Summary
Ici, nous décrivons des méthodes de manipulation optogénétique de types particuliers de neurones pendant la surveillance des états de sommeil/éveil chez les souris, présentant nos travaux récents sur le noyau de lit de la stria terminalis comme exemple.
Abstract
Ces dernières années, l'optogénétique a été largement utilisée dans de nombreux domaines de la recherche neuroscientifique. Dans de nombreux cas, une opsine, comme la rhodopsine 2 (ChR2), est exprimée par un vecteur de virus dans un type particulier de cellules neuronales chez diverses souris Cre-driver. L'activation de ces opsines est déclenchée par l'application d'impulsions lumineuses qui sont délivrées par laser ou LED par des câbles optiques, et l'effet de l'activation est observé avec une résolution de temps très élevée. Les expérimentateurs sont en mesure de stimuler les neurones de façon aigue tout en surveillant le comportement ou un autre résultat physiologique chez la souris. L'optogénétique peut permettre des stratégies utiles pour évaluer la fonction des circuits neuronaux dans la régulation des états de sommeil/éveil chez la souris. Ici nous décrivons une technique pour examiner l'effet de la manipulation optogénétique des neurones avec une identité chimique spécifique pendant la surveillance d'électroencéphalogramme (EEG) et d'électromyogramme (EMG) pour évaluer le stade de sommeil des souris. Par exemple, nous décrivons la manipulation des neurones GABAergic dans le noyau de lit du terminalis de stria (BNST). L'excitation optogénétique aigue de ces neurones déclenche une transition rapide à l'éveil une fois appliqué pendant le sommeil de NREM. La manipulation optogénétique ainsi que l'enregistrement EEG/EMG peuvent être appliqués pour déchiffrer les circuits neuronaux qui régulent les états de sommeil/éveil.
Introduction
Le sommeil est essentiel pour une fonction cognitive optimale. Des résultats récents suggèrent également que les perturbations dans le sommeil sont associées à un large éventail de maladies1,2,3. Bien que les fonctions du sommeil ne soient pas encore encore en grande partie résolues, des progrès substantiels ont été réalisés récemment dans la compréhension des circuits neuronaux et des mécanismes qui contrôlent les états de sommeil/éveil4. Chez les mammifères, il y a trois états de vigilance : l'éveil, le sommeil non rapide des mouvements oculaires (NREM) et le sommeil rapide des yeux (REM). L'éveil est caractérisé par des oscillations rapides d'EEG (5-12 Hz) de basse amplitude avec l'activité motrice intentionnelle et soutenue. Le sommeil NREM est défini par des oscillations lentes (1-4 Hz) de haute amplitude (ondes delta), avec un manque de conscience et une activité motrice ciblée. Le sommeil paradoxal est caractérisé par des oscillations relativement rapides (6-12 Hz) de faible amplitude et presque complète atonia musculaire bilatérale5.
Borbely a proposé une théorie de la régulation de l'éveil du sommeil connue sous le nom de modèle à deux processus6,7. Un processus homéostatique, également appelé processus S, représente la pression du sommeil qui s'accumule pendant l'éveil et se dissipe pendant le sommeil. Un autre processus, appelé processus C, est un processus circadien, ce qui explique pourquoi les niveaux de vigilance fluctuent dans le cycle de 24 h. En plus de ces deux processus, les facteurs allostatiques sont également importants pour la régulation du sommeil / éveil8,9. Les facteurs allostatiques incluent les états nutritionnels et l'émotion. La peur et l'anxiété sont généralement accompagnées d'une augmentation de l'excitation ainsi que des réponses autonomes et neuroendocrines10,11,12. Le système limbique est censé jouer un rôle dans la régulation de la peur et de l'anxiété, et les mécanismes sous-jacents aux réponses autonomes et neuroendocrines ont été étudiés en profondeur, mais la voie par laquelle le système limbique influence le sommeil / état d'éveil n'a pas encore été révélé. Un grand nombre d'études récentes utilisant l'opto- et la pharmacogénétique ont suggéré que les neurones et les circuits neuronaux qui régulent les états de sommeil/éveil sont distribués dans tout le cerveau, y compris les cortices, le cerveau avant basal, le thalamus, l'hypothalamus, et le tronc cérébral. En particulier, les progrès récents dans l'optogénétique nous ont permis de stimuler ou d'inhiber des circuits neuronaux spécifiques in vivo avec des résolutions spatiales et temporelles élevées. Cette technique permettra de progresser dans notre compréhension des substrats neuronaux du sommeil et de l'éveil, et comment les états de sommeil/éveil sont réglés par les processus circadiens, la pression du sommeil et les facteurs allostatiques, y compris l'émotion. Cet article vise à introduire comment utiliser la manipulation optogénétique combinée avec l'enregistrement du sommeil / veille, qui pourrait avoir le potentiel de mettre à jour notre compréhension des connectomes et des mécanismes dans le cerveau qui jouent un rôle dans la régulation du sommeil NREM, sommeil paradoxal, et l'éveil. La compréhension de ce mécanisme par lequel le système limbique régule les états de sommeil/éveil est d'une importance primordiale pour la santé, parce que l'insomnie est habituellement associée à l'anxiété ou à la peur d'être incapable de dormir (somniphobie).
