Summary
여기 우리는 박테리아의 autofluorescence를 줄이기 위해 photobleaching 메서드를 설명 합니다. Photobleaching, 후 확률적 광학 재건 현미경 cyanobacterial FtsZ 반지의 3 차원 슈퍼 해상도 이미지를 얻을 하는 데 사용 됩니다.
Abstract
슈퍼 해상도 현미경은 단백질 상호 작용 및 많은 유기 체에서 subcellular 구조 연구에 널리 사용 되었습니다. 그러나 광합성 유기 체,, 슈퍼 해상도 영상의 가로 해상도만 ~ 100 nm. 낮은 해상도 확률적 광학 재건 현미경 (폭풍) 등 슈퍼 해상도 영상에 필요한 고 강도 레이저에 의해 발생 하는 광합성 세포의 높은 autofluorescence 배경 때문 이다. 여기, 우리는 photobleaching 기반 폭풍 방법을 개발 된 최근 해양 picocyanobacterium Prochlorococcus이미징 기술. Photobleaching, 후 Prochlorococcus 의 autofluorescence는 효과적으로 감소 그 폭풍 ~ 10의 측면 분해능으로 수행할 수 있도록 nm. 이 방법을 사용 하 여, 우리는 FtsZ 단백질의 조직에 vivo에서 3 차원 (3 차원)을 취득 하 고 Prochlorococcus의 세포 주기 동안 4 개의 다른 FtsZ 반지 형태학 특성. 우리는 여기에 설명 하는 방법 다른 광합성 유기 체의 슈퍼 해상도 이미징에 대 한 채택 될 수도 있습니다.
Introduction
슈퍼 해상도 microscopies 빛의 회절 한계를 휴식 하 고 하위 회절 해상도 (< 200 nm) 내에서 이미지를 제공할 수 있습니다. 그들은 널리 사용 되었습니다 많은 유기 체에서 단백질 지 방화 및 subcellular 구조 공부 하. 슈퍼 해상도 현미경 방법 등 구조화 조명 현미경 (SIM)를 주요 자극 방출 소모 현미경 (호텔 위치), 폭풍, 그리고 photoactivated 지역화 현미경 검사 법 (종 려). 메커니즘 및 응용 프로그램의 이러한 슈퍼 해상도 현미경 되었습니다 다른1,2검토.
폭풍 10 높은 해상도 달성할 수 있다 공간 분리3,4nm. 폭풍, 회절 제한 된 지역 내에서 하나의 분자 ("에") 활성화 되 고 분자의 나머지 ("off") 사 유지 됩니다. 단일 분자의-와 급속 한 스위치에의 축적, "회절 무제한" 이미지 생성된3수 있습니다. 한편, 많은 종류의 유기 염료 및 형광 단백질 고해상도 현미경5,6일반 형광 현미경 검사 법에서 쉽게 업그레이드할 수 있도록 폭풍에 적용 됩니다.
폭풍은 널리 적용 되지 광합성 세포, 박테리아, 조류, 등에서 하며 식물 세포 엽록체7,8, 사실 그 폭풍은 드라이브 photoswitching 높은 레이저 강도. 고 강도 레이저 형편이 나쁘게 광합성 세포에 강한 autofluorescence 배경 흥분 하며 폭풍 영상에서 단일 분자 지역화 방해 합니다. 폭풍우를 사용 하 여 subcellular 구조 또는 광합성 세포에 있는 단백질 상호 작용을 조사 하려면, 우리는 배경 autofluorescence 신호9를 풀기 위해 photobleaching 프로토콜을 개발 했다. 일상적인 immunofluorescent 얼룩 절차에서는 표본 단계에서 차단, 폭풍에 대 한 요구 사항에 맞게 광합성 세포의 autofluorescence를 절감 하 고 강도의 하얀 빛에 노출 됩니다. 따라서,이 프로토콜은 폭풍 안료 생물 조사 가능 합니다.
