Summary
Hier beschreiben wir eine Immunofluoreszenz-Methode, um die Autofluoreszenz der Cyanobakterien zu reduzieren. Nach Immunofluoreszenz wird stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie verwendet, um dreidimensionale Höchstauflösung Bilder der Cyanobakterien FtsZ Ring zu erhalten.
Abstract
Höchstauflösung Mikroskopie hat am meisten benutzt, um Protein-Interaktionen und subzelluläre Strukturen in vielen Organismen zu studieren. In photosynthetischen Organismen ist die laterale Auflösung des Super-Auflösung jedoch nur ~ 100 nm. Die geringe Auflösung ist vor allem aufgrund des hohen Autofluoreszenz Hintergrundes der photosynthetischen Zellen verursacht durch hochintensive Laser, die für die Super-Resolution Imaging, wie stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie (Sturm) erforderlich sind. Hier beschreiben wir eine Immunofluoreszenz-gestützte Sturm Methode, die entwickelt wurde vor kurzem für die marine Picocyanobacterium Prochlorococcusimaging. Nach Immunofluoreszenz, die Autofluoreszenz Prochlorococcus wird effektiv reduziert, sodass dieser Sturm mit einer lateralen Auflösung von ~ 10 erfolgen kann nm. Mit dieser Methode wir die Organisation in Vivo dreidimensionale (3D), der das Protein FtsZ erwerben und vier verschiedene FtsZ Ring Morphologien während des Zellzyklus Prochlorococcuscharakterisieren. Die Methode, die wir hier beschreiben könnte für die Super-Resolution Imaging anderer photosynthetischen Organismen verabschiedet werden.
Introduction
Super-Resolution Microscopies können brechen die Beugungsgrenze des Lichts und Bilder innerhalb Sub Beugung Auflösungen (< 200 nm). Sie haben in vielen Organismen verbreitet, um Protein-Lokalisierung und subzelluläre Strukturen zu studieren. Großen Höchstauflösung Mikroskopieverfahren umfassen strukturierte Beleuchtung Mikroskopie (SIM), stimulierte Emission Depletion Mikroskopie (STED), Sturm und photoaktiviert Lokalisierung Mikroskopie (PALM). Die Mechanismen und Anwendungen diese Super-Resolution Mikroskope wurden überprüft an anderer Stelle1,2.
Sturm erreichen eine Auflösung bis zu 10 nm durch räumliche Trennung3,4. Für Sturm nur ein Molekül in einer Beugung begrenzte Region ("on") aktiviert ist und der Rest der Moleküle sind inaktivierte ("off") gehalten. Durch eine Anhäufung der schnellen ein- und - Ausschalten einzelner Moleküle kann ein "Beugung-unlimited" Bild generierten3sein. Inzwischen sind viele Arten von organischen Farbstoffen und fluoreszierende Proteine anwendbar im Sturm, so dass ein einfaches Upgrade von regelmäßigen Fluoreszenzmikroskopie hochauflösender Mikroskopie5,6.
Sturm ist nicht weit in den photosynthetischen Zellen, wie z. B. Cyanobakterien, Algen, angewendet und pflanzlichen Zellen mit Chloroplasten7,8, die aufgrund der Tatsache, dass Sturm ist erfordert hohe Laserintensität auf Laufwerk Photoswitching. Hochintensive Laser ungünstig reizt stark Autofluoreszenz Hintergrund in photosynthetischen Zellen und stört die Einzelmolekül-Lokalisierung in der Sturm-Bildgebung. Um mit Sturm der subzellulären Strukturen oder Protein-Interaktionen in photosynthetischen Zellen untersuchen, entwickelten wir ein Immunofluoreszenz-Protokoll, um den Hintergrund Autofluoreszenz Signale9zu stillen. In eine Routine immunofluorescent Färbeverfahren sind Exemplare weißes Licht von hoher Intensität während der Blockierungsschritt ausgesetzt, die die Autofluoreszenz des photosynthetischen Zellen zu den Anforderungen für Sturm senkt. So, dieses Protokoll macht es möglich, pigmentierte Organismen mit Sturm zu untersuchen.
