, fordype bein prøvene i 0,25 M EDTA løsning (pH 8.0) 5 dager etter 24 h fiksering.
- Legg alle prøvene i 75% alkohol for langtidslagring.
- Sammenligne signalstyrken for luciferase på samme tidspunkt i to grupper. Begge grupper, registrere offer datoene for hver musen og beregne den overlevelse kurver av de to gruppene med programvare.
Merk: Alle prosedyrer oppsummeres i figur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å demonstrere hemming anti-MALAT1 gapmer DNA i MM, vi slått ned uttrykk for MALAT1 og brukt det i H929 og MM.1S celler. Førtiåtte timer senere, celler ble samlet for analyse av sammenleggbare effektivitet og statusen apoptose i celler transfekterte med anti-MALAT1 gapmer eller kontroll DNA. qRT PCR resultatene viste at anti-MALAT1 gapmer DNA slått ned det MALAT1 uttrykket i H929 og MM.1S celler effektivt (figur 2A). Statusen for apoptose ble bestemt av flowcytometri, som åpenbart ned-regulert MALAT1 indusert apoptose betydelig (figur 2B).
Disse resultatene indikerer at anti-MALAT1 oligos hemmer MM effektivt i vitro. Men en effektiv levering metoden shuttle for anti-MALAT1 oligos i vivo behov utvikles, hvilke er likeledes hindringen av antisense oligos i klinisk program. dermed vår interesse i SWCNT. SWCNT er en ny nanomaterial for narkotika-leveranser, som kan utvikle hydrophilicity og dissolubility etter passende endringer; Derfor kan det levere Last i ulike former, for eksempel oligonucleotide narkotika. For å validere levering effektiviteten av SWCNT i vivo, functionalized vi først SWCNT med DSPE-PEG2000-aminer, som utstyrt hydrophilicity og bindende spesifisiteten til SWCNT19. Deretter ble denne funksjonelle SWCNT behandlet med sulfo-LC-SPDP for å opprette gratis sulfhydryl grupper som brukes til å koble med oligo. For å bøy oligo anti-MALAT1 og sulfo-LC-SPDP-behandlet SWCNT, 5' endene av anti-MALAT1 oligo er endret med thiol grupper (S-S); å synlig spore levering, 3 endene av anti-MALAT1 oligo ble endret med cyanine 3 (Cy3). Etter alle syntese trinnene, SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 ble innhentet (figur 1)12. Da ble det lagt til kultur medium med H929-GFP og MM.1S-GFP celler å validere levering effektiviteten.
Som vist i figur 2C, SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 ble effektivt levert i kjernen av MM celler og betydelig undertrykt endogene MALAT1 nivået i både H929 og MM.1S celler (figur 2D). For å undersøke giftighet og sikkerheten til SWCNT i normale celler, ble SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 lagt i mediet av BMEC-1 celler i ulike konsentrasjoner; Lipofectamine var behandling kontrollen. vanlig mediet ble brukt som viktig kontroll (figur 2E). Deretter ble cellen levedyktighet oppdaget ved hjelp av en celle levedyktighet analysen kit på dag 1, dag 2 og dag 3. Ingen signifikant forskjell i cellen levedyktighet hemming ble funnet mellom SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 og kontrollen behandling i ulike doser og tidspunkt. Det var ingen forskjell sammenlignet med vanlig medium (NC), som viser at giftigheten av SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 ligner på kontrollen i behandling, som har en begrenset og akseptabel toksisitet til normale celler ved høy dosering.