여기, 우리는 폭풍 FtsZ 반지 조직 단 세포 picocyanobacterium Prochlorococcus에서 이미지를 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. FtsZ 반지 구조 (Z 반지) 셀10 의 둘레를 polymerizes 이며11세포 분열 필수적인 매우 보존된 tubulin 같은 cytoskeletal 단백질 이다. Prochlorococcus 유지은 autofluorescent 배경 및 기본 안티-FtsZ 항 체와 immunostained을 줄이기 위해 첫 번째 photobleached와 보조 반대로 토끼 (H + L) IgG 항 체는 fluorophore와 활용은 다음 (예: , 알 렉 사 Fluor 750). 결국, 폭풍우는 다른 세포 주기 단계 동안 Prochlorococcus 에서 자세한 FtsZ 반지 단체를 관찰 하는 데 사용 됩니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 샘플 준비 및 고정
- 해 수 기반 Pro99 중간12의 5 mL을 axenic Prochlorococcus MED4의 1 mL 접종 5 일 후 35 µmol 광자/m2s의 진도 빛 아래 23 ° C에서 Prochlorococcus 문화 성장, 1.5 mL 튜브에 문화의 1 mL를 수집 합니다.
참고:는 접종 후 5 일 Prochlorococcus MED4 도달 한다 늦은 로그 단계, 약 108 셀/mL, 폭풍 이미징에 대 한 적절 한입니다. - 문화를 해결 하기 위해 1.5 mL 튜브에 갓 25 %paraformaldehyde (PFA) (w/v)에서 준비 하는 포름알데히드의 100 µ L, 50% 글의 2 µ L를 추가 합니다. 20 분 동안 실내 온도에 어둠 속에서 샘플을 품 어.
참고: 샘플은 유지 고정을 위한 어둠 속에도 빛 때문에 민감한. - 스핀 1 분; 13500 x g 에서 샘플 다운 그리고는 상쾌한 제거 resuspend Pro99 중간12의 100 µ L에 셀. Immunostaining까지 4 ° C에서 샘플을 저장 합니다.
2. 폴리스 티 렌 구슬 Coverslip precoating
참고: 폴리스 티 렌 구슬 드리프트 보정을 위한 표준 표식으로 간주 됩니다.
- 소용돌이 원래 폴리스 티 렌 구슬의 유리병 및 준비 작업 슬러리로 50% 에탄올 1:20,000 희석.
- 핫 플레이트, 온도 120 ° C를 설정 켜고 coverslips 뜨거운 접시에 놓습니다.
- 각 coverslip에 작업 슬러리의 100 µ L를 로드 합니다. 10 분 동안 뜨거운 접시에 coverslip 품 어 하 고, 실내 온도에 저장에 대 한 접시에는 coverslips를 신중 하 게 전송.
참고: 그것에 붙어 있던 구슬 가진 측, 직면 한다 그리고 셀 같은 쪽에 붙어 있어야 한다. 구슬은 coverslips에 움직일 수 있으며 샘플에 떠도는 수정 사용 폭풍 이미징 동안 실시간. 구슬 immobilizing, 후에 coverslips는 불 수 없습니다.
3. 폴 리-L-리 신 구슬 코팅 Coverslip에의 코팅
참고:이 cyanobacterial 셀의 동원 정지에 대 한 이루어집니다.
- 비드 코팅 면이는 coverslip의 중심으로 폴 리-L-리 신 (1 mg/mL)의 100 µ L를 추가 합니다. 실 온에서 30 분 동안 앉아 보자.
- 한 피 펫을 사용 하 여 신중 하 게 첨부 되지 않은 폴 리-L-lysine을 열망 하 고 1.5 mL 튜브에 그것을 전송. 폴 리-L-리 신 다시 4 ° C에서 저장 합니다.
- 60 mm 페 트리 접시에 coverslip 울트라 필터링 물 10 mL로 씻어 고 간단히 종이 타월에 coverslip 건조.
- coverslip 나중 사용을 위해 페 트리 접시 (100 mm)에 저장 합니다. 요리 하는 coverslip의 첨부 파일을 방지 하기 위해 라인 parafilm의 레이어와 페 트리 접시.