On pense que le BNST joue un rôle essentiel dans l'anxiété et la peur. GAD 67-exprimant les neurones GABAergic sont une population importante de la BNST12,13. Nous avons examiné l'effet de la manipulation optogénétique de ces neurones (GABABNST) sur les états de sommeil/éveil. L'une des plus grandes avancées en neurosciences ces dernières années a été des méthodes qui permettent la manipulation de neurones avec des identités chimiques particulières in vivo, avec des résolutions spatiales et temporelles élevées. L'optogénétique est très utile pour démontrer les liens de causalité entre l'activité neuronale et les réponses comportementales spécifiques14. Nous décrivons l'optogénétique comme méthode pour examiner la connectivité fonctionnelle des circuits neuronaux définis dans la régulation des états de sommeil/éveil. En utilisant cette technique, de grands progrès ont été réalisés dans la compréhension des circuits neuronaux qui régulent le sommeil / éveil états15,16,17,18,19 . Dans de nombreux cas, les opsines sont spécifiquement introduites dans les neurones avec des identités chimiques particulières dans les régions sélectives du cerveau par une combinaison de souris Cre-driver et Cre-inductible AAV-négocié le transfert de gène. En outre, l'expression focale d'opsines photosensibles telles que la canalrhodopsine 2 (ChR2)20 ou l'archaerhodopsine (ArchT)21 combinée à un système Cre-loxP ou Flp-FRT nous permet de manipuler une population neuronale sélective et spécifique voie neuronale22.
Nous décrivons ici des expériences sur des neurones GABAergic dans le BNST comme exemple. Pour exprimer des opsines dans une population neuronale désignée, des souris de conducteur de Cre appropriées et des vecteurs de virus Cre-dépendants sont le plus fréquemment utilisés. Les lignes transgéniques ou knock-in dans lesquelles les opsines sont exprimées en particulier les populations neuronales sont également utiles. Dans les expériences suivantes, nous avons utilisé GAD67-Cre knock-in souris23 dans lequel seuls les neurones GABAergic exprimer Cre recombinase avec un fond génétique C57BL/6J, et un vecteur AAV qui contient ChR2 (hChR2 H134R) fusionné avec EYFP ou EYFP comme un contrôle avec un commutateur "FLEx (Flip-excision)"24. La procédure décrit spécifiquement l'excitation optogénétique des neurones GABAergic dans le BNST pendant la surveillance des états de sommeil/éveil25.
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Protocol
Toutes les expériences ici ont été approuvées par le Comité d'expérimentation et d'utilisation des animaux de l'Université de Tsukuba, conformément aux directives des NIH.
1. Chirurgie animale, injection de virus, électrode pour EEG/EMG, et implantation optique de fibre
MISE EN GARDE: Les techniques appropriées de protection et de manipulation devraient être choisies en fonction du niveau de biosécurité du virus à utiliser. AAV doit être utilisé dans une pièce isolée classé P1A pour l'injection, et le tube transportant AAV doit être stérilisé avec un autoclave après tout le volume est utilisé. Le site chirurgical et tout le matériel implanté doivent être propres et stériles pendant l'utilisation.
REMARQUE: Voir figure 1.
- Désinfecter l'équipement chirurgical avec l'autoclave.
- Anesthésiez les souris à l'isoflurane à l'aide d'un vaporisateur anesthésique. Observez jusqu'à ce que la souris ait atteint la profondeur désirée de l'anesthésie, déterminée par la perte de réponse au pincement de la queue avec des forceps. Appliquer un onduleur ophtalmique sur les yeux pour éviter qu'ils ne sèchent.
- Désinfecter le champ chirurgical avec une solution d'iode ou 70% EtOH (3x) et sécher suffisamment. Laisser le virus dégeler sur la glace pendant la chirurgie. Couvrir la zone chirurgicale de papier absorbant de banc de laboratoire.
- Fixez la tête de la souris dans l'appareil stéréotaxique avec des barres d'oreille et un pincement au nez. Après avoir confirmé que la tête est maintenue de façon stable, faire une incision midsagittal dans le cuir chevelu pour s'assurer que les positions du bregma et lambda sont situées au même niveau sur une ligne horizontale.
