Summary
Her beskriver vi en photobleaching metode til at reducere autofluorescence af cyanobakterier. Efter photobleaching anvendes stokastiske optisk genopbygning mikroskopi til at opnå tre-dimensionelle super-opløsning billeder af cyanobakteriel FtsZ ring.
Abstract
Super-resolution mikroskopi har været meget anvendt til at undersøge protein interaktioner og subcellulært strukturer i mange organismer. I fotosyntetiske organismer, men den laterale opløsning på Super-resolution imaging er kun ~ 100 nm. Lav-opløsning er hovedsagelig på grund af den høje autofluorescence baggrund af fotosyntetiserende celler forårsaget af høj intensitet lasere, der er nødvendige for super-opløsning imaging, såsom stokastiske optisk genopbygning mikroskopi (STORM). Her, beskriver vi en photobleaching-assisteret STORM metode som blev udviklet for nylig til imaging den marine picocyanobacterium Prochlorococcus. Efter photobleaching, autofluorescence af Prochlorococcus reduceres effektivt, så denne STORM kan udføres med en lateral opløsning på ~ 10 nm. Brug denne metode, vi erhverve i vivo tre-dimensionel (3-D)-organisation af FtsZ proteinet og karakterisere fire forskellige FtsZ ring morfologier under celle cyklus af Prochlorococcus. Metoden vi beskrive her kan vedtages for super-opløsning billeddannelse af andre fotosyntetiske organismer.
Introduction
Super-opløsning microscopies kan bryde diffraktion grænse lysets og give billeder inden for sub diffraktion resolutioner (< 200 nm). De har været meget udbredt i mange organismer til at studere proteiner lokalisering og subcellulært strukturer. Major super-resolution mikroskopi metoder omfatter strukturerede belysning mikroskopi (SIM), stimuleret emission udtynding mikroskopi (STED), STORM og photoactivated lokalisering mikroskopi (PALM). De mekanismer og anvendelser af disse super-opløsning mikroskoper har været gennemgået andetsteds1,2.
STORM kan opnå en opløsning så høj som 10 nm af rumlig adskillelse3,4. For STORM, kun ét molekyle i en diffraktion-begrænset region er aktiveret ("om") og resten af molekylerne holdes inaktiverede ("off"). Af en ophobning af hurtig tænd og - ud af enkelt molekyler, kan en "diffraktion-ubegrænset" billede være genereret3. I mellemtiden, mange slags organiske farvestoffer og fluorescerende proteiner er gældende i STORM, giver mulighed for en nem opgradering fra regelmæssige Fluorescens mikroskopi til høj opløsning mikroskopi5,6.
STORM har ikke er almindeligt anvendt i fotosyntetiserende celler, såsom cyanobakterier, alger, og planteceller med grønkorn7,8, som skyldes, at STORM kræver høj laser intensitet til at drive photoswitching. Høj intensitet laser ugunstig ophidser stærk autofluorescence baggrund i fotosyntetiserende celler og forstyrrer den enkelt-molekyle lokalisering i STORM billedbehandling. For at bruge STORM til at undersøge subcellulært strukturer eller protein interaktioner i fotosyntetiserende celler, udviklede vi en photobleaching protokol for at slukke baggrund autofluorescence signaler9. I en rutinemæssig immunfluorescent farvning procedure udsættes prøver for hvidt lys med en høj intensitet under trinnet blokering, der sænker autofluorescence af fotosyntetiserende celler til at opfylde kravene til STORM. Således, denne protokol gør det muligt at undersøge pigmenteret organismer med STORM.
