Summary
Här, vi beskriver metoder för optogenetisk manipulation av vissa typer av nervceller under övervakning av sömn/vakenhet stater i möss, presentera vårt senaste arbete på sängen kärnan i stria terminalis som ett exempel.
Abstract
Under de senaste åren har optogenetik ofta använts inom många områden av neurovetenskaplig forskning. I många fall, en opsin, såsom Channel rhodopsin 2 (ChR2), uttrycks av en virusvektor i en viss typ av neuronala celler i olika CRE-driver möss. Aktivering av dessa opsins utlöses av tillämpning av ljuspulser som levereras av laser eller leds genom optiska kablar, och effekten av aktivering observeras med mycket hög tid upplösning. Försöksledaren kan akut stimulera nervceller medan övervakning beteende eller ett annat fysiologiskt utfall hos möss. Optogenetics kan möjliggöra användbara strategier för att utvärdera funktionen av neuronala kretsar i regleringen av sömn/vakenhet stater i möss. Här beskriver vi en teknik för att undersöka effekten av optogenetisk manipulation av nervceller med en specifik Kemisk identitet under elektroencefalogram (EEG) och Elektromyogram (EMG) övervakning för att utvärdera sömn stadiet av möss. Som ett exempel, vi beskriver manipulation av GABAergic neuroner i sängen kärnan i stria terminalis (BNST). Akut optogenetisk excitation av dessa nervceller utlöser en snabb övergång till vakenhet när de appliceras under NREM-sömn. Optogenetisk manipulation tillsammans med EEG/EMG inspelning kan tillämpas för att dechiffrera neuronala kretsar som reglerar sömn/vakenhet stater.
Introduction
Sömn är viktigt för optimal kognitiv funktion. De senaste rönen tyder också på att sömnstörningar i sömnen är förknippade med ett brett spektrum av sjukdomar1,2,3. Även om funktionerna i sömnen är ännu i stort sett olösta, betydande framsteg har gjorts nyligen i förståelsen av neurala kretsar och mekanismer som styr sömn/vakenhet stater4. Hos däggdjur finns det tre tillstånd av vaksamhet: vakenhet, icke-Rapid ögonrörelser (NREM) sömn, och snabba ögonrörelser (REM) sömn. Vakenhet kännetecknas av snabba EEG svängningar (5-12 Hz) av låg amplitud med målmedveten och ihållande motorisk aktivitet. NREM-sömnen definieras av långsamma svängningar (1-4 Hz) av kick amplitud (delta vinkar), med brist av medvetenhet och målmedveten motorisk aktivitet. REM-sömn karakteriseras av förhållandevis fastar svängningar (6-12 Hz) av låg amplitud och nästan färdig bilateral muskel Atonia5.
Borbely föreslog en teori om sömn-vakenhet förordning kallas två processmodell6,7. En homeostatiska process, även kallad process S, representerar sömn tryck som ackumuleras under vakenhet och skingpates under sömnen. En annan process, kallad process C, är en Cirkadisk process, vilket förklarar varför vaksamhets nivåerna fluktuerar i 24 h cykel. Förutom dessa två processer, allostatiska faktorer är också viktiga för regleringen av sömn/vakenhet8,9. Allostatiska faktorer inkluderar näringsmässiga stater och känslor. Rädsla och ångest åtföljs vanligtvis av en ökning av upphetsning tillsammans med autonoma och neuroendokrina svar10,11,12. Det limbiska systemet tros spela en roll i regleringen av rädsla och ångest, och mekanismerna bakom autonoma och neuroendokrina svar har studerats utförligt, men den väg genom vilken det limbiska systemet påverkar sömn/vakenhet stater har inte ännu inte avslöjats. Ett stort antal nyligen genomförda studier med OPTO-och Farmakogenetik har föreslagit att nervceller och neuronala kretsar som reglerar sömn/vakenhet stater distribueras i hela hjärnan, inklusive cortices, basal forebrain, Thalamus, hypothalamus, och hjärnstammen. I synnerhet har de senaste framstegen inom optogenetik tillåtit oss att stimulera eller hämma specifika neurala kretsar in vivo med höga rumsliga och temporala resolutioner. Denna teknik kommer att möjliggöra framsteg i vår förståelse av de neurala substrat för sömn och vakenhet, och hur sömn/vakenhet stater regleras av dygnsrytm processer, sömn tryck, och allostatiska faktorer, inklusive känslor. Detta dokument syftar till att införa hur man använder optogenetisk manipulation kombinerat med sömn/Wake inspelning, som kan ha potential att uppdatera vår förståelse av de connectomes och mekanismer i hjärnan som spelar en roll i regleringen av NREM sömn, REM-sömn, och vakenhet. Förståelse för denna mekanism genom vilken det limbiska systemet reglerar sömn/vakenhet stater är av största vikt för hälsan, eftersom sömnlöshet är vanligtvis förknippas med ångest eller rädsla för att inte kunna sova (somniphobia).