Neste, en human MM spres musemodell ble etablert for å vurdere behandling effekten av SWCNT-anti-MALAT1 i vivo. Først hver SCID-beige mus (av 8 uker gamle) ble injisert med 5 x 106 MM.1S-Luc-mCherry celler intravenøst (Figur 3). Totalt 14 musene ble injisert med MM.1S celler. blant dem, syv mus var tilfeldig ordnet i en SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 behandlingsgruppe, og en annen syv var i kontrollgruppen. Både SWCNT-anti-MALAT1 og SWCNT-kontroll oligos var oppløst i 0,5 mL 1 x PBS og injisert gjennom halen venene 7 dager etter svulst celle injeksjon. SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 behandling ble gjentatt hver 7 dager før avslutningen av eksperimentet. For å evaluere svulst byrden, ble luciferin signalet observert av en i vivo tenkelig system (IVIS) 30 min etter luciferin injeksjon 1 x i uken før SWCNT-oligo injeksjon. Vi fant at luciferin signaler av mus i gruppen SWCNT-anti-MALAT1 behandling var bemerkelsesverdig lavere sammenlignet med de av gruppen for SWCNT-kontroll-behandling etter 21 dager behandling (fra dag 28). Deres helse og overlevelse status ble sjekket og spilles inn hver dag og oppsummert i en Kaplan-Meier kurve. Fra disse resultatene vi konkluderte med at SWCNT-anti-MALAT1 behandling via intravenøs injeksjon kan levere anti-MALAT1-oligos til kreftceller effektivt. Vi så begrenset svulst byrden og utvidet Musenes lifespans (p = 0,04) som forventet, som er lik i vitro resultater. Vi fant noen betydelige bivirkninger av behandling i mus i hele eksperimentet perioden, noe som indikerte at SWCNT-anti-MALAT1 injeksjon er en trygg behandling for mus; Derfor er SWCNT en trygg og pålitelig i vivo leveringssystem for anti-MALAT1.
Figur 1 : Skjematisk diagram av syntese, absorpsjon, og i vivo avstandtagen for en SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 gapmer oligo. (A) SWCNT var functionalized med DSPE-PEG2000-aminer og deretter konjugert med anti-MALAT1-Cy3 via disulfide sammenhengen formidlet av Sulfo-LC-SPDP. (B) SWCNT-konjugerte anti-MALAT1 ble sprøytet inn en mus med MM.1S-Luc-mCherry celler via hale venen. (C) SWCNT-konjugerte anti-MALAT1 trenger phospholipid bilayer membranen gjennom innsetting eller endocytose. (D) SWCNT-anti-MALAT1 ble pakket i tidlig endosomes etter absorpsjon av celler. deretter den tidlige endosome modnet til en sen endosome og slått sammen med en lysosome til en endolysosome. Endolysosome hjelper slippe anti-MALAT1 fra SWCNT ved å bryte disulfide obligasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : SWCNT-anti-MALAT1 ble levert effektivt med minimum toksisitet og indusert apoptose i MM cellelinjer. SWCNT-anti-MALAT1 gapmer oligo eller SWCNT-kontroll oligo var transfekterte av Lipofectamine i H929 og MM.1S celler, henholdsvis. Førtiåtte timer senere, samlet vi celler for (A) analyse av MALAT1 uttrykk av qRT PCR og (B) apoptose analyse av flowcytometri. (C) H929-GFP og MM.1S-GFP-cellene var co kulturperler med SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 i 48 timer; levering effektiviteten ble bestemt av fluorescens mikroskopet (skala barer = 100 µm). (D) uttrykk nivå ofMALAT1 ble oppdaget av qRT PCR, som viste at det var ble slått ned i H929 og MM.1S celler (** p < 0,01, *** p < 0,001). (E) SWCNT og kontrollen behandling ble lagt i en kultur medium med BMEC-1 celler ved ulike doser. Spredning ble målt ved hjelp av en celle levedyktighet analysen kit. Dette tallet er endret fra Hu et al.16. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : SWCNT-anti-MALAT1 undertrykt myelom vokser i MM.1S-celle-bygget MM spres musemodell. (A) 5 x 106 MM.1S-Luc-mCherry celler ble injisert intravenøst til halen vener bestrålt SCID-beige mus (syv i hver gruppe); 50 μL av en SWCNT-anti-MALAT1 eller SWCNT-kontroll løsning ble injisert hver 7 dager via hale venen fra 7 dag etter MM.1S celle injeksjon. IVIS ble brukt til å overvåke tumor vekst. (B) Hind lem lammelse og tumor byrden ble brukt som endepunktene og overlevelse dataene ble analysert av en Kaplan-Meier analyse. Dette tallet har blitt endret fra Hu et al.16. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bevis har vist at lncRNAs tar del i regulering av mange fysiologiske og patofysiologiske prosedyrer i kreft, inkludert MM7,8,9; de har potensial til å bli mål for kreftbehandling, noe som kan realiseres ved antisense oligonucleotides20,21,22. US Food and Drug Administration (FDA) har godkjent flere antisense oligonucleotide stoffer, inkludert fomivirsen for cytomegalovirus retinitis23, mipomersen homozygous familiær hyperkolesterolemi24, nusinersen for spinal muskel atrofi25, og eteplirsen for Duchenne muskeldystrofi26. I denne studien vi endret anti-MALAT1 gapmer DNA med 2-OMe-RNA og konjugert den med funksjonell SWCNT. SWCNT bærer og leverer anti-MALAT1 oligos som transport, som ikke bare forbedret slektskap av oligo-målet på grunn av sin fleksibilitet og flere lasting, men også stabilisert oligos og hjalp hindre nuclease nedbrytning under levering27 .