- Pour éviter un écart de positionnement, ajustez correctement les niveaux de pincement du nez et les barres d'oreille de haut en bas. Le bregma et le lambda se réfèrent à l'intersection entre le sutura saggitalis et le sutura coronalis ou sutura lambdoidal, respectivement (figure 2).
- Utilisez des pinces Serafin pour maintenir la peau afin de maintenir l'accès au crâne. Après l'exposition du crâne, désinfecter la surface du crâne avec de l'iode ou 5% H2O2, pour permettre aux sutures crâniennes, y compris le bregma et lambda d'être visualisé plus clairement.
- Préparer l'injection vectorielle AAV :
- Laver l'intérieur d'une seringue de10 ml (voir Tableau des matériaux) de façon séquentielle avec 70 % etOH, 100 % EtOH et de l'eau stérilisée, 5 fois chacune. Fixez la seringue dans la pince d'un bras de pompe à microinjection et assurez-vous que toute la solution dans la seringue est déchargée.
- Aspirez soigneusement 2 ll d'huile minérale sans bulles d'air, puis aspirez le volume désigné de la solution virale. Après l'aspiration, manipulez le bouton de piston et confirmez que la solution de virus émerge à la pointe de l'aiguille.
REMARQUE: Le volume d'injection de la solution virale a été déterminé dans le but d'expérimenter à l'aide de la même souche de souris et du même produit antivirus. La relation entre le volume de la solution virale et l'étendue de la zone d'infection doit être estimée à l'avance.
- Injecter un vecteur AAV :
- Ajustez la pointe de l'aiguille de microinjection sur le bregma et notez les coordonnées comme point d'origine. Déplacez la pointe vers le site d'injection désigné (pour le BNST : antéropostérieur - 0,2 mm, médiolatéral - 1,0 mm, dorsoventral - 4,2 mm) et placez la pointe de l'aiguille sur la position. Placez une marque sur le crâne et percez des trous d'environ 2 mm de diamètre à l'aide d'une perceuse dentaire muni d'un coupeur de carbure de 0,7 mm. Veillez à ne pas endommager la dura ou le tissu cérébral.
- Après avoir enlevé le sang autour des trous avec un coton-tige, déplacez lentement l'aiguille dans la position de la BNST. Injectez lentement la quantité désignée de solution virale (0,07 l/min) avec un micro-injecteur mécanique. Après avoir terminé l'injection, laisser l'aiguille pendant 5 min pour permettre à la solution d'infiltrer suffisamment le tissu BNST. Sortez soigneusement l'aiguille.
- Pour l'injection bilatérale, répétez les étapes 1.8.1-1.8.2 de l'autre côté. Tout au long de la procédure, garder le crâne humide avec des applications de salin stérile.
REMARQUE: Nous avons utilisé des implants EEG/EMG personnalisés (W: 5 mm, D: 7 mm, H: 1 mm) avec quatre électrodes EEG (4 mm), deux électrodes EMG (2 mm; couper l'électrode de 4 mm à 2 mm avec des pinces) et 6 électrodes (4,5 mm) (Figure2A).
- Soudez deux fils en acier inoxydable (voir Tableau des matériaux) à partir de laquelle 1 mm de l'isolant est dépouillé des deux extrémités aux électrodes EMG. Ajuster le centre des électrodes au brégma et marquer la position de chaque électrode EEG (antéropostérieure 1,5 mm, médiolatéral - 1,0 mm), et déterminer la position de l'implant (Figure 2B).
- Implanter des fibres optiques :
- Fixez une ferrule de fibre optique au manipulateur et faites pivoter le bras du manipulateur de sorte qu'il ait un angle de 30 degrés par rapport à une ligne horizontale (ce processus n'est nécessaire que pour éviter les interférences entre les électrodes et les fibres optiques, comme dans le cas de la stimulation BNST). Mettez la pointe de fibre sur le bregma et enregistrez les coordonnées.
- Déplacez la pointe vers la ligne d'insertion ciblée et marquez la position sur le crâne. Placez également des marques supplémentaires près du site d'insertion pour les vis d'ancre. Percer le crâne sur chaque site avec un perceur dentaire pour insérer la fibre optique et fixer la vis. Fixez la vis sur le crâne. Veillez à ne pas casser la dura ou endommager les tissus par la vis.
- Insérez doucement la fibre optique jusqu'à ce qu'elle atteigne le BNST avec un manipulateur. La ferrule doit reposer sur le crâne restant (figure 1B).
- Appliquer du ciment dentaire photocurable (voir Tableau des matériaux) pour couvrir la fibre et la vis. Le temps de réaction pour solidifier la colle doit être spécifié par le manuel du fabricant (Notre matériau a besoin d'exposition à la lumière pour au moins 10 s avec une longueur d'onde spécifique photo-générateur. Il n'est pas nécessaire de sécher la colle après cela).