참고: 구슬와 폴 리-L-리 신, 도장된 coverslip 저장할 수 있습니다 실내 온도에 적어도 절반 년. 따라서, 사전에 coverslips의 배치를 준비 하 고 좋습니다.
4입니다.는 Coverslip 셀의 동원 정지
- 도장된 coverslip parafilm 참조 됩니다 얼룩 접시로 이제부터 아래쪽으로 새로운 배양 접시에 전송. 하는 coverslip에 고정된 샘플의 100 µ L 로드 셀 첨부 파일을 허용 하도록 30 분 동안 앉아 보자.
- 것입니다 라고를 세척 접시 이제부터 12-잘 접시의 우물에는 coverslip 전송. coverslip 씻어 잘에 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) (10 m m 나2HPO4, 1.8 m m KH2포4, 137 m m NaCl, 그리고 2.7 m m KCl, pH 7.4)의 1 mL를 추가 합니다. PBS 버퍼를 제거 하 고 다시는 coverslip 씻어 새로운 PBS 버퍼를 추가 합니다.
5입니다. permeabilization Cyanobacterial 셀의
- 피 펫을 사용 하 여 PBS 버퍼를 제거 합니다. 0.05% 비 이온 세제-100 (v/v), 10 mM EDTA, 10 mM Tris (pH 8.0), 및 0.2 mg/mL lysozyme 세척 접시의 우물에 갓된 permeabilization 버퍼의 1 mL를 추가 합니다.
- 20 분 동안 37 ° C에 세척 접시를 품 어. 그런 다음 permeabilization 버퍼를 제거 합니다.
- 1 mL의 PBS 버퍼를 추가 하 고 5 분 제거 PBS 버퍼에 대 한 부드럽게 세척 접시를 쉐이크 통에 세척 접시를 놓습니다. 이 단계는 coverslip 씻어 3 배를 반복 합니다.
6. 엽록소의 Photobleaching 차단 단계에서 안료
- 얼룩 요리 하는 coverslip 전송. 0.2% (v/v) 비 이온 세제-100과는 coverslip 상단 3% (v/v) 염소 혈 청 블로킹 버퍼의 50 µ L를 추가 합니다.
- 얼음에 플레이트를 얼룩 전체 놓고 1800 µmol 광자/m2·s에 광도와 크 세 논 빛 소스 적어도 60 분 동안 photobleaching에 대 한 이동 합니다.
- Photobleaching 후에 차단, 조심 스럽게 종이 타월의 가장자리와 adsorbing 여 블로킹 버퍼를 제거.
참고: 크 세 논 빛의 강도 너무 높은 적절 한 선글라스의 쌍 눈 보호를 위해 필요 하다. 한편, 광원 및 알루미늄 호 일을 사용 하 여 눈 손상 될 수 있는 빛의 누수를 방지 하려면 접시 포장. coverslip 촉촉한 유지 되도록 coverslip 매 15 분을 확인 합니다. 건조는 coverslip 이면 차단 버퍼의 50 µ L를 추가 합니다.
7. 항 체 바인딩
- 안티-Anabaena FtsZ 항 체 제조업체의 지침에 따라 물 200 µ L에 녹.
- 블로킹 버퍼의 99 µ L로 안티 FtsZ 항 체의 1 µ L를 희석. coverslip에 희석된 주 항 체의 50 µ L을 추가 하 고 30 분 동안 실내 온도에 그것을 품 어.
- 세척 접시는 coverslip 전송. 1 mL의 PBS 버퍼를 추가 하 고 쉐이크에 세척 접시를 놓습니다. 부드럽게 흔들어 세척 접시 5 분 반복에 대 한이 단계는 coverslip 씻어 3 배.
- 얼룩 요리 하는 coverslip 전송. 블로킹 버퍼의 500 µ L로 이차 항 체의 1 µ L를 희석. coverslip에 희석된 이차 항 체의 50 µ L을 추가 하 고 실 온에서 어둠 속에서 30 분 동안 품 어.
