Medición de la proteína sensible a la fuerza dinámica en células vivas usando una combinación de técnicas fluorescentes

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para el uso simultáneo de Förster Resonancia Sensores de tensión basado en la transferencia de energía para medir recuperación de carga y de la fluorescencia de la proteína después de photobleaching para medir la dinámica de la proteína que permite la medida de fuerza-sensible dinámica de proteínas dentro de células vivas.

Abstract

Las células detectar y responden a las señales físicas en su entorno mediante la conversión de estímulos mecánicos en señales detectables bioquímicamente en un proceso llamado mecanotransducción. Un paso crucial en la mecanotransducción es la transmisión de fuerzas entre los entornos internos y externos. Para transmitir las fuerzas, debe existir un vínculo físico sostenido, intacto creado por una serie de interacciones proteína-proteína. Una interacción de proteína-proteína dada, carga mecánica no puede tener ningún efecto en la interacción, conducen a la rápida disociación de la interacción, o incluso estabiliza la interacción. Entender cómo molecular carga dicta volumen de proteína en las células vivas puede proporcionar información valiosa sobre el estado mecánico de una proteína, a su vez dilucidar su papel en la mecanotransducción. Técnicas existentes para medir la dinámica de la proteína sensible a la fuerza o falta de mediciones directas de la carga de proteína o confían en las mediciones realizadas fuera del contexto celular. Aquí, describimos un protocolo para la recuperación de fluorescencia de transferencia de Förster Resonancia energética después de photobleaching (FRAP traste) técnica, que permite la medición de la dinámica de la proteína sensible a la fuerza dentro de las células vivas. Esta técnica es potencialmente aplicable a cualquier sensor de tensión basado en el traste, facilita el estudio de la dinámica de la proteína sensible a la fuerza en variedad de estructuras subcelulares y en diferentes tipos celulares.

Introduction

El medio extracelular es una fuente rica de estímulos bioquímicos y físicos que determinan el comportamiento celular. En particular, la naturaleza física del microambiente puede mediar claves funciones celulares, incluyendo el crecimiento celular, migración y diferenciación^1,2,3,4. Dysregulation de la mecánica del microambiente es un componente crítico para muchas enfermedades que aún no tienen tratamientos adecuados, tales como cáncer⁵, ateroesclerosis⁶y fibrosis⁷. Una completa comprensión de cómo las células convierten estímulos físicos en señales detectables bioquímicamente, un proceso llamado mecanotransducción, requiere la aclaración de los mecanismos moleculares que median la transmisión de la fuerza, tanto dentro y fuera de las células y dentro de varias estructuras subcelulares.

Dentro de estructuras subcelulares, las proteínas están cambiando constantemente enlace y desenlace basado en la fuerza de sus interacciones vinculantes socios⁸. Para que las fuerzas ser transmitido con éxito a través de una distancia física, deben existir una cadena ininterrumpida de interacciones de proteínas, lo que significa que volumen de ventas de la proteína debe ser lo suficientemente lento para mantener y transmitir la fuerza a su pareja de enlace⁹. Mientras que las interacciones proteína-proteína generalmente consisten de varios no-covalentes entre los dominios de la proteína, la interacción a menudo se conceptualiza como un estado encuadernado que puede la transición a un estado independiente bajo diferentes condiciones^{10, 11}. una interacción proteína-proteína dada, es posible que fuerza puede tener ningún efecto en la duración de la interacción, conocida como un “vínculo ideal”, reducir la duración de la interacción, conocida como un “bono de resbalón” o aumentar la duración de la interacción , conocido como un “bono de captura”¹⁰. Así, hay una intrincada relación entre la carga de proteínas y la dinámica de la proteína, que denominamos sensible a la fuerza dinámica.

