Summary
Qui descriviamo un metodo photobleaching per ridurre l'autofluorescenza di cianobatteri. Dopo photobleaching, microscopia stocastico ricostruzione ottico viene utilizzata per ottenere immagini tridimensionali ad alta super-risoluzione dell'anello FtsZ cianobatterica.
Abstract
Microscopia di Super-risoluzione è stato ampiamente utilizzata per studiare le interazioni della proteina e strutture subcellulari in molti organismi. Negli organismi fotosintetici, tuttavia, la risoluzione laterale dell'imaging di Super-risoluzione è solo ~ 100 nm. La bassa risoluzione è dovuto principalmente sullo sfondo di alta autofluorescenza delle cellule fotosintetiche causato da laser ad alta intensità che sono necessari per l'imaging di Super-risoluzione, come il microscopio stocastico ricostruzione ottico (tempesta). Qui, descriviamo un assistita photobleaching tempesta metodo che è stato sviluppato recentemente per formazione immagine il picocyanobacterium marino Acinetobacter. Dopo photobleaching, l'autofluorescenza di Acinetobacter è efficacemente ridotto così quella tempesta può essere eseguita con una risoluzione laterale di ~ 10 nm. Utilizzando questo metodo, acquisiamo l'organizzazione in vivo tridimensionale (3D) della proteina FtsZ e caratterizzano le quattro diverse morfologie di anello di FtsZ durante il ciclo cellulare di Acinetobacter. Il metodo che qui descritto potrebbe essere adottato per l'imaging di Super-risoluzione di altri organismi fotosintetici.
Introduction
Microscopie di Super-risoluzione possono rompere il limite di diffrazione di luce e di fornire immagini all'interno di risoluzioni Sub-diffrazione (< 200 nm). Essi sono stati ampiamente utilizzati in molti organismi per studiare la localizzazione della proteina e strutture subcellulari. Maggiore super-risoluzione microscopia metodi includono illuminazione strutturata microscopia (SIM), stimolato microscopia di svuotamento di emissione (STED), tempesta e microscopia di fotoattivazione localizzazione (PALM). I meccanismi e le applicazioni di questi super-risoluzione microscopi sono stati esaminati altrove1,2.
TEMPESTA può raggiungere una risoluzione alta come 10 nm di separazione spaziale3,4. Per la tempesta, soltanto una molecola all'interno di una regione di diffrazione limitata è attivo ("on") e il resto delle molecole sono tenute inattivato ("off"). Da un accumulo di accensione rapida e - off di singole molecole, un'immagine "diffrazione-illimitato" può essere generato3. Nel frattempo, molti tipi di coloranti organici e proteine fluorescenti sono applicabili in tempesta, permettendo un facile aggiornamento da microscopia di fluorescenza regolari a microscopia ad alta risoluzione5,6.
TEMPESTA non è stato ampiamente applicato in cellule fotosintetiche, come cianobatteri, alghe, e cellule vegetali con cloroplasti7,8, che è dovuto al fatto che la tempesta richiede laser ad alta intensità per unità photoswitching. Il laser ad alta intensità sfavorevole eccita autofluorescence forte background in cellule fotosintetiche e interferisce con la localizzazione di singola molecola nell'imaging di tempesta. Per poter utilizzare tempesta per indagare le strutture subcellulari o interazioni della proteina in cellule fotosintetiche, abbiamo sviluppato un protocollo di photobleaching per placare lo sfondo autofluorescence segnali9. In una procedura di macchiatura immunofluorescente routine, gli esemplari sono esposti a luce bianca di alta intensità durante la fase di blocco, che abbassa l'autofluorescenza delle cellule fotosintetiche per soddisfare i requisiti per la tempesta. Così, questo protocollo rende fattibile per studiare gli organismi pigmentati con tempesta.