Hier beschreiben wir das Protokoll Sturm zu verwenden, um die FtsZ Ring-Organisation in der einzelligen Picocyanobacterium ProchlorococcusBild. FtsZ ist ein hoch konservierte Tubulin-ähnliche Zellskelett Protein die polymerisiert um eine Ringstruktur (Z-Ring) um den Umfang einer Zelle10 zu bilden und ist wichtig für die Zellteilung11. Erhalten Prochlorococcus Zellen sind die ersten Photobleached zur Verringerung der Autofluorescent Hintergrund und Immunostained mit einem primären Anti-FtsZ Antikörper, und dann eine Sekundärantikörper Anti-Kaninchen-IgG (H + L) ist mit einem Fluorophor konjugiert (z.B. , Alexa Fluor 750). Schließlich wird Sturm verwendet, um die detaillierte FtsZ Ring Organisationen in Prochlorococcus in verschiedenen Zellzyklus Phasen zu beobachten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Probieren Sie Vorbereitung und Fixierung
- 1 mL axenic Prochlorococcus MED4 bis 5 mL des Meerwasser-basierte Pro99 mittlere12zu impfen. Wachsen Sie Prochlorococcus Kulturen bei 23 ° C unter dem Licht mit einer Intensität von 35 µmol Photonen/m2s. fünf Tage später, sammeln Sie 1 mL der Kultur in einer 1,5-mL-Tube.
Hinweis: Fünf Tage nach der Inokulation, Prochlorococcus MED4 erreichen die späten Log-Phase mit etwa 108 Zellen/mL, die eignet sich für Sturm Bildgebung. - Fügen Sie 100 µL frisch zubereitet aus 25 % Paraformaldehyd (PFA) (w/V) Formaldehyd und 2 µL 50 % Glutaraldehyd in der 1,5-mL-Tube, die Kultur zu beheben. Inkubieren Sie die Probe im Dunkeln bei Raumtemperatur für 20 min.
Hinweis: Die Probe war im Dunkeln zur Fixierung gehalten weil Glutaraldehyd Licht empfindlich. - Spin-down der Probe bei 13.500 X g für 1 min; dann entfernen Sie den Überstand und Aufschwemmen der Zellen in 100 µL der Pro99 mittlere12. Speichern Sie das Sample bei 4 ° C bis Immunostaining.
(2) Anschwemmung des Deckglases mit Polystyrol-Kügelchen
Hinweis: Polystyrol Perlen gelten als die treuhändische Marker für Drift-Korrektur.
- Wirbel der Original Fläschchen von Polystyrol-Kügelchen und bereiten eine Verdünnung von 1: 20.000 mit 50 % Ethanol als Gülle arbeiten.
- Schalten Sie die Herdplatte, stellen Sie die Temperatur auf 120 ° C und legen Sie Deckgläsern auf die heiße Platte.
- Laden Sie 100 µL arbeiten Gülle auf jeder Deckglas. Inkubieren Sie das Deckglas auf der Heizplatte für 10 min, und übertragen Sie dann sorgfältig die Deckgläsern, Petri-Schalen für die Lagerung bei Raumtemperatur.
Hinweis: Sollte die Seite mit den Perlen befestigt, um es nach oben, und die Zellen sollten auf der gleichen Seite angebracht werden. Die Perlen sind auf den Deckgläsern immobilisiert und verwendet für die Korrektur der Probe-treiben in Echtzeit während der Sturm Bildgebung. Nach Immobilisierung der Perlen, können nicht die Deckgläsern geflammt.
3. Beschichtung von Poly-L-Lysin auf der Wulst-beschichtete Deckglas
Hinweis: Dies geschieht für die Immobilisierung von Cyanobakterien Zellen.
- Das Zentrum von dem Deckglas fügen Sie 100 µL der Poly-L-Lysin (1 mg/mL hinzu) mit der Wulst-beschichteten Seite nach oben. Lassen Sie es für 30 min bei Raumtemperatur.
- Verwenden Sie eine Pipette, um sorgfältig streben die ungebundene Poly-L-Lysin und überträgt es auf eine 1,5-mL-Tube. Speichern Sie Poly-L-Lysin bei 4 ° C zur Wiederverwendung.
- Spülen Sie das Deckglas mit 10 mL Ultra-gefiltertes Wasser in einer 60 mm Petrischale und dann kurz trocknen Sie das Deckglas auf einem Papiertuch.