En egnet modifikasjon på overflaten av SWCNTs kan hjelpe det få pålitelige dispersibility i fysiologisk relevant, vandig miljøer og fremme deres biodistribution28,29. Vi brukte DSPE-PEG2000-Amin endre SWCNT, som har vist seg å pode på SWCNT og forbedre vandig Løseligheten av det, og det viste videre, utmerket stabilitet uten agglomeration i biologiske media30. Sulfo-LC-SPDP ble brukt som en crosslinker på eksperimentet, som hjalp functionalized SWCNT å binde anti-MALAT1 gapmer DNA gjennom disulfide kobling, og deretter levere dem i celler. Når SWCNT inn i MM celler, ble de tatt av tidlig endosomes (pH ~ 6.0), som deretter modnet til slutten endosomes (pH ~ 5.0) sammen med en redusert pH verdien31. Fordelen med koblingen PEG er at liming er stabil ved pH > 6, men opp til 75-95% av PEG-tilknyttet utgitt innen 2 timer når pH ble mindre enn 5,532,33,34. Endosomes bærer SWCNT-anti-MALAT1 sammen med lysosomer (pH ~ 4.5) til en endolysosome, og deretter disulfide obligasjoner ble katalysert av lysosomale thiol reduktase, som var optimalt aktivert på en lav pH35. Dette senere utgitt gratis anti-MALAT1 gapmer DNA. Ifølge eksperimentresultatet i vitro og in vivo, SWCNT levert SWCNT-anti-MALAT1 effektivt og hjalp det handle på samme måte i funksjonen til anti-MALAT1 i vitro.
Functionalized SWCNTs går gjennom phospholipid bilayer via to mønstre: innsetting36,37 og endocytose38,39. Disse prosedyrene hjelpe SWCNT levere Last i celler uten å avbryte stabilisering av celle membraner, derfor redusert toksisitet av SWCNT. Vi injisert 50 µL av SWCNT-anti-MALAT1 (~ 40 mg/L) i hver mus (~ 20 g); Dermed var siste narkotika konsentrasjonen 0,1 mg/kg, som er mye lavere enn dosering vi brukte toksisitet eksperimenter (2 mg/L og 4 mg/L). Som tidligere resultater viste, SWCNT har en lignende effekt som kontrollen behandling (f.eks Lipofectamine) på cellevekst og levedyktigheten til matchet doser. Kontrollen behandling er en vanlig reagens for cellen transfection og antas å ha en begrenset og akseptabel toksisitet celler; Derfor tror vi SWCNT har bare en minimum toksisitet for normale celler.
Som en transporttjeneste for antisense oligonucleotides er metabolisme en annen viktig faktor for sikkerheten av SWCNT. Det har vist at functionalized SWCNT er hovedsakelig utskilt gjennom nyrene, uten glomerular og rørformede toksisitet40. Vi fant ikke nyre dysfunksjon-relaterte symptomer som oliguri, anuria, ødem, utseende endringer av nyrene, etc., i mus som akseptert SWCNT injeksjon. Dermed har SWCNTs ingen toksisitet innvirkning på grunn av noen unormal akkumulering i en mus med en vanlig nyrefunksjon.