Her beskriver vi protokol for at bruge STORM for at billede FtsZ ring organisation i den encellede picocyanobacterium Prochlorococcus. FtsZ er en stærkt bevarede tubulin-lignende cytoskeletal proteiner, der polymeriserer for at danne en ring struktur (Z-ring) omkring omkredsen af en celle10 og er vigtig for celledeling11. Bevaret Prochlorococcus celler er første photobleached til reduktion af autofluorescent baggrund og immunostained med en primær anti-FtsZ antistof, og derefter en sekundær anti-kanin IgG (H + L) antistof konjugeret med et fluorophore (f.eks. , Alexa Fluor 750). Til sidst, bruges STORM til at observere de detaljerede FtsZ ring organisationer i Prochlorococcus under forskellige cellecyklus faser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. prøve forberedelse og fiksering
- Podes 1 mL af axenic Prochlorococcus MED4 til 5 mL havvand-baserede Pro99 medium12. Vokse Prochlorococcus kulturer ved 23 ° C under lys med en intensitet på 35 µmol fotoner/m2s. fem dage senere, indsamle 1 mL af kultur i en 1,5 mL tube.
Bemærk: Fem dage efter podning, Prochlorococcus MED4 vil nå den sene log fase, med ca 108 celler/mL, som er relevant for STORM billeddannelse. - Tilsættes 100 µL af formaldehyd frisklavet fra 25% PARAFORMALDEHYD (PFA) (w/v) og 2 µL af 50% glutaraldehyd i 1,5 mL tube til fix kultur. Inkuber prøven i mørke ved stuetemperatur i 20 min.
Bemærk: Prøven var holdt i mørke til fiksation fordi glutaraldehyd er lys følsom. - Spin ned prøve ved 13.500 x g i 1 min; derefter Fjern supernatanten og resuspend celler i 100 µL af Pro99 medium12. Opbevares prøven ved 4 ° C indtil immunfarvning.
2. precoating af Coverslip med polystyren perler
Bemærk: Polystyren perler betragtes som den fiducial markør for afdrift korrektion.
- Vortex oprindelige vial af polystyren perler og forberede en 1:20,000 fortynding med 50% ethanol som arbejder gylle.
- Tænd varmepladen, Indstil temperaturen til 120 ° C og Anbring coverslips på varmepladen.
- Indlæse 100 µL af arbejdende gylle på hver coverslip. Inkubér coverslip på varmeplade i 10 min, og derefter omhyggeligt overføre coverslips til petriskåle til opbevaring ved stuetemperatur.
Bemærk: Side med perlerne knyttet til det bør møde, og cellerne skal fastgøres på den samme side. Perlerne er immobiliseret på coverslips og bruges til at korrigere prøve-drivende i realtid under STORM billeddannelse. Efter immobilisere perlerne, kan ikke være flammede coverslips.
3. belægning af Poly-L-lysin på det perle-belagt Coverslip
Bemærk: Dette er gjort for immobilisering af cyanobakteriel celler.
- Tilføj 100 µL af poly-L-lysin (1 mg/mL) til midten af coverslip med perle-coatede side vender opad. Lad det sidde i 30 min. ved stuetemperatur.
- Bruge en pipette omhyggeligt aspire løstliggende poly-L-lysin og overføre det til en 1,5 mL tube. Gemme poly-L-lysin ved 4 ° C for genbrug.
- Skyl coverslip med 10 mL af ultra-filtreret vand i en 60-mm petriskål og derefter tørre kort coverslip på et stykke køkkenrulle.
- Gemme coverslip i en petriskål (100 mm) til senere brug. For at undgå udlæg i coverslip til fadet, line petriskål med et lag af parafilm.
Bemærk: Coverslip, præcoatede med perler og poly-L-lysin, kan opbevares ved stuetemperatur i mindst et halvt år. Derfor er forberede en parti af coverslips i forvejen stærkt anbefales.
4. immobilisering af celler på Coverslip
- Overføre en brugsklare coverslip til en ny petriskål med parafilm nederst, som vil blive henvist til som farvning fadet fremover. Indlæse 100 µL af den faste prøve på coverslip og lad det sidde i 30 min at tillader celle vedhæftet fil.
- Overførsel af coverslip til et godt af en 12-godt plade, som vil blive henvist til som vask skål fremover. Der tilsættes 1 mL af fosfatbufferet saltopløsning (PBS) (10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl og 2,7 mM KCl, pH 7,4) til godt at vaske coverslip. Fjerne PBS buffer og tilføje en ny PBS buffer for at vaske coverslip igen.
