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Bioengineering

फ्लोरोसेंट तकनीक का एक संयोजन का उपयोग कर कोशिकाओं के रहने में बल के प्रति संवेदनशील प्रोटीन गतिशीलता का मापन

Published: November 02, 2018
doi:
10.3791/58619
, ,
1Department of Biomedical Engineering,Duke University

Summary

यहां, हम Förster अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण आधारित तनाव सेंसरों के एक साथ उपयोग के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान प्रोटीन की गतिशीलता को मापने के लिए photobleaching के बाद प्रोटीन लोड और प्रतिदीप्ति वसूली को मापने के लिए बल के प्रति संवेदनशील की माप को सक्षम करने जीवित कोशिकाओं के भीतर प्रोटीन गतिशीलता ।

Abstract

कोशिकाओं भावना और mechanotransduction बुलाया एक प्रक्रिया में जैव रासायनिक-जासूसी संकेतों में यांत्रिक उत्तेजनाओं में परिवर्तित करके अपने वातावरण में भौतिक संकेतों का जवाब. mechanotransduction में एक महत्वपूर्ण कदम बाहरी और आंतरिक वातावरण के बीच बलों के संचरण है । बलों को संचारित करने के लिए, प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की श्रृंखला के द्वारा बनाए गए निरंतर, अटूट शारीरिक संबंध होना चाहिए । एक दिया प्रोटीन-प्रोटीन संपर्क के लिए, यांत्रिक लोड या तो बातचीत पर कोई प्रभाव नहीं है, बातचीत के तेजी से संबंध है, या यहां तक कि बातचीत को स्थिर करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । कैसे आणविक लोड हुक्म समझ में रहने वाले कोशिकाओं में प्रोटीन कारोबार एक प्रोटीन के यांत्रिक राज्य के बारे में बहुमूल्य जानकारी प्रदान कर सकते हैं, बारी में mechanotransduction में अपनी भूमिका elucidating । बल के प्रति संवेदनशील प्रोटीन गतिशीलता को मापने के लिए मौजूदा तकनीक या तो प्रोटीन लोड के प्रत्यक्ष माप कमी या सेलुलर संदर्भ के बाहर प्रदर्शन माप पर भरोसा करते हैं । यहां, हम Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन-photobleaching के बाद प्रतिदीप्ति वसूली (झल्लाहट-frap है) तकनीक है, जो जीवित कोशिकाओं के भीतर बल के प्रति संवेदनशील प्रोटीन गतिशीलता के माप में सक्षम बनाता है । इस तकनीक संभवतः किसी भी झल्लाहट आधारित तनाव संवेदक के लिए लागू है, बल के अध्ययन की सुविधा-सेलुलर संरचनाओं की विविधता में संवेदनशील प्रोटीन गतिशीलता और विभिंन प्रकार के सेल में ।

Introduction

extracellular पर्यावरण दोनों जैव रासायनिक और भौतिक संकेतों है कि सेल व्यवहार हुक्म का एक समृद्ध स्रोत है । विशेष रूप से, microenvironment की शारीरिक प्रकृति प्रमुख सेलुलर कार्यों मध्यस्थता कर सकते हैं, सेल विकास, प्रवास सहित, और भेदभाव1,2,3,4. microenvironment के यांत्रिकी के Dysregulation कई रोगों है कि अभी तक पर्याप्त उपचार नहीं है के लिए एक महत्वपूर्ण घटक है, इस तरह के कैंसर के रूप में5, atherosclerosis6, और फाइब्रोसिस7. कैसे कोशिकाओं जैव रासायनिक-जासूसी संकेतों में शारीरिक उत्तेजनाओं को बदलने की एक पूरी समझ, एक प्रक्रिया mechanotransductioned, आणविक बल संचरण मध्यस्थ तंत्र के elucidation की आवश्यकता है, दोनों में और कोशिकाओं के बाहर और कई उपसेलुलर संरचनाओं के भीतर ।