- Speichern Sie das Deckglas in eine Petrischale (100 mm) zur späteren Verwendung. Um die Anlage das Deckglas auf den Teller zu verhindern, säumen Sie die Petrischale mit einer Schicht aus Parafilm.
Hinweis: Das Deckglas, vorbeschichteten mit Perlen und Poly-L-Lysin, kann für mindestens ein halbes Jahr bei Raumtemperatur gelagert werden. Daher wird dringend empfohlen, einen Stapel von Deckgläsern im Voraus vorbereiten.
(4) Immobilisierung von Zellen auf das Deckglas
- Übertragen Sie ein vorbeschichteten Deckglas auf eine neue Petrischale mit Parafilm an der Unterseite, die die Färbung Gericht fortan genannt wird. Laden Sie 100 µL der festen Probe auf dem Deckglas zu und lassen Sie es für 30 min um Zelle Anlage ermöglichen.
- Übertragen Sie das Deckglas zu einem Brunnen eine 12-Well-Platte, die die Wäsche-Schüssel fortan genannt wird. Fügen Sie 1 mL der Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) (10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl und 2,7 mM KCl, pH 7,4) zum Brunnen, um das Deckglas zu waschen. Entfernen Sie die PBS-Puffer zu und fügen Sie einen neuen PBS-Puffer um das Deckglas wieder waschen.
5. Permeabilisierung der Cyanobakterien Zellen
- Entfernen Sie die PBS-Puffer mit einer Pipette. Der Brunnen der Schale waschen, die 0,05 % nicht-ionische Waschmittel-100 (V/V), 10 mM EDTA, 10 mM Tris (pH 8,0) und 0,2 mg/mL Lysozym enthält fügen Sie 1 mL frisch zubereitete Permeabilisierung Puffer hinzu.
- Inkubieren Sie die Wäsche-Schüssel bei 37 ° C für 20 min. Entfernen Sie dann die Permeabilisierung Puffer.
- Fügen Sie 1 mL PBS-Puffer und einen Shaker, welcher sanft die Wasch-Schale schüttelt für 5 min. entfernen den PBS-Puffer setzen Sie waschen Schale auf. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 X das Deckglas zu waschen.
6. Immunofluoreszenz des Chlorophylls Pigmente in einem Schritt blockieren
- Übertragen Sie das Deckglas auf den befleckenden Gericht. Fügen Sie 50 µL blocking-Puffer, enthält 0,2 % (V/V) nichtionische Waschmittel-100 und 3 % (V/V) Ziegenserum, auf der Oberseite des Deckglases.
- Stelle das ganze Platte auf Eis Färbung und verschieben Sie es unter der Xenon-Lichtquelle für Immunofluoreszenz für mindestens 60 min, mit einer Lichtstärke bei 1.800 µmol Photonen/m2·s.
- Entfernen Sie nach Immunofluoreszenz und blockieren vorsichtig den blockierenden Puffer von am Rand von einem Papiertuch adsorbierenden.
Hinweis: Die Intensität des Xenon-Lichts ist so hoch, dass ein paar richtige Sonnenbrille zum Schutz der Augen benötigt wird. Wickeln Sie unterdessen die Lichtquelle und die Platte mit Alu-Folie um zu vermeiden, das Austreten von Licht, die Augenschäden verursachen. Überprüfen Sie das Deckglas alle 15 min um sicherzustellen, dass das Deckglas feucht bleibt. Wenn das Deckglas trocken ist, fügen Sie 50 µL blocking-Puffer.
7. die Antikörperbindung
- Anti -Anabaena FtsZ Antikörper in 200 µL des Wassers entsprechend den Anweisungen des Herstellers zu lösen.
- Verdünnen Sie 1 µL Anti-FtsZ Antikörper in 99 µL blocking-Puffer. Fügen Sie 50 µL verdünnter Primärantikörper auf das Deckglas und bei Zimmertemperatur 30 min inkubieren.
- Übertragen Sie das Deckglas auf den Teller waschen. Fügen Sie 1 mL PBS-Puffer und legen Sie die Wäsche-Schüssel auf einen Shake. Schütteln Sie vorsichtig waschen Schale für 5 min. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 X das Deckglas zu waschen.