Para entender el efecto de la carga dinámica de bond, un número de experimentos altamente informativos se han realizado en el nivel de una sola molécula. Utilizando proteínas aisladas o fragmentos de proteínas y técnicas de manipulación, como pinzas magnéticas, pinza óptica y microscopía de fuerza atómica, estos estudios han demostrado las interacciones de proteínas sensibles a la fuerza por varios relevantes proteínas^11,12. Ambas integrinas¹³ y caderinas¹⁴, que son proteínas transmembranales importantes para la formación de interacciones célula-matriz y célula-célula, respectivamente, han demostrado alteraciones en la dinámica debido a la carga. Dentro de la célula, vinculina es reclutado a ambos talin¹⁵ y α-catenina¹⁶ en una forma dependiente de la fuerza y puede formar un lazo de captura con actina¹⁷, indicando un papel crucial para vinculin en adherencias focales (FAs) y uniones adherentes (AJs ) bajo carga. Estudios de una sola molécula permiten el aislamiento de las interacciones proteína-proteína específica y resultados sin ambigüedades, pero no tienen en cuenta la complejidad del entorno celular.

Señal los experimentos demostraron que varias estructuras subcelulares, como FAs y AJs, mechanosensitive y exhiben mayor Asamblea en respuesta a cargas generadas internamente o externamente aplicado^{18,19, 20,21,22}. Además, varios modelos teóricos han sugerido que mechanosensitive Asamblea podría ser conducido por la proteína sensible a la fuerza dinámica^23,24,25. Para examinar estas dinámicas sensibles a la fuerza dentro de las células vivas, se han tomado algunos enfoques indirectos. FRAP y técnicas relacionadas proporcionan una metodología relativamente simple para medir la dinámica de la proteína en células^26,27,28,29. Sin embargo, la medición de la carga de proteína ha sido más limitada. Un enfoque típico es comparar la dinámica de proteínas en células con y sin la exposición a un inhibidor de citoesqueleto utilizado para reducir el total de la célula contractilidad^8,30,31. Conceptualmente, se trata de una comparación entre una alta carga y el estado de baja carga. Sin embargo, no hay ninguna cuantificación de la carga a través de la proteína en cualquier Estado, y puede haber efectos bioquímicos no intencionales del inhibidor, la pérdida de sitios de Unión clave a lo largo de un filamento de actina F. Otro método, específico para FAs, ha sido medir el esfuerzo total de la fuerza en el substrato por la FA mediante microscopía de fuerzas de tracción aproximada carga molecular y examinar la relación con la dinámica de una sola proteína dentro de la FA³². Mientras que este enfoque permite la cuantificación del total de la fuerza, no proporciona información molecular específica. FAs se componen de más de 200 proteínas diferentes, muchos de los cuales pueden llevar de carga³³. Así, la salida total de la fuerza de una FA de medición potencialmente oscurece la posibilidad de múltiples vías de transmisión de fuerza y no fiable proporciona una medida de la carga sobre una proteína específica.

A diferencia de los enfoques anteriores en la mecanobiología, el advenimiento de los sensores de tensión basados en traste permite directo^34,35,36células de medición de cargas de proteínas específicas dentro de la vida. Aquí, presentamos un protocolo que combina sensores de tensión basados en traste con FRAP basado en medida de la dinámica de la proteína. Nos referimos a esta técnica como FRAP de traste. Este enfoque permite la medida simultánea de la carga de proteína y la proteína dinámica, permitiendo la evaluación de la dinámica de la proteína sensible a la fuerza en las células vivas (figura 1). Ya se ha aplicado la técnica de FRAP de traste para el estudio de la dinámica sensible a la fuerza de la mecánica vinculador proteína vinculina³⁷. Sensores de tensión se han desarrollado numerosas proteínas que intervienen en una variedad de estructuras subcelulares. Por ejemplo, se han desarrollado sensores para vinculin³⁴ y talin^38,39 en FAs, caderinas y cateninas en AJs^40,41,42, nesprin en el LINC nuclear complejo ⁴³y⁴⁴ de la α-actinina filamin³⁶ en el citoesqueleto y MUC-1 en el glicocálix⁴⁵, entre otros⁴⁶. Asimismo, el FRAP es que una técnica comúnmente utilizada ha sido utilizada en proteínas mechanosensitive adherencias focales^8,31, las ensambladuras de los adherens⁴⁷, actina corteza²⁶y núcleo⁴⁸. Avanza, que la técnica de FRAP traste debe ser ampliamente aplicable a cualquiera de estos sensores existentes o recién desarrollado sensores, lo que permite la medición de la dinámica sensible a la fuerza en una amplia variedad de contextos y estructuras subcelulares. Hacia este fin, proporcionamos un protocolo detallado, generalizado para la aplicación de la técnica de FRAP traste aplicable en estos sistemas. Ojala, esto le permitirá una amplia variedad de experimentos de dilucidar el papel de diversas proteínas mechanosensitive en la regulación de transmisión de la fuerza y en la mediación de comportamiento celular.