- 세척 접시는 coverslip 전송. 통에 PBS 버퍼의 1 mL와 함께 그것을 씻어. 부드럽게 흔들 5 분 랩에 대 한 세척 접시 광선이 있도록 알루미늄 종이로 세척 접시. 3 x이이 단계를 반복 합니다.
- 우물에 갓 4 %paraformaldehyde (PFA) (w/v)에서 준비 하는 포름알데히드의 500 µ L를 추가 합니다. 실 온에서 어둠 속에서 15 분 동안 coverslip 품 어.
- 포름알데히드를 제거 하 고 세척 단계 3를 반복.
- 영상까지는 coverslip 어둠 속에서 4 ° C에서 PBS 버퍼에 저장 합니다.
8입니다. 버퍼 이미징 폭풍의 준비
- 바로 폭풍 영상 앞 표 1에 따라 버퍼 이미징의 1 mL를 준비 합니다.
참고: 이미지 버퍼의 수명 약 2 시간으로, 준비 신선한 사용 하기 바로 전에. 포도 당 산화 효소 및 catalase의 추가 후에 vortexing를 하지 마십시오.
주의: 메 틸 비올로겐은 유독한 물자 이다. 특히 신경을 처리 하시기 바랍니다. Cyclooctatetraene는 고양이 발암 물질로 분류 된다. 1 화학입니다. 제발 흡입을 방지 하 고 피부 접촉 화학 후드에서 cyclooctatetraene 재고 솔루션 및 이미징 버퍼를 만들.
9. 이미지 수집 스톰 데이터
- 로드 로드 챔버 (그림 1)에 coverslip. 부드럽게 cyanobacterial 세포 세척 피하려고 챔버로 갓된 이미징 버퍼를 로드 합니다. 공기에 있는 산소와의 반응을 방지 하기 위해 이미징 버퍼 상단 직사각형 coverslip 장소. 아래는 coverslip 트랩 공기 방울을 피하십시오.
- 카메라, LED 조명과 레이저를 켭니다. 이미지 수집, 중심 위치 결정 및 보정13표류 하는 샘플에 대 한 오픈 폭풍 소프트웨어.
- 렌즈 위에 침수 기름 반 방울을 추가 합니다. 챔버를 로드 하 고 있는지 확인 하십시오 목표의 렌즈는 coverslip와 접촉 하는 게.
- 750 nm 레이저로 신호를 검사 합니다.
참고: 항상는 autofluorescence 감소 되도록 두 번째 항 체 마이너스 얼룩 네거티브 컨트롤을 포함 합니다. - 셀 및 표준 마커를 포함 하는 샘플 영역을 식별 합니다. 보정을 표류 하는 샘플에 대 한 소프트웨어를 시작 합니다.
참고: 일반적으로, 이상적인 샘플 영역 10-30 셀을 포함합니다. 한편, 셀 겹치는 셀을 피하기 위해를 잘 분리 되어야 한다. - 기준으로 한 넓은 필드 이미지 획득, 카메라 전자 곱셈 (EM)와 300와 30 ms (그림 2A)의 노출 시간에 얻을.
- 높은 전력, 약 4.5 kW/c m2을 750 nm 여기 레이저 강도 증가. fluorophores 스파스 점멸 패턴으로 전환 했습니다, 일단 33 Hz (그림 2B)에서 10000 프레임을 수집 하 여 하나의 슈퍼 해상도 이미지를 얻을.
참고:는 fluorophores 절연 하지 않으면, 몇 분 더 fluorophores 어두운 상태로 전환 되 고 고립 된 단일 분자 순서 대로 깜박일 때까지 기다립니다. 여기에 설명 된 프레임 수 샘플에 적합 하 고 다른 대상된 구조에 대 한 최적화가 필요 합니다.
10. 원시 데이터에서 슈퍼 해상도 이미지의 재구성
- ImageJ QuickPALM (테이블의 재료)14 라는 플러그인을 사용 하 여 3 차원 컬러 슈퍼 해상도 이미지를 재구성 하.