Qui, descriviamo il protocollo da utilizzare tempesta all'immagine dell'organizzazione di anello FtsZ nella picocyanobacterium unicellulari Acinetobacter. FtsZ è una proteina del citoscheletro altamente conservata di tubulina-come che polimerizza per formare una struttura ad anello (l'anello Z) lungo la circonferenza di una cella10 ed è essenziale per la divisione cellulare11. Cellule sono conservate Prochlorococcus prima photobleached per ridurre la priorità bassa autofluorescent e immunostained con un anticorpo primario anti-FtsZ, e poi un anticorpo di IgG (H + L) anti-coniglio secondario è coniugato con un fluoroforo (per esempio. , Alexa Fluor 750). Alla fine, tempesta è usato per osservare le organizzazioni di anello di FtsZ dettagliate in Acinetobacter durante le fasi di ciclo cellulare diverso.
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Protocol
1. preparazione e la fissazione del campione
- Inoculare 1 mL di axeniche Prochlorococcus MED4 a 5 mL della base di acqua di mare Pro99 medio12. Crescere Prochlorococcus culture a 23 ° C sotto la luce con un'intensità di 35 µmol fotoni/m2s. cinque giorni più tardi, raccogliere 1 mL di coltura in una provetta da 1,5 mL.
Nota: Cinque giorni dopo l'inoculazione, Acinetobacter MED4 raggiungerà la fase tarda del registro, con circa 108 cellule/mL, che è appropriato per l'imaging di tempesta. - Aggiungere 100 µ l di formaldeide preparati al momento da 25% paraformaldeide (PFA) (w/v) e 2 µ l di 50% glutaraldeide nella provetta da 1,5 mL per fissare la cultura. Incubare il campione al buio a temperatura ambiente per 20 min.
Nota: Il campione è stato tenuto all'oscuro per fissazione perché glutaraldeide è luce sensibile. - Rotazione verso il basso il campione a 13.500 x g per 1 min; quindi, rimuovere il supernatante e risospendere le cellule in 100 µ l del medio Pro9912. Conservare il campione a 4 ° C fino a che immunostaining.
2. spre-spalmatura del coprivetrino con perle di polistirolo
Nota: Perle di polistirolo sono considerati come il marcatore fiduciale per la correzione di deriva.
- Vortex originale flacone di perle di polistirolo e preparare una diluizione di 1: 20,000 con etanolo al 50% come lavoro liquami.
- Accendere la piastra riscaldante, impostare la temperatura a 120 ° C e posizionare i vetrini coprioggetto sulla piastra calda.
- Caricare 100 µ l di liquami di lavoro su ogni vetrino coprioggetti. Incubare il vetrino coprioggetto sulla piastra calda per 10 minuti e, quindi, attentamente trasferire i coprioggetti Petri per stoccaggio a temperatura ambiente.
Nota: Il lato con le perline collegato ad esso dovrebbe affrontare, e le cellule devono essere attaccate sullo stesso lato. Le perle sono immobilizzate su lamelle e utilizzate per correggere l'esempio alla deriva in tempo reale durante la formazione immagine di tempesta. Dopo immobilizzazione le perline, non possono essere fiammati i coprioggetti.
3. rivestimento di poli-L-lisina sul coprioggetto rivestite con perlina
Nota: Questo viene fatto per l'immobilizzazione delle cellule cianobatterica.
- Aggiungere 100 µ l di poli-L-lisina (1 mg/mL) al centro del coprivetrino con lato rivestite con perlina rivolto verso l'alto. Lasciate riposare per 30 min a temperatura ambiente.
- Utilizzare una pipetta per attentamente aspire unattached poli-L-lisina e trasferirlo in una provetta da 1,5 mL. Salvare il poli-L-lisina a 4 ° C per il riutilizzo.
- Risciacquare il coprioggetto con 10 mL di acqua ultra-filtrate in una capsula di Petri 60mm ed asciugare brevemente il coprivetrino su un tovagliolo di carta.
- Conservare il vetrino coprioggetto in una capsula Petri (100 mm) per un successivo utilizzo. Per evitare l'attacco del coprivetrino al piatto, linea di Petri con uno strato di parafilm.