Protocol

1. generar muestras para la proyección de imagen Construcción de sensor de tensión estable expresa en tipo celular deseado. Clon de tensión sensor construcción pRRL vector o otros plásmidos de expresión viral.Nota: Varias herramientas de clonación moleculares diferentes están disponibles para lograr este paso incluyendo el uso de enzimas de restricción, extensión e Gibson Asamblea35. El vector pRRL se utiliza en la transducción viral lenti y permite un alto grado …

Representative Results

TRASTE-FRAP se compone de la combinación de dos técnicas fluorescentes, FRET y FRAP. Como nos hemos centrado en los efectos de la carga de la proteína, se utilizaron sensores de tensión basados en FRET34,46. Estos sensores se basan a menudo en una tensión detección módulo que consiste en dos proteínas fluorescentes, tales como mTFP1 y VenusA206K, conectados por un enlazador flagelliform (figura 1A</str…

Discussion

El método FRAP traste permite la medida directa de la dinámica de la proteína sensible a la fuerza, una propiedad que ha sido difícil de sonda directamente dentro de las células vivas. La sensibilidad de la dinámica de la proteína a carga molecular es fundamental para la función de la proteína como una fuerza transmisor o transductor. Carga se requiere para la transmisión de ambos generados internamente y las fuerzas aplicadas externamente, había llamado mechanotransmission y para la conversión de esas fuerza…

Materials

0.05% Trypsin-EDTA	Thermo Fisher	25300062
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	30525-89-4
60x Objective NA1.35	Olympus	UPLSAPO 60XO
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x)	Gibco	15240-062
Automated Stage	Prior Scientific	H117EIX3
Custom Dichroic Mirror	Chroma Technology Corp		T450/514rpc
Custom mTFP1 Emission Filter	Chroma Technology Corp		ET485/20m
Custom mTFP1 Excitation Filter	Chroma Technology Corp		ET450/30x
Custom Venus Excitation Filter	Chroma Technology Corp		ET514/10x
DMEM-gfp Live Cell Visualization Medium	Sapphire	MC102
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma Aldrich	D5796	with L-glutamine and sodium bicarbonate
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30396.03
Fibronectin, Human	Corning	47743-654
FRAPPA Calibration Slide	Andor		provided along with FRAPPA unit
FRAPPA System with 515 nm Laser	Andor
Glass-bottomed Fluoro Dishes	World Precision Instruments	FD35
HEK293-T Cells	ATCC	CRL-3216
Hexadimethrine Bromide, Polybrene	Sigma Aldrich	H9268-5G
High-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma Aldrich	D6429
Inverted Fluorescent Microscope	Olympus	IX83
JMP Pro Software	SAS
Lambda 10-3 Motorized Filter Wheels	Sutter Instruments	LB10-NW
LambdaLS Arc Lamp with 300W Ozone-Free Xenon Bulb	Sutter Instruments	LS/OF30
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-027
MATLAB Software	Mathworks
MEM Non-Essential Amino Acids	Thermo Fisher	11140050
MetaMorph for Olympus	Olympus
Micro-Humidification System	Bioptechs	130708
MoFlo Astrios EQ Cell Sorter	Beckman Coulter	B25982
Objective Heater Medium	Bioptechs	150819-13
OptiMEM	Thermo Fisher	31985070
Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537
pMD2.G Envelope Plasmid	Addgene	12259
pRRL Vector			gift from Dr. Kam Leong (Columbia University)
psPax2 Packaging Plasmid	Addgene	12260
sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 Camera	Hamamatsu Photonics	C11440-22CU
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge	Thermo Fisher	75004505
Stable Z Stage Warmer	Bioptechs	403-1926
Venus Emission Filter	Semrock	FF01-571/72