5. permeabilization af cyanobakteriel celler
- Fjerne PBS bufferen ved hjælp af en pipette. Der tilsættes 1 mL af frisklavede permeabilization buffer til godt af vask skål, som indeholder 0.05% nonionisk detergent-100 (v/v), 10 mM EDTA, 10 mM Tris (pH 8,0) og 0,2 mg/mL lysozym.
- Inkuber vask skål ved 37 ° C i 20 min. Fjern derefter permeabilization bufferen.
- Der tilsættes 1 mL PBS buffer og placere vask skål på en shaker, som forsigtigt ryster vask skål for 5 min. Fjern PBS buffer. Gentag dette trin 3 x at vaske coverslip.
6. Photobleaching af klorofyl pigmenter i en blokering af trin
- Overførsel af coverslip til farvning fadet. Tilsæt 50 µL blokerende buffer, som indeholder 0,2% (v/v) nonionisk detergent-100 og 3% (v/v) ged serum, på toppen af coverslip.
- Placere hele farvning plade på is og flytte det under xenon lys kilden til photobleaching i mindst 60 min, med en lysintensitet på 1.800 µmol fotoner/m2·s.
- Efter photobleaching og blokering, forsigtigt fjerne de blokerende buffer af adsorbing det med kanten af en køkkenrulle.
Bemærk: Intensiteten af xenon lys er så høj, at et par ordentlige solbriller er nødvendig for beskyttelse af øjne. I mellemtiden, wrap lyskilden og pladen ved hjælp af aluminiumsfolie for at undgå udsivning af lys, som kan forårsage øjenskader. Check coverslip hvert 15 min for at sikre, at coverslip stadig er fugtig. Hvis coverslip er tør, tilsættes 50 µL blokerende buffer.
7. antistof bindende
- Opløse anti -Anabaena FtsZ antistof i 200 µL vand ifølge producentens anvisninger.
- Fortyndes 1 µL af anti-FtsZ antistof til 99 µL blokerende buffer. Tilsæt 50 µL fortyndede primære antistof på coverslip og inkuberes ved stuetemperatur i 30 min.
- Overførsel af coverslip til vask skål. Der tilsættes 1 mL PBS buffer og placere vask skål på en shake. Ryst forsigtigt vask skål i 5 min. Gentag dette trin 3 x at vaske coverslip.
- Overførsel af coverslip til farvning fadet. Fortyndes 1 µL af en sekundær antistof til 500 µL blokerende buffer. Tilsæt 50 µL fortyndede sekundær antistof på coverslip og der inkuberes i 30 min. i mørke ved stuetemperatur.
- Overførsel af coverslip til vask skål. Vaske det med 1 mL PBS buffer på en shaker. Ryst forsigtigt vask skål i 5 min. Wrap vask skål med aluminium papir til at gøre det lys-proof. Gentag dette trin 3 x.
- Tilføje 500 µL af formaldehyd frisklavet fra 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) (w/v) til brønden. Inkubér coverslip i 15 min. i mørke ved stuetemperatur.
- Fjerne formaldehyd og Gentag trinnet vask 3 x.
- Gemme coverslip i PBS buffer ved 4 ° C i mørke indtil billeddannelse.
8. forberedelse af STORMEN Imaging Buffer
- Forberede 1 mL af imaging buffer i henhold til tabel 1, umiddelbart før STORM billeddannelse.
Bemærk: Som holdbarheden af imaging bufferen er ca 2 h, forberede det friske, lige før brug. Undgå vortexing efter tilsætning af glucose stavbakterier og katalase.
Forsigtig: Methyl viologen er giftigt materiale. Kan du håndtere det med særlig omhu. Cyclooctatetraene er klassificeret som et kræftfremkaldende stof kat. 1 kemiske. Venligst undgå indånding og hudkontakt og gøre cyclooctatetraene stamopløsning og billedbehandling buffer i en kemisk hætte.
9. billede erhvervelse af STORM Data
- Indlæse coverslip i læsning kammer (figur 1). Indlæse frisklavede imaging buffer forsigtigt ind i kammeret til at undgå at vaske ud de cyanobakteriel celler. Placer en rektangulær coverslip på toppen af den billeddiagnostiske buffer til at forhindre dets reaktion med ilt i luften. Undgå fældefangst luftbobler under coverslip.