- Dans cette étape, assurez-vous qu'aucun matériaux (vis ou colle) n'occupe l'espace de montage pour les électrodes. En outre, évitez de faire toute interruption dans le ciment pour la ferrule se connectant à la fibre optique et le câble. Répétez les étapes 1.10.1-1.10.4 du côté opposé pour la stimulation bilatérale.
- Percer des trous pour les électrodes EEG/EMG. Insérez les pointes des électrodes dans les trous. Tenez l'implant et appliquez de l'adhésif cyanoacrylate dans l'espace entre le crâne et les électrodes. Insérez à nouveau avec l'attention de ne pas interférer avec les matériaux.
- Couvrez la circonférence des électrodes et des fibres optiques avec l'adhésif de cyanoacrylate suivi de l'application de l'accélérant de cyanoacrylate sur l'adhésif. Cette étape évite de causer une interruption à la zone de raccordement du câble ferrule-à-optique et de l'électrode au fil (figure 1C).
REMARQUE: L'adhésif cyanoacrylate et son accélérant sont nocifs pour l'œil de la souris. Faites attention à ne pas causer de déversement de ces substances chimiques. Aussi, veillez à ne pas toucher fortement les électrodes et les fibres afin d'éviter une déviation inattendue immédiatement après la solidification adhésive. - Exposer les muscles du cou de la souris et insérer les fils de l'électrode EMG sous le muscle. Ajuster la longueur de l'électrode EMG de sorte qu'il se situe juste sous les muscles nuchaux. La connexion légère entre la pointe de l'électrode et le fascia musculaire est suffisante pour capter le signal EMG.
- Appliquer l'adhésif cyanoacrylate pour remplir les implants et solidifier l'adhésif avec un liquide d'accélération. Ensuite, mettez la souris sur un coussin chauffant pour la récupération jusqu'à ce que le réflexe postural apparaît. Ajuster la température des coussinx chauffants à la température corporelle au repos des animaux (36,0 oC en ZT 0-12 dans le cas des souris C57BL6; ne dépassent pas 38,0 oC).
REMARQUE: Un antibiotique n'est pas nécessaire pour la chirurgie stérile. - Suivez vos directives institutionnelles locales pour l'analgésie postopératoire. Gardez les souris dans une cage d'accueil pendant une période de récupération d'au moins 7 jours.
2. Surveillance EEG/EMG avec Photo-excitation des neurones ciblés dans des états spécifiques de sommeil
MISE EN GARDE: Ce protocole comprend l'utilisation d'équipement laser de classe 3B ou d'appareils LED. Les expérimentateurs doivent être au courant de l'information sur la sécurité. Des lunettes de protection sont nécessaires.
- Avant de connecter le câble laser à la fibre optique, ajustez l'intensité laser à l'échelle. Attachez la pointe du câble laser à une fibre optique inutilisée avec une ferrule et confirmez qu'il n'y a pas d'espace à la jonction entre la fibre et le câble.
- Allumez l'interrupteur principal du laser et attendez 20 min pour qu'il se réchauffe.
- Émettre le laser au vérificateur d'intensité et ajuster l'intensité du laser à 10 mW/mm2. Changer le mode laser pour transistor logique et confirmer que les impulsions lumineuses sont émises à partir de la fibre contrôlée par le régulateur de modèle qui est fixé à 10 ms pour la durée, 40 ms pour le repos, 20 fois pour le cycle, et 20 fois répéter (c'est-à-dire, 20 Hz de 10 ms impulsions lumineuses pour 20 s).
- Après la période de récupération, déplacez les souris à la chambre expérimentale pour l'enregistrement de l'EEG/EMG. Maison souris à une constante de 23 oC avec un cycle de 12 h de lumière / sombre avec de la nourriture et de l'eau disponible ad libitum.
- Connectez l'électrode implantée et l'adaptateur de câble qui est attaché à un anneau de glissement pour éviter l'enchevêtrement. Il est recommandé de couvrir la jonction avec des matériaux imperméables à la lumière tels que le papier d'aluminium pour prévenir les fuites au laser. Si une expérience bilatérale est nécessaire, utilisez un anneau de glissement avec une pièce jointe bifurque pour les câbles.
- Dans ce protocole, nous évaluons la latence à l'éveil du sommeil NREM ou du sommeil paradoxal, de sorte que le temps d'enregistrement devrait être limité dans le temps de zeitgeber optimisé (ZT0 est défini comme le moment où la lumière est allumée). Ce protocole a été réalisé entre ZT4 - ZT10. Laissez les souris rester librement dans la chambre expérimentale pendant au moins 1 h comme acclimatation.