Nota: Il vetrino coprioggetto, sensibilizzato con perline e poli-L-lisina, può essere conservato a temperatura ambiente per almeno un semestre. Di conseguenza, preparando una serie di lamelle in anticipo è altamente raccomandato.
4. immobilizzazione delle cellule il coprivetrino
- Trasferire un coprioggetto ricoperto prima una nuova capsula Petri con parafilm nella parte inferiore, che deve essere indicato come il piatto di macchiatura d'ora in poi. Caricare 100 µ l del campione fisso il coprivetrino e lasciate riposare per 30 minuti consentire il collegamento delle cellule.
- Trasferire il coprioggetto in un pozzetto di una piastra 12-pozzetti, che deve essere indicato come il piatto di lavaggio d'ora in poi. Aggiungere 1 mL di tampone fosfato salino (PBS) (10mm Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl e 2.7 mM KCl, pH 7.4) al pozzo a lavare il vetrino coprioggetti. Rimuovere il tampone PBS e aggiungere un nuovo tampone PBS per lavare nuovamente il vetrino coprioggetti.
5. permeabilizzazione delle cellule cianobatterica
- Rimuovere il tampone PBS utilizzando una pipetta. Aggiungere 1 mL di tampone di permeabilizzazione preparata al momento del lavaggio piatto, che contiene 0,05% detergente non ionico-100 (v/v), 10 mM EDTA, 10 mM Tris (pH 8.0) e lisozima di 0,2 mg/mL.
- Incubare il piatto di lavaggio a 37 ° C per 20 min. Quindi, rimuovere il buffer di permeabilizzazione.
- Aggiungere 1 mL di tampone PBS e posizionare il piatto di lavaggio su un agitatore che scuote dolcemente il piatto di lavaggio per 5 minuti, rimuovere il tampone PBS. Ripetere questo passaggio 3x per lavare il vetrino coprioggetti.
6. Photobleaching della clorofilla pigmenti in un passaggio di blocco
- Trasferire il coprioggetto al piatto colorazione. Aggiungere 50 µ l di tampone bloccante, che contiene 0.2% (v/v) non ionici detergente-100 e siero di capra del 3% (v/v), nella parte superiore il vetrino coprioggetti.
- Posizionare l'intera piastra sul ghiaccio di colorazione e spostarlo sotto la sorgente luminosa del xeno per photobleaching per almeno 60 min, con un'intensità di luce a 1.800 µmol fotoni/m2p.
- Dopo photobleaching e di blocco, rimuovere con cautela il tampone bloccante di adsorbimento e con il bordo di un tovagliolo di carta.
Nota: L'intensità della luce allo xeno è così alto che un paio di occhiali da sole adeguate è necessaria per la protezione degli occhi. Nel frattempo, avvolgere la sorgente luminosa e la piastra utilizzando carta stagnola per evitare la fuoriuscita di luce, che può danneggiare gli occhi. Controllare il coprioggetto ogni 15 min per assicurarsi che il vetrino coprioggetto rimane umido. Se il vetrino coprioggetto è asciutto, aggiungere 50 µ l di tampone bloccante.
7. anticorpi
- Sciogliere anti - anticorpo diAnabaena FtsZ in 200 µ l di acqua secondo le istruzioni del produttore.
- Diluire 1 µ l di anticorpo anti-FtsZ in 99 µ l di tampone bloccante. Aggiungere 50 µ l di anticorpo primario diluito il coprivetrino e incubare a temperatura ambiente per 30 min.
- Trasferire il coprioggetto per il piatto di lavaggio. Aggiungere 1 mL di tampone PBS e posizionare il piatto di lavaggio su una scossa. Agitare delicatamente il piatto di lavaggio per 5 min, ripetere questo passaggio 3x per lavare il vetrino coprioggetti.
- Trasferire il coprioggetto al piatto colorazione. Diluire 1 µ l di anticorpo secondario in 500 µ l di tampone bloccante. Aggiungere 50 µ l di anticorpo secondario diluito sul vetrino coprioggetto e Incubare 30 min al buio a temperatura ambiente.