- Übertragen Sie das Deckglas auf den befleckenden Gericht. Verdünnen Sie 1 µL eines sekundären Antikörpers in 500 µL blocking-Puffer. Fügen Sie 50 µL verdünnter Sekundärantikörper auf das Deckglas und 30 min im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren.
- Übertragen Sie das Deckglas auf den Teller waschen. Waschen Sie es mit 1 mL PBS-Puffer in einen Shaker geben. Schütteln Sie vorsichtig waschen Schale für 5 min. wickeln die Wasch-Schale mit Aluminium Papier zu machen, lichtdicht. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 X.
- Die gut fügen Sie 500 µL von Formaldehyd, frisch zubereitet aus 4 % Paraformaldehyd (PFA) (w/V hinzu). Inkubieren Sie das Deckglas für 15 min im Dunkeln bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie das Formaldehyd und wiederholen Sie Waschschritt 3 X.
- Lagern Sie das Deckglas bis zur Bildgebung in PBS-Puffer bei 4 ° C im Dunkeln.
8. Vorbereitung des Sturms Imaging-Puffer
- Bereiten Sie 1 mL Puffer nach Tabelle 1, unmittelbar vor dem Sturm-Bildgebung imaging vor.
Hinweis: Da die Haltbarkeit des Puffers bildgebenden ca. 2 h ist, bereiten Sie es frisch, direkt vor der Verwendung. Vermeiden Sie aufschütteln nach Zugabe von Glukose-Oxidase und Katalase.
Achtung: Methyl-Viologen ist giftiges Material. Bitte gehen sie mit besonderer Sorgfalt. Cyclooctatetraene ist als Karzinogen der Katze eingestuft. 1 chemische. Bitte nicht einatmen und Hautkontakt und machen das Cyclooctatetraene Stammlösung und bildgebenden Puffer in einer chemischen Kapuze.
9. Bild Erfassung von Sturm
- Laden Sie das Deckglas in den Füllraum (Abbildung 1). Laden Sie die frisch zubereiteten bildgebenden Puffer sanft in die Kammer zu vermeiden, waschen Sie die Cyanobakterien Zellen. Legen Sie ein rechteckiges Deckglas auf der Oberseite der bildgebenden Puffer, seine Reaktion mit Sauerstoff in der Luft zu verhindern. Vermeiden Sie Trapping Luftblasen unter dem Deckglas.
- Schalten Sie die Kamera, das LED-Licht und Laser. Open-Sturm-Software für die Bildaufnahme, Schwerpunkt Positionsbestimmung und Probe driften Korrektur13.
- Tropfen Sie halb einen Immersionsöl auf der Linse. Die Kammer zu laden und darauf achten, dass die Linse des Objektivs nimmt Kontakt mit dem Deckglas.
- Untersuchen Sie das Signal mit einem 750-nm-Laser.
Hinweis: Immer auch eine zweite Antikörper-Minus-Färbung Negativkontrolle um sicherzustellen, dass die Autofluoreszenz verringert wird. - Identifizieren Sie einen Probe-Bereich, der Zellen und Kugelmarker enthält. Starten Sie die Software für Beispiel driften Korrektur.
Hinweis: im allgemeinen Bereich ideale Beispiel 10-30 Zellen enthält. Unterdessen sollten die Zellen getrennt werden, auch um keine überlappenden Zellen zu vermeiden. - Ein Weitfeld-Bild als Referenz zu erwerben, mit der Kamera Elektron Multiplikation (EM) gewinnen bei 300 und einer Belichtungszeit von 30 ms (Abbildung 2A).
- Erhöhen Sie die Laserstärke 750 nm Anregung zu einer höheren Macht, etwa 4,5 kW/cm2. Sobald die Fluorophore in ein spärlich blinkende Muster umgestellt wurden, erwerben Sie ein super-Auflösung durch das Sammeln von 10.000 Frames bei 33 Hz (Abb. 2 b).
Hinweis: Wenn die Fluorophore nicht isoliert sind, warten Sie ein paar Minuten, bis weitere Fluorophore zu den dunklen Zustand geschaltet werden und die isolierte einzelne Moleküle sequenziell flackern. Die Anzahl der Frames, die hier beschriebenen eignet sich für unser Beispiel und für andere gezielte Strukturen optimiert werden muss.