Vi er først til å bøy anti-følelse oligonucleotides målretting lncRNA med functionalized SWCNT og bruke den til MM behandling. SWCNT er en type roman nanomaterial, som har konsekvent chiralitet, valgfritt diameter og lengde distribusjon. Etter functionalization behandling, SWCNTs utvikle vannløselighet og biocompatibility og bli en ideell biologiske shuttle å levere mange Last gjennom cellemembranen, og dermed øke distribusjon og styrke behandlingseffekt. I tillegg kan SWCNT stabilisere anti-følelse oligonucleotide molekyler nuclease fordøyelsen1. Resultatene viser, den functionalized SWCNT-anti-MALAT1 leveres MALAT1 i MM celler effektivt og hemmet MM vekst dramatisk cellelinjer i vitro og spres musemodell i vivo. Hittil har observerer vi ikke noen toksisitet på grunn av SWCNT behandling i disse eksperimentene. Denne studien viser at SWCNT er en trygg og effektiv levering kjøretøy for antisense oligonucleotide narkotika og kan brukes som en bærer for terapeutisk molekyler i pasienter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takke Lerner Research Institute proteomic, genomisk, og tenkelig kjerner for deres hjelp og støtte. Finansiering: Dette arbeidet ble økonomisk støttet av NIH/NCI grant R00 CA172292 (til J.J.Z.) og oppstart midler (til J.J.Z.) og kliniske og translasjonsforskning Science samarbeid (CTSC) av Case Western Reserve University Core utnyttelse Pilot Grant (til J.J.Z.). Dette arbeidet utnyttet Leica SP8 AC confocal mikroskop som ble kjøpt med støtte fra nasjonale institutter for helse SIG grant 1S10OD019972-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SWCNTs | Millipore-Sigma | 704113 | |
| DSPE-PEG2000-Amine | Avanti Polar Lipids | 880128 | |
| bath sonicator | VWR | 97043-992 | |
| 4 mL centrifugal filter | Millipore-Sigma | Z740208-8EA | |
| UV/VIS spectrometer | Thermo Fisher Scientific | accuSkan GO UV/Vis Microplate Spectrophotometer | extinction coefficient of 0.0465 L/mg/cm at 808 nm |
| Sulfo-LC-SPDP | ProteoChem | c1118 | |
| DTT solution | Millipore-Sigma | 43815 | |
| NAP-5 column | GE Healthcare | 17-0853-01 | |
| in vivo imaging system | PerkinElmer | ||
| NOD.CB17-Prkdcscid/J mice | Charles River lab | 250 | |
| Flow cytometer | Becton Dickinso | ||
| Lipofectamine | Invitrogen | 11668019 | Lipofectamine2000 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 10437-028 | |
| RMPI-1640 medium | Invitrogen | 11875-093 | |
| MALAT1-QF: | synthesized by IDT Company | 5’- GTTCTGATCCCGCTGCTATT - 3’ | |
| MALAT1-QR: | synthesized by IDT Company | 5’- TCCTCAACACTCAGCCTTTATC - 3’ | |
| GAPDH-QF: | synthesized by IDT Company | 5’- CAAGAGCACAAGAGGAAGAGAG - 3’ | |
| GAPDH-QR: | synthesized by IDT Company | 5’- CTACATGGCAACTGTGAGGAG - 3’ | |
| Quantitative PCR using SYBR Green PCR master mix | Thermo Fisher Scientific | A25780 | |
| RevertAid first-stand cDNA synthesis kit | Thermo Fisher Scientific | K1621 | |
| anti-MALAT1 | synthesized by IDT Company | 5’-mC*mG*mA*mA*mA*C*A*T*T *G*G*C*A*C*A*mC*mA*mG*mC*mA-3’ |
|
| Cell Viability Assay Kit | Promega Corporation | G7570 | CellTiter-GloLuminescent Cell Viability Assay Kit |
| accuSkan GO UV/Vis Microplate Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| centrifugal filter | Millipore-Sigma | UFC910008 | |
| SPSS software | IBM | version 24.0 | |
| D-Luciferin | Millipore-Sigma | L9504 |
References
- Jiang, X., et al. RNase non-sensitive and endocytosis independent siRNA delivery system: delivery of siRNA into tumor cells and high efficiency induction of apoptosis. Nanoscale. 5 (16), 7256-7264 (2013).