- Trasferire il coprioggetto per il piatto di lavaggio. Lavare con 1 mL di tampone PBS su un agitatore. Agitare delicatamente il piatto di lavaggio per 5 min, avvolgere il piatto di lavaggio con carta alluminio per renderlo a prova di luce. Ripetere questo passaggio x 3.
- Aggiungere 500 µ l di formaldeide preparati al momento da paraformaldeide al 4% (PFA) (w/v). Incubare il vetrino coprioggetto per 15 min al buio a temperatura ambiente.
- Rimuovere la formaldeide e ripetere la fase di lavaggio 3 x.
- Conservare il vetrino coprioggetto in tampone PBS a 4 ° C al buio fino a formazione immagine.
8. preparazione della tempesta Buffer di Imaging
- Preparare 1 mL di tampone secondo la tabella 1, immediatamente prima dell'imaging di tempesta di imaging.
Nota: Come la shelf life del buffer imaging è di circa 2 h, prepararlo fresco, proprio prima dell'uso. Evitare l'uso del Vortex dopo l'aggiunta di glucosio ossidasi e catalasi.
Attenzione: Metil viologeno è materiale velenoso. Si prega di trattare con particolare cura. Cicloottatetraene è classificata come cancerogena Cat. 1 chimica. Si prega di evitare l'inalazione e contatto con la pelle e rendere la soluzione di riserva cicloottatetraene e buffer di imaging in una cappa chimica.
9. immagine acquisizione dei dati di tempesta
- Caricare il coprioggetto nel vano di carico (Figura 1). Caricare il buffer imaging preparato delicatamente nell'alloggiamento per evitare di lavare fuori le cellule cianobatterica. Posto un coprioggetto rettangolare nella parte superiore il buffer di imaging per impedire la sua reazione con l'ossigeno nell'aria. Evitare le bolle d'aria di intrappolamento sotto il vetrino coprioggetti.
- Accendere la fotocamera, la luce del LED e laser. Aprire il software STORM per acquisizione di immagini, determinazione della posizione di baricentro e campione di drifting correzione13.
- Aggiungere mezza una goccia di olio per immersione in cima la lente. Caricare la camera e assicurarsi che la lente dell'obiettivo fa contatto con il vetrino coprioggetti.
- Esaminare il segnale con un laser di 750 nm.
Nota: Sempre includere un secondo controllo anticorpo-meno-macchiatura negativo per garantire che l'autofluorescenza è diminuita. - Identificare un'area campione che contiene entrambe le cellule e marker fiduciali. Avviare il software per esempio alla deriva di correzione.
Nota: In generale, l'area campione ideale contiene cellule di 10-30. Nel frattempo, le cellule devono essere separate bene per evitare eventuali celle sovrapposte. - Acquisire un'immagine di grande campo come riferimento, con il moltiplicarsi di elettrone di fotocamera (EM) guadagno a 300 e un tempo di esposizione di 30 ms (Figura 2A).
- Aumentare l'intensità del laser di eccitazione di 750 nm a una forza superiore, circa 4,5 kW/cm2. Una volta i fluorofori hanno la transizione in un modello di rado lampeggio, è possibile acquisire una sola immagine di Super-risoluzione raccogliendo 10.000 fotogrammi a 33 Hz (Figura 2B).
Nota: Se i fluorofori non sono isolate, attendere un paio di minuti fino a quando altri fluorofori sono commutati allo stato scuro e le singole molecole isolate verificarsi uno sfarfallio in sequenza. Il numero di fotogrammi qui descritto è adatto per il nostro campione e deve essere ottimizzato per altre strutture mirate.
10. ricostruzione di Super-risoluzione immagini dai dati grezzi
- Utilizzare un plugin chiamato QuickPALM (Tabella materiali)14 in ImageJ per ricostruire un'immagine di Super-risoluzione di colore 3D.