참고:는 예비 색채 이미지 (그림 2C) 색된 스케일 바 (그림 2C) 나타납니다. 색에는 z 축 깊이 나타냅니다. - 3 차원 비디오, 구문에서 슈퍼 해상도의 스택 구조를 설명 하기 위해 z 축 이미지 구분 마다 10 nm QuickPALM14를 사용 하 여. 스택의 밝기를 조정 하 고 복제 한 대상 셀의 스택. ImageJ 3D 뷰어 (자료 테이블)15 라는 플러그인을 사용 하 여 셀의 3 차원 이미지를 생성. 데모에 대 한 3 차원 구조의 회전을 기록 합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
폭풍 확률론 개별 photoswitchable fluorophores를 활성화 하 여 슈퍼 해상도 이미지를 달성 한다. 각 fluorophore의 위치를 기록 하 고 슈퍼 해상도 이미지 다음이 위치4에 따라 만들어집니다. 따라서, fluorophore 위치 정밀도 슈퍼 해상도 이미지 재건을 위해 중요 하다. 447 Prochlorococcus 의 흡수 스펙트럼 피크 및 680 nm,그리고 Prochlorococcus는 최소 흡수 700 nm16위 파장에. 그러나, Prochlorococcus MED4 세포는 여전히 높은 autofluorescence 750 nm 레이저 (그림 3A), 폭풍 영상 필요의 매우 높은 농도에 노출 될 경우 발생 합니다. 따라서, 높은 autofluorescence 배경 Prochlorococcus 세포의 무 겁 게 슈퍼 해상도 영상 방해합니다.
Prochlorococcus에서 단백질 조직을 조사 하는 폭풍을 활용 하기 위해 우리는 photobleaching 메서드를 개발 했다. 30 분에 대 한 강도 높은의 하얀 빛에 노출 된 후 Prochlorococcus MED4 세포의 autofluorescence autofluorescence와 여러 셀 검색 여전히 비록 (그림 3B), 감소 합니다. 우리는 추가 60 분 photobleaching 시간을 길게 하 고 셀의 대부분 그들의 autofluorescence (그림 3C)을 잃 었 발견. 이러한 결과 우리가 여기 개발 photobleaching 메서드 크게 광합성 유기 체에 있는 autofluorescence를 줄일 수 있는 나타냅니다.
Photobleaching, 후 폭풍을 사용 하 여 세포 분열 단백질 FtsZ Prochlorococcus 에 시각화 수 있었습니다 MED4 셀. Cyanobacterium Prochlorococcus 는 작은 고17지구 가장 풍부한 광합성 유기 체. Prochlorococcus 셀의 지름만 500-700 nm18입니다. 이러한 작은 셀 크기, 기존의 와이드 필드 형광 현미경 검사 법 (그림 2A)를 사용 하 여 Prochlorococcus 셀에서 FtsZ 반지 조직 시각화 수는. 그러나, 폭풍우는 9.6의 공간 해상도 z 축에서 xy 평면과 41.6 nm에 nm. 폭풍을 사용 하 여, FtsZ 반지 Prochlorococcus (그림 2B , 4)에서 자세한 형태를 드러낼 수 있었습니다. 3 차원 폭풍 이미지를 회전 하 여 우리 FtsZ 반지 형태학의 4 가지 종류가 확인: 클러스터 (그림 4A, 영화 S1), 불완전 한 반지 (그림 4B, 영화 S2), 완전 한 반지 (그림 4 C, 영화 S3), 반지 (그림 4 D, 영화 S4)를 두 번. 격차는 비슷한 Caulobacter cresentus19에 있는 Prochlorococcus (그림 4C, 영화 S3)의 완전 한 FtsZ 반지에서 관찰 되었다. 이러한 네 가지 유형의 FtsZ 반지 형태학 FtsZ 반지의 조립 공정 Prochlorococcus의 세포 주기 동안 그리고이 연구는 Prochlorococcus 의 세포 분열 동안 FtsZ 반지의 역할을 이해 하는 데 도움이 9.