BNST tros spela en viktig roll i ångest och rädsla. Gad 67-uttrycker GABAergic neuroner är en stor population av bnst12,13. Vi undersökte effekten av optogenetisk manipulation av dessa nervceller (GABABnst) på sömn/vakenhet stater. En av de största framstegen inom neurovetenskap under de senaste åren har varit metoder som möjliggör manipulation av nervceller med särskilda kemiska identiteter in vivo, med hög rumsliga och temporala resolutioner. Optogenetik är mycket användbart för att demonstrera orsakssambanden mellan neurala aktivitet och specifika beteendemässiga svar14. Vi beskriver optogenetik som en metod för att undersöka funktionell anslutning av definierade neurala kretsar i regleringen av sömn/vakenhet stater. Genom att utnyttja denna teknik, stora framsteg har uppnåtts i förståelsen av neuronala kretsar som reglerar sömn/vakenhet stater15,16,17,18,19 . I många fall, opsins är specifikt introduceras i nervceller med särskilda kemiska identiteter i selektiva hjärnregioner genom en kombination av CRE-driver möss och CRE-inducerbara AAV-medierad genöverföring. Vidare, fokala uttryck för fotokänsliga opsins som channelrhodopsin 2 (ChR2)20 eller archaerhodopsin (archt)21 kombinerat med ett CRE-loxP eller FLP-FRT-system tillåter oss att manipulera en selektiv neuronala population och specifika neurala väg22.
Vi beskriver här experiment på GABAergic neuroner i BNST som ett exempel. För att uttrycka opsins i en utsedd neuronala population, lämpliga CRE förare möss och CRE-beroende virusvektorer används oftast. Transgena eller Knock-in linjer där opsins uttrycks i synnerhet neuronala populationer är också användbara. I följande experiment använde vi GAD67-CRE Knock-in möss23 där endast GABAergic neuroner uttrycka CRE driver med en C57BL/6j genetisk bakgrund, och en AAV vektor som innehåller ChR2 (hChR2 H134R) smält med eyfp eller eyfp som en kontroll med en "FLEx (Flip-excision) switch"24. Förfarandet beskriver specifikt optogenetisk excitation av GABAergic neuroner i BNST under övervakning av sömn/vakenhet stater25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment här godkändes av Animal experiment och använda kommittén vid universitetet i Tsukuba, som uppfyller NIH riktlinjer.
1. djur kirurgi, virus insprutning, elektrod för EEG/EMG och optisk fiber implantation
Försiktighet: Lämpliga skydds-och hanteringsmetoder bör väljas på grund av den biosäkerhetsnivå hos viruset som ska användas. AAV ska användas i ett isolerat P1A graderat rum för injektion, och röret som transporterar AAV måste steriliseras med en autoklav efter att all volym har använts. Operationsstället och allt implanterat material ska vara rent och sterilt under användning.
Anmärkning: Se figur 1.
- Desinficera den kirurgiska utrustningen med autoklav.
- Anesthetize möss med isofluran med hjälp av en anestesi spridare. Observera tills musen har nått det önskade djupet av anestesi, bestäms av förlust av svar att nypa svansen med pinkoppar. Applicera oftalmisk salva på ögonen för att förhindra att de torkar.
- Desinficera det kirurgiska fältet med jodlösning eller 70% EtOH (3x) och torka tillräckligt. Låt viruset Tina på is när operationen utförs. Täck det kirurgiska området med absorberande Lab bänk papper.
- Fäst musens huvud i stereotaktisk apparat med öron stänger och en näsa nypa. Efter att ha bekräftat huvudet hålls stabilt, gör en planet snitt i hårbotten för att säkerställa positionerna för bregma och lambda ligger på samma nivå på en horisontell linje.