Nota: Una preliminare cromatica immagine (Figura 2) insieme a una barra di scala con codifica a colori (Figura 2) apparirà. Il colore rappresenta la profondità sull'asse z. - Per dimostrare il 3-d della struttura in un costrutto di video, una pila di Super-risoluzione immagini con asse z sezionato ogni 10 nm utilizzando QuickPALM14. Regolare la luminosità delle pile e duplicare la pila di cella uno obiettivo. Utilizzare un plugin denominato Visualizzatore 3D (Tabella materiali)15 in ImageJ per generare l'immagine 3D della cella. Registrare la rotazione della struttura 3-d per scopi dimostrativi.
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Representative Results
TEMPESTA realizza formazione immagine super-risoluzione attivando fotomodulabili singoli fluorophores casualmente. La posizione di ogni fluoroforo è registrata e un'immagine di Super-risoluzione è quindi costruita basata su queste posizioni4. Pertanto, la precisione della posizione fluoroforo è importante per la ricostruzione di immagine di Super-risoluzione. Gli spettri di assorbimento di Acinetobacter picco a 447 nm e 680 nme Acinetobacter ha un assorbimento minimo a lunghezze d'onda oltre 700 nm16. Tuttavia, le cellule Prochlorococcus MED4 ancora emesso autofluorescence alto quando esposto a un'intensità estremamente alta del laser 750 nm (Figura 3A), che è richiesto per l'imaging di tempesta. Così, sullo sfondo di alta autofluorescenza delle cellule Prochlorococcus interferisce pesantemente con formazione immagine super-risoluzione.
Al fine di utilizzare tempesta per studiare le organizzazioni di proteina in Acinetobacter, abbiamo sviluppato un metodo di photobleaching. Dopo l'esposizione a una luce bianca ad alta intensità per 30 min, l'autofluorescenza delle cellule MED4 Prochlorococcus è diminuito (Figura 3B), anche se ancora sono state rilevate diverse celle con autofluorescenza. Abbiamo ulteriormente allungato il tempo di photobleaching di 60 min e trovato che la maggior parte delle cellule hanno perso loro autofluorescenza (Figura 3). Questi risultati indicano che il metodo di photobleaching che abbiamo sviluppato qui può ridurre notevolmente l'autofluorescenza degli organismi fotosintetici.
Dopo photobleaching, siamo stati in grado di utilizzare la tempesta per visualizzare la divisione cellulare proteina FtsZ in Acinetobacter MED4 cellule. Il cianobatterio Prochlorococcus è il più piccolo e l'organismo fotosintetico più abbondante sulla terra17. Il diametro di una cellula di Acinetobacter è solo 500-700 nm18. Con una dimensione di piccole cellule, è Impossibile visualizzare l'organizzazione di anello di FtsZ in cellule Prochlorococcus utilizzando la microscopia a fluorescenza grandangolari convenzionali (Figura 2A). Tuttavia, la tempesta ha una risoluzione spaziale di 9,6 nm nel piano xy e 41,6 nm nell'asse z. Utilizzo di tempesta, siamo stati in grado di rivelare una morfologia dettagliata dell'anello FtsZ in Acinetobacter (figure 2B e 4). Ruotando le immagini 3-d di tempesta, abbiamo identificato quattro tipi diversi di morfologie di FtsZ anello: cluster (Figura 4A, Film S1), un anello incompleto (Figura 4B, Film S2), un anello completo (Figura 4 C, Film S3) e doppi anelli (Figura 4 D, Film S4). Le lacune sono state osservate negli anelli FtsZ completi di Acinetobacter (Figura 4, Film S3), che è simile a quello trovato in Caulobacter cresentus19. Questi quattro tipi di morfologie di FtsZ anello ha mostrato il processo di assemblaggio dell'anello FtsZ durante il ciclo cellulare di Acinetobacter, e questo studio ci ha aiutato a comprendere il ruolo dell'anello FtsZ durante la divisione cellulare di Acinetobacter 9.
