Messung von Kraft-und Kleinschreibung Proteindynamik in lebenden Zellen mit einer Kombination von fluoreszierenden Techniken

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die gleichzeitige Verwendung von Förster Resonance Energy Transfer-basierte Spannung Sensoren zur Messung der Belastung und Fluoreszenz Proteingewinnung nach Immunofluoreszenz Proteindynamik ermöglichen die Messung der Kraft-und Kleinschreibung messen Proteindynamik innerhalb von lebenden Zellen.

Abstract

Zellen spüren und reagieren auf körperliche Signale in ihrer Umgebung durch die Umwandlung der mechanischen Reize in biochemisch nachweisbar Signale in einem Prozess namens Mechanotransduktion. Ein entscheidender Schritt in Mechanotransduktion ist die Übertragung der Kräfte zwischen den internen und externen Umgebungen. Kräfte zu übertragen, muss eine nachhaltige, ungebrochen körperliche Verbindung erstellt durch eine Reihe von Protein-Protein-Wechselwirkungen. Für ein gegebenes Protein-Protein-Interaktion mechanischer Belastung haben entweder keine Auswirkungen auf die Interaktion, zu schneller Distanzierung der Interaktion führen oder sogar stabilisieren die Interaktion. Verstehen, wie molekulare Last diktiert, dass Protein-Umsatz in lebenden Zellen wertvolle Informationen über den mechanischen Zustand eines Proteins, im Gegenzug seine Rolle bei der Mechanotransduktion Aufklärung liefern kann. Bestehende Techniken zur Messung von Kraft-und Kleinschreibung Proteindynamik fehlen direkte Messungen des Proteins Last oder verlassen Sie sich auf die Messungen außerhalb des zellulären Kontexts. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Förster Resonanz Energie Transfer-Fluoreszenz Erholung nach Immunofluoreszenz (Bund-FRAP) Technik, ermöglicht die Messung von Kraft-und Kleinschreibung Proteindynamik innerhalb von lebenden Zellen. Diese Technik gilt möglicherweise für jeden Bund-basierte Spannung Sensor erleichtern das Studium der Kraft-Sensitive Proteindynamik in unterschiedlichsten subzellulären Strukturen und in verschiedenen Zelltypen.

Introduction

Die extrazelluläre Umgebung ist eine reiche Quelle von biochemischen und physikalischen Signale, die ihr Verhalten der Zelle bestimmen. Insbesondere kann die physische Beschaffenheit der Mikroumgebung wichtige Zellfunktionen einschließlich Zellwachstum, Migration und Differenzierung^1,2,3,4vermitteln. Dysregulation der Mechanik von der Mikroumgebung ist eine kritische Komponente für viele Krankheiten, die noch nicht ausreichende Behandlungen, wie z. B. Krebs⁵, Atherosklerose⁶und Fibrose⁷verfügen. Ein vollständiges Verständnis der wie Zellen physikalischen Reize in biochemisch nachweisbar Signale umwandeln, ein Prozess Mechanotransduktion bezeichnet, erfordert die Aufklärung der molekularen Mechanismen vermitteln Kraftübertragung, sowohl in als auch außerhalb der Zellen und in mehreren subzelluläre Strukturen.

Im Inneren der subzellulären Strukturen sind Proteine ständig umdrehen; Bindung und loslösen, basierend auf der Stärke ihrer Interaktionen mit verbindlichen Partner⁸. Für Kräfte erfolgreich über eine räumliche Distanz hinweg übertragen werden muss eine ununterbrochene Kette von Protein-Protein-Interaktionen, was bedeutet, dass ein Protein-Umsatz langsam genug, um aufrecht zu erhalten und Kraft zu seinen verbindlichen Partner⁹übertragen werden muss. Während Protein-Protein-Interaktionen in der Regel von mehreren nicht-kovalente Bindungen zwischen den Protein-Domänen bestehen, ist die Interaktion häufig als gebundenen Staat konzipiert, die in einem ungebundenen Zustand unter verschiedenen Bedingungen^10, übergehen kann ¹¹. für ein gegebenes Protein-Protein-Interaktion ist es möglich, dass Kraft keine Wirkung auf die Dauer der Interaktion haben, bekannt als eine “ideale Bond”, reduzieren die Lebensdauer der Interaktion, bekannt als “Slip-Bond”, oder erhöhen die Lebensdauer der Interaktion , bekannt als ein “Fang Bond”¹⁰. So gibt es eine komplizierte Beziehung zwischen Protein Last und Proteindynamik, die wir als Kraft-Sensitive Dynamik bezeichnen.