- För att undvika en positionering gap, lämpligt Justera nivåerna av näsan nypa och öron stänger upp och ner. Bregma och lambda hänvisar till korsningen mellan Sutura saggitalis och Sutura coronalis eller Sutura lambdoidal, respektive (figur 2).
- Använd Serafin klämmor för att hålla huden för att bibehålla tillgången till kraniet. Efter exponering av skallen, desinficera ytan av skallen med jod eller 5% H2O2, att möjliggöra kraniala suturer inklusive bregma och lambda som skall visualiseras tydligare.
- Förbered AAV-vektor injektion:
- Tvätta insidan av en 10 mL spruta (se tabell över material) sekventiellt med 70% etoh, 100% EtOH, och steriliserat vatten, 5 gånger vardera. Fäst sprutan i klämman på en görs pump arm och se till att all lösning i sprutan är urladdat.
- Aspirera försiktigt 2 μL mineralolja utan luftbubblor och aspirera sedan på den angivna volymen av virus lösningen. Efter aspiration, manipulera kolven knappen och bekräfta att virus lösning framträder på spetsen av nålen.
Anmärkning: Injektionsvolymen av virus lösningen bestämdes i pilotexperiment med samma möss stam och samma virus produkt. Sambandet mellan mängden virus lösning och omfattningen av infektionsområdet bör uppskattas i förväg.
- Injicera AAV-vektor:
- Justera spetsen på mikroinjektionsnålen på bregma och notera koordinaterna som den ursprungliga punkten. Flytta spetsen till det utsedda injektionsstället (för bnst: anteroposterior + 0,2 mm, snett ± 1,0 mm, dorsoventral-4,2 mm) och Placera spetsen på nålen på positionen. Sätt en markering på skallen och borra hål på ca 2 mm i diameter med hjälp av en tandborr med en 0,7 mm hårdmetallfräs. Var noga med att inte skada Dura eller hjärnvävnad.
- Efter avlägsnande av blod från runt hålen med en bomullspinne, sakta flytta nålen i positionen av BNST. Injicera långsamt den angivna mängden virus lösning (0,07 μl/min) med en mekanisk mikroinjektor. Efter avslutad injektion, lämna nålen i 5 min så att lösningen att tillräckligt infiltrera BNST vävnad. Ta försiktigt ut injektionsnålen.
- Upprepa steg 1.8.1-1.8.2 på den andra sidan för bilateral injektion. Under hela förfarandet, hålla skallen fuktig med tillämpningar av steril saltlösning.
Anmärkning: Vi använde anpassade EEG/EMG implantat (b: 5 mm, D: 7 mm, H: 1 mm) med fyra EEG-elektroder (4 mm), två EMG-elektroder (2 mm; skär 4 mm elektrod till 2 mm med nippers) och 6 elektroder (4,5 mm) (figur 2A).
- Lödtenn två rostfria trådar (se tabell över material) från vilken 1 mm av isoleringen är strippad av båda ändarna till EMG elektroder. Justera mitten av elektroderna till bregma och markera positionen för varje EEG-elektrod (anteroposterior ± 1,5 mm, snett ± 1,0 mm) och bestäm implantatets position (figur 2b).
- Implantat optiska fibrer:
- Fäst en optisk fiber hylsa till manipulatorn och rotera manipulatorn armen så att den har en vinkel på ± 30 ° mot en horisontell linje (denna process behövs endast för att undvika störningar mellan elektroder och optiska fibrer, såsom i fallet med BNST stimulering). Sätt fiber spetsen på bregma och anteckna koordinaterna.
- Flytta spetsen till den riktade insättnings linjen och markera positionen på skallen. Lägg också till ytterligare markeringar nära insättnings platsen för ankar skruvarna. Borra skallen på varje plats med en tand borr för att sätta in optisk fiber och fäst skruven. Fäst skruven på skallen. Var noga med att inte bryta Dura eller skada någon vävnad med skruv.
- Sätt in optisk fiber försiktigt tills de når över BNST med en manipulator. Kontakt förtennad bör vila på det resterande kraniet (figur 1b).
- Applicera photocurable Dental cement (se tabell över material) för att täcka fibrer och skruven. Reaktionstiden för att stelna limmet bör specificeras i tillverkarens manual (vårt material behöver exponering för ljus i minst 10 s med specifik våglängd foto-Generator. Det är onödigt att torka limmet efter detta).