सेलुलर संरचनाओं के अंदर, प्रोटीन लगातार बदल रहे हैं; बाध्यकारी और बाध्यकारी भागीदारों के साथ उनकी बातचीत की ताकत के आधार पर बाइंडिंग8. बलों के लिए सफलतापूर्वक एक भौतिक दूरी भर में प्रेषित किया जा करने के लिए, वहां प्रोटीन के एक अटूट श्रृंखला-प्रोटीन बातचीत होना चाहिए, जिसका अर्थ है कि एक प्रोटीन कारोबार को बनाए रखने और अपने बाध्यकारी साथी9बल संचारित करने के लिए पर्याप्त धीमी होना चाहिए । जबकि प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत आम तौर पर कई गैर से मिलकर बनता है प्रोटीन डोमेन के बीच बांड आबंध, बातचीत अक्सर एक बाध्य राज्य के रूप में धारणा है कि विभिंन शर्तों10के तहत एक असीम राज्य के लिए संक्रमण कर सकते हैं, 11. एक दिया प्रोटीन-प्रोटीन संपर्क के लिए, यह संभव है कि बल बातचीत के जीवनकाल, एक “आदर्श बंधन” के रूप में जाना जाता है पर कोई प्रभाव नहीं हो सकता है, बातचीत के जीवनकाल कम, एक “पर्ची बांड” के रूप में जाना जाता है, या बातचीत के जीवनकाल में वृद्धि , एक “पकड़ो बांड”10के रूप में जाना जाता है । इस प्रकार, प्रोटीन लोड और प्रोटीन गतिशीलता के बीच एक जटिल संबंध है, जिसे हम बल-संवेदी गतिशीलता के रूप में संदर्भित करते हैं ।

बांड गतिशीलता पर लोड के प्रभाव को समझने की दिशा में, अत्यधिक जानकारीपूर्ण प्रयोगों की एक संख्या एकल-अणु स्तर पर प्रदर्शन किया गया है । अलग प्रोटीन, या प्रोटीन और चुंबकीय चिमटी, ऑप्टिकल चिमटी, और परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी के रूप में हेरफेर तकनीक के टुकड़े का उपयोग करना, इन अध्ययनों से कई प्रासंगिक के लिए बल के प्रति संवेदनशील प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत का प्रदर्शन किया है प्रोटीन्स11,12. दोनों integrins13 और cadherins14, जो transmembrane प्रोटीन सेल-मैट्रिक्स और सेल-सेल बातचीत, क्रमशः के गठन के लिए महत्वपूर्ण हैं, लोड करने के कारण गतिशीलता में परिवर्तन का प्रदर्शन किया है । सेल के भीतर, vinculin दोनों टलीं15 और α-catenin16 के लिए एक बल पर निर्भर तरीके से भर्ती है और17actin के साथ एक कैच बांड फार्म कर सकते हैं, दोनों फोकल आसंजन (फास) और vinculin जंक्शनों पर adherens के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका का संकेत (AJs ) के अंतर्गत लोड । एकल अणु अध्ययन विशिष्ट प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत और उपज अस्पष्ट परिणाम के अलगाव के लिए अनुमति देते हैं, लेकिन वे सेलुलर वातावरण की जटिलता के लिए खाते में नहीं है ।