Figura 1: componenti della camera di carico e l'alloggiamento assemblato con il buffer di vetrini coprioggetti e imaging per l'imaging di STORM. Il coprioggetto con il campione era al primo posto sulla scanalatura della parte inferiore. La parte superiore era quindi avvitata con attenzione la parte inferiore. Il buffer di imaging è stato aggiunto nella camera di caricamento e poi accuratamente coperto con un vetrino coprioggetto quadrato. Bolle dovrebbero essere evitate per ridurre al minimo qualsiasi movimento che può influenzare la precisione della misurazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Rappresentativo del largo-campo, STORM 2-D e 3-d colore STORM immagini di FtsZ in Acinetobacter MED4. Le immagini sono state scattate dallo stesso campo di vista usando microscopia elettronica grandangolari regolare (A), (B) 2-D tempesta e (C) colore 3D STORM. I colori nel pannello C indicano la profondità dei segnali fluorescenti sull'asse z. I numeri nel pannello C indicano le celle di interesse. Le barre della scala = 1 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Photobleaching di Acinetobacter MED4. Fisso Prochlorococcus MED4 cellule erano (A), non photobleached, o sono stati photobleached per (B) 30 min e (C) 60 min. La luce allo xeno XD-300 è stata usata ad un'intensità di 1.800 µmol/m2p. cellule erano eccitate da un 750-nm laser alla stessa intensità, come è stato utilizzato per l'imaging di tempesta. Il autofluorescences erano imaged con gli stessi filtri utilizzato nella tempesta per assicurarsi la presenza di minimo autofluorescenza per interessare la tempesta. Le barre di scala = 2 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: rappresentante STORM immagini delle quattro morfologie di anello di FtsZ. Quattro diverse morfologie di anello di FtsZ sono state osservate in Acinetobacter: cluster (A), (B) un incompleto anello, anello (C) una completa e anelli doppio (D). Per la stessa cella, immagini di microscopia di fluorescenza (i) largo-campo, (ii) tempesta sul piano xy e (iii) tempesta dopo rotazione sono stati indicati. Il film 3-d, corrispondenti alle celle in pannelli A, B, Ce D sono mostrati nel film S1, S2, S3 e S4, rispettivamente. Le barre di scala = 500 nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Prodotti chimici | Soluzione di riserva | Concentrazione finale |
| glucosio | N/A | 10% (p/v) |
| Tris-Cl (pH 8.0) | 0,5 M | 50 mM |
| Acido ascorbico | 100 mM | 1 mM |
| Metil viologeno | 100 mM | 1 mM |
| Cicloottatetraene | 200 mM | 2 mM |
| TCEP | 0,5 M | 25 mM |
| Glucosio ossidasi | 56 mg/ml | 0,56 mg/ml |
| Catalasi | 4 mg/ml | 40 µ g/ml |
Tabella 1: Ricetta per il buffer di imaging.
Film S1: mazzi di proteine di FtsZ osservati Prochlorococcus Cellule MED4. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)
Film S2: un anello incompleto delle proteine di FtsZ osservata in Prochlorococcus Cellule MED4. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)
Film S3: un anello completo di proteine di FtsZ osservata in Prochlorococcus Cellule MED4. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)
Film S4: un doppio anello di proteine di FtsZ osservata in Prochlorococcus Cellule MED4. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)
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Discussion
In questo protocollo, abbiamo descritto una procedura per ridurre significativamente l'autofluorescenza del cianobatterio Prochlorococcus (Figura 3) e, quindi, immunostain le proteine nelle cellule, che ci ha permesso di utilizzare tempesta per studiare il FtsZ 3D morfologie di anello in Acinetobacter (Figura 4). Questo protocollo potrebbe essere adottato per l'imaging di Super-risoluzione in altri organismi fotosintetici.
Gli studi precedenti sugli organismi fotosintetici principalmente utilizzato SIM per ottenere super-resolution imaging poiché SIM non richiede i laser ad alta intensità. Tuttavia, la risoluzione spaziale di SIM è solo ~ 100 nm1, che è molto inferiore a quello della tempesta. In questo studio, la risoluzione spaziale delle immagini tempesta potrebbe raggiungere 9,6 nm nel piano xy e 41,6 nm nel asse z9. La migliore risoluzione fornita da photobleaching e tempesta imaging permette ai ricercatori di studiare gli organismi fotosintetici in dettaglio senza precedenti.