- I detta steg, se till att inga material (skruv eller lim) upptar monteringsutrymmet för elektroderna. Dessutom undvika att göra något avbrott i cement för kontakt förtennad ansluta till optisk fiber och kabel. Upprepa steg 1.10.1-1.10.4 på motsatt sida för bilateral stimulering.
- Borrhål för EEG/EMG-elektroder. Sätt in spetsarna på elektroderna i hålen. Håll implantatet och applicera cyanoakrylatlim på utrymmet mellan skallen och elektroderna. Sätt igen med uppmärksamhet för att inte störa något material.
- Täck omkretsen av elektroderna och optiska fibrer med cyanoakrylatlim följt av applicering av cyanoakrylataccelerant på limmet. Detta steg undviker att orsaka något avbrott vid Ferrule-till-optisk kabel och elektrod-till-bly tråd anslutande zon (figur 1c).
Anmärkning: Cyanoakrylatlim och dess Accelerant är skadliga för mus ögat. Uppmärksamma att inte orsaka spill av dessa kemiska ämnen. Också, vara noga med att inte starkt röra elektroderna och fibrerna för att undvika oväntade avvikelser omedelbart efter självhäftande stelning. - Exponera mus halsen muskler och sätt trådarna för EMG elektroden under muskeln. Justera längden på EMG-elektroden så att den lokaliserar precis under de nackmusklerna. Ljus anslutning mellan spetsen på elektrod och muskel fascian är tillräckligt för att fånga EMG signalen.
- Applicera cyanoakrylatlim för att fylla implantaten och stelna limmet med accelerations vätska. Sedan, Placera musen på en värmedyna för återhämtning tills den postural reflex visas. Justera värme pad temperatur till djurens vilande kroppstemperatur (36,0 ° c i ZT 0-12 vid C57BL6 möss, Överskrid inte 38,0 ° c).
Anmärkning: Ett antibiotikum krävs inte för steril kirurgi. - Följ dina lokala institutionella riktlinjer för postoperativ analgesi. Förvara mössen i en hem bur under en återhämtningstid på minst 7 dagar.
2. EEG/EMG övervakning med foto-excitation av riktade nervceller i specifika sömn tillstånd
Försiktighet: Detta protokoll omfattar användning av laserutrustning av klass 3B eller LED-anordningar. Försöksledaren bör vara medveten om säkerhetsinformation. Skyddande ögon glasögon krävs.
- Innan du ansluter laser kabeln till optisk fiber, justera laserintensitet med en scaler. Tjudra spetsen på laser kabeln till en oanvänd optisk fiber med en kontakt förtennad och bekräfta att det inte finns något utrymme vid korsningen mellan fiber och kabeln.
- Slå på huvudströmbrytaren på lasern och vänta 20 min för att värma upp.
- Avge lasern till intensitetskontrollen och justera laserintensiteten till 10 mW/mm2. Ändra laser läge till transistor logik och bekräfta att ljuspulser avges från fiber styrs av mönstret regulator som är inställd på 10 ms för varaktighet, 40 MS för vila, 20 gånger för cykel, och 20 gånger upprepa (det vill, 20 Hz 10 MS ljuspulser för 20 s).
- Efter återhämtningsperioden, flytta möss till experiment kammaren för registrering av EEG/EMG. Husmöss vid en konstant 23 ° c med en 12 h ljus/mörker cykel med mat och vatten tillgängliga AD libitum.
- Anslut den implanterade elektroden och kabeladaptern som är bundna till en slip-ring för att undvika insnärjning. Det rekommenderas att täcka korsningen med ljus-impermeable material såsom aluminiumfolie för att förhindra Lasers läckaget. Om ett bilateralt experiment krävs, Använd en slip ring med en dela fäste för kablarna.
- I detta protokoll, vi bedömer latens till vakenhet från NREM sömn eller REM-sömn, så inspelningstiden bör begränsas i optimerad Zeitgeber tid (ZT0 definieras som den tid då ljuset är på). Detta protokoll genomfördes mellan ZT4-ZT10. Låt mössen stanna fritt i experiment kammaren i minst 1 h som acklimatisering.
- Under försöksperioden, övervaka EEG och EMG signaler i samma Monitor och utvärdera musens tillstånd som vakenhet, NREM sömn eller REM-sömn. Använd förstärkningskontrollen för varje våg för att göra det lättare att särskilja varje tillstånd.