Zum Verständnis der Auswirkungen der Belastung auf die Anleihe Dynamik, wurden eine Reihe von hochinformativen Experimente auf der Einzelmolekül-Ebene durchgeführt. Mit isolierten Proteine oder Fragmente von Proteinen und Manipulationstechniken wie magnetische Pinzette, optische Pinzette und Rasterkraftmikroskopie, zeigten diese Studien Kraft-Sensitive Protein-Protein-Interaktionen für mehrere relevante Proteine-^11,–¹². Beide Integrine¹³ und Cadherine¹⁴, die transmembranen Proteine wichtig zur Bildung Zellmatrix und Zell-Zell-Interaktionen, bzw. sind, zeigten Veränderungen in der Dynamik durch geladen. Innerhalb der Zelle Vinkulin wird auf beide Talin¹⁵ und α-Catenin¹⁶ in einer Kraft-abhängigen Weise eingestellt, und bilden eine Fang-Anleihe mit Aktin¹⁷, zeigt eine entscheidende Rolle für Vinkulin bei fokalen Adhäsionen (FAs) und Adherens Junctions (AJs ) unter Last. Einzelmolekül-Studien für die Isolierung von spezifischen Protein-Protein-Interaktionen zu ermöglichen und eindeutige Ergebnisse liefern, aber sie nicht die Komplexität der zellulären Umgebung entfallen.

Landmark Experimente zeigten, dass mehrere subzelluläre Strukturen, einschließlich FAs und AJs, Mechanosensitive und verbesserte Montage als Reaktion auf intern generierten oder äußerlicher Anwendung Lasten^{18,19aufweisen, 20,21,22}. Darüber hinaus haben mehrere theoretische Modelle vorgeschlagen, dass Mechanosensitive Montage durch Kraft-Sensitive Protein Dynamics^23,24,25gefahren werden konnte. Um diese Kraft-Sensitive Dynamiken innerhalb von lebenden Zellen zu untersuchen, wurden einige indirekte Ansätze unternommen. FRAP und verwandte Techniken bieten eine relativ einfache Methode zur Messung von Proteindynamik Zellen^26,27,28,29. Jedoch wurde die Messung von Protein Last mehr beschränkt. Ein typisches Vorgehen soll Proteindynamik in Zellen mit und ohne Exposition gegenüber einem Zellskelett Inhibitor verwendet, um allgemeine Zelle Kontraktilität^8,30,31zu vergleichen. Im Prinzip handelt es sich um einen Vergleich zwischen einer hohen Belastung und niedrigen Lastzustand. Allerdings gibt es keine Quantifizierung der Last über das Protein in keinem der Staaten, und möglicherweise gibt es biochemische Nebeneffekte des Inhibitors, so den Verlust von wichtigen Bindestellen entlang einer F-Aktin-Filament. Ein weiterer Ansatz, speziell für FAs, wurde zur Messung der Gesamtkraft Anstrengung auf dem Substrat durch das FA mit Traktion Rasterkraftmikroskopie um ungefähre molekulare Last und untersuchen Sie die Beziehung mit der Dynamik eines einzigen Proteins innerhalb der FA³². Während dieser Ansatz die Quantifizierung der Gesamtkraft ermöglicht, bietet es keine molekular spezifische Informationen. FAs bestehen aus mehr als 200 verschiedene Proteine, von die viele Last³³tragen können. So Messausgang die Gesamtkraft von einem FA möglicherweise verdeckt die Möglichkeit, mehrere Kraft Übertragungswege und zuverlässig liefert ein Maß für die Belastung auf ein bestimmtes Protein.

Im Gegensatz zu früheren Ansätzen in Mechanobiology, das Aufkommen der Bund-basierte Spannung Sensoren ermöglicht die direkte Messung von Lasten erlebt durch bestimmte Proteine in lebenden Zellen^34,35,36. Hier präsentieren wir eine Protokoll, die Bund-basierte Spannung Sensoren mit FRAP Maß Proteindynamik verbindet. Wir bezeichnen diese Technik als Bund FRAP. Dieser Ansatz ermöglicht die gleichzeitige Messung von Protein Last- und Proteindynamik, so dass die Bewertung der Kraft-Sensitive Proteindynamik in lebenden Zellen (Abbildung 1). Bereits, hat die Bund FRAP-Technik für die Untersuchung von Kraft-und Kleinschreibung Dynamik der mechanischen Linker Protein Vinkulin³⁷angewendet. Spannung-Sensoren wurden für zahlreiche Proteine entwickelt, die in einer Vielzahl von subzellulären Strukturen relevant sind. Zum Beispiel sind Sensoren für Vinkulin³⁴ und Talin^38,39 in FAs, Cadherine und Catenins in AJs^40,41,42, Nesprin in der nuklearen LINC Komplex entwickelt worden ⁴³, α-Actinin⁴⁴ und Filamin³⁶ in dem Zytoskelett und MUC-1 in der Glycocalyx⁴⁵, unter anderem⁴⁶. In ähnlicher Weise ist FRAP eine häufig verwendete Technik auf Mechanosensitive Proteine innerhalb der fokalen Adhäsionen^8,31, Adherens Junctions⁴⁷Aktin Kortex²⁶und Kern⁴⁸verwendet worden ist. Voran, die Bund-FRAP Technik breit anwendbar zu sein sollte dieser vorhandenen Sensoren oder neu entwickelte Sensoren zur Messung von Kraft-und Kleinschreibung Dynamik in einer Vielzahl der subzellulären Strukturen und Zusammenhänge ermöglicht. Zu diesem Zweck bieten wir eine detaillierte, generalisierte Protokoll für die Umsetzung der Bund-FRAP-Technik in diese unterschiedlichen Systeme anwendbar. Hoffentlich wird dies eine Vielzahl von Experimenten, die Aufklärung der Rollen der verschiedenen Mechanosensitive Proteine bei der Regulierung der Kraftübertragung und bei der Vermittlung Zelle Verhalten ermöglichen.