10. Umbau des Super-Resolution-Bilder aus den Rohdaten
- Verwenden Sie eine Plugin namens QuickPALM (Table of Materials)14 in ImageJ, um ein 3-d-Höchstauflösung Farbbild zu rekonstruieren.
Hinweis: Eine vorläufige chromatische Bild (Abbildung 2) zusammen mit einer farbcodierten Maßstabsleiste (Abbildung 2) erscheint. Die Farbe entspricht die Tiefe auf der z-Achse. - Bilder mit z-Achse geschnitten um zu demonstrieren, die 3-d-Struktur in einem video, Konstrukt einen Stapel von Höchstauflösung alle 10 nm mit QuickPALM14. Stellen Sie die Helligkeit der Stapel und duplizieren Sie die Stapel von einer Zielzelle zu. Verwenden Sie eine Plugin namens 3D Viewer (Table of Materials)15 in ImageJ, um 3-d-Bild der Zelle zu erzeugen. Notieren Sie die Drehung der 3-d-Struktur zu Demonstrationszwecken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sturm erreicht Höchstauflösung Bildgebung durch Aktivierung einzelner photoschaltbare Fluorophore stochastisch. Die Position des jeden Fluorophor aufgezeichnet und ein super-Resolution-Bild wird dann basierend auf diesen Standorten4konstruiert. Daher ist die Genauigkeit des Standortes Fluorophor wichtig für die Höchstauflösung Bildrekonstruktion. Die Absorptionsspektren von Prochlorococcus peak bei 447 nm und 680 nm,und Prochlorococcus hat eine minimale Absorption bei Wellenlängen über 700 nm16. Prochlorococcus MED4 Zellen emittiert jedoch immer noch hohe Autofluoreszenz bei einer extrem hohen Intensität von der 750-nm-Laser (Abbildung 3A), die für Sturm Bildgebung erforderlich ist. So stört die hohe Autofluoreszenz Hintergrund Prochlorococcus Zellen stark Höchstauflösung Bildgebung.
Um Sturm zur Untersuchung von Protein-Organisationen in Prochlorococcusnutzen zu können, haben wir eine Immunofluoreszenz-Methode entwickelt. Nach der Exposition auf ein weißes Licht von hoher Intensität für 30 min verringert die Autofluoreszenz Prochlorococcus MED4 Zellen (Abb. 3 b), obwohl mehrere Zellen mit Autofluoreszenz noch erkannt wurden. Wir weitere länglich Immunofluoreszenz Zeit bis 60 min und festgestellt, dass die Mehrzahl der Zellen ihre Autofluoreszenz (Abbildung 3 verloren). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Immunofluoreszenz-Methode, die wir hier entwickelt die Autofluoreszenz in photosynthetischen Organismen stark verringern kann.
Nach Immunofluoreszenz, konnten wir Sturm zu verwenden, um die Zellteilung Protein FtsZ in Prochlorococcus visualisieren MED4 Zellen. Die Cyanobacterium Prochlorococcus ist das kleinste und das am häufigsten vorkommende photosynthetische Organismus auf der Erde17. Der Durchmesser einer Zelle Prochlorococcus beträgt nur 500-700 nm18. Mit dieser kleinen Zellengröße ist es unmöglich, die FtsZ Ring Organisation in Prochlorococcus Zellen unter Verwendung von konventionellen Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie (Abbildung 2A) zu visualisieren. Sturm hat jedoch eine räumliche Auflösung von 9,6 nm in der Xy-Ebene und 41.6 nm in der z-Achse. Sturm konnten wir eine ausführliche Morphologie des FtsZ Ring in Prochlorococcus (Abbildungen 2 b und 4) zu offenbaren. Durch 3-d-Sturm-Bilder drehen, haben wir vier verschiedene Arten von FtsZ Ring Morphologien identifiziert: Cluster (Abbildung 4A, Film S1), eine unvollständige Ring (Abbildung 4 b, S2 Film), einen kompletten Ring (Abb. 4 C, Film-S3), und Ringe (Abbildung 4D, Film S4) zu verdoppeln. Lücken verzeichneten die komplette FtsZ Ringe des Prochlorococcus (Abbildung 4, Film-S3), das ist ähnlich wie in Caulobacter Cresentus19. Diese vier Arten von FtsZ Ring Morphologien zeigte den Montageprozess FtsZ Ring während des Zellzyklus Prochlorococcus, und diese Studie half uns zu verstehen, die Rolle der FtsZ Ring während der Zellteilung Prochlorococcus 9.