- För mätning av NREM-sömn till vakenhet latens, Observera stabila NREM-sömn för 40 s eller stabil REM-sömn för 30 s, sedan slå på switchen av mönstret generatorn för photostimulation (detta protokoll genererar 20 Hz av 10 MS ljuspulser för 20 s). Bekräfta laser utsläppet till de implanterade optiska fibrerna.
- Spela in EEG/EMG-signaler tills det sovande tillståndet ändras till vakenhet. Om två eller flera experimentella prövningar behövs, begränsa optogenetisk manipulation till en gång om dagen eftersom photostimulation är en konstgjord intervention som kan påverka sömn/vakenhet arkitektur.
- Efter experimentet, djupt söva och parfymera med steril saltlösning och paraformaldehyd (PFA) för provtagning hela hjärnan för immunohistokemisk analys26.
3. analys av latenstid från NREM-sömn till vakenhet
- Efter inspelning av EEG/EMG signaler, överföra signalen data till en dator för bedömning sömn/vakenhet stater. Detta protokoll beskriver metoden för EEG-analys med inspelningsprogramvara (se tabell över material).
- Starta programmet Sleep Sign och klicka på fliken Arkiv och välj Öppna för att välja den inspelade data (. KCD-fil). Klicka på fliken viloläge för att välja epoktid för att justera tidsfönstret för varje epok (vi använder 1 epok/4 SEK).
- Manuellt betyg sömn/vakenhet stater baserat på EEG/EMG signaler, enligt följande kriterier: vakenhet, hög EMG och låg EEG-spänning med hög frekvens; NREM, låg EMG-ton och hög EEG-spänning med hög δ (0,5-4 Hz) frekvens; och REM, EMG indikerar muskel Atonia och låg EEG-spänning med hög θ (6-9 Hz) frekvens. En stat som inte efter varandra fortsätter för 16 s (dvs. 4 epoker) definieras inte som en statlig förändring eftersom det inte är en stabil stat.
- Klicka och håll vänster musknapp på den första epoken och dra markören tills den specifika trenden för mer än 16 s (4 epoker) är avslutad. Då, frige den lämna mus knapp och välja den lämplig stat (vakenhet eller NREM sova eller REM sova) i popmusik-upp fönster. Upprepa denna procedur för att göra alla EEG/EMG-signaler inspelade i filen.
- Hitta den exakta tiden för stimulering i epoken där EEG visar NREM-eller REM-sömn, och epoken visar tillståndsövergång efter stimuleringspunkten. Räkna antalet epoker mellan perioderna strax efter stimulering och strax före tillståndsövergång.
- Multiplicera räknade antalet epoker med 4 s (A). I epoken av stimulering, ta en skärmdump och mäta bredden mellan stimuleringspunkten och slutet av epoken. Dividera sedan den uppmätta längden med hela epoklängden och multiplicera med 4 s (B). Likaså beräkna varaktigheten av NREM sova i epoken av statens förändring, vilket innebär att tiden mellan början av epoken och staten ändra punkt (C).
- Sum A, B och C för att få latens från NREM-sömn till vakenhet. Samma förfarande används för analys av tillståndsövergång från REM-sömn till vakenhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den nuvarande studien visade effekten av optogenetisk excitation av GABABnst nervceller på Sleep State Transition. ChR2-EYFP uttrycktes i GABA neuroner i BNST. En in situ hybridisering histokemiska studie visade att ChR2-eyfp var colokaliserade i nervceller som uttrycker Gad 67 mRNA signaler, vilket indikerar att dessa är GABAergic nervceller. Immunohistochemical slice prover bekräftade positionen av optisk fiber, vars spets var precis ovanför BNST25.
Figur 3a visar representativa EEG/EMG-spår före och efter fotostimulering under NREM-sömnen. Hög spänning och långsam frekvens EEG utan EMG-signaler representerar NREM-sömn. Fotostimulering (10 MS pulser vid 20 Hz i 20 sekunder) applicerades efter stabil NREM-sömn. Stimulering utlöser akut övergång till vakenhet (lågspänning och hög frekvens EEG med aktiva EMG-signaler) om 2 s efter stimulering i ChR2-uttrycker möss. Kontrollera möss (EYFP) visade inte övergång efter stimulering (latens att vakna från NREM: EYFP, 295,39 ± 106,61 SEK, n = 6; ChR2:2,71 ± 0,59 SEK, n = 6; t10 = 2,35, p < 0,05; Figur 3b, övre). Dessa data tyder på att excitation av GABABnst nervceller under NREM-sömn utlöser snabb induktion av vakenhet. Å andra sidan hade photostimulation under REM-sömn ingen effekt (EYFP: 36,45 ± 13,08 SEK, n = 6; ChR2:37,29 ± 15,19 SEK, n = 6; t10 = 0,04, p = 0,484; Figur 3b, botten) så en övergångseffekt uppstod endast i NREM-sömn.