그림 1: 구성 요소 로드 챔버와 폭풍 이미징에 대 한 coverslips 및 이미징 버퍼와 조립된 챔버의. 샘플 coverslip 아래쪽의 홈에 먼저 배치 했다. 위쪽은 다음 하단 부분에 신중 하 게 실수를. 이미지 버퍼 로드 챔버에 추가 되었고 신중 하 게 평방 coverslip로 덮여. 거품 측정의 정확도 영향을 미칠 수 있는 모든 움직임을 최소화 하기 위해 피해 야 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 대표 넓은 필드, 2 차원 폭풍, 그리고 3 차원 색상 FtsZ Prochlorococcus MED4에서의 폭풍 이미지. 일반 (A) 넓은 필드 현미경 검사 법, (B) 2 차원 폭풍, 그리고 (C)를 사용 하 여 같은 필드의 보기에서 이미지 찍은 3 차원 컬러 폭풍. 패널 C 색상 형광 신호를 z 축에서의 깊이 나타냅니다. 패널 C 에 숫자의 셀을 나타냅니다. 스케일 바 = 1 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: Photobleaching의 Prochlorococcus MED4. Prochlorococcus MED4 고정 셀 (A) 하지 photobleached, 또는 그들이 photobleached (B) (C)와 30 분 60 분. XD-300 크 세 논 빛 사용 되었다 1800 µ / m2·s.의 강도에서 세포 흥분 했다 동일한 강도로 750 nm 레이저에 의해 사용 되었다 폭풍 이미징. autofluorescences 폭풍 폭풍 영향을 최소한의 autofluorescence의 존재 확인에 사용 되는 동일한 필터와 몇 군데 있었다. 스케일 바 = 2 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 4 FtsZ 반지 형태학의 대표적인 폭풍 이미지. 4 다른 FtsZ 반지 형태학은 Prochlorococcus에서 관찰 되었다: (A) 클러스터, (B)는 불완전 한 반지, (C)는 완전 한 반지, 및 (D) 더블 반지. 같은 셀에 대 한 (i) 넓은 분야 형광 현미경 검사 법, (ii) xy-평면, 폭풍과 폭풍 (iii) 회전 후의 이미지 표시 했다. 셀 패널 A에 해당 하는 3 차원 영화, B, C및 D 에 표시 됩니다 영화 S1, S2, S3, S4, 각각. 스케일 바 = 500 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 화학 물질 | 재고 솔루션 | 최종 농도 |
| 포도 당 | N/A | 10% (w/v) |
| 트리 스-Cl (pH 8.0) | 0.5 M | 50 mM |
| 의약품 | 100 m m | 1mm |
| 메 틸 비올로겐 | 100 m m | 1mm |
| Cyclooctatetraene | 200 mM | 2 mM |
| TCEP | 0.5 M | 25 m m |
| 포도 당 산화 효소 | 56 mg/ml | 0.56 mg/ml |
| 카 탈 라 제 | 4 mg/ml | 40 µ g/ml |
표 1: 이미지 버퍼에 대 한 제조 법입니다.
영화 S1: FtsZ 단백질의 클러스터에서 관찰 Prochlorococcus MED4 셀. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
영화 S2: FtsZ 단백질의 불완전 한 반지에서 관찰 Prochlorococcus MED4 셀. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
영화 S3: FtsZ 단백질의 완전 한 반지에서 관찰 Prochlorococcus MED4 셀. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
영화 S4: FtsZ 단백질의 더블 반지에서 관찰 Prochlorococcus MED4 셀. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 프로토콜에서 설명 하는 cyanobacterium Prochlorococcus (그림 3C)의 autofluorescence를 크게 감소 하는 절차와, 다음, immunostain 공부 3 차원 FtsZ 폭풍을 활용 수 있게 세포에 있는 단백질 반지 Prochlorococcus (그림 4)에서 형태학. 이 프로토콜은 슈퍼 해상도 영상 다른 광합성 유기 체에 대 한 채택 될 수도 있습니다.