Abbildung 1: Komponenten der Füllraum und der versammelten Kammer mit Deckgläsern und Imaging-Puffer für Sturm Imaging. Das Deckglas mit der Probe wurde zunächst auf die Nut der Unterteil gelegt. Der obere Teil wurde dann vorsichtig auf das Unterteil geschraubt. Die Image-Puffer wurde in den Füllraum hinzugefügt und dann vorsichtig mit einem quadratischen Deckgläschen bedeckt. Bläschen sollte vermieden werden, um jede Bewegung zu minimieren, die die Genauigkeit der Messung beeinflussen können. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Repräsentative Weitfeld-, Sturm 2-D und 3-d Farbbilder Sturm der FtsZ in Prochlorococcus MED4. Die Bilder stammen aus der gleichen Sichtfeld mit regelmäßigen (A) Weitfeld-Mikroskopie, (B) 2-D Sturm und (C) 3D-Farbe Sturm. Die Farben im Bedienfeld " C " zeigen die Tiefe der fluoreszierenden Signale auf der z-Achse. Die Zahlen im Bedienfeld " C " geben die Zellen von Interesse. Der Maßstabsbalken = 1 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Immunofluoreszenz von Prochlorococcus MED4. Feste Prochlorococcus MED4 Zellen waren (A) nicht Photobleached, oder Photobleached (B) 30 min und (C) 60 min. Diente der XD-300-Xenon-Licht mit einer Intensität von 1.800 µmol/m(2·s) Zellen waren begeistert von einem 750-nm-Laser mit der gleichen Intensität wie verwendet wurde für die Sturm-Bildgebung. Die Autofluorescences wurden mit den gleichen Filter wie im Sturm, um sicherzustellen, dass die Anwesenheit von minimaler Autofluoreszenz Sturm beeinflussen abgebildet. Der Maßstabsbalken = 2 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: repräsentative Sturm Bilder von vier FtsZ Ring Morphologien. Vier verschiedene FtsZ Ring Morphologien verzeichneten Prochlorococcus: Cluster (A), (B) eine unvollständige Ring und (C) eine komplette Ring Doppelringe (D). Für die gleiche Zelle gezeigt wurden Bilder von (i) Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskopie, (Ii) Sturm auf der Xy-Ebene, und (Iii) Sturm nach der Drehung. Die 3-d-Filme entsprechend auf die Zellen in Seitenteile A, B, Cund D Filme S1, S2, S3 und S4, bzw. entnehmen Sie bitte. Der Maßstabsbalken = 500 nm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Chemikalien | Stammlösung | Endkonzentration |
| Glukose | N/A | 10 % (w/V) |
| Tris-Cl (pH 8,0) | 0,5 M | 50 mM |
| Ascorbinsäure | 100 mM | 1 mM |
| Methyl-viologen | 100 mM | 1 mM |
| Cyclooctatetraene | 200 mM | 2 mM |
| DÄMMUND | 0,5 M | 25 mM |
| Glukose-oxidase | 56 mg/ml | 0,56 mg/ml |
| Katalase | 4 mg/ml | 40 µg/ml |
Tabelle 1: Rezept für den imaging-Puffer.
Film S1: Cluster FtsZ-Proteine beobachtet Prochlorococcus Zellen MED4. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)
Film S2: eine unvollständige Ring FtsZ-Proteine beobachtet Prochlorococcus Zellen MED4. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)
Film S3: ein kompletten Ring FtsZ-Proteine beobachtet Prochlorococcus Zellen MED4. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)
Film S4: ein Doppel-Ring FtsZ-Proteine beobachtet Prochlorococcus Zellen MED4. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In diesem Protokoll beschrieben wir ein Verfahren um die Autofluoreszenz des Cyanobacterium Prochlorococcus (Abbildung 3) deutlich zu reduzieren und dann Immunostain der Proteine in den Zellen, die ermöglicht, Sturm um die 3-d-FtsZ studieren nutzen Ring-Morphologien in Prochlorococcus (Abbildung 4). Dieses Protokoll könnte für Super-Resolution Imaging in anderen photosynthetischen Organismen verabschiedet werden.