Figur 1 : Procedur för att injicera AAV, implantat optiska fibrer och EEG/EMG implantat. AFörsöksförfarande för virus injektion. EYFP-smält ChR2 eller EYFP (för kontroll) gen inkorporerad i AAV-vektor vars transkription aktiveras av CRE driver har injicerats bilateralt i BNST. Boptiska fibrer sattes in mot bnst i en 30 ° vinkel mot horisontalplanet för att förhindra kollision med elektroden. Två skruvar sattes runt den. C) EEG/EMG-inspelningsenheten implanterades efter säker placering av optiska fibrer. D) i slutet av operationen ska hela det kirurgiska området täckas med cyanoakrylatlim och starkt fixeras. Se till att inte tillämpa någon agent till den region som förbinder elektroden och Ferrules. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Anpassad EEG/EMG elektrod och elektrod stift insättnings ställen. (A) topp: av 6 elektrod stift, de yttre två stiften skärs ner till 2 mm. botten: EEG/EMG elektroder. (B) dessa elektroder och EMG ledningar är sedan lödda. Den anslutande zonen bör isoleras med någon isolering som cyanoakrylat lim. Insättnings ställen av elektroder är relativa till bregma (anteroposterior ± 1.5 mm, snett ± 1,0 mm). EMG ledningar sätts in under hals muskeln med avlägsnande av isolering skydda tråden vid insättningsstället (1 mm). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Effekten av GABAbnst stimulering på tillståndsövergång i NREM-sömn och rem-sömn. A) representativt EEG-och EMG-våg-och EEG-strömspektrum. Photostimulation (10 MS pulser vid 20 Hz för 20 SEK) applicerades på ChR2-uttrycker GABABnst nervceller efter 40 s NREM sömn. Vakenhet inducerades snabbt efter en 2 s. EEG visade låg spänning och hög frekvens med EMG sprängning. EEG-strömspektrogrammet visade också övergång från låg till hög frekvens. (B) optogenetisk excitation av GABAbnst nervceller visade snabb övergång från NREM sömn till vakenhet (övre), men denna effekt sågs inte i fallet med att tillämpa samma manipulation i REM-sömn (botten). *p < 0,05, Welch t-test. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi presenterade här en metod för att utvärdera effekten av optogenetisk stimulering av nervceller med särskilda kemiska identiteter på statliga övergångar av sömn/vakenhet och gav ett exempel på manipulation av GABABnst nervceller. Våra data visade att optogenetisk excitation av GABABnst nervceller resulterar i omedelbar övergång från NREM sömn till vakenhet.
Olika experimentella konstruktioner finns tillgängliga på grund av utvecklingen av många typer av optogenetiska verktyg. Det är möjligt att aktivera eller hämma neuronala aktivitet av särskilda nervceller med hjälp av olika typer av opsins, såsom ChR2, SSFO, halorhodopsin, ArchT, och iChloC27. ChR2 kan aktivera nervceller några millisekunder efter foto-stimulering och detta kan användas för att framkalla åtgärder potentialer i en fas-lås sätt av en pulsgenerator för att undersöka den akuta effekten i specifika sömn stadier. En stabilt aktivera opsin såsom stabil Step funktion opsin (SSFO), som inducerar depolarisering av nervceller för 15 till 30 min efter stimulering, kan också vara till nytta för vissa typer av experiment för att observera en semi-kronisk effekt28. Depolariserade celler med SSFO kan bli känsligare för olika fysiologiska neuronala indata och avaktiveras med hjälp av långa våglängdsljus. Dessutom kan vi aktivera axoner genom implantation av optiska fibrer på platsen för en axonal projektion. Fiber stimulering kan ge information om funktionen av en viss axonal projektion väg.