- Tænd kameraet, LED-lys og laser. Åben STORM software til billede erhvervelse, barycentrum holdning beslutsomhed og prøve drivende korrektion13.
- Tilføj halvdelen en dråbe immersionsolie på toppen af linsen. Indlæse kammeret og sørg for linsen af målet gør kontakt med coverslip.
- Undersøge signalet med en 750-nm laser.
Bemærk: Altid omfatte et andet antistof-minus-farvning negativ kontrol for at sikre, at autofluorescence er formindsket. - Identificere et eksempelområde, der indeholder både celler og fiducial markører. Starte softwaren til prøven drivende korrektion.
Bemærk: generelt er den ideelle eksempelområde indeholder 10-30 celler. I mellemtiden, cellerne skal adskilles klogt i at undgå overlappende celler. - Erhverve en wide-feltet billede som reference, med kamera elektron multiplikation (EM) gevinst på 300 og en eksponeringstid på 30 ms (figur 2A).
- Øge 750-nm excitation laser intensitet til en højere magt, ca 4,5 kW/cm2. Når fluorophores har skiftet til en sparsom blinkemønster, erhverve et super-opløsning billede ved at indsamle 10.000 rammer ved 33 Hz (figur 2B).
Bemærk: Hvis fluorophores ikke er isolerede, vente et par minutter indtil flere fluorophores der skiftes til den mørke og de isolerede enkelt molekyler flimre sekventielt. Antallet rammer, der er beskrevet her er velegnet til vores prøve og skal være optimeret til andre målrettede strukturer.
10. genopbygning af super-opløsning billeder fra Raw-Data
- Brug et plugin kaldet QuickPALM (Table of Materials)14 i ImageJ for at rekonstruere en 3D-farve Super-opløsning billede.
NOTE: En foreløbig kromatisk billede (fig. 2 c) sammen med en farvekodet skalalinjen (figur 2 c) vises. Farven repræsenterer dybde på z-aksen. - For at demonstrere 3-D struktur i en video, konstruere en stak af super-opløsning billeder med z-akse sektionerede hver 10 nm med QuickPALM14. Juster lysstyrken for stakkene og duplikere stakken af én målcellen. Brug et plugin kaldet 3D-fremviseren (Table of Materials)15 i ImageJ til at generere den 3D-billede af cellen. Optage rotation af 3D-struktur til demonstrationsformål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
STORM opnår super-resolution billeddannelse ved at aktivere individuelle photoswitchable fluorophores stochastically. Placeringen af hver fluorophore registreres og en super-opløsning billede er derefter bygget baseret på disse steder4. Derfor er præcisionen af fluorophore placering vigtige for super-opløsning billede genopbygning. Absorptionsspektra af Prochlorococcus peak på 447 nm og 680 nm,og Prochlorococcus har en minimal absorption ved bølgelængder over 700 nm16. Prochlorococcus MED4 celler udledes dog stadig høj autofluorescence når de udsættes for en meget høj intensitet af 750-nm laser (figur 3A), som er nødvendig for STORM imaging. Således, den høje autofluorescence baggrund af Prochlorococcus celler stærkt forstyrrer super-resolution billeddannelse.
For at udnytte STORM til at undersøge protein organisationer i Prochlorococcus, udviklede vi en photobleaching metode. Efter udsættelse for et hvidt lys med høj intensitet i 30 min faldt autofluorescence af Prochlorococcus MED4 celler (figur 3B), selv om flere celler med autofluorescence stadig var opdaget. Vi yderligere aflange photobleaching tid til 60 min. og fandt, at hovedparten af cellerne mistet deres autofluorescence (figur 3 c). Disse resultater viser, at metoden photobleaching vi udviklet her i høj grad kan mindske autofluorescence i fotosyntetiske organismer.