- Pendant la période expérimentale, surveillez les signaux EEG et EMG dans le même moniteur et évaluez l'état de la souris comme veille, sommeil NREM ou sommeil paradoxal. Utilisez le contrôle de gain pour chaque vague pour faciliter la distinction de chaque état.
- Pour mesurer la latence de sommeil NREM à l'éveil, observez un sommeil Stable NREM pour 40 s ou un sommeil paradoxal stable pour 30 s, puis allumez le commutateur du générateur de motifs pour la photostimulation (ce protocole génère 20 Hz de 10 ms d'impulsions lumineuses pour 20 s). Confirmer l'émission laser aux fibres optiques implantées.
- Enregistrez les signaux EEG/EMG jusqu'à ce que l'état de sommeil change en éveil. Si deux essais expérimentaux ou plus sont nécessaires, limitez la manipulation optogénétique à une fois par jour parce que la photostimulation est une intervention artificielle qui pourrait affecter l'architecture du sommeil et de l'éveil.
- Après l'expérience, anesthésiez profondément et perfilez avec le salin stérile et le paraformaldehyde (PFA) pour l'échantillonnage du cerveau entier pour l'analyse immunohistochimique26.
3. Analyse du temps de latence du sommeil NREM à l'éveil
- Après avoir enregistré les signaux EEG/EMG, transférez les données de signal à un ordinateur pour la notation des états de sommeil/éveil. Ce protocole décrit la méthode d'analyse de l'EEG avec un logiciel d'enregistrement (voir Tableau des matériaux).
- Démarrez l'application de signe de sommeil et cliquez sur l'onglet Fichier et sélectionnez Ouvrez pour choisir les données enregistrées (fichier.kcd). Cliquez sur l'onglet Sommeil pour sélectionner l'heure d'époque pour ajuster la fenêtre de temps pour chaque époque (nous utilisons 1 époque/4 sec).
- Score manuel état de sommeil/éveil basé sur les signaux EEG/EMG, selon les critères suivants : éveil, EMG élevé et basse tension d'EEG avec haute fréquence ; NREM, faible tonalité EMG et haute tension EEG avec une fréquence élevée (0,5-4 Hz); et REM, EMG indique l'atonie musculaire et la basse tension d'EEG avec la fréquence élevée de 6-9 Hz. Un État qui ne se poursuit pas consécutivement pendant 16 s (c.-à-d. 4 époques) n'est pas défini comme un changement d'état parce qu'il n'est pas un état stable.
- Cliquez et maintenez le bouton de la souris gauche sur la première époque et faites glisser le curseur jusqu'à ce que la tendance spécifique de plus de 16 s (4 époques) soit terminée. Ensuite, relâchez le bouton de la souris gauche et choisissez l'état approprié (éveil ou sommeil NREM ou sommeil paradoxal) dans la fenêtre pop-up. Répétez cette procédure pour marquer tous les signaux EEG/EMG enregistrés dans le fichier.
- Trouvez l'heure exacte de la stimulation à l'époque où l'EEG montre le sommeil NREM ou REM, et l'époque montrant la transition de l'état suivant le point de stimulation. Comptez le nombre d'époques entre les périodes juste après la stimulation et juste avant la transition de l'état.
- Puis multipliez le nombre compté d'époques par 4 s (A). À l'époque de la stimulation, prenez une capture d'écran et mesurez la largeur entre le point de stimulation et la fin de l'époque. Ensuite, divisez la longueur mesurée par toute la longueur de l'époque et multipliez par 4 s (B). De même, calculer la durée du sommeil NREM à l'époque du changement d'état, ce qui signifie le temps entre le début de l'époque et le point de changement d'état (C).
- Sum A, B et C pour obtenir la latence du sommeil NREM à l'éveil. La même procédure est utilisée pour l'analyse de la transition de l'état du sommeil paradoxal à l'éveil.
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Representative Results
La présente étude a montré l'effet de l'excitation optogénétique des neurones GABABNST sur la transition de l'état du sommeil. ChR2-EYFP a été exprimée au centre dans les neurones GABA dans le BNST. Une étude histochimique d'hybridation in situ a prouvé que ChR2-EYFP a été colocalisé dans les neurones exprimant des signaux d'ARNm de GAD 67, indiquant que ce sont des neurones GABAergic. Des échantillons de tranches immunohistochimiques ont confirmé la position de la fibre optique, dont la pointe était juste au-dessus de la BNST25.