मील का पत्थर प्रयोगों का प्रदर्शन किया है कि कई उपसेलुलर संरचनाओं, जिनमें शामिल है फास और AJs, mechanosensitive हैं, और प्रदर्शन के जवाब में बढ़ाया विधानसभा आंतरिक रूप से उत्पंन या बाह्य लागू-लोड18,19, 20,21,22. इसके अतिरिक्त, कई सैद्धांतिक मॉडल का सुझाव दिया है कि mechanosensitive विधानसभा बल के प्रति संवेदनशील प्रोटीन गतिशीलता23,24,25से प्रेरित हो सकता है । जीवित कोशिकाओं के भीतर इन बल संवेदनशील गतिशीलता की जांच करने के लिए, कुछ अप्रत्यक्ष दृष्टिकोण लिया गया है । frap है और संबंधित तकनीक कोशिकाओं में प्रोटीन गतिशीलता को मापने के लिए एक अपेक्षाकृत सरल पद्धति प्रदान26,27,28,29. हालांकि, प्रोटीन लोड की माप अधिक सीमित किया गया है । एक ठेठ दृष्टिकोण के साथ कोशिकाओं में प्रोटीन गतिशीलता की तुलना करने के लिए और एक cytoskeletal अवरोधक के लिए जोखिम के बिना समग्र सेल सिकुड़ना8,30,31को कम करने के लिए प्रयोग किया जाता है । धारणा, यह एक उच्च लोड और कम लोड राज्य के बीच एक तुलना है । हालांकि, वहां या तो राज्य में प्रोटीन भर में लोड का कोई ठहराव है, और वहां अवांछित अवरोध करनेवाला के जैव रासायनिक प्रभाव हो सकता है, इस तरह के एक एफ actin रेशा के साथ महत्वपूर्ण बाध्यकारी साइटों की हानि । एक और दृष्टिकोण, करने के लिए विशेष है, को मापने के लिए एफए द्वारा सब्सट्रेट पर कुल बल परिश्रम के लिए कर्षण बल माइक्रोस्कोपी का उपयोग लगभग आणविक लोड करने के लिए और एफए३२के भीतर एक प्रोटीन की गतिशीलता के साथ संबंध की जांच करने के लिए किया गया है । हालांकि इस दृष्टिकोण कुल बल के ठहराव के लिए अनुमति देता है, यह आणविक विशिष्ट जानकारी प्रदान नहीं करता है । फास से अधिक २०० विभिंन प्रोटीन से बना रहे हैं, जिनमें से कई लोड३३सहन कर सकते हैं । इस प्रकार, एक एफए के कुल बल उत्पादन को मापने संभावित कई बल संचरण रास्ते की संभावना अस्पष्ट और मज़बूती से एक विशिष्ट प्रोटीन पर लोड का एक उपाय प्रदान नहीं करता है.

mechanobiology में पिछले दृष्टिकोण के विपरीत, झल्लाहट आधारित तनाव सेंसर के आगमन कोशिकाओं३४,३५,३६रहने वाले अंदर विशिष्ट प्रोटीन द्वारा अनुभवी भार के प्रत्यक्ष माप की अनुमति देता है । यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल है कि झल्लाहट आधारित तनाव सेंसर frap है-आधारित उपाय के साथ प्रोटीन की गतिशीलता को जोड़ती है पेश करते हैं । हम झल्लाहट के रूप में इस तकनीक का उल्लेख-frap है । इस दृष्टिकोण प्रोटीन लोड और प्रोटीन गतिशीलता के एक साथ माप सक्षम बनाता है, इस प्रकार के रहने वाले कोशिकाओं में बल के प्रति संवेदनशील प्रोटीन गतिशीलता के आकलन की अनुमति (चित्रा 1) । पहले से ही, झल्लाहट-frap है तकनीक के अध्ययन के लिए लागू किया गया है सेना के प्रति संवेदनशील मैकेनिकल लिंकर प्रोटीन vinculin३७की गतिशीलता । तनाव सेंसर कई प्रोटीन है कि सेलुलर संरचनाओं की एक किस्म में प्रासंगिक है के लिए विकसित किया गया है । उदाहरण के लिए, सेंसर vinculin के लिए विकसित किया गया है३४ और टलीं३८,३९ में फास, cadherins और catenins में AJs४०,४१,४२, nesprin परमाणु LINC परिसर में ४३, α-actinin४४ और filamin३६ में cytoskeleton, और MUC-1 में glycocalyx४५, अंय लोगों के बीच४६। इसी तरह, frap है एक सामान्य रूप से इस्तेमाल किया तकनीक फोकल आसंजन8,31, adherens जंक्शनों४७, actin प्रांतस्था26, और नाभिक४८के भीतर mechanosensitive प्रोटीन पर इस्तेमाल किया गया है । आगे बढ़ते, झल्लाहट-frap है तकनीक इन मौजूदा सेंसरों या नव विकसित सेंसरों में से किसी के लिए मोटे तौर पर लागू किया जाना चाहिए, उपसेलुलर संरचनाओं और संदर्भों की एक विस्तृत विविधता में बल के प्रति संवेदनशील गतिशीलता के माप के लिए अनुमति देता है. इस अंत की ओर, हम झल्लाहट-frap है इन विभिंन प्रणालियों में लागू तकनीक को लागू करने के लिए एक विस्तृत, सामान्यीकृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । उंमीद है, यह प्रयोग की एक विस्तृत विविधता बल संचरण को विनियमित करने में विभिंन mechanosensitive प्रोटीन की भूमिका elucidating और मध्यस्थता सेल व्यवहार में सक्षम हो जाएगा ।