Efter photobleaching, kunne vi bruge STORM til at visualisere celledeling protein FtsZ i Prochlorococcus MED4 celler. Cyanobacterium Prochlorococcus er den mindste og den mest rigelige fotosyntetiske organismer på jorden17. Diameteren af en Prochlorococcus celle er kun 500-700 nm18. Med sådan en lille Cellestørrelse er det umuligt at visualisere FtsZ ring organisation i Prochlorococcus celler ved hjælp af konventionelle wide-felt Fluorescens mikroskopi (figur 2A). STORM har dog en geografisk opløsning på 9,6 nm i flyet xy og 41.6 nm i z-aksen. Ved hjælp af STORM, var vi i stand til at afsløre en detaljeret morfologi af FtsZ ring i Prochlorococcus (tal 2B og 4). Ved at dreje 3D-STORM billeder, vi identificeret fire forskellige typer af FtsZ ring morfologier: klynger (figur 4A, Film S1), en ufuldstændig ring (figur 4B, Film S2), en komplet ring (figur 4 C, Filmen S3), og dobbelt ringe (figur 4 D, Film S4). Hullerne blev observeret i de komplette FtsZ ringe af Prochlorococcus (fig. 4 c, Film S3), som er magen til, findes i Caulobacter cresentus19. Disse fire typer af FtsZ ring morfologier viste forsamling processen af FtsZ ring i løbet af celle cyklus af Prochlorococcus, og denne undersøgelse hjalp os med at forstå rollen, som FtsZ ring under celledeling af Prochlorococcus 9.
Figur 1: komponenter i læsning kammer og samlet kammer med coverslips og imaging bufferen for STORM imaging. Coverslip med prøven blev placeret på rille på den nederste del først. Den øverste del var så omhyggeligt skruet på den nederste del. De billeddiagnostiske buffer blev tilføjet i salen, lastning og derefter omhyggeligt dækket med en firkantet coverslip. Bobler bør undgås for at minimere enhver bevægelse, der kan påvirke nøjagtigheden af målingen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentative wide-feltet, 2-D STORM og 3D farve STORM billeder af FtsZ i Prochlorococcus MED4. Billederne blev taget fra samme synsfelt ved hjælp af regelmæssig (A) wide-felt mikroskopi, (B) 2-D STORM og (C) 3D-farve STORM. Farver i panelet C viser dybden af fluorescerende signalerne på z-aksen. Tallene i panelet C angiver cellerne af interesse. Skala barer = 1 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Photobleaching af Prochlorococcus MED4. Fast Prochlorococcus MED4 celler blev (A) ikke photobleached, og de var photobleached til (B) 30 min og (C) 60 min. XD-300 xenon lys blev brugt på en intensitet på 1.800 µmol/m2·s. celler blev ophidset af en 750-nm laser på samme intensitet som blev brugt til STORM billeddannelse. Autofluorescences var afbildet med de samme filtre som anvendes i STORM for at sikre tilstedeværelsen af minimal autofluorescence påvirker STORMEN. Skala barer = 2 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: repræsentative STORM billeder af fire FtsZ ring morfologier. Fire forskellige FtsZ ring morfologier blev observeret i Prochlorococcus: (A) klynger, (B) en ufuldstændig ring, (C) en komplet ring og (D) dobbelt ringe. For den samme celle, blev billeder a wide-felt Fluorescens mikroskopi, (ii) STORM på xy-planet, og (iii) STORM efter rotation vist. 3D-film svarer til cellerne i paneler A, er B, Cog D vist i film S1, S2, S3 og S4, henholdsvis. Skala barer = 500 nm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Kemikalier | Stamopløsningen | Endelig koncentration |
| glukose | NIELSEN | 10% (w/v) |
| Tris-Cl (pH 8.0) | 0,5 M | 50 mM |
| Ascorbinsyre | 100 mM | 1 mM |
| Methyl viologen | 100 mM | 1 mM |
| Cyclooctatetraene | 200 mM | 2 mM |
| TCEP | 0,5 M | 25 mM |
| Glucose stavbakterier | 56 mg/ml | 0,56 mg/ml |
| Katalase | 4 mg/ml | 40 µg/ml |
Tabel 1: Opskrift på imaging-buffer.