- Murakami, T., et al. Water-dispersed single-wall carbon nanohorns as drug carriers for local cancer chemotherapy. Nanomedicine (Lond). 3 (4), 453-463 (2008).
- Kam, N. W., Dai, H. Carbon nanotubes as intracellular protein transporters: generality and biological functionality. Journal of the American Chemical Society. 127 (16), 6021-6026 (2005).
- Kam, N. W., Liu, Z., Dai, H. Functionalization of carbon nanotubes via. cleavable disulfide bonds for efficient intracellular delivery of siRNA and potent gene silencing. Journal of the American Chemical Society. 127 (36), 12492-12493 (2005).
- Kam, N. W., Liu, Z., Dai, H. Carbon nanotubes as intracellular transporters for proteins and DNA: an investigation of the uptake mechanism and pathway. Angewandte Chemie International Edition in English. 45 (4), 577-581 (2006).
- Ntziachristos, P., Abdel-Wahab, O., Aifantis, I. Emerging concepts of epigenetic dysregulation in hematological malignancies. Nature Immunology. 17 (9), 1016-1024 (2016).
- Evans, J. R., Feng, F. Y., Chinnaiyan, A. M. The bright side of dark matter: lncRNAs in cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 2775-2782 (2016).
- Ronchetti, D., et al. Distinct lncRNA transcriptional fingerprints characterize progressive stages of multiple myeloma. Oncotarget. 7 (12), 14814-14830 (2016).
- Wong, K. Y., et al. Epigenetic silencing of a long non-coding RNA KIAA0495 in multiple myeloma. Molecular Cancer. 14, 175 (2015).
- Schmidt, L. H., et al. The long noncoding MALAT-1 RNA indicates a poor prognosis in non-small cell lung cancer and induces migration and tumor growth. Journal of Thoracic Oncology. 6 (12), 1984-1992 (2011).
- Ji, P., et al. MALAT-1, a novel noncoding RNA, and thymosin beta4 predict metastasis and survival in early-stage non-small cell lung cancer. Oncogene. 22 (39), 8031-8041 (2003).
- Luo, J. H., et al. Transcriptomic and genomic analysis of human hepatocellular carcinomas and hepatoblastomas. Hepatology. 44 (4), 1012-1024 (2006).
- Guffanti, A., et al. A transcriptional sketch of a primary human breast cancer by 454 deep sequencing. BMC Genomics. 10, 163 (2009).
- Cho, S. F., et al. MALAT1 long non-coding RNA is overexpressed in multiple myeloma and may serve as a marker to predict disease progression. BMC Cancer. 14, 809 (2014).
- Handa, H., et al. Long non-coding RNA MALAT1 is an inducible stress response gene associated with extramedullary spread and poor prognosis of multiple myeloma. British Journal of Haematology. 179 (3), 449-460 (2017).
- Hu, Y., et al. Targeting the MALAT1/PARP1/LIG3 complex induces DNA damage and apoptosis in multiple myeloma. Leukemia. , (2018).
- Lennox, K. A., Behlke, M. A. Cellular localization of long non-coding RNAs affects silencing by RNAi more than by antisense oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 44 (2), 863-877 (2016).
- Kam, N. W., O'Connell, M., Wisdom, J. A., Dai, H. Carbon nanotubes as multifunctional biological transporters and near-infrared agents for selective cancer cell destruction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (33), 11600-11605 (2005).
- Zeineldin, R., Al-Haik, M., Hudson, L. G. Role of polyethylene glycol integrity in specific receptor targeting of carbon nanotubes to cancer cells. Nano Letters. 9 (2), 751-757 (2009).
- Amodio, N., D'Aquila, P., Passarino, G., Tassone, P., Bellizzi, D. Epigenetic modifications in multiple myeloma: recent advances on the role of DNA and histone methylation. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21 (1), 91-101 (2017).
- Ahmad, N., Haider, S., Jagannathan, S., Anaissie, E., Driscoll, J. J. MicroRNA theragnostics for the clinical management of multiple myeloma. Leukemia. 28 (4), 732-738 (2014).