Figure 3A montre des traces représentatives d'EEG/EMG avant et après la photostimulation pendant le sommeil NREM. L'EEG à haute tension et à fréquence lente sans signaux EMG représente le sommeil NREM. La photostimulation (10 ms impulsions à 20 Hz pendant 20 sec) a été appliquée suite à un sommeil Stable NREM. La stimulation déclenche une transition aigue vers l'éveil (EEG basse tension et haute fréquence avec signaux EMG actifs) environ 2 s après stimulation chez les souris exprimant ChR2. Les souris témoins (EYFP) n'ont pas montré de transition après stimulation (lalatence du réveil de NREM : EYFP, 295,39 à 106,61 s, n - 6 ; ChR2: 2,71 à 0,59 sec, n - 6; t10 à 2,35, p lt; 0,05; Figure 3B, supérieure). Ces données suggèrent que l'excitation des neurones DE BNST de GABA pendant le sommeil de NREM déclenche l'induction rapide de l'éveil. D'autre part, la photostimulation pendant le sommeil paradoxal n'a eu aucun effet (EYFP : 36,45 à 13,08 s, n - 6 ; ChR2: 37,29 à 15,19 s, n - 6; t10 à 0,04, p 0,484; Figure 3B, en bas) donc un effet de transition n'est apparu que dans le sommeil NREM.
Figure 1 : Procédure d'injection d'AAV, d'implants de fibres optiques et d'implants EEG/EMG. (A) Procédure expérimentale d'injection de virus. EYFP-fused ChR2 ou EYFP (pour le contrôle) gène incorporé dans le vecteur AAV dont la transcription est activée par Cre recombinase a été injecté bilatéralement dans le BNST. (B) Des fibres optiques ont été insérées vers le BNST à un angle de 30 degrés par rapport à l'horizontale pour éviter la collision avec l'électrode. Deux vis ont été insérées autour. (C) Le dispositif d'enregistrement D'EEG/EMG a été implanté après le placement sécurisé des fibres optiques. (D) À la fin de l'opération, toute la zone chirurgicale doit être recouverte d'adhésif au cyanoacrylate et fortement fixée. Assurez-vous de ne pas appliquer d'agent dans la région reliant l'électrode et les ferrules. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Sites d'insertion d'électrodes et d'électrodes EEG/EMG personnalisés. (A) Top : Sur 6 broches d'électrode, les deux broches externes sont réduites à 2 mm. En bas : électrodes EEG/EMG. (B) Ces électrodes et les fils de conduction EMG sont ensuite soudés. La zone de connexion doit être isolée avec n'importe quelle isolation comme l'adhésif de cyanoacrylate. Les sites d'insertion des électrodes sont relatifs au bregma (antéropostérieur - 1,5 mm, médiolatéral - 1,0 mm). Des fils D'EMG sont insérés sous le muscle du cou avec l'élimination de l'isolation protégeant le fil au site d'insertion (1 mm). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Effet de GABABNST stimulation sur la transition d'état dans le sommeil de NREM et le sommeil paradoxal. (A) Spectre d'ondes et d'EEG représentatif s'agite et EMG. La photostimulation (10 ms impulsions à 20 Hz pendant 20 sec) a été appliquée aux neurones GABABNST exprimant ChR2 après 40 s sommeil NREM. L'éveil a été rapidement induit après un 2 s. L'EEG a montré la basse tension et la haute fréquence avec l'éclatement d'EMG. Le spectrogramme de puissance d'EEG a également montré la transition de basse à haute fréquence. (B) L'excitation optogénétique des neurones DE GABABNST a montré la transition rapide du sommeil de NREM à l'éveil (supérieur), mais cet effet n'a pas été vu dans le cas d'appliquer la même manipulation dans le sommeil paradoxal (en bas). p lt; 0,05, Welch's t-test. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Nous avons présenté ici une méthode pour évaluer l'effet de la stimulation optogénétique des neurones avec des identités chimiques particulières sur les transitions d'état du sommeil/éveil et avons donné un exemple de manipulation des neurones DE BNST de GABA. Nos données ont prouvé que l'excitation optogénétique des neurones deBNST de GABA a comme conséquence la transition immédiate du sommeil de NREM à l'éveil.
Diverses conceptions expérimentales sont disponibles en raison du développement de nombreux types d'outils optogénétiques. Il est possible d'activer ou d'inhiber l'activité neuronale de neurones particuliers en utilisant différents types d'opsines, telles que ChR2, SSFO, halorhodopsin, ArchT, et iChloC27. ChR2 peut activer les neurones quelques millisecondes après la photo-stimulation et cela peut être utilisé pour évoquer des potentiels d'action d'une manière de verrouillage de phase par un générateur d'impulsions pour examiner l'impact aigu dans des stades de sommeil spécifiques. Une opsine d'activation stable telle que l'opsine stable de fonction d'étape (SSFO), qui induit la dépolarisation des neurones pendant 15 à 30 min après stimulation, pourrait également être utile pour quelques genres d'expériences conçues pour observer un effet semi-chronique28. Les cellules dépolarisées avec SSFO pourraient devenir plus sensibles à diverses entrées neuronales physiologiques et être désactivées en appliquant la lumière de longueur d'onde longue. En outre, nous pouvons activer les axones par l'implantation de fibres optiques sur le site d'une projection axonale. La stimulation de fibre pourrait fournir l'information sur la fonction d'une voie axonale particulière de projection.