Film S1: klynger af FtsZ proteiner observeret i Prochlorococcus MED4 celler. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Film S2: en ufuldstændig ring af FtsZ proteiner observeret i Prochlorococcus MED4 celler. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Film S3: en hel ring af FtsZ proteiner observeret i Prochlorococcus MED4 celler. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Film S4: et dobbelt-ring af FtsZ proteiner observeret i Prochlorococcus MED4 celler. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokol, vi beskrev en procedure for at reducere autofluorescence af cyanobacterium Prochlorococcus (figur 3 c) og derefter, immunostain proteiner i cellerne, som gjorde det muligt for os at udnytte STORM til at studere den 3D-FtsZ ring morfologier i Prochlorococcus (figur 4). Denne protokol kan vedtages for super-opløsning imaging i andre fotosyntetiske organismer.
Tidligere undersøgelser på fotosyntetiske organismer anvendes hovedsageligt SIM for at opnå super-opløsning imaging fordi SIM ikke kræver lasere af høj intensitet. Men den rumlige opløsning af SIM er kun ~ 100 nm1, som er meget lavere end for STORM. I denne undersøgelse, den rumlige opløsning af STORM billeder kunne nå 9.6 nm i flyet xy og 41.6 nm i z-aksen9. Den forbedrede opløsning leveres af photobleaching og STORM imaging gør det muligt for forskere at studere fotosyntetiske organismer i hidtil uset detalje.
Photobleaching før STORM er et afgørende skridt, der gør det muligt for forskere at observere beliggenhed og dynamik af proteiner i autofluorescent organismer. Udover cyanobakterier, har vi bevist, at autofluorescence af blomstrende plante Arabidopsis thaliana kunne også være slukkes efter 60 min i photobleaching9. Photobleaching har været meget udbredt, for eksempel for at forbedre signal-støj-forholdet og visualisering af flere biomarkører sekventielt20. Det blev også påvist at photobleaching før imaging er fordelagtige, når iagttage en autofluorescence prøve under Raman spektroskopi21. Derfor kan det være muligt at anvende denne photobleaching metode til at reducere autofluorescence af andre fotosyntetiske organismer, herunder eukaryote alger, karplanter og organismer, der indeholder proteorhodopsin og bakterieklorofyl.
Fotosyntetiske organismer indeholder forskellige pigmenter, der har forskellige absorptionsspektre; organiske farvestoffer og fluorescerende proteiner skal derfor vælges med forsigtighed. For eksempel, i denne undersøgelse, et farvestof med en maksimal excitation bølgelængde af omkring 750 nm blev brugt. Selvom to kanaler (750 nm og 650 nm) er tilgængelige for STORM præsenteres her, kunne Prochlorococcus autofluorescent signaler stadig konstateres efter udsættes under en 650-nm laser, selv efter langvarig photobleaching. Dette er sandsynligvis fordi 650 nm er en af de større absorption bølgelængder for Prochlorococcus. På den anden side, nogle Synechococcus og red alger indeholder phycoerythrin som deres pigment22, som har en absorptionsspektrum fra 488 nm til 560 nm og en minimal absorption på 650 nm23. Derfor kan det være muligt at bruge en 650-nm kanal i stedet for en 750-nm kanal til at studere proteiner inden for disse phycoerythrin-holdige autotrofer.
I Resumé giver en passende kombination af photobleaching og STORM en kraftfuld tilgang for at forstå protein organisation i fotosyntetiserende celler i detaljer, som yderligere vil afsløre deres dynamik og potentiale funktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne takke Daiying Xu for hendes teknisk bistand og kommentarer til manuskriptet. Denne undersøgelse er støttet af tilskud fra den National Natural Science Foundation of China (projektnummer 41476147) og forskningsråd i tilskud af Hong Kong Special Administrative Region, Kina (projektnumre 689813 og 16103414).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene particles | Spherotech | PP-20-10 | 2.0-2.4 µm |
| Coverslip | Marienfeld | 0111580 | 18 mm ∅, Thickness No. 1 |
| Ethanol | Scharlau | ET00021000 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P9155 | mol wt 70,000-150,000 |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Glutaraldehyde solution, 50% | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| PBS | Sigma | P3813 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| EDTA Disodium Salt, 2-hydrate | Gold biotechnology | E-210-500 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| anti-Anabaena FtsZ antibody | Agrisera | AS07217 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Life Technologies | A-21039 | conjugated with Alexa Fluor 750 |
| D-Glucose Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Methyl Viologen | Sigma-Aldrich | 856177 | |
| Cyclooctatetraene | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | 646547 | |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| XD-300 Xenon light source | 250 W | ||
| STORM microscope | NBI | SRiS microscope | |
| Rohdea | NBI | SRiS 3.0 | software for imaging acquisition |
| Luna | NBI | SRiS 3.0 | software for drifting correction |
| QuickPALM | https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis | ||
| 3D Viewer | http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home |
References
- Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells. Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A New Wave of Cellular Imaging. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 285-314 (2010).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods Methods. 8 (12), 1027-1036 (2012).
- Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Komis, G., Šamajová, O., Ovečka, M., Šamaj, J. Super-resolution Microscopy in Plant Cell Imaging. Trends in Plant Science. 20 (12), 834-843 (2015).
- Schubert, V. Super-resolution Microscopy - Applications in Plant Cell Research. Frontiers in Plant Science. 8, 531 (2017).
- Liu, R., et al. Three-Dimensional Superresolution Imaging of the FtsZ Ring during Cell Division of the Cyanobacterium Prochlorococcus. mbio. 8 (6), e00657 (2017).
- Adams, D. W., Errington, J. Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring. Nature Reviews Microbiology. 7, 642-653 (2009).
- Boer, P. A. Advances in understanding E. coli cell fission. Current Opinion in Microbiology. 13 (6), 730-737 (2010).
- Moore, L. R., Post, A. F., Rocap, G., Chisholm, S. W. Utilization of different nitrogen sources by the marine cyanobacteria Prochlorococcus and Synechococcus. Limnology and Oceanography. 47 (4), 989-996 (2002).
- Zhao, T., et al. A user-friendly two-color super-resolution localization microscope. Optics Express. 23 (2), 1879 (2015).
- Henriques, R., Lelek, M., Fornasiero, E. F., Valtorta, F., Zimmer, C., Mhlanga, M. M. QuickPALM: 3D real-time photoactivation nanoscopy image processing in ImageJ. Nature Methods. 7 (5), 339-340 (2010).
- Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ. BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).
- Ting, C. S., Rocap, G., King, J., Chisholm, S. W. Cyanobacterial photosynthesis in the oceans: The origins and significance of divergent light-harvesting strategies. Trends in Microbiology. 10 (3), 134-142 (2002).
- Biller, S. J., Berube, P. M., Lindell, D., Chisholm, S. W. Prochlorococcus: The structure and function of collective diversity. Nature Reviews Microbiology. 13 (1), 13-27 (2015).
- Morel, A., Ahn, Y. -H., Partensky, F., Vaulot, D., Claustre, H. Prochlorococcus and Synechococcus - a Comparative-Study of Their Optical-Properties in Relation To Their Size and Pigmentation. Journal of Marine Research. 51, 617-649 (1993).
- Holden, S. J., Pengo, T., Meibom, K. L., Fernandez, C., Collier, J., Manley, S. High throughput 3D super-resolution microscopy reveals Caulobacter crescentusin vivo Z-ring organization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (12), 4566-4571 (2014).
- Zhao, M., Wei, B., Chiu, D. T. Imaging multiple biomarkers in captured rare cells by sequential immunostaining and photobleaching. Methods. 64 (2), 108-113 (2013).
- Golcuk, K., Mandair, G. S., Callender, A. F., Sahar, N., Kohn, D. H., Morris, M. D. Is photobleaching necessary for Raman imaging of bone tissue using a green laser? Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (7), 868-873 (2006).
- Haxo, F. T., Blinks, L. R. Photosynthetic Action Spectra of Marine Algae. The Journal of General Physiology. 33 (4), 389-422 (1950).
- Bryant, D. A. Phycoerythrocyanin and Phycoerythrin: Properties and Occurrence in Cyanobacteria. Journal of General Microbiology. 128 (4), 835-844 (1982).