Photobleaching prima della tempesta è una fase critica che consente ai ricercatori di osservare la posizione e la dinamica delle proteine negli organismi autofluorescent. Oltre a cianobatteri, abbiamo dimostrato che autofluorescenza della fioritura pianta che Arabidopsis thaliana potrebbe anche essere spento dopo 60 min di photobleaching9. Il photobleaching è stato ampiamente utilizzato, per esempio per migliorare il rapporto segnale-rumore e la visualizzazione di biomarcatori multipli in sequenza20. E ' stato anche dimostrato che photobleaching prima di formazione immagine è vantaggiosa quando si osserva un campione di autofluorescenza sotto di spettroscopia Raman21. Di conseguenza, potrebbe essere possibile applicare questo metodo photobleaching per ridurre l'autofluorescenza di altri organismi fotosintetici, tra cui alghe eucariote, piante vascolari e gli organismi che contengono proteorhodopsin e bacteriochlorophyll.
Gli organismi fotosintetici contengono pigmenti differenti che hanno differente spettri di assorbimento; Pertanto, è necessario essere prudentemente selezionato coloranti organici e proteine fluorescenti. Ad esempio, in questo studio, un colorante con una lunghezza d'onda di eccitazione massima di circa 750 nm è stato utilizzato. Anche se due canali (750 nm e 650 nm) sono disponibili per la tempesta qui presentati, Prochlorococcus autofluorescent segnali potrebbero ancora essere osservati dopo essere stato esposto sotto un laser a 650 nm, anche dopo prolungato photobleaching. Questo è probabilmente perché 650 nm è uno delle lunghezze d'onda di assorbimento maggiore per Acinetobacter. D'altra parte, alcuni Prochlorococcus marinus e alghe rosse contengono ficoeritrina come loro pigmento22, che ha uno spettro di assorbimento da 488 nm a 560 nm e un assorbimento minimo 650 nm23. Di conseguenza, potrebbe essere possibile utilizzare un canale di 650 nm invece di un canale di 750 nm a studiare le proteine all'interno di questi autotrofi contenenti ficoeritrina.
In sintesi, una combinazione adeguata di photobleaching e tempesta fornisce un approccio potente per capire l'organizzazione della proteina in cellule fotosintetiche in dettaglio, che rivelerà ulteriormente la loro funzione dinamiche e potenzialità.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Daiying Xu per la sua assistenza tecnica e commenti sul manoscritto. Questo studio è supportato da sovvenzioni da National Natural Science Foundation of China (progetto numero 41476147) e Consiglio concede, ricerca della regione amministrativa speciale di Hong Kong, Cina (numeri di progetto 689813 e 16103414).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene particles | Spherotech | PP-20-10 | 2.0-2.4 µm |
| Coverslip | Marienfeld | 0111580 | 18 mm ∅, Thickness No. 1 |
| Ethanol | Scharlau | ET00021000 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P9155 | mol wt 70,000-150,000 |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Glutaraldehyde solution, 50% | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| PBS | Sigma | P3813 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| EDTA Disodium Salt, 2-hydrate | Gold biotechnology | E-210-500 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| anti-Anabaena FtsZ antibody | Agrisera | AS07217 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Life Technologies | A-21039 | conjugated with Alexa Fluor 750 |
| D-Glucose Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Methyl Viologen | Sigma-Aldrich | 856177 | |
| Cyclooctatetraene | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | 646547 | |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| XD-300 Xenon light source | 250 W | ||
| STORM microscope | NBI | SRiS microscope | |
| Rohdea | NBI | SRiS 3.0 | software for imaging acquisition |
| Luna | NBI | SRiS 3.0 | software for drifting correction |
| QuickPALM | https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis | ||
| 3D Viewer | http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home |
References
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