EEG/EMG inspelning under optogenetisk manipulation är en mindre invasiv metod för att fastställa de direkta konsekvenserna av selektiv excitation/hämning av neurala kretsar på sömn/vakenhet stater hos möss. Med denna metod, många neuronala populationer och neurala kretsar har visat sig vara inblandade i regleringen av sömn/vakenhet stater. Mot vidareutveckling av denna teknik, är det möjligt att implantatet flera fibrer för att manipulera flera vägar samtidigt, eller detta kan också användas i kombination med fiber photometory eller miniscope för att övervaka neuronala aktiviteter.
Sammanfattningsvis, det förväntas att optogenetik kommer att påskynda framsteg i att frigöra mysteriet med sömn reglering av hjärnan och utvecklingen av innovativa terapier för refraktär sömnlöshet och andra sömnstörningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Detta projekt stöddes delvis finansiellt av Merck & Co.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av Merck Investigator Studies program (#54843), en KAKENHI Grant-in-Aid för vetenskaplig forskning om innovativa områden, "WillDynamics" (16H06401) (TS), och en KAKENHI Grant-in-Aid för undersökande forskning om innovativa områden (TS) (18H02595).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x1 Fiber-optic Rotary Joints | Doric | FRJ 1x1 FC-FC | for optogenetics |
| 6-pin header | KEL corporation | DSP02-006-431G | |
| 6-pin socket | Hirose | 21602X3GSE | |
| A/D converter | Nippon koden | N/A | Analog to digital converter |
| AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP | 3.70×1013(genomic copies/ml) | ||
| AAV10-EF1a-DIO-EYFP | 5.82×1013(genomic copies/ml) | ||
| Ampicillin | Fuji film | 014-23302 | |
| Amplifier | Nippon koden | N/A | for EEG/EMG recording |
| Anesthetic vaporizer | Muromachi | MK-AT-210D | |
| Automatic injecter | KD scientific | 780311 | |
| Carbide cutter | Minitor | B1055 | φ0.7 mm. Reffered as dental drill, used with high speed rotary micromotor |
| Cyanoacrylate adhesion (Aron alpha A) and acceleration | Konishi | #30533 | |
| Dental curing light | 3M | Elipar S10 | |
| Epoxy adhesive | Konishi | #04888 | insulation around the solder of 6-pin and shielded cable |
| Fiber optic patch cord (branching) | Doric | BFP(#)_50/125/900-0.22 | |
| Gad67-Cre mice | provided by Dr. Kenji Sakimura | Cre recombinase gene is knocked-in in the Gad67 allele | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 65461-01 | |
| High speed rotary micromotor kit | FOREDOM | K.1070 | Used with carbide cutter |
| Interconnecting sleeve | Thorlab | ADAF1 | φ2.5 mm Ceramic |
| Isoflurane | Pfizer | 871119 | |
| Laser | Rapp OptoElectronic | N/A | 473 nm wave length |
| Laser intesity checker | COHERENT | 1098293 | |
| Laser stimulator | Bio research center | STO2 | reffered as pulse generator in text |
| Optic fiber with ferrule | Thorlab | FP200URT-CANNULA-SP-JP | |
| pAAV2-rh10 | provided by PennVector Core | ||
| pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA | Addgene | plasimid # 20296 | |
| pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA | provided by Dr. Karl Deisseroth | ||
| Patch cord | Doric | D202-9089-0.4 | 0.4m length, laser conductor between laser and rotary joint |
| pHelper | Stratagene | ||
| Photocurable dental cement | 3M | 56846 | |
| Serafin clamp | Stoelting | 52120-43P | |
| Shielded cable | mogami | W2780 | Soldering to 6-pin socket for EEG/EMG recording |
| Sleep recording chamber | N/A | N/A | Custum-made (21 cm× 29 cm × 19 cm) with water tank holder |
| Sleep sign software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Slip ring | neuroscience,inc | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Stainless screw | Yamazaki | N/A | φ1.0 x 2.0 |
| Stainless wire | Cooner wire | AS633 | 0.0130 inch diameter |
| Stereotaxic frame with digital console | Koph | N/A | Model 940 |
| Syringe needle | Hamilton | 7803-05 | |
| Vital recorder software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG recording |
References
- Spoormaker, V. I., Montgomery, P. Disturbed sleep in post-traumatic stress disorder: Secondary symptom or core feature? Sleep Medicine Reviews. 12 (3), 169-184 (2008).