Protocol

1. erzeugen Sie Proben für die Bildgebung Stabil ausdrückliche Spannung Sensor Konstrukt in gewünschten Zelltyp. Klonen Sie Spannung Sensor Konstrukt in pRRL Vektor oder anderen viralen Expressionsplasmid.Hinweis: Verschiedene molecular cloning Tools stehen zu erreichen diesen Schritt, einschließlich der Verwendung von Restriktionsenzymen, überlappen, Erweiterung und Gibson Montage35. Der pRRL Vektor wird in Lenti virale Transduktion verwendet und ermöglicht ein hohes M…

Representative Results

Bund-FRAP setzt sich aus der Kombination von zwei fluoreszierende Techniken, Bund und FRAP. Da wir auf die Auswirkungen der Protein-Last, verwendeten wir Spannung FRET-basierte Sensoren34,46. Diese Sensoren basieren häufig auf eine Spannung Sensor Modul bestehend aus zwei fluoreszierende Proteine, wie mTFP1 und VenusA206K, verbunden durch eine birnenförmige Linker (Abbildung 1A). Wenn das Modul zwis…

Discussion

Die Bund-FRAP-Methode ermöglicht direkte Messung von Kraft-Sensitive Protein Dynamics, eine Eigenschaft, die schwierig war, direkt in lebenden Zellen zu untersuchen. Die Empfindlichkeit der Proteindynamik molekulare Belastung ist entscheidend für die Funktion des Proteins als Kraft Sender oder Wandler. Beladung ist erforderlich für die Übertragung der beiden intern generierten und äußerlicher Anwendung Kräfte, genannt Mechanotransmission und für die Umwandlung von jenen Kräften in biochemisch nachweisbar Signale…

Materials

0.05% Trypsin-EDTA	Thermo Fisher	25300062
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	30525-89-4
60x Objective NA1.35	Olympus	UPLSAPO 60XO
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x)	Gibco	15240-062
Automated Stage	Prior Scientific	H117EIX3
Custom Dichroic Mirror	Chroma Technology Corp		T450/514rpc
Custom mTFP1 Emission Filter	Chroma Technology Corp		ET485/20m
Custom mTFP1 Excitation Filter	Chroma Technology Corp		ET450/30x
Custom Venus Excitation Filter	Chroma Technology Corp		ET514/10x
DMEM-gfp Live Cell Visualization Medium	Sapphire	MC102
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma Aldrich	D5796	with L-glutamine and sodium bicarbonate
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30396.03
Fibronectin, Human	Corning	47743-654
FRAPPA Calibration Slide	Andor		provided along with FRAPPA unit
FRAPPA System with 515 nm Laser	Andor
Glass-bottomed Fluoro Dishes	World Precision Instruments	FD35
HEK293-T Cells	ATCC	CRL-3216
Hexadimethrine Bromide, Polybrene	Sigma Aldrich	H9268-5G
High-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma Aldrich	D6429
Inverted Fluorescent Microscope	Olympus	IX83
JMP Pro Software	SAS
Lambda 10-3 Motorized Filter Wheels	Sutter Instruments	LB10-NW
LambdaLS Arc Lamp with 300W Ozone-Free Xenon Bulb	Sutter Instruments	LS/OF30
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-027
MATLAB Software	Mathworks
MEM Non-Essential Amino Acids	Thermo Fisher	11140050
MetaMorph for Olympus	Olympus
Micro-Humidification System	Bioptechs	130708
MoFlo Astrios EQ Cell Sorter	Beckman Coulter	B25982
Objective Heater Medium	Bioptechs	150819-13
OptiMEM	Thermo Fisher	31985070
Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537
pMD2.G Envelope Plasmid	Addgene	12259
pRRL Vector			gift from Dr. Kam Leong (Columbia University)
psPax2 Packaging Plasmid	Addgene	12260
sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 Camera	Hamamatsu Photonics	C11440-22CU
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge	Thermo Fisher	75004505
Stable Z Stage Warmer	Bioptechs	403-1926
Venus Emission Filter	Semrock	FF01-571/72