L'enregistrement d'EEG/EMG pendant la manipulation optogénétique est une méthode moins invasive pour déterminer les conséquences directes de l'excitation/inhibition sélective des circuits neuraux sur des états de sommeil/éveil chez les souris. Avec cette méthode, de nombreuses populations neuronales et circuits neuronaux ont été montrés pour être impliqués dans la régulation des états de sommeil / éveil. Vers le développement ultérieur de cette technique, il est possible d'implanter plusieurs fibres pour manipuler plusieurs voies simultanément, ou cela pourrait également être utilisé en combinaison avec des fibres photométory ou miniscopes pour surveiller les activités neuronales.
En conclusion, il est prévu que l'optogénétique permettra d'accélérer les progrès dans le déverrouillage du mystère de la régulation du sommeil par le cerveau et le développement de thérapies innovantes pour l'insomnie réfractaire et d'autres troubles du sommeil.
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Disclosures
Ce projet a été en partie soutenu financièrement par Merck et Co.
Acknowledgments
Cette étude a été appuyée par le Merck Investigator Studies Program (#54843), un KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas, «WillDynamics» (16H06401) (T.S.), et un KAKENHI Grant-in-Aid for Exploratory Research on Innovative Areas (T.S.) (18H02595).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x1 Fiber-optic Rotary Joints | Doric | FRJ 1x1 FC-FC | for optogenetics |
| 6-pin header | KEL corporation | DSP02-006-431G | |
| 6-pin socket | Hirose | 21602X3GSE | |
| A/D converter | Nippon koden | N/A | Analog to digital converter |
| AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP | 3.70×1013(genomic copies/ml) | ||
| AAV10-EF1a-DIO-EYFP | 5.82×1013(genomic copies/ml) | ||
| Ampicillin | Fuji film | 014-23302 | |
| Amplifier | Nippon koden | N/A | for EEG/EMG recording |
| Anesthetic vaporizer | Muromachi | MK-AT-210D | |
| Automatic injecter | KD scientific | 780311 | |
| Carbide cutter | Minitor | B1055 | φ0.7 mm. Reffered as dental drill, used with high speed rotary micromotor |
| Cyanoacrylate adhesion (Aron alpha A) and acceleration | Konishi | #30533 | |
| Dental curing light | 3M | Elipar S10 | |
| Epoxy adhesive | Konishi | #04888 | insulation around the solder of 6-pin and shielded cable |
| Fiber optic patch cord (branching) | Doric | BFP(#)_50/125/900-0.22 | |
| Gad67-Cre mice | provided by Dr. Kenji Sakimura | Cre recombinase gene is knocked-in in the Gad67 allele | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 65461-01 | |
| High speed rotary micromotor kit | FOREDOM | K.1070 | Used with carbide cutter |
| Interconnecting sleeve | Thorlab | ADAF1 | φ2.5 mm Ceramic |
| Isoflurane | Pfizer | 871119 | |
| Laser | Rapp OptoElectronic | N/A | 473 nm wave length |
| Laser intesity checker | COHERENT | 1098293 | |
| Laser stimulator | Bio research center | STO2 | reffered as pulse generator in text |
| Optic fiber with ferrule | Thorlab | FP200URT-CANNULA-SP-JP | |
| pAAV2-rh10 | provided by PennVector Core | ||
| pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA | Addgene | plasimid # 20296 | |
| pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA | provided by Dr. Karl Deisseroth | ||
| Patch cord | Doric | D202-9089-0.4 | 0.4m length, laser conductor between laser and rotary joint |
| pHelper | Stratagene | ||
| Photocurable dental cement | 3M | 56846 | |
| Serafin clamp | Stoelting | 52120-43P | |
| Shielded cable | mogami | W2780 | Soldering to 6-pin socket for EEG/EMG recording |
| Sleep recording chamber | N/A | N/A | Custum-made (21 cm× 29 cm × 19 cm) with water tank holder |
| Sleep sign software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Slip ring | neuroscience,inc | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Stainless screw | Yamazaki | N/A | φ1.0 x 2.0 |
| Stainless wire | Cooner wire | AS633 | 0.0130 inch diameter |
| Stereotaxic frame with digital console | Koph | N/A | Model 940 |
| Syringe needle | Hamilton | 7803-05 | |
| Vital recorder software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG recording |
References
- Spoormaker, V. I., Montgomery, P. Disturbed sleep in post-traumatic stress disorder: Secondary symptom or core feature? Sleep Medicine Reviews. 12 (3), 169-184 (2008).