- Dworak, M., Wiater, A., Alfer, D., Stephan, E., Hollmann, W., Struder, H. K. Increased slow wave sleep and reduced stage 2 sleep in children depending on exercise intensity. Sleep Medicine. 9 (3), 266-272 (2008).
- Mellman, T. A. Sleep and anxiety disorders. Psychiatric Clinics of North America. 29 (4), 1047-1058 (2006).
- Scammell, T. E., Arrigoni, E., Lipton, J. O. Neural circuitry of wakefulness and sleep. Neuron. 93 (4), 747-765 (2017).
- Chemelli, R. M., et al. Narcolepsy in orexin knockout mice: Molecular genetics of sleep regulation. Cell. 98 (4), 437-451 (1999).
- Borbély, A. A., Daan, S., Wirz-Justice, A., Deboer, T. The two-process model of sleep regulation: A reappraisal. Journal of Sleep Research. 25 (2), 131-143 (2016).
- Daan, S., Beersma, D. G., Borbely, A. A. Timing of human sleep: recovery process gated by a circadian pacemaker. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 246 (2), R161-R183 (1984).
- Saper, C. B., Cano, G., Scammell, T. E. Homeostatic, circadian, and emotional regulation of sleep. Journal of Comparative Neurology. 493 (1), 92-98 (2005).
- Saper, C. B., Fuller, P. M., Pedersen, N. P., Lu, J., Scammell, T. E. Sleep state switching. Neuron. 68 (6), 1023-1042 (2010).
- LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).
- Tovote, P., Fadok, J. P., Lüthi, A. Neuronal circuits for fear and anxiety. Nature Reviews Neuroscience. 16 (6), 317-331 (2015).
- Lebow, M. A., Chen, A. Overshadowed by the amygdala: the bed nucleus of the stria terminalis emerges as key to psychiatric disorders. Molecular Psychiatry. 21 (4), 450-463 (2016).
- Wu, S., et al. Tangential migration and proliferation of intermediate progenitors of GABAergic neurons in the mouse telencephalon. Development. 138 (12), 2499-2509 (2011).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251-266 (2012).
- de Lecea, L., Carter, M. E., Adamantidis, A. Shining light on wakefulness and arousal. Biological Psychiatry. 71 (12), 1046-1052 (2012).
- Carter, M. E., Brill, J., Bonnavion, P., Huguenard, J. R., Huerta, R., de Lecea, L. Mechanism for hypocretin-mediated sleep-to-wake transitions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2635-E2644 (2012).
- Weber, F., Dan, Y. Circuit-based interrogation of sleep control. Nature Publishing Group. 538, 51-59 (2016).
- Weber, F., Chung, S., Beier, K. T., Xu, M., Luo, L., Dan, Y. Control of REM sleep by ventral medulla GABAergic neurons. Nature. 526, 435-438 (2015).
- Oishi, Y., et al. Slow-wave sleep is controlled by a subset of nucleus accumbens core neurons in mice. Nature Communications. 8 (1), 1-12 (2017).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Han, X., et al. A high-light sensitivity optical neural silencer: development and application to optogenetic control of non-human primate cortex. Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 1-8 (2011).
- Kim, C. K., Adhikari, A., Deisseroth, K. Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 18 (4), 222-235 (2017).
- Saito, Y. C., et al. GABAergic neurons in the preoptic area send direct inhibitory projections to orexin neurons. Frontiers in Neural Circuits. 7 (December), 1-3 (2013).
- Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping. Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).
- Kodani, S., Soya, S., Sakurai, T. Excitation of GABAergic neurons in the bed nucleus of the stria terminalis triggers immediate transition from non-rapid eye movement sleep to wakefulness in mice. Journal of Neuroscience. 37, 7174-7176 (2017).
- Lin, F., Pichard, J. Handbook of practical immunohistochemistry: frequently asked questions. , Springer. (2011).
- Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. Silencing neurons: tools, applications, and experimental constraints. Neuron. 95 (3), 504-529 (2017).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Prigge, M., Schneider, F., Davidson, T. J., O’Shea, D. J., Sohal, V. S., Goshen, I., Finkelstein, J., Paz, J. T., Stehfest, K., Fudim, R., Ramakrishnan, C., Huguenard, J. R., Hegemann, P., Deisseroth, K. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. Nature. 40 (6), 1301-1315 (2012).