Frühere Studien zu photosynthetischen Organismen verwendet hauptsächlich SIM Super-Resolution imaging, da SIM nicht Lasern von hoher Intensität erforderlich ist. Allerdings ist die räumliche Auflösung der SIM nur ~ 100 nm1, viel geringer als die der Sturm. In dieser Studie konnte die räumliche Auflösung der Sturm Bilder erreichen 9,6 nm in der Xy-Ebene und 41.6 nm in der z-Achse-9. Die verbesserte Auflösung zur Verfügung gestellt von Immunofluoreszenz und Sturm Bildgebung erlaubt Forschern photosynthetische Organismen noch nie da gewesenen ausführlich zu studieren.
Immunofluoreszenz vor dem Sturm ist ein entscheidender Schritt, mit dem Forscher, die Lage und die Dynamik von Proteinen in Autofluorescent Organismen zu beobachten zu können. Neben Cyanobakterien haben wir die Autofluoreszenz der blühenden Pflanze gezeigt, die Arabidopsis Thaliana auch nach 60 min Immunofluoreszenz9abgeschreckt werden könnten. Die Immunofluoreszenz ist weit verbreitet, zum Beispiel zur Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnis und die Visualisierung von mehreren Biomarker nacheinander20. Es wurde auch gezeigt, dass Immunofluoreszenz vor Bildgebung vorteilhaft ist, wenn eine Autofluoreszenz-Probe unter Raman-Spektroskopie21zu beobachten. Daher kann es möglich, diese Immunofluoreszenz-Methode zur Reduzierung der Autofluoreszenz der anderen photosynthetischen Organismen, einschließlich eukaryotischen Algen, Gefäßpflanzen und Organismen mit Proteorhodopsin und Zeitschrift anzuwenden sein.
Photosynthetische Organismen enthalten verschiedene Pigmente, die unterschiedlichen Absorptionsspektren haben; organische Farbstoffe und fluoreszierende Proteine müssen daher umsichtig ausgewählt werden. Zum Beispiel in dieser Studie, eine Farbe mit einer maximalen Erregung Wellenlänge von etwa 750 nm verwendet wurde. Obwohl zwei Kanäle (750 nm bis 650 nm) sind verfügbar für den Sturm hier vorgestellten, Prochlorococcus Autofluorescent Signale konnten noch nach ausgesetzt unter einem 650-nm-Laser, auch nach längerer Immunofluoreszenz beobachtet werden. Das liegt wahrscheinlich daran 650 nm gehört zu den großen Absorption Wellenlängen für Prochlorococcus. Auf der anderen Seite einige vorkommenden Rotalgen enthalten und Phycoerythrin als ihre Pigment22, hat ein Absorptionsspektrum von 488 nm bis 560 nm und eine minimale Absorption bei 650 nm23. Daher könnte es einen 650-nm-Kanal statt einen 750 nm-Kanal zu verwenden, um die Proteine innerhalb dieser Phycoerythrin-haltigen autotrophe studieren durchführbar.