- Dworak, M., Wiater, A., Alfer, D., Stephan, E., Hollmann, W., Struder, H. K. Increased slow wave sleep and reduced stage 2 sleep in children depending on exercise intensity. Sleep Medicine. 9 (3), 266-272 (2008).
- Mellman, T. A. Sleep and anxiety disorders. Psychiatric Clinics of North America. 29 (4), 1047-1058 (2006).
- Scammell, T. E., Arrigoni, E., Lipton, J. O. Neural circuitry of wakefulness and sleep. Neuron. 93 (4), 747-765 (2017).
- Chemelli, R. M., et al. Narcolepsy in orexin knockout mice: Molecular genetics of sleep regulation. Cell. 98 (4), 437-451 (1999).
- Borbély, A. A., Daan, S., Wirz-Justice, A., Deboer, T. The two-process model of sleep regulation: A reappraisal. Journal of Sleep Research. 25 (2), 131-143 (2016).
- Daan, S., Beersma, D. G., Borbely, A. A. Timing of human sleep: recovery process gated by a circadian pacemaker. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 246 (2), R161-R183 (1984).
- Saper, C. B., Cano, G., Scammell, T. E. Homeostatic, circadian, and emotional regulation of sleep. Journal of Comparative Neurology. 493 (1), 92-98 (2005).
- Saper, C. B., Fuller, P. M., Pedersen, N. P., Lu, J., Scammell, T. E. Sleep state switching. Neuron. 68 (6), 1023-1042 (2010).
- LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).
- Tovote, P., Fadok, J. P., Lüthi, A. Neuronal circuits for fear and anxiety. Nature Reviews Neuroscience. 16 (6), 317-331 (2015).
- Lebow, M. A., Chen, A. Overshadowed by the amygdala: the bed nucleus of the stria terminalis emerges as key to psychiatric disorders. Molecular Psychiatry. 21 (4), 450-463 (2016).
- Wu, S., et al. Tangential migration and proliferation of intermediate progenitors of GABAergic neurons in the mouse telencephalon. Development. 138 (12), 2499-2509 (2011).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251-266 (2012).
- de Lecea, L., Carter, M. E., Adamantidis, A. Shining light on wakefulness and arousal. Biological Psychiatry. 71 (12), 1046-1052 (2012).
- Carter, M. E., Brill, J., Bonnavion, P., Huguenard, J. R., Huerta, R., de Lecea, L. Mechanism for hypocretin-mediated sleep-to-wake transitions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2635-E2644 (2012).
- Weber, F., Dan, Y. Circuit-based interrogation of sleep control. Nature Publishing Group. 538, 51-59 (2016).
- Weber, F., Chung, S., Beier, K. T., Xu, M., Luo, L., Dan, Y. Control of REM sleep by ventral medulla GABAergic neurons. Nature. 526, 435-438 (2015).
- Oishi, Y., et al. Slow-wave sleep is controlled by a subset of nucleus accumbens core neurons in mice. Nature Communications. 8 (1), 1-12 (2017).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Han, X., et al. A high-light sensitivity optical neural silencer: development and application to optogenetic control of non-human primate cortex. Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 1-8 (2011).
- Kim, C. K., Adhikari, A., Deisseroth, K. Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 18 (4), 222-235 (2017).
- Saito, Y. C., et al. GABAergic neurons in the preoptic area send direct inhibitory projections to orexin neurons. Frontiers in Neural Circuits. 7 (December), 1-3 (2013).
- Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping. Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).
- Kodani, S., Soya, S., Sakurai, T. Excitation of GABAergic neurons in the bed nucleus of the stria terminalis triggers immediate transition from non-rapid eye movement sleep to wakefulness in mice. Journal of Neuroscience. 37, 7174-7176 (2017).
- Lin, F., Pichard, J. Handbook of practical immunohistochemistry: frequently asked questions. , Springer. (2011).
- Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. Silencing neurons: tools, applications, and experimental constraints. Neuron. 95 (3), 504-529 (2017).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Prigge, M., Schneider, F., Davidson, T. J., O’Shea, D. J., Sohal, V. S., Goshen, I., Finkelstein, J., Paz, J. T., Stehfest, K., Fudim, R., Ramakrishnan, C., Huguenard, J. R., Hegemann, P., Deisseroth, K. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. Nature. 40 (6), 1301-1315 (2012).