광합성 유기 체에 대 한 이전 연구 주로 슈퍼 해상도 이미징 SIM 높은 강도 레이저를 필요로 하지 않습니다 달성 하기 위해 SIM을 사용. 그러나, SIM의 공간 해상도가입니다만 ~ 100 nm1, 폭풍의 그것 보다 훨씬 낮은. 이 연구에서는 폭풍 이미지의 공간 해상도 9.6 도달할 수 z 축9xy 평면과 41.6 nm에 nm. Photobleaching 및 폭풍 영상 제공 향상 된 해상도 전례 없는 자세히 광합성 유기 체를 연구 하는 연구자를 수 있습니다.
Photobleaching 스톰 전에 위치와 autofluorescent 유기 체에 있는 단백질의 역학을 관찰 하는 연구원을 가능 하 게 하는 중요 한 단계 이다. 박테리아, 게다가 우리 애기 thaliana 또한 photobleaching9의 60 분 후 래 수 꽃 식물의 그의 autofluorescence를 증명 하고있다. photobleaching 널리 이용 되는, 예를 들어 순차적으로 신호 대 잡음 비율 및 여러 생체의 시각화를 향상 시키기 위한20. 그것은 또한 영상이 유리 라만 분광학21에서 autofluorescence 샘플을 관찰 하기 전에 photobleaching를 시연. 따라서, 가능을 줄이기 위해 진 핵 조류, 관 식물, 및 proteorhodopsin 및 bacteriochlorophyll를 포함 하는 유기 체를 포함 한 다른 광합성 유기 체의 autofluorescence이 photobleaching 메서드를 적용할 수 있습니다.
광합성 생물 포함 다른 안료를 다른 흡수 스펙트럼; 따라서, 유기 염료 및 형광 단백질 신중 하 게 선택 해야 합니다. 예를 들어이 연구에서 약 750의 최대 흥분 파장을 가진 염료 nm 사용 되었다. 비록 두 채널 (750 nm 및 650 nm) 폭풍에 사용할 수 있는 여기에 제시, Prochlorococcus autofluorescent 신호 아직도 관찰 될 수 있었다 장시간된 photobleaching 후에 650 nm 레이저에 노출 후. 이것은 아마도 때문에 650 nm Prochlorococcus에 대 한 주요 흡수 파장 중 하나입니다. 다른 한편으로, 일부 Synechococcus 와 빨강 조류 포함 phycoerythrin 그들의 안료22, 488에서 흡수 스펙트럼은 560 nm 및 650 nm23최소 흡수. 따라서, 그것은 750 nm 채널 대신 650 nm 채널을 사용 하 여 이러한 phycoerythrin 포함 하 슬에 내 단백질 연구 가능한 수 있습니다.
요약, photobleaching와 폭풍의 적절 한 조합을 자세히, 더 그들의 역학 및 잠재적인 기능을 보여줄 것입니다 광합성 세포에서 단백질 조직을 이해 하는 강력한 접근 방식을 제공 합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 그녀의 기술 지원 및 원고에 대 한 의견 Daiying 쑤 감사합니다. 이 연구는 국립 자연 과학 재단의 중국 (프로젝트 번호 41476147)에서 교부 금 및 연구 보조금 위원회는 홍콩 특별 행정구, 중국 (프로젝트 번호 689813 및 16103414)의 의해 지원 됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene particles | Spherotech | PP-20-10 | 2.0-2.4 µm |
| Coverslip | Marienfeld | 0111580 | 18 mm ∅, Thickness No. 1 |
| Ethanol | Scharlau | ET00021000 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P9155 | mol wt 70,000-150,000 |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Glutaraldehyde solution, 50% | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| PBS | Sigma | P3813 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| EDTA Disodium Salt, 2-hydrate | Gold biotechnology | E-210-500 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| anti-Anabaena FtsZ antibody | Agrisera | AS07217 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Life Technologies | A-21039 | conjugated with Alexa Fluor 750 |
| D-Glucose Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Methyl Viologen | Sigma-Aldrich | 856177 | |
| Cyclooctatetraene | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | 646547 | |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| XD-300 Xenon light source | 250 W | ||
| STORM microscope | NBI | SRiS microscope | |
| Rohdea | NBI | SRiS 3.0 | software for imaging acquisition |
| Luna | NBI | SRiS 3.0 | software for drifting correction |
| QuickPALM | https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis | ||
| 3D Viewer | http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home |
References
- Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells. Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A New Wave of Cellular Imaging. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 285-314 (2010).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods Methods. 8 (12), 1027-1036 (2012).
- Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Komis, G., Šamajová, O., Ovečka, M., Šamaj, J. Super-resolution Microscopy in Plant Cell Imaging. Trends in Plant Science. 20 (12), 834-843 (2015).
- Schubert, V. Super-resolution Microscopy - Applications in Plant Cell Research. Frontiers in Plant Science. 8, 531 (2017).
- Liu, R., et al. Three-Dimensional Superresolution Imaging of the FtsZ Ring during Cell Division of the Cyanobacterium Prochlorococcus. mbio. 8 (6), e00657 (2017).
- Adams, D. W., Errington, J. Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring. Nature Reviews Microbiology. 7, 642-653 (2009).
- Boer, P. A. Advances in understanding E. coli cell fission. Current Opinion in Microbiology. 13 (6), 730-737 (2010).
- Moore, L. R., Post, A. F., Rocap, G., Chisholm, S. W. Utilization of different nitrogen sources by the marine cyanobacteria Prochlorococcus and Synechococcus. Limnology and Oceanography. 47 (4), 989-996 (2002).
- Zhao, T., et al. A user-friendly two-color super-resolution localization microscope. Optics Express. 23 (2), 1879 (2015).
- Henriques, R., Lelek, M., Fornasiero, E. F., Valtorta, F., Zimmer, C., Mhlanga, M. M. QuickPALM: 3D real-time photoactivation nanoscopy image processing in ImageJ. Nature Methods. 7 (5), 339-340 (2010).
- Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ. BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).
- Ting, C. S., Rocap, G., King, J., Chisholm, S. W. Cyanobacterial photosynthesis in the oceans: The origins and significance of divergent light-harvesting strategies. Trends in Microbiology. 10 (3), 134-142 (2002).
- Biller, S. J., Berube, P. M., Lindell, D., Chisholm, S. W. Prochlorococcus: The structure and function of collective diversity. Nature Reviews Microbiology. 13 (1), 13-27 (2015).
- Morel, A., Ahn, Y. -H., Partensky, F., Vaulot, D., Claustre, H. Prochlorococcus and Synechococcus - a Comparative-Study of Their Optical-Properties in Relation To Their Size and Pigmentation. Journal of Marine Research. 51, 617-649 (1993).
- Holden, S. J., Pengo, T., Meibom, K. L., Fernandez, C., Collier, J., Manley, S. High throughput 3D super-resolution microscopy reveals Caulobacter crescentusin vivo Z-ring organization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (12), 4566-4571 (2014).
- Zhao, M., Wei, B., Chiu, D. T. Imaging multiple biomarkers in captured rare cells by sequential immunostaining and photobleaching. Methods. 64 (2), 108-113 (2013).
- Golcuk, K., Mandair, G. S., Callender, A. F., Sahar, N., Kohn, D. H., Morris, M. D. Is photobleaching necessary for Raman imaging of bone tissue using a green laser? Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (7), 868-873 (2006).
- Haxo, F. T., Blinks, L. R. Photosynthetic Action Spectra of Marine Algae. The Journal of General Physiology. 33 (4), 389-422 (1950).
- Bryant, D. A. Phycoerythrocyanin and Phycoerythrin: Properties and Occurrence in Cyanobacteria. Journal of General Microbiology. 128 (4), 835-844 (1982).