- Amodio, N., et al. Drugging the lncRNA MALAT1 via. LNA gapmeR ASO inhibits gene expression of proteasome subunits and triggers anti-multiple myeloma activity. Leukemia. , (2018).
- Highleyman, L. FDA approves fomivirsen, famciclovir, and Thalidomide. Food and Drug Administration. BETA. 5, (1998).
- Smith, R. J., Hiatt, W. R. Two new drugs for homozygous familial hypercholesterolemia: managing benefits and risks in a rare disorder. JAMA Internal Medicine. 173 (16), 1491-1492 (2013).
- Aartsma-Rus, A. FDA Approval of Nusinersen for Spinal Muscular Atrophy Makes 2016 the Year of Splice Modulating Oligonucleotides. Nucleic Acid Therapeutics. 27 (2), 67-69 (2017).
- Nelson, S. F., Miceli, M. C. FDA Approval of Eteplirsen for Muscular Dystrophy. The Journal of the American Medical Association. 317 (14), 1480 (2017).
- Liu, Z., Sun, X., Nakayama-Ratchford, N., Dai, H. Supramolecular chemistry on water-soluble carbon nanotubes for drug loading and delivery. American Chemical Society Nano. 1 (1), 50-56 (2007).
- Ali-Boucetta, H., et al. Multiwalled carbon nanotube-doxorubicin supramolecular complexes for cancer therapeutics. Chemical communications (Cambridge). (4), 459-461 (2008).
- Bianco, A., Kostarelos, K., Partidos, C. D., Prato, M. Biomedical applications of functionalised carbon nanotubes. Chemical communications. (5), Cambridge. 571-577 (2005).
- Hadidi, N., Kobarfard, F., Nafissi-Varcheh, N., Aboofazeli, R. Optimization of single-walled carbon nanotube solubility by noncovalent PEGylation using experimental design methods. International Journal of Nanomedicine. 6, 737-746 (2011).
- Padilla-Parra, S., et al. Quantitative imaging of endosome acidification and single retrovirus fusion with distinct pools of early endosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17627-17632 (2012).
- Wu, H., Zhu, L., Torchilin, V. P. pH-sensitive poly(histidine)-PEG/DSPE-PEG co-polymer micelles for cytosolic drug delivery. Biomaterials. 34 (4), 1213-1222 (2013).
- Oishi, M., Nagatsugi, F., Sasaki, S., Nagasaki, Y., Kataoka, K. Smart polyion complex micelles for targeted intracellular delivery of PEGylated antisense oligonucleotides containing acid-labile linkages. Chembiochem. 6 (4), 718-725 (2005).
- Dong, H., Ding, L., Yan, F., Ji, H., Ju, H. The use of polyethylenimine-grafted graphene nanoribbon for cellular delivery of locked nucleic acid modified molecular beacon for recognition of microRNA. Biomaterials. 32 (15), 3875-3882 (2011).
- Arunachalam, B., Phan, U. T., Geuze, H. J., Cresswell, P. Enzymatic reduction of disulfide bonds in lysosomes: characterization of a gamma-interferon-inducible lysosomal thiol reductase (GILT). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (2), 745-750 (2000).
- Lelimousin, M., Sansom, M. S. Membrane perturbation by carbon nanotube insertion: pathways to internalization. Small. 9 (21), 3639-3646 (2013).
- Thomas, M., Enciso, M., Hilder, T. A. Insertion mechanism and stability of boron nitride nanotubes in lipid bilayers. J Phys Chem B. 119 (15), 4929-4936 (2015).
- Jin, H., Heller, D. A., Strano, M. S. Single-particle tracking of endocytosis and exocytosis of single-walled carbon nanotubes in NIH-3T3 cells. Nano Letters. 8 (6), 1577-1585 (2008).
- Jin, H., Heller, D. A., Sharma, R., Strano, M. S. Size-dependent cellular uptake and expulsion of single-walled carbon nanotubes: single particle tracking and a generic uptake model for nanoparticles. American Chemical Society Nano. 3 (1), 149-158 (2009).
- Ruggiero, A., et al. Paradoxical glomerular filtration of carbon nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12369-12374 (2010).