Protocol

1. इमेजिंग के लिए नमूने उत्पन्न छुरा एक्सप्रेस तनाव संवेदक वांछित सेल प्रकार में निर्माण । क्लोन तनाव संवेदक pRRL वेक्टर या अंय वायरल अभिव्यक्ति प्लाज्मिड में निर्माण ।नोट: कई अलग आणविक क्लोनिंग…

Representative Results

झल्लाहट-frap है दो फ्लोरोसेंट तकनीक, झल्लाहट और frap है के संयोजन से बना है । हम प्रोटीन लोड के प्रभाव पर ध्यान केंद्रित के रूप में, हम झल्लाहट-आधारित तनाव सेंसर३४,४६इस्तेम?…

Discussion

झल्लाहट-frap है विधि बल के प्रति संवेदनशील प्रोटीन गतिशीलता, एक संपत्ति है कि सीधे रहने वाले कोशिकाओं के अंदर जांच करने के लिए मुश्किल हो गया है की प्रत्यक्ष माप के लिए अनुमति देता है । प्रोटीन गतिशीलता आ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

यह काम एक राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन कैरियर पुरस्कार (NSF-CMMI-14-54257) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (16GRNT30930019) और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (R01GM121739-01) डॉ Brenton हॉफमैन और एक राष्ट्रीय को संमानित किया से अनुदान के द्वारा समर्थित किया गया साइंस फाउंडेशन ग्रेजुएट रिसर्च फेलोशिप Katheryn Rothenberg को सम्मानित किया । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी नहीं कि NSF या NIH के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

Materials

0.05% Trypsin-EDTA Thermo Fisher 25300062
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 30525-89-4
60x Objective NA1.35 Olympus UPLSAPO 60XO
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) Gibco 15240-062
Automated Stage Prior Scientific H117EIX3
Custom Dichroic Mirror Chroma Technology Corp T450/514rpc
Custom mTFP1 Emission Filter Chroma Technology Corp ET485/20m
Custom mTFP1 Excitation Filter Chroma Technology Corp ET450/30x
Custom Venus Excitation Filter Chroma Technology Corp ET514/10x
DMEM-gfp Live Cell Visualization Medium Sapphire MC102
Dulbecco's Modified Eagle's Medium  Sigma Aldrich D5796 with L-glutamine and sodium bicarbonate
Fetal Bovine Serum HyClone SH30396.03
Fibronectin, Human Corning 47743-654
FRAPPA Calibration Slide Andor provided along with FRAPPA unit
FRAPPA System with 515 nm Laser Andor
Glass-bottomed Fluoro Dishes World Precision Instruments FD35
HEK293-T Cells ATCC CRL-3216
Hexadimethrine Bromide, Polybrene Sigma Aldrich H9268-5G
High-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium Sigma Aldrich D6429
Inverted Fluorescent Microscope Olympus IX83
JMP Pro Software SAS
Lambda 10-3 Motorized Filter Wheels Sutter Instruments LB10-NW
LambdaLS Arc Lamp with 300W Ozone-Free Xenon Bulb Sutter Instruments LS/OF30
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027
MATLAB Software Mathworks
MEM Non-Essential Amino Acids Thermo Fisher 11140050
MetaMorph for Olympus Olympus
Micro-Humidification System Bioptechs 130708
MoFlo Astrios EQ Cell Sorter Beckman Coulter B25982
Objective Heater Medium Bioptechs 150819-13
OptiMEM Thermo Fisher 31985070
Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich D8537
pMD2.G Envelope Plasmid Addgene 12259
pRRL Vector gift from Dr. Kam Leong (Columbia University)
psPax2 Packaging Plasmid Addgene 12260
sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 Camera Hamamatsu Photonics C11440-22CU
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge Thermo Fisher 75004505
Stable Z Stage Warmer Bioptechs 403-1926
Venus Emission Filter Semrock FF01-571/72
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Rothenberg, K. E., Puranam, I., Hoffman, B. D. Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques. J. Vis. Exp. (141), e58619, doi:10.3791/58619 (2018).
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