Zusammenfassend bietet eine richtige Kombination von Immunofluoreszenz und Sturm einen leistungsfähigen Ansatz um die Protein-Organisation in photosynthetischen Zellen im Detail zu verstehen, die weiter ihre Dynamik und Potenzial Funktion offenbaren wird.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren danken für ihre technische Unterstützung und kommentiert das Manuskript Daiying Xu. Diese Studie stützt sich auf Zuschüsse aus der National Natural Science Foundation of China (Projektnummer 41476147) und der Forschung gewährt Rat von der Hong Kong Special Administrative Region, China (Projekt-Nummern 689813 und 16103414).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene particles | Spherotech | PP-20-10 | 2.0-2.4 µm |
| Coverslip | Marienfeld | 0111580 | 18 mm ∅, Thickness No. 1 |
| Ethanol | Scharlau | ET00021000 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P9155 | mol wt 70,000-150,000 |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Glutaraldehyde solution, 50% | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| PBS | Sigma | P3813 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| EDTA Disodium Salt, 2-hydrate | Gold biotechnology | E-210-500 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| anti-Anabaena FtsZ antibody | Agrisera | AS07217 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Life Technologies | A-21039 | conjugated with Alexa Fluor 750 |
| D-Glucose Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Methyl Viologen | Sigma-Aldrich | 856177 | |
| Cyclooctatetraene | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | 646547 | |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| XD-300 Xenon light source | 250 W | ||
| STORM microscope | NBI | SRiS microscope | |
| Rohdea | NBI | SRiS 3.0 | software for imaging acquisition |
| Luna | NBI | SRiS 3.0 | software for drifting correction |
| QuickPALM | https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis | ||
| 3D Viewer | http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home |
References
- Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells. Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A New Wave of Cellular Imaging. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 285-314 (2010).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods Methods. 8 (12), 1027-1036 (2012).
- Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Komis, G., Šamajová, O., Ovečka, M., Šamaj, J. Super-resolution Microscopy in Plant Cell Imaging. Trends in Plant Science. 20 (12), 834-843 (2015).
- Schubert, V. Super-resolution Microscopy - Applications in Plant Cell Research. Frontiers in Plant Science. 8, 531 (2017).
- Liu, R., et al. Three-Dimensional Superresolution Imaging of the FtsZ Ring during Cell Division of the Cyanobacterium Prochlorococcus. mbio. 8 (6), e00657 (2017).
- Adams, D. W., Errington, J. Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring. Nature Reviews Microbiology. 7, 642-653 (2009).
- Boer, P. A. Advances in understanding E. coli cell fission. Current Opinion in Microbiology. 13 (6), 730-737 (2010).
- Moore, L. R., Post, A. F., Rocap, G., Chisholm, S. W. Utilization of different nitrogen sources by the marine cyanobacteria Prochlorococcus and Synechococcus. Limnology and Oceanography. 47 (4), 989-996 (2002).
- Zhao, T., et al. A user-friendly two-color super-resolution localization microscope. Optics Express. 23 (2), 1879 (2015).
- Henriques, R., Lelek, M., Fornasiero, E. F., Valtorta, F., Zimmer, C., Mhlanga, M. M. QuickPALM: 3D real-time photoactivation nanoscopy image processing in ImageJ. Nature Methods. 7 (5), 339-340 (2010).
- Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ. BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).
- Ting, C. S., Rocap, G., King, J., Chisholm, S. W. Cyanobacterial photosynthesis in the oceans: The origins and significance of divergent light-harvesting strategies. Trends in Microbiology. 10 (3), 134-142 (2002).
- Biller, S. J., Berube, P. M., Lindell, D., Chisholm, S. W. Prochlorococcus: The structure and function of collective diversity. Nature Reviews Microbiology. 13 (1), 13-27 (2015).
- Morel, A., Ahn, Y. -H., Partensky, F., Vaulot, D., Claustre, H. Prochlorococcus and Synechococcus - a Comparative-Study of Their Optical-Properties in Relation To Their Size and Pigmentation. Journal of Marine Research. 51, 617-649 (1993).
- Holden, S. J., Pengo, T., Meibom, K. L., Fernandez, C., Collier, J., Manley, S. High throughput 3D super-resolution microscopy reveals Caulobacter crescentusin vivo Z-ring organization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (12), 4566-4571 (2014).
- Zhao, M., Wei, B., Chiu, D. T. Imaging multiple biomarkers in captured rare cells by sequential immunostaining and photobleaching. Methods. 64 (2), 108-113 (2013).
- Golcuk, K., Mandair, G. S., Callender, A. F., Sahar, N., Kohn, D. H., Morris, M. D. Is photobleaching necessary for Raman imaging of bone tissue using a green laser? Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (7), 868-873 (2006).
- Haxo, F. T., Blinks, L. R. Photosynthetic Action Spectra of Marine Algae. The Journal of General Physiology. 33 (4), 389-422 (1950).
- Bryant, D. A. Phycoerythrocyanin and Phycoerythrin: Properties and Occurrence in Cyanobacteria. Journal of General Microbiology. 128 (4), 835-844 (